CN104177480A - 木糖转运蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了两种木糖转运蛋白。将所述蛋白在目的菌株中表达后，目的菌株对木糖的利用速度和产溶剂速度加快，其对葡萄糖的利用速度也出乎意料地得到加快，从而获得了对木糖和葡萄糖利用速度均显著提高的生产菌，进而提高了相应生物燃料，例如乙醇或丁醇的产量。在此基础上，本发明提供了包含所述蛋白的编码序列的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞以及它们在产生生物燃料中的用途和方法。

Description

木糖转运蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种木糖转运蛋白及其应用。
背景技术
由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，利用可再生资源制造生物能源已受到世界各国的普遍重视，例如乙醇、丁醇等等。而丁醇由于其优良的燃烧特性及较乙醇更优的储存运输特性，更是有望在将来成为新一代生物燃料。自二战以来随着石油工业的发展，生物丁醇发酵由于较高的原料成本，大规模发酵一直处于停滞状态，而且随着近年来粮食价格的不断上涨及国家相关粮食安全战略的制定，采用粮食发酵生产燃料丁醇已受到严格限制。
我国传统的丁醇发酵生产中采用的生产菌-丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)以粮食原料(如玉米、小麦等)为底物。较高的粮食价格致使原料费用占溶剂生产总成本的比例偏高(75%以上)，这不仅限制了丁醇产品的市场竞争力，也严重违背了我国的粮食安全战略。因此，就长远而言，以非粮原料，尤其是廉价的木质纤维素资源(如秸秆、稻草等)通过生物转化制造生物燃料，例如丁醇是今后发展的必然趋势。
丙酮丁醇梭菌除了能够利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，还能利用木糖、乳糖、阿拉伯糖等多种碳源。农林废弃物(秸秆、稻草等)中的纤维素和半纤维素水解后的主要成分是葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，丙酮丁醇梭菌宽泛的底物谱使得该菌可以利用纤维素、半纤维素水解液为原料进行生物丁醇的发酵。纤维素和半纤维素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望大大降低原料成本。
然而，丙酮丁醇梭菌与很多其它细菌一样存在着糖代谢物阻遏效应(carboncatabolite repression，CCR)，即在葡萄糖存在时，几乎不利用木糖和阿拉伯糖。此外，丙酮丁醇梭菌木糖代谢本身也存在瓶颈，例如对木糖的利用较慢，或者在高木糖浓度下，对木糖的利用缓慢且不充分。鉴于此，要提高丙酮丁醇梭菌在混合糖中木糖和阿拉伯糖利用率需要克服两个问题，一是葡萄糖存在时对木糖、阿拉伯糖代谢的阻遏，二是木糖代谢自身存在的瓶颈。
此外，现有技术中利用的菌株还往往存在产酸过多的问题，产酸过多说明碳源被消耗在非所需产物上，降低了对原材料的利用率，因此，对于生产菌株，产酸越低越好。而产酸过多也会对于菌体生长产生不利影响。丙酮丁醇梭菌发酵分为产酸期和产溶剂期，如果能加快酸回用速度就能够让菌株更早进入产溶剂期。
综上所述，本领域急需鉴定新的木糖转运蛋白，进而开发出能够高效转运木糖的菌株，从而提高菌株对木糖的利用率和利用速度以及提高酸回用速度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型木糖转运蛋白，开发出能够高效转运木糖的菌株，从而提高菌株对木糖的利用率和利用速度以及提高酸回用速度。
在第一方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的编码序列；或
(ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。
在优选的实施方式中，所述表达载体包含SEQ ID NO:3或4所示的多核苷酸序列。
在第二方面，本发明提供包含本发明第一方面所述表达载体或基因组上整合有以下编码序列的宿主细胞：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的编码序列；或
(ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。
在优选的实施方式中，所述宿主细胞是丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或大肠杆菌(E.Coli)。
在另一优选的实施方式中，所述宿主细胞是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。
在第三方面，本发明提供以下蛋白或包含其编码序列的表达载体或包含所述表达载体的宿主细胞在产生生物燃料中的用途：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白；或
(ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白功能的由(i)衍生的蛋白。
在优选的实施方式中，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
在另一优选的实施方式中，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
在第四方面，本发明提供一种产生生物燃料的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对本发明第二方面所述的宿主细胞进行发酵，使所述宿主细胞产生生物燃料；和
ii)从i)的体系中获得所述生物燃料。
在优选的实施方式中，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
在另一优选的实施方式中，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A所示为大肠杆菌K12中构建的木糖转运子各缺陷株生长曲线即OD600nm变化情况。
图1B所示为将木糖转运子cac1530(sym3)和cac3422(sym4)分别异源功能互补大肠杆菌木糖转运子缺陷株K12/ΔxylEG后所得菌株的生长曲线即OD600nm变化情况。
图2A所示为在丙酮丁醇梭菌ATCC824中分别敲除木糖转运子cac1530(sym3)和cac3422(sym4)后所得突变株824sym3和824sym4与野生型824在0.5%含量木糖培养基中发酵残糖和生长曲线。
图2B所示为突变株824sym3和824sym4与野生型824在2%含量木糖培养基中发酵残糖和生长曲线。
图3A所示为在丙酮丁醇梭菌ATCC824中过表达cac1530(sym3)和cac3422(sym4)后所得菌株824thl-sym3和824thl-sym4与野生型824在6%含量木糖培养基中发酵残糖含量变化曲线。
图3B所示为菌株824thl-sym3和824thl-sym4与野生型824在6%含量木糖培养基中发酵产生丙酮、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸的含量变化。
图4A所示为菌株824thl-sym3和824thl-sym4与野生型824在含有4%葡萄糖和2%木糖的混糖培养基中发酵残糖含量变化曲线，其中实线表示葡萄糖的残糖含量，虚线表示木糖的残糖含量。
图4B所示为菌株824thl-sym3和824thl-sym4与野生型824在含有4%葡萄糖和2%木糖的混糖培养基中发酵产生丙酮、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸的含量变化。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在大肠杆菌木糖转运缺陷株中异源互补预测的木糖转运蛋白不仅能够恢复对木糖的利用能力，还提高了在高木糖浓度下该菌株对木糖的利用率，加快了菌株对木糖的利用速度和产溶剂以及酸回用速度；更出乎意料的是，在加快菌株对木糖利用的同时加快了葡萄糖的利用速度；而在丙酮丁醇梭菌中敲除和过表达该木糖转运蛋白得到的菌株对于木糖的利用能力以及产酸产溶剂能力发生了相应的变化，从而获得对木糖和葡萄糖利用率均提高的丙酮丁醇梭菌，进而能提高相应生物燃料，例如丁醇的产量。在此基础上完成了本发明。
CAC1530和CAC3422蛋白
本文所用的术语“CAC1530”、“CAC1530蛋白”、“CAC3422”或“CAC3422蛋白”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均表示氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID NO:3或4所示。
本文所用的术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。因此，本文所用的术语“分离的CAC1530蛋白”或“分离的CAC3422蛋白”是指所述蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CAC1530蛋白或CAC3422蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的可溶性片段。通常，该片段具有“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的类似物。这些类似物与天然“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
在本发明中，“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的保守性变异多肽指与SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。
初始残基 代表性的取代残基 优选的取代残基
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro;Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu
Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu
因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本领域技术人员明白，本发明的“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”还包括“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
任何一种“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的生物活性片段是指“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的片段，但其仍然能保持全长“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的50%的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
本发明还提供了编码本发明“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3或4所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:3或4所示编码序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:1或2所示成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的多聚核苷酸。
本发明的“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明编码序列的表达载体，以及用本发明的表达载体或“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”。一般来说有以下步骤：
1.用本发明的编码“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；
3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本文所述的宿主细胞包括包含表达载体或基因组上整合了本发明“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”编码序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株不仅能够恢复对木糖的利用能力，还提高了在高木糖浓度下该菌株对木糖的利用速度，加快了菌株的产溶剂速度和酸回用速度；更出乎意料的是同时加快了葡萄糖的利用速度。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。例如，所述宿主细胞包括可以利用木糖产生各种产物的菌株。所述菌株包括但不限于丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和大肠杆菌(E.Coli)。在优选的实施方式中，所述菌株为丙酮丁醇梭菌。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在优选的实施方式中，所述“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”是：(i)具有SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的蛋白；或(ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”功能的由(i)衍生的蛋白；或
所述“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的编码基因是：(i)具有SEQ IDNO:3或4所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO:3或4所示序列互补的多核苷酸。
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员会理解，本发明的蛋白、表达载体、宿主细胞可用于产生各种利用纤维素或半纤维素水解液为原料的产物，例如生物燃料。在具体的实施方式中，所述产物包括但不限于：丁醇、乙醇、丙酮、生物柴油、氨基酸。在优选的实施方式中，所述产物是丁醇和乙醇，更优选丁醇。
本发明还提供了利用本发明的表达载体或宿主细胞产生各种产物的方法。例如，在具体的实施方式中，可通过发酵包含本发明表达载体或其基因组上整合由本发明蛋白的编码序列的宿主细胞，使之产生所需产物；然后从发酵体系中获得所述产物。
本发明的优点：
1.本发明显著提高菌株对木糖的利用速度；
2.本发明显著提高菌株对葡萄糖的利用速度；
3.外源性导入本发明蛋白的菌株能够加快对葡萄糖的利用，提早启动对木糖的使用，减少工艺流程的时间，减少人力、物理的消耗，节约成本；
4.采用本发明能够更灵活地选择生产廉价易得的原料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。
本发明所用的菌株、质粒和试剂
菌株和质粒
质粒pANS1，序列参见文献(Appl Environ Microbiol，1993，59(4):1077-1081.)，含壮观霉素抗性基因。
质粒pIJ773和质粒pIJ790，序列参见文献(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，2003，100(4):1541-1546)
质粒pSUN600，序列见SEQ NO:5。
质粒pWJ1为大肠杆菌(E.coli)和丙酮丁醇梭菌的穿梭质粒(将来源于丁酸梭菌DSM10702的复制子pCB102替换掉pSY6的复制子pIM13)，其在丙酮丁醇梭菌中表达红霉素抗性基因，该质粒的序列见SEQ NO:6。
质粒pIMP1-thl为大肠杆菌和丙酮丁醇梭菌的穿梭质粒(载体骨架基于参考文献Appl Environ Microbiol，1993，59(4):1077-1081.中的pIMP1，区别仅在于引入了thl基因(cac2873)的启动子)，在丙酮丁醇梭菌中表达红霉素抗性基因。
菌株大肠杆菌K12/ΔxylE购自CGSC(The Coli Genetic Stock Center)。
菌株大肠杆菌DH5α购自Takara公司。
菌株大肠杆菌ER2275购自New England Biolabs公司。
菌株丙酮丁醇梭菌ATCC824购于ATCC(American Type CultureCollection)。
试剂
本发明中使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自AXYGEN生物科技有限公司，TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit购自Sigma-Aldrich公司，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基和缓冲液如下：
M9培养基配方如下：
配制1L培养基，应在750ml无菌去离子水（冷至50℃或50℃以下）中加入：
灭菌的去离子水至980ml。
其中，5×M9盐溶液配制：用无离子水溶解下列盐类，终体积为1L：
分装成200ml一份，在1.05kg/cm2高压下蒸汽灭菌15min。
分别配制MgSO4溶液和CaCl2溶液，高压灭菌。用无菌水将5×M9盐溶液稀释至980ml后，加入MgSO4溶液和CaCl2溶液。葡萄糖溶液在加到稀释的M9盐溶液之前，用0.22μm滤器过滤除菌。
CGM培养基配方如下(Joseph W.Roos等，Biotechnology andBioengineering,P681-694,Vol557,1985)：2g(NH4)2SO4，1g K2HPO4·3H2O，0.5g KH2PO4，0.1g MgSO4·7H2O，0.015g FeSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.01gMnSO4·H2O，0.002g CoCl2，0.002g ZnSO4，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物(YeastExtraction)，50g葡萄糖，2%琼脂溶于1L水中。
P2培养基的配制方法如下(F.Monot等，Appl Environ Microbiol,Issue6,Vol44,1982)：
溶液1：40g D-葡萄糖；20g D-木糖或60g D-木糖或20gD-木糖或5gD-木糖，加H2O定溶至850mL；
溶液2：NH4Ac2.2g，K2HPO4·3H2O0.5g，KH2PO40.5g，加H2O定溶至100mL；
溶液3：2.0g MgSO4·7H2O，0.1g MnSO4·H2O，0.1g NaCl，0.1gFeSO4·7H2O；
溶液4：100ml蒸馏水中加入100mg氨基苯甲酸(β-aminobenzoic acid)，100mg维生素B1(thiamine)，1mg生物素(biotin)；
溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀后分装成95mL/瓶，以过滤除菌，N2排除瓶中的空气。
ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4，10mM MgCl2。
ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4。
本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自Toyobo公司。
其它常规试剂均为国产或进口分装。
序列说明
序列SEQ ID NO:1-32分别代表如下所示序列：
SEQ ID NO 具体序列 SEQ ID NO 具体序列
1 CAC1530编码蛋白氨基酸序列 21 引物3422-EcoR1-s
2 CAC3422编码蛋白氨基酸序列 22 引物3422-Sma1-a
3 CAC1530基因序列 23 引物1530-BamH1-s
4 CAC3422基因序列 24 引物1530-Sma1-a
5 质粒pSUN600序列 25 引物3422-BamH1-s
6 质粒pWJ1序列 26 引物3422-Sma1-a
7 引物xylF-up-s 27 引物pIMP1-thl seq-s
8 引物xylF-down-a 28 引物pIMP1-thl seq-a
9 引物xylH-up-s 29 引物Sym3-663s-EBS1d
10 引物xylH-down-a 30 引物Sym3-663s-EBS2
11 引物xylG-up-s 31 引物Sym3-663s-IBS
12 引物xylG-down-a 32 引物Sym4-1048a-EBS1d
13 引物xylF-s 33 引物Sym4-1048a-EBS2
14 引物xylF-a 34 引物Sym4-1048a-IBS
15 引物xylH-s 35 引物Sym3-663s-ID-s
16 引物xylH-a 36 引物Sym3-663s-ID-a
17 引物xylG-s 37 引物Sym4-1048a-ID-s
18 引物xylG-a 38 引物Sym4-1048a-ID-a
19 引物1530-EcoR1-s
20 引物1530-Sma1-a
实施例1.大肠杆菌K12中木糖转运缺陷株的构建
在木糖转运突变株K12/ΔxylE的基础上，利用PCR targeting的方法，分别敲除xylF、xylH和xylG基因。
1.1外源同源重组片段构建
以质粒pIJ773为模板，利用引物对xylF-up-s/xylF-down-a通过PCR扩增，得到敲除xylF基因的中断盒。
以质粒pIJ773为模板，利用引物对xylH-up-s/xylH-down-a通过PCR扩增，得到敲除xylH基因的中断盒。
以质粒pIJ773为模板，利用引物对xylG-up-s/xylG-down-a通过PCR扩增，得到敲除xylG基因的中断盒。
1.2K12木糖转运缺陷株的构建
在菌株K12/ΔxylE中转入质粒pIJ790，氨苄霉素抗性平板筛选，得到能够实现高效同源重组的菌株。再通过电转的方式分别导入敲除xylF基因的中断盒、敲除xylH基因的中断盒和敲除xylG基因的中断盒，阿普拉霉素平板筛选。然后分别利用引物对xylF-s/a，xylH-s/a，xylG-s/a进行菌落PCR鉴定(反应试剂由Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供、条件：95℃5min，94℃30s、55℃30s、2572℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)。鉴定正确得到大肠杆菌木糖缺陷株K12/ΔxylEF、K12/ΔxylEH和K12/ΔxylEG。
1.3K12木糖转运缺陷株在木糖培养基中生长情况
从LB平板上挑取大肠杆菌木糖缺陷株K12/ΔxylEF、K12/ΔxylEH和K12/ΔxylEG接入4mL LB液体培养基中，过夜培养，以5%接种量接入50ml M9培养基中培养发酵，取发酵液测定OD600nm值。结果如图1A所示。
从试验结果可以明显看出，K12/ΔxylEG的OD600nm值显著低于其它测试菌株，从而证明K12/ΔxylEG是木糖转运缺陷株。
实施例2.CAC1530、CAC3422在大肠杆菌中的异源功能互补
以丙酮丁醇梭菌ATCC824基因组为模板，设计引物扩增CAC1530和CAC3422基因片段，酶切处理后与同样酶切处理的载体相连，转化大肠杆菌缺陷株，菌落PCR验证并抽提质粒测序。
2.1载体构建
以ATCC824基因组为模板，以引物对1530-EcoR1-s和1530-Sma1-a作为引物，通过PCR扩增CAC1530基因片段，然后使用EcoR1和Sma1进行双酶切，并与同样经EcoR1和Sma1双酶切的载体pSUN600(SEQ NO:5所示)连接，转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，以引物对pIMP1-thlseq-s/a为引物测序验证正确后保菌。得到质粒pSym3。
以ATCC824基因组为模板，以引物对3422-EcoR1-S和3422-Sma1-a作为引物，通过PCR扩增CAC3422基因片段，然后使用EcoR1和Sma1进行双酶切，并与同样经EcoR1和Sma1双酶切的载体pSUN600连接，转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，以引物对pIMP1-thl seq-s/a为引物测序验证正确后保菌。得到质粒pSym4。
2.2异源功能互补菌株的构建
将获得的质粒pSym3、pSym4以及空白对照质粒pSUN006分别以CaCl2热休克法转化大肠杆菌K12/ΔxylEG感受态细胞：42℃，热击90sec，然后添加4℃LB液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。
使用引物对1530-EcoR1-s和1530-Sma1-a对获得的菌落进行菌落PCR，以检测质粒pSym3是否成功转入大肠杆菌缺陷株中，若正确，得到重组菌株K12/ΔxylEG-pSym3。
使用引物对3422-EcoR1-s和3422-Sma1-a，用同样的方法进行菌落PCR验证，得到重组菌株K12/ΔxylEG-pSym4。
同时得到对照菌株K12/ΔxylEG-pSUN006。
2.3异源功能互补菌株的生长情况
从LB平板上挑取重组菌株K12/ΔxylEG-pSym3、K12/ΔxylEG-pSym4和对照菌株K12/ΔxylEG-pSUN006的单菌落接入4mL LB液体培养基中，过夜培养，以5%接种量接入50ml M9培养基中培养发酵，取发酵液测定OD600nm值。结果如图1B所示。
从试验结果可以看出，菌株K12/ΔxylEG-pSym3、K12/ΔxylEG-pSym4的OD600nm值显著高于对照菌株K12/ΔxylEG-pSUN006，从而证明菌株K12/ΔxylEG-pSym3、K12/ΔxylEG-pSym4能够有效利用木糖。
实施例3.丙酮丁醇梭菌ATCC824中CAC1530和CAC3422敲除质粒的构建
通过PCR扩增CAC1530基因片断，然后使用XhoI和BsrGI进行双酶切，并与同样经XhoI和BsrGI酶切的pWJ1载体连接，得到中断质粒pWJ1-CAC1530。其中，PCR扩增基因CAC1530的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒，具体步骤如下：
3.1PCR扩增引物
参考TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供的方法，分别设计引物用于构建pWJ1-CAC1530质粒载体。
PCR扩增需要的EBS通用引物(EBS universal)由TargetronTM GeneKnockout System(TA0100)试剂盒自带。
所用引物分别为Sym3-663s-EBS1d、Sym3-663s-EBS2、Sym3-663s-IBS和Sym4-1048a-EBS1d、Sym4-1048a-EBS2、Sym4-1048a-IBS。
3.2PCR扩增
使用Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃30s，94℃30s，55℃30s，72℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)，扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用胶回收试剂盒纯化回收350bp处的条带。
3.3构建pWJ1-glcG重组质粒载体
使用Xho I及BsrGI分别酶切载体pWJ1和CAC1530基因片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。
将酶切后的CAC1530基因片段与酶切后的载体片段使用T4DNA连接酶连接，该连接反应在16℃水浴锅中进行10hr，将获得的连接产物以CaCl2热休克法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：42℃，热击90sec，然后添加4℃LB液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。
对获得的菌落进行菌落PCR(反应试剂由Sigma-Aldrich的TargetronTMGene Knockout System(TA0100)试剂盒提供、条件：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)，以检测350bp的targetron片段是否连接入pWJ1载体中，PCR扩增引物为IBS和EBS1d。
PCR检测结果显示，菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带。随即挑取PCR呈阳性的菌落以LB液体培养基扩培，提取质粒。然后，以IBS和EBS1d作为引物，提取的质粒作为模板进行测序，结果如预期：targetron片段确已连接入pWJ1载体。
CAC3422的敲除质粒构建方法同CAC1530敲除质粒。
实施例4.丙酮丁醇梭菌ATCC824中CAC1530和CAC3422敲除菌株的构建
将pWJ1-CAC1530质粒经大肠杆菌ER2275/pANS1在Cac8I位点甲基化后，电转丙酮丁醇梭菌ATCC824，复苏4h后，取200μl细胞液涂布于加有20μg/mL红霉素的CGM平板上，在厌氧箱内37℃培养48-96小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体过程如下：
4.1pWJ1-CAC1530质粒的甲基化
为防止外源DNA进入丙酮丁醇梭菌后被其限制系统切割降解，需对pWJ1-CAC1530质粒进行甲基化(Mermelstein,L.D和Papoutsakis,E.T.ApplEnviron Microbiol.vol59.issue4：p1077-81)。
将pANS1质粒以CaCl2热休克法转化入大肠杆菌ER2275，获得菌株大肠杆菌ER2275/pANS1。将抽提获得的pWJ1-glcG质粒转化入大肠杆菌ER2275/pANS1感受态细胞，由于pANS1质粒具有壮观霉素抗性，因此涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB培养基平板上培养过夜后，挑取单菌落接至4mL添加有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中过夜培养，获得含pANS1及pWJ1-glcG的大肠杆菌ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将抽提获得的质粒使用SatI酶切验证(以未转化入大肠杆菌ER2275/pANS1的pSY6-ccpA为对照；SatI为Cac824I的同裂酶，与Cac824I具有相同的识别位点)，酶切结果显示，经上述处理的质粒pWJ1-glcG不能被SatI酶切，而对照可被SatI酶切，根据酶切结果，经上述处理的质粒pWJ1-CAC1530的Cac824I酶切位点被甲基化而不被丙酮丁醇梭菌的限制系统所识别。
4.2pWJ1-CAC1530质粒电转入丙酮丁醇梭菌ATCC824
将丙酮丁醇梭菌ATCC824于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养16hr，再按1%接种量接入50mL CGM液体培养基中培养，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取30mL菌液，于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入30mL4℃的ETM缓冲液悬浮，再于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入1mL4℃的ET缓冲液，获得悬浮菌液。
取上述悬浮菌液190μL，加入10μL(约1～3μg)pWJ1-CAC1530甲基化质粒(冰上操作)，混匀后转入电转杯中(2mm直径)，使用Bio-Rad MicroPulserTM电转仪电转，电压1.8kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，于37℃培养8hr后，取200μL细胞液涂布于加有20μg/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37℃培养约2～4天。
4.3菌落的PCR验证
pWJ1-CAC1530质粒转化入丙酮丁醇梭菌ATCC824中后，可能会将二类内含子的部分序列插入到基因组的CAC1530基因中，是否有内含子插入可以使用插入位点上下游的引物，通过菌落PCR加以验证(未插入内含子的野生型菌将扩增出621bp的条带，插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为1566bp条带)，因此，随机挑取五个转化子进行验证，其中，以丙酮丁醇梭菌ATCC824基因组为阴性对照，具体过程如下：
PCR反应使用的引物为Sym3-663s-ID-s/a。
PCR反应体系：与实施例2相同；PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃5min。
将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
4.4测序验证阳性转化子
随机挑取步骤4.3中的阳性转化子，以加有20μg/mL红霉素的CGM液体培养基培养后，抽提基因组。以抽提的基因组为模板，以Sym3-663s-ID-s/a为引物对进行PCR扩增，回收扩增获得的1566bp DNA条带并测序。测序结果显示，该序列的663|664位点的DNA为插入的内含子序列，即内含子序列精确地插入到预计的663|664位点之间。
4.5824/pWJ1-CAC1530敲除质粒的丢失
将10μl生长至对数生长期的转化子分别转接至5ml CGM无抗和含有红霉素(20μg/ml)的试管中，12～15小时转接一次，直至抗性试管不再生长为止，此过程需约2天。将抗性试管不再生长时对应代时的无抗试管菌液涂板，菌落PCR、测序验证(同4.3、4.4)保证内含子的插入，将丢失敲除质粒的突变株824sym3用于后续的实验过程。
突变株824sym4的构建过程与824sym3类似，设计的二类内含子插入位点为1048|1049。
实施例5.丙酮丁醇梭菌突变株824sym3和824sym4的木糖利用情况
从CGM平板上挑取单菌突变株824sym3、824sym4和824接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8～10hr，使菌浓OD600nm达到0.4，以5%接入50ml P2培养基中培养发酵，取发酵液测定OD600nm值及检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela1200HPLC测定，结果如图2所示)，其中测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理：发酵液经离心后，分别取上清液，以H2O经20倍稀释后用于残糖测定。
由图2可知，CAC1530和CAC3422敲除菌株对木糖的利用显著降低。
实施例6.丙酮丁醇梭菌ATCC824中CAC1530和CAC3422过表达质粒的构建
以丙酮丁醇梭菌ATCC824基因组为模板，设计引物扩增CAC1530和CAC3422基因片段，酶切处理后与同样酶切处理的载体相连，转化DH5α，菌落PCR验证并抽提质粒测序。其中，PCR、酶切、连接转化、菌落PCR方法同实施例2。具体过程如下：
6.1pIMP1-thl-sym3质粒的构建
以1530-BamH1-s/1530-Sma-a为引物扩增出CAC1530片段。使用BamHI及SmaI分别酶切载体pIMP1-thl和CAC1530基因片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
6.2pIMP1-thl-sym4质粒的构建
以3422-BamH1-s/3422-Sma-a为引物扩增出CAC3422片段。使用BamHI及SmaI分别酶切载体pIMP1-thl和CAC1530基因片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
实施例7.丙酮丁醇梭菌ATCC824中CAC1530和CAC3422过表达菌株的构建
7.1各质粒的甲基化
方法同4.1
7.2甲基化的各质粒的电转
方法同4.2
7.3各个工程菌的菌落PCR验证
PCR体系、方法、DNA琼脂糖电泳验证同4.3，阳性对照为各自构建正确的质粒，阴性对照为水。
7.3.1丙酮丁醇梭菌824sym3的鉴定
引物为1530-BamH1-s/1530-Sma-a，获得的阳性菌落简称为824thl-sym3。
7.3.1丙酮丁醇梭菌824(pIMP1-thl-xylT)的鉴定
引物为3422-BamH1-s/3422-Sma-a，获得的阳性菌落简称为824thl-sym4。
实施例8.丙酮丁醇梭菌重组菌株的木糖利用和产酸、产溶剂情况
从CGM平板上挑取单菌(824thl-sym3、824thl-sym4和包含pIMP1空白质粒的824pIMP1)接入含有5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8～10hr，使菌浓OD600nm达到0.4，以5%接入100mlP2培养基中培养发酵，取发酵液检测OD600nm值、残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela1200HPLC测定)、丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela7890A气相色谱仪测定)、以及乙酸、丁酸含量，以丙酮丁醇梭菌ATCC824作为对照，其中，测定发酵液中的残糖含量和丙酮、丁醇和乙醇含量前需进行如下预处理：
发酵液经离心后分别取上清液测定残糖和丙酮、丁醇、乙醇：
上清液以H2O经20倍稀释后用于残糖测定；取400μL上清液与100μL内标混合均匀测定丙酮、丁醇和乙醇(内标配方为：25g异丁醇，5g异丁酸，50mL37%浓盐酸，加水定容至1L)。
由图3所示结果可以看出，丙酮丁醇梭菌重组菌株对木糖的利用速度远高于包含pIMP1空白质粒的野生型菌株；而丙酮、乙醇和丁醇的产生速度也远高于包含pIMP1空白质粒的野生型菌株；相对于包含pIMP1空白质粒的野生型菌株产酸提前，酸回用速度加快。
实施例9.丙酮丁醇梭菌重组菌株对混糖的利用情况
从CGM平板上挑取单菌(824thl-sym3、824thl-sym4和包含pIMP1空白质粒的824pIMP1)接入含有5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8～10hr，使菌浓OD600nm达到0.4，以5%接入100mlP2培养基中培养发酵，取发酵液检测OD600nm值、残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela1200HPLC测定)、丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela7890A气相色谱仪测定)、以及乙酸、丁酸含量，以丙酮丁醇梭菌ATCC824作为对照，具体方法同实施例8。结果如图4所示。
从图4所示试验结果可以看出，在利用混糖(4%葡萄糖+2%木糖)时，重组菌株对木糖的利用速度依旧远高于包含pIMP1空白质粒的野生型菌株；而乙醇的产生速度也远高于包含pIMP1空白质粒的野生型菌株。此外，发明人还进一步出乎意料地发现，重组菌株在木糖利用速度大大加快的同时，还显著加快了对葡萄糖的利用，由于体系中存在葡萄糖会对菌株利用木糖产生阻碍作用，即，糖代谢物阻遏作用，菌株能够加快对葡萄糖的消耗，就能尽早启动对木糖的使用，从而减少整个工艺流程的时间，进而减少人力、物理的消耗，节约成本。相对于包含pIMP1空白质粒的野生型菌株产酸提前，酸回用速度加快。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种表达载体，所述表达载体包含：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的编码序列；或
(ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含SEQ ID NO:3或4所示的多核苷酸序列。
3.包含权利要求1或2所述表达载体或基因组上整合有以下编码序列的宿主细胞：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的编码序列；或
(ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
5.以下蛋白或包含其编码序列的表达载体或包含所述表达载体的宿主细胞的用途，其特征在于，用于产生生物燃料：
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白；或
(ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白功能的由(i)衍生的蛋白。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
8.一种产生生物燃料的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对权利要求3或4所述的宿主细胞进行发酵，使所述宿主细胞产生生物燃料；和
ii)从i)的体系中获得所述生物燃料。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
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