CN107074918B - Gal2转运体的变异体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为Gal2变异体的多肽，其在与T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代和任选地其它氨基酸取代。本发明另外涉及编码所述多肽的核酸分子并且涉及含有所述核酸分子的宿主细胞。本发明另外涉及用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法，其包含所述核酸分子优选地在所述宿主细胞中的表达。本发明还涉及所述多肽、核酸分子或宿主细胞的用途，其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生产，和/或用于含有戊糖(优选地D‑木糖和/或L‑阿拉伯糖)的生物材料的重组发酵。

Description

GAL2转运体的变异体和其用途
技术领域
本发明涉及作为Gal2变异体的多肽，其在与T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代和任选地其它氨基酸取代。本发明另外涉及编码所述多肽的核酸分子并且涉及含有所述核酸分子的宿主细胞。本发明另外涉及用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法，其包含所述核酸分子优选地在所述宿主细胞中的表达。本发明还涉及所述多肽、核酸分子或宿主细胞的用途，其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生产，和/或用于含有戊糖(优选地D-木糖和/或L-阿拉伯糖)的生物材料的重组发酵。
背景技术
啤酒、葡萄酒和烘焙酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因其将糖发酵成乙醇和二氧化碳的特征而已用于面包、葡萄酒和啤酒的生产数个世纪。在生物技术中，酿酒酵母除生产异源蛋白质以外，还特别用于生产乙醇用于工业目的。乙醇作为用于合成的初始底物而用于许多工业分支。由于油的存在愈加稀少，油价升高和全世界对石油的需求持续增加，所以乙醇作为一种替代燃料变得愈加重要。此外，酿酒酵母也用于生产其它生物燃料或有价值的生化化合物，如异丁醇、丁二酸、法呢烯/法呢烯或青蒿素。
为了使价格实惠并且高效的生物燃料生产成为可能，提出使用含有木质纤维素的生物质本身作为初始底物，如秸秆、来自木材工业和农业的废料以及日常生活垃圾的有机组分。首先，所述生物质是非常方便的，并且其次大量存在。木质纤维素的三种主要组分是木质素、纤维素和半纤维素。半纤维素，在纤维素之后第二种最常出现的聚合物，是一种高度支化的杂聚物。它由戊糖(L-阿拉伯糖、D-木糖)、糖醛酸(4-O-甲基-D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸)和己糖(D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖)组成。虽然半纤维素可以比纤维素更易水解，但是它含有通常无法由酵母酿酒酵母转化的戊糖L-阿拉伯糖和D-木糖。
为了能够使用戊糖进行发酵，这些戊糖必须首先穿过质膜进入细胞。虽然酿酒酵母不能代谢D-木糖或L-阿拉伯糖，但是它可以将D-木糖或L-阿拉伯糖吸收至细胞中。然而，酿酒酵母不具有特异性转运体。转运借助于己糖转运体来进行。然而，所述转运体对D-木糖的亲和力明显低于D-葡萄糖(Kotter和Ciriacy,1993)。在如树干毕赤酵母(P.stipitis)、休哈塔假丝酵母(C.shehatae)或嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)等能够代谢D-木糖的酵母(Du Preez等人,1986)中，转运D-葡萄糖的非特异性低亲和力转运体以及仅针对D-木糖的特异性高亲和力质子同向转运体都存在(Hahn-Hagerdal等人,2001)。
在早期实验中，发现一些酵母，如热带假丝酵母(Candida tropicalis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，天生发酵D-木糖或L-阿拉伯糖或可以至少将其同化。然而，这些酵母完全缺乏将L-阿拉伯糖和D-木糖发酵成乙醇的能力，或它们仅具有极低乙醇产率(Dien等人,1996)。此外，关于D-木糖和L-阿拉伯糖的吸收几乎仍未知晓。在酵母休哈塔假丝酵母中，有人假设质子同向转运(Lucas和Uden,1986)。在酿酒酵母中，由半乳糖通透酶Gal2已知它可以转运D-木糖并且还转运结构与D-半乳糖极其类似的L-阿拉伯糖。(Kou等人,1970)。大部分己糖转运体可以介导D-木糖的吸收。
近年来特别结合木糖的发酵描述戊糖在酿酒酵母的经生物技术修饰的酵母菌株中的醇类发酵，其中尤其使用酵母菌株树干毕赤酵母的各种基因进行酿酒酵母的基因修饰。工程改造在此处特别集中于将来自树干毕赤酵母(木糖发酵酵母)的初始木糖同化基因引入到酿酒酵母中，即到传统上用于由己糖生产乙醇的酵母中(Jin等人2004)。
Jeppson等人(2006)描述借助于引入与天然利用木糖的酵母树干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母中类似或与细菌代谢途径类似的木糖代谢途径而由酿酒酵母发酵木糖。
Katahira等人(2006)描述了木质纤维素生物质(如木屑)的硫酸水解产物作为燃料生物乙醇生产的重要材料。在这一研究中，构建能够发酵木糖和纤维寡糖的重组酵母菌株。为此，将多种基因整合到此酵母菌株中，即用于细胞间表达来自树干毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以及来自酿酒酵母的木酮糖激酶并且用于在细胞表面上呈现来自棘孢曲霉(Aspergillus acleatus)的β-葡糖苷酶。在木屑的硫酸水解产物发酵中，木糖和纤维寡糖在36小时之后被重组菌株充分发酵。
Pitkanen等人(2005)描述了酿酒酵母菌株的木糖恒化分离株的获得和表征，所述分离株过度表达编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母的基因和编码内源性木酮糖激酶的基因。所述分离株是从以木糖作为单个或主要碳源的好氧恒化培养物获得。在好氧条件下在具有30g/l木糖的基本培养基上，恒化分离株的生长速率比原始菌株高3倍(0.15h-1相比于0.05h-1)。木糖吸收率增加几乎两倍。戊糖磷酸代谢途径的关键酶(转酮醇酶、转醛醇酶)的活性增加两倍，而其底物(戊糖-5-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸)的浓度因此降低。
Brat等人(2009)筛选核酸数据库关于编码假定的木糖异构酶的序列并且最后能够克隆并在酿酒酵母中成功表达来自厌氧细菌植物发酵梭菌(Clostridiumphytofermentans)的高活性新种类的木糖异构酶。此酶的异源表达赋予酵母细胞代谢D-木糖和使用其作为唯一的碳和能量来源的能力。
Demeke等人(2013)研发出一种含有13个基因的表达盒，所述基因包括编码D-木糖异构酶的植物发酵梭菌xylA和戊糖磷酸途径的酶，并且将所述盒插入在工业酿酒酵母菌株Ethanol Red基因组的两个复本中。随后进行EMS突变诱发、基因组重排和在D-木糖富集的木质纤维素水解产物中选择，接着在具有D-木糖的复合培养基中进行多轮进化工程改造，逐渐建立非常高效的D-木糖发酵。
Becker和Boles(2003)描述了酿酒酵母实验室菌株的工程改造和选择，所述菌株能够使用L-阿拉伯糖进行生长并且使其发酵成乙醇。这可能归因于由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AraA以及大肠杆菌AraB和AraD组成的细菌L-阿拉伯糖代谢途径的过度表达和同时在酵母菌株中转运L-阿拉伯糖的酵母半乳糖通透酶的过度表达。所选菌株的分子分析显示使用L-阿拉伯糖的预定前提是L-核酮糖激酶的活性较低。然而，尤其报告此酵母菌株生长极慢。
Wiedemann和Boles(2008)显示来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的L-阿拉伯糖异构酶和来自大肠杆菌的L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-P 4-差向异构酶的密码子优化基因的表达有力地提高L-阿拉伯糖转化率。
Farwick等人(2014)研发出一种新的用于筛选和工程改造戊糖转运体的系统，所述戊糖转运体不再受葡萄糖抑制。此系统是基于所有己糖转运体和所有己糖/葡糖激酶缺失的D-木糖发酵酵母菌株(hxt0hxk0菌株)。D-葡萄糖可以不再用作碳源，但是在转运水平下干扰D-木糖利用率。因此，可易于选择允许在浓度增加的D-葡萄糖存在下吸收D-木糖的突变型转运体。在进化工程改造和突变诱发方法中使用此系统，作者能够由酿酒酵母己糖转运体生成特异性D-木糖转运体。这些突变型转运体中的一些在与半乳糖转运体Gal2的N376对应的位置处具有更换。然而，虽然它们证明具有针对葡萄糖的抗性，但是其中大部分对木糖的吸收率降低。
WO 2008/080505A1公开了一种来自树干毕赤酵母的阿拉伯糖转运体，其使得酵母细胞能够吸收L-阿拉伯糖。EP 11 001 841.3公开了一种用于构建戊糖发酵酵母的植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的特异性阿拉伯糖转运体。
WO 2012/049170 A2和WO 2012/049173 A1公开了戊糖和葡萄糖发酵酵母细胞，其除了其它核酸之外含有并且表达具有阿拉伯糖通透酶活性的多肽，所述多肽包含Gal2在位置T219变成天冬酰胺或N376变成丝氨酸的突变，使得转运体具有针对葡萄糖的抑制性作用的抗性。
所属领域中仍需要特异性戊糖转运体，尤其特异性D-木糖转运体，其对戊糖具有较高亲和力和/或较高活性，尤其与葡萄糖抗性组合，允许特异性吸收D-木糖和/或L-阿拉伯糖至细胞(如酵母细胞)中，即使在低戊糖浓度下仍具有高吸收率，并且因此促进戊糖(尤其D-木糖和/或L-阿拉伯糖)的利用和发酵，并且尤其在同时存在葡萄糖的情况下。
因此，本发明的一个目标是提供经改善和/或更具特异性的转运体，其以较高活性和/或较高亲和力转运戊糖，如D-木糖和/或L-阿拉伯糖。
发明内容
根据本发明，此目标是由在与SEQ ID NO:1氨基酸序列的T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的多肽来实现，
其中所述多肽与SEQ ID NO:1氨基酸序列具有至少60％、或优选地至少70％或80％或90％或95％序列一致性，并且其中所述多肽具有活体外和/或活体内戊糖转运功能。
根据本发明，此目标是由编码本发明的多肽的核酸分子来实现。
根据本发明，此目标是由含有本发明的核酸分子并且优选地表达所述核酸分子的宿主细胞来实现，其中所述宿主细胞优选地是真菌细胞并且更优选地是酵母细胞，如酵母属(Saccharomyces species)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、汉逊酵母属(Hansenula sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)或耶氏酵母属(Yarrowia sp.)。
根据本发明，此目标是通过一种用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法来实现，所述方法包含优选地在根据本发明的宿主细胞中表达根据本发明的核酸分子。
根据本发明，此目标是通过将根据本发明的多肽、根据本发明的核酸分子或根据本发明的宿主细胞用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生产，
和/或用于含有戊糖(优选地D-木糖和/或L-阿拉伯糖)的生物材料的重组发酵来实现。
具体实施方式
在下文更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于本文中所描述的具体方法论、方案和试剂，因为这些都可以改变。还应理解，本文中所用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不打算限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。出于本发明的目的，本文中所列举的所有参考文献都以全文引用的方式并入。
Gal2变异体
如上文所论述，本发明提供Gal2变异体。
具体来说，本发明提供一种多肽，其在与SEQ ID NO:1氨基酸序列的T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代。
本发明的多肽与SEQ ID NO:1氨基酸序列具有至少60％、或优选地至少70％或80％或90％或95％序列一致性，并且具有活体外和/或活体内戊糖转运功能。
优选地，本发明的多肽是酿酒酵母的Gal2。
SEQ ID NO:1是CEN.PK2-1C和CEN.PK113-7D的Gal2的野生型蛋白质或氨基酸序列。
CEN.PK2-1C的Gal2是具有574个氨基酸的蛋白质。
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/FUNGI/getSeq.pl？seq＝YLR081W_CEN.PK113-7D
根据本发明的多肽，优选地Gal2变异体，在与SEQ ID NO:1氨基酸序列或与SEQ IDNO:1氨基酸序列至少60％一致、优选地至少70％一致、更优选地至少80％一致、甚至更优选地至少90％一致、更优选地95％一致并且更优选地99％一致的氨基酸序列的T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代。
如本文所用，术语“在与……对应的位置处”意思指SEQ ID NO:1中的相应位置，然而，其在相关多肽链中可以具有另一相对位置编号。等效取代可以通过比较两个序列中的位置来确定，所述序列可以出于比较目的进行比对。氨基酸的相对位置可以由于相关多肽的不同长度或相关多肽中氨基酸的缺失或添加而改变。
根据本发明的多肽，优选地Gal2变异体，具有活体外和/或活体内戊糖转运功能，尤其活体外和/或活体内D-木糖和/或L-阿拉伯糖转运功能。
优选地，戊糖是D-木糖和/或L-阿拉伯糖。
如本文所用，如果未另外指出，那么术语“木糖”意思与D-木糖相同，“阿拉伯糖”意思与L-阿拉伯糖相同，并且“葡萄糖”意思与D-葡萄糖相同。
如本文所用，术语“百分比(％)一致”是指两个氨基酸序列之间的序列一致性。一致性可以通过比较两个序列中的位置来确定，所述序列可以出于比较的目的进行比对。当比较序列中的等效位置被相同氨基酸占据时，分子被视为在所述位置处一致。
如本文所用，术语“功能等效物”是指与SEQ ID NO.1氨基酸序列并非100％一致并且包含与具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白质相比不更改或改变蛋白质的活性或功能的氨基酸添加和/或插入和/或缺失和/或取代和/或更换的氨基酸序列，即“功能等效物”例如涵盖具有保守氨基酸取代或较小缺失和/或插入的氨基酸序列，只要这些修饰不实质上影响活体外和/或活体内L-阿拉伯糖转运功能即可。
一般来说，所属领域的技术人员了解以下事实：蛋白质的氨基酸序列中的一些氨基酸更换对所述蛋白质的(二级或三级)结构、功能和/或活性不具有影响。与本文中所公开的氨基酸序列相比具有这类“中性”氨基酸更换的氨基酸序列属于本发明的范围。
在一优选实施例中，根据本发明的在与SEQ ID NO.1的T354对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的多肽，优选地Gal2变异体，
包含氨基酸取代T354A。
优选地，在与T354对应的位置处的氨基酸取代与无这类氨基酸取代的多肽相比增加活体外和/或活体内戊糖转运功能的活性。
优选地，在与T354对应的位置处的氨基酸取代与无这类氨基酸取代的多肽相比增加多肽对戊糖的亲和力。
-其它氨基酸取代
在一个实施例中，根据本发明的多肽，优选地Gal2变异体，包含其它氨基酸取代：
优选地在与SEQ ID NO:1氨基酸序列的V71对应的位置处的氨基酸取代。
所述其它氨基酸取代优选地是V71I。
本发明优选地提供以下多肽/Gal2变异体：
-T354A
-T354A/V71I
核酸分子
如上文所论述，本发明提供一种核酸分子，其编码根据本发明的多肽。
在一个实施例中，本发明的核酸分子另外包含：
-载体核酸序列，优选地表达载体序列，
和/或
-启动子核酸序列和终止子核酸序列，
和/或
-包含其它调控核酸序列。
在一个实施例中，本发明的核酸分子包含dsDNA、ssDNA、PNA、CNA、RNA或mRNA或其组合。
根据本发明的核酸分子优选地包含与天然存在的核酸序列一致(除添加根据本发明的氨基酸取代以外)或经密码子优化以便在宿主细胞中使用的核酸序列。
根据本发明使用的核酸分子优选地是核酸表达构建体。
根据本发明的核酸表达构建体是例如包含根据本发明的核酸分子的表达盒，或包含根据本发明的核酸分子或表达盒的表达载体。
核酸表达构建体优选地包含调控序列，如启动子和终止序列，其与编码本发明的多肽的核酸序列可操作地连接。
核酸表达构建体可以另外包含5'和/或3'识别序列和/或选择标记。
宿主细胞
如上文所论述，本发明提供含有根据本发明的核酸分子的宿主细胞。
优选地，本发明的宿主细胞表达所述核酸分子。
优选地，根据本发明的宿主细胞是真菌细胞并且更优选地是酵母细胞。
酵母细胞优选地是选自以下群组的属的一员：酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属或耶氏酵母属。
酵母细胞更优选地是选自以下群组的物种的一员：酿酒酵母、布得利酵母(S.bulderi)、巴奈特酵母(S.barnetti)、少孢酵母(S.exiguus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、糖化酵母(S.diastaticus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、多型汉逊酵母(H.polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)，如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母或解脂耶氏酵母。
在一优选实施例中，宿主细胞属于物种酿酒酵母。
当编码本发明的多肽(优选地Gal2变异体)的核酸分子/序列在宿主细胞(优选地酵母细胞)中表达时，宿主细胞被赋予吸收D-木糖和/或L-阿拉伯糖的能力，D-木糖和/或L-阿拉伯糖接着可以被进一步代谢。由此，细胞能够在作为碳源的D-木糖和/或L-阿拉伯糖上生长。
优选地，宿主细胞(优选地酵母细胞)与不含有根据本发明的核酸分子的细胞相比对D-木糖和/或L-阿拉伯糖的吸收率增加。
在一优选实施例中，本发明的宿主细胞(优选地酵母细胞)另外含有
-编码木糖代谢途径的蛋白质(优选地木糖异构酶和木酮糖激酶)的核酸分子，
和/或
-编码阿拉伯糖代谢途径的蛋白质(优选地阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶、核酮糖-5-P 4-差向异构酶)的核酸分子。
这类宿主细胞优选地具有
-增加的D-木糖和/或L-阿拉伯糖利用率
和/或
-与不含有根据本发明的核酸分子的细胞相比，在D-木糖和/或L-阿拉伯糖下较快的生长速率。
举例来说，本发明的宿主细胞(优选地酵母细胞)可以另外含有编码阿拉伯糖代谢途径的蛋白质(具体来说阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶、核酮糖-5-P 4-差向异构酶)的核酸分子。
优选的是细菌阿拉伯糖代谢途径的蛋白质，具体来说大肠杆菌araB L-核酮糖激酶、大肠杆菌araD L-核酮糖-5-P 4-差向异构酶和地衣芽孢杆菌araA L-阿拉伯糖-异构酶。
在一优选实施例中，根据本发明的宿主细胞(优选地酵母细胞)通过基因araA(L-阿拉伯糖-异构酶)、araB(L-核酮糖激酶)和araD(L-核酮糖-5-P-4-差向异构酶)的引入和表达来修饰，并且另外如例如本发明人在EP 1 499 708 B1中所述过度表达TAL1(转醛醇酶)基因，并且除此以外还含有至少一种根据本发明的核酸分子。
视酵母细胞的既定用途而定，所述酵母细胞可以含有、表达或过度表达编码其它蛋白质(如转醛醇酶TAL1和/或TAL2、转酮醇酶TKL1和/或TKL2、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶RPE1、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶RKI1)的其它核酸序列或来自其它生物体的编码相同酶活性的相应序列。
举例来说，本发明的宿主细胞(优选地酵母细胞)可以另外过度表达编码木糖代谢途径的蛋白质、具体来说木糖异构酶和木酮糖激酶的核酸分子。
优选的是植物发酵梭菌或瘤胃壶菌属(Piromyces)xylA木糖异构酶和酿酒酵母XKS1木酮糖激酶。
在一优选实施例中，根据本发明的宿主细胞(优选地酵母细胞)通过基因xylA(木糖异构酶)、XKS1(木酮糖激酶)的引入和/或过度表达来修饰并且过度表达TAL1(转醛醇酶)基因。
视酵母细胞的既定用途而定，所述酵母细胞可以含有、表达或过度表达编码其它蛋白质(如转醛醇酶TAL1和/或TAL2、转酮醇酶TKL1和/或TKL2、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶RPE1、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶RKI1)的其它核酸序列或来自其它生物体的编码相同酶活性的相应序列。
用于生产生物乙醇的方法和用途
如上文所论述，本发明提供一种用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法。
所述方法包含根据本发明的核酸分子优选地在根据本发明的宿主细胞中的表达。
如上文所论述，本发明提供以下各项的用途：
-根据本发明的多肽，
-根据本发明的核酸分子，或
-根据本发明的宿主细胞，
其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生产，
和/或用于含有戊糖(优选地D-木糖和/或L-阿拉伯糖)的生物材料的重组发酵。
如本文所用，术语“生物基化合物”或“其它生物基化合物”是指由生物材料和原料(生物质)、特别是通过使用微生物获得的化合物和物质。
(其它)生物基化合物可以是选自(但不限于)以下的化合物：
乳酸、乙酸、丁二酸、苹果酸或其它有机酸，
1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、其它醇，
氨基酸、烷烃、萜烯、类异戊二烯、溶剂、医药化合物、维生素。
优选实施例的进一步描述
本发明人已鉴别出Gal2变异体，其展现
-活体外和/或活体内戊糖转运功能的活性增加和/或
-对戊糖的亲和力增加
与野生型或无相应氨基酸取代的Gal2多肽相比。
因此，本发明人已鉴别出Gal2变异体，其因而赋予宿主细胞(优选地酵母细胞)吸收D-木糖和/或D-阿拉伯糖的能力和优选地，增加对戊糖(优选地D-木糖和/或D-阿拉伯糖)的吸收的能力。
为此，还对实例和图式进行参考。
-L-阿拉伯糖和D-木糖的吸收
为使得戊糖(具体来说，D-木糖和/或L-阿拉伯糖)可以被酿酒酵母代谢，它们必须首先被细胞吸收。
针对戊糖D-木糖测试的所有己糖转运体对己糖的亲和力比对D-木糖高得多。对于L-阿拉伯糖，呈现类似情况。在迄今构建的可以利用戊糖(D-木糖或L-阿拉伯糖)的所有菌株中，报告生长相对缓慢。特别是，为此提出缓慢和不良的戊糖吸收是原因(Becker和Boles,2003；Richard等人,2002)。在由D-葡萄糖和D-木糖或D-葡萄糖和L-阿拉伯糖组成的糖类混合物的发酵中，所述糖不是同时被转化。由于转运体对D-葡萄糖的高亲和力，所以首先代谢D-葡萄糖。发生所谓的双峰转换(diauxic shift)。只有在D-葡萄糖被耗尽之后才立刻转化戊糖，生长期明显较慢(Kuyper等人,2005a；Kuyper等人,2005b)。给出不存在特异性针对戊糖的转运体作为解释。
-Gal2
己糖半乳糖是通过高亲和力转运体Gal2(Km＝1至5mM)转运，所述转运体同样亲和葡萄糖(Km＝1.5至1.9)(参见例如Reifenberger等人,1997)。与半乳糖利用所需的其它结构基因(GAL1，半乳糖激酶；GAL10，变旋酶/UDP-葡萄糖-4-差向异构酶；GAL7，半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶)一样，其表达在葡萄糖存在下受到抑制并且还需要由半乳糖诱导。Gal2也是分解代谢物钝化的目标(Horak和Wolf,1997)。Gal2是仅数种可以转运L-阿拉伯糖的转运体之一。与大部分其它己糖转运体一样，其可以转运D-木糖。然而，其对L-阿拉伯糖和D-木糖的亲和力相当低。因此，在低D-木糖或L-阿拉伯糖浓度下，吸收活性极低。
Farwick等人(2014)研发出允许在D-葡萄糖存在下吸收D-木糖的突变型转运体。这些突变型转运体中的一些在与半乳糖转运体Gal2的N376对应的位置处具有氨基酸更换。然而，虽然它们证明具有针对葡萄糖的抗性，但是其中大部分对木糖的吸收率降低。
本发明的多肽展现对木糖的吸收率和/或亲和力增加，特别是与使其抵抗受葡萄糖抑制的突变组合。
已经使用各种突变诱发方法以及在非常特定的条件下使用具有各种不同修饰的经工程改造的酵母菌株的进化工程改造来发现经改善的源于Gal2的戊糖转运体。这些转运体必须在精密的筛选系统中使用生长测试和糖吸收分析进行测试。最后，必须对突变型转运体进行测序并且必须从各种突变阐明最后引起特性改善的那些。
D-木糖占富含木聚糖的木质纤维素生物质(如硬木和秸秆)中总糖的多达35％(参见Demeke等人2013)。具有大量阿拉伯糖的生物质(数据来源：美国能源部http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/searchl.cgi)：
Figure BDA0001275396720000101
Figure BDA0001275396720000111
根据本发明的Gal2变异体也对其利用率具有极大重要性。
在酵母酿酒酵母中使用功能性并且同时特异性戊糖转运体的可能性首先是由木质纤维水解产物生产生物乙醇和生产用于其它化学合成的高级前体产物，特别是当戊糖浓度低并且同时存在葡萄糖时。
以下清单来源于研究“来自生物质的高附加值化学物质”(参见wwwl.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf)。此处，30种化学物质被分类为特别有价值的，其可以由生物质产生。
C原子数 前30种候选物
1 氢气、一氧化碳
2
3 丙三醇、3-羟基丙酸、乳酸、丙二酸、丙酸、丝氨酸
4 乙偶姻、天冬氨酸、反丁烯二酸、3-羟基丁内酯、苹果酸、丁二酸、苏氨酸
5 阿拉伯糖醇、糠醛、谷氨酸、伊康酸、乙酰丙酸、脯氨酸、木糖醇、木糖酸
6 乌头酸、柠檬酸盐、2,5-呋喃二甲酸、葡萄糖二酸、赖氨酸、左旋葡聚糖、山梨醇
一旦这些化学物质由木质纤维素通过生物转化(例如使用酵母发酵)产生，那么重要的是具有针对半纤维素糖阿拉伯糖和木糖的特异性、高度活性转运体。
以下实例和图式说明本发明，但不将其局限于此。
附图说明
图1：Gal2_T354A在EBY.VW4000中的生长测试
转化体在具有20g/l麦芽糖的5ml SCM-ura中在30°下培育，用水洗涤并且将OD600调节至1。因此其随后连续稀释。将5μl滴在相应培养基上并且将其在30°下培育三天。采用具有20g/l麦芽糖的SCM-ura稀释液作为对照物。将具有突变型转运体的细胞滴在具有0.2％和2％葡萄糖的SCD-ura以及具有0.2％和2％D-半乳糖的SCG-ura上以测试其功能。此外，使用CEN.PK2的野生型和Ethanol Red以及Gal2_ep3.1进行比较。具有突变T354A的半乳糖转运体来自HDY.GUF10。
图2：Gal2_T354A在AFY10中的生长测试
转化体在具有2％乙醇的5ml SCE-ura-leu中在30°下培育，用水洗涤并且将OD600调节至1。因此其随后连续稀释。将5μl滴在相应培养基上并且将其在30°下培育五天。采用具有2％乙醇的SCE-ura-leu稀释液作为对照物。将具有突变型转运体的细胞滴在具有0.2％和2％D-木糖的SCX-ura-leu以及具有1％D-木糖与4％D-葡萄糖的SC-ura-leu和具有0.2％D-木糖与2％D-葡萄糖的SC-ura-leu上以测试其功能。此外，使用CEN.PK2的野生型和Ethanol Red以及Gal2_ep3.1进行比较。具有突变T354A的半乳糖转运体来自HDY.GUF10。
图3：Gal2T354A与V71I和L280R组合在EBY.VW4000中在30°下四天后的液滴测试。将数种稀释液从左至右滴下(未经稀释、1:10、1:100、1:1000)。
图4：Gal2T354A与V71I和L280R组合在AFY10中在30°下六天后的液滴测试。将数种稀释液从左至右滴下(未经稀释、1:10、1:100、1:1000)。
实例
方法
菌株和培养基
-细菌
大肠杆菌SURE(Stratagene)
完全培养基LB 1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl，pH 7.5(参见Sambrook和Russell,2001)
为了对编码抗生素抗性的质粒进行选择，在高压灭菌之后将40μg/ml氨苄西林(ampicillin)添加至培养基中。固体培养基另外含有1.9％琼脂。在37℃下进行培养。
-酵母
CEN.PK2-1C
MATa leu2-3,112ura3-52trp1-289his3-Δ1MAL2-8C SUC2(EUROSCARF,Frankfurt)
菌株EBY.VW4000
EBY.VW4000(基因型：MATa leu2-3,112ura3-52trp1-289his3-Δ1MAL2-8c SUC2Δhxt1-17Δgal2stlΔ::loxP agt1Δ::loxP mph2Δ::loxP mph3Δ::loxP)(Wieczorke等人,1999)
菌株Ethanol Red
可以从法国里尔的乐斯福(Lesaffre,Lille,France)购得。描述于Demeke等人(2013)中。
菌株HDY.GUF10
消耗木糖和阿拉伯糖的工业酿酒酵母菌株来源于Ethanol Red(Dietz 2013)。
菌株AFY10
EBY.VW4000 glk1Δ::loxP hxk1Δ::loxP hxk2Δ::loxP ylr446wΔ::loxPpyk2Δ::pPGK1-opt.XKS1-tPGK1 pTPI1-TAL1-tTAL1 pTDH3-TKL1-tTKL1 pPFK1-RPE1-tRPE1 pFBA-RKI1-tRKI1 loxP(Farwick等人,2014)。
菌株AFY10X
AFY10+YEp-kanR_optXI(Farwick等人,2014)。
-合成的完全选择性培养基SC
0.67％无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础、0.5％硫酸铵、20mM二氢磷酸钾(pH6.3)、无所用质粒的营养缺陷型标记的相应氨基酸的氨基酸/核碱基溶液、各自指定浓度的碳源
合成的完全培养基中氨基酸和核碱基的浓度(Zimmermann,1975)：腺嘌呤(0.08mM)、精氨酸(0.22mM)、组氨酸(0.25mM)、异亮氨酸(0.44mM)、亮氨酸(0.44mM)、赖氨酸(0.35mM)、甲硫氨酸(0.26mM)、苯丙氨酸(0.29mM)、苏氨酸(0.48mM)、色氨酸(0.19mM)、酪氨酸(0.34mM)、尿嘧啶(0.44mM)和缬氨酸(0.49mM)。如所指定，使用L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、乙醇和麦芽糖作为碳源。
固体完全和选择性培养基另外含有1.9％琼脂。在30℃下进行酵母细胞的培养。
质粒
质粒 参考文献
p426H7 Becker和Boles,2003
YEp 181_pHXT7-optXI_Clos Subtil和Boles,2012
p426H7_GAL2_WT
p426H7_GAL2_ep3.1
p426H7-GAL2_EtOHred
p426H7-GAL2_GUF10
p426H7_GAL2-T354A
p426H7_GAL2-V71I
DNA的制备
-从大肠杆菌分离质粒DNA
使用GeneJETTM Plasmid Miniprep试剂盒(Fisher Scientific)根据制造商说明书进行对来自大肠杆菌培养物的质粒DNA的小规模制备。使用QUIAGEN Plasmid Maxi试剂盒进行大规模制备。
-从酿酒酵母分离质粒和基因组DNA
为了从酵母细胞分离基因组和质粒DNA，通过离心(1min，2000×g)收集5-10ml稳定期培养物并且在1ml无菌ddH2O中洗涤一次。将细胞集结粒通过涡旋再悬浮于400μl YP-缓冲液1中并且随后通过添加400μl YP-缓冲液2、1/3至2/3体积玻璃珠(Φ0.25-0.5mm)并在VXR basic Vibrax(IKA)上在2000转/分下振荡8分钟而裂解。通过离心(30sec，16000×g)集结细胞碎片并且将650μl清液层转移至新的艾本德管(eppendorf tube)。添加325μl冷的YP-缓冲液3，使样品涡旋并且随后在冰上培育10分钟以沉淀蛋白质和其它污染物。将样品离心(10-15min，4℃，16000×g)，将700μl清液层转移至新的艾本德管并且添加700μl异丙醇。在剧烈混合之后，在室温下培育样品10分钟以使得DNA沉淀，接着通过离心(≥30min，RT，16000×g)集结。将DNA离心块用500μl冷(-20℃)的70％(v/v)乙醇洗涤两次，在室温和16000×g下进行5分钟离心步骤，接着在室温下干燥10分钟并且视DNA离心块的大小而定，溶解于15-30μl无菌ddH2O中。
-测定DNA浓度
DNA浓度是通过光谱光度法在240-300nm的波长范围中加以测量。如果通过商E260nm/E280nm确定DNA的纯度是1.8，那么吸光度E260nm＝1.0相当于DNA浓度是50μgdsDNA/ml(Sambrook和Russell,2001)。
-PCR产物的DNA纯化
使用Qiagen公司的“QIAquick PCR纯化试剂盒”根据制造商的信息进行PCR产物的纯化。
使用限制性核酸内切酶消化DNA(限制性消化)
为了进行DNA的位点特异性裂解，在所提供的缓冲液下并且根据制造商说明书使用来自New England Biolabs(NEB)或Fermentas的限制性核酸内切酶。通常，每微克DNA使用1-3个单位进行反应，培育2-12小时。这个方法用于制备用于重组克隆的载体，确定正确组装的质粒或特异性降解来自混合物的特定质粒。
聚合酶链反应(PCR)
将不同聚合酶用于此研究中的不同PCR实验。为了确认基因组基因缺失或整合，使用Crimson Taq聚合酶(NEB)。为了扩增ORF(用于测序)、用于重组克隆的基因或扩增用于基因组基因缺失或整合的整合盒，使用Phusion或Q5聚合酶(NEB)。PCR反应物的组成和相应PCR程序呈现在下表中。使用NEB主页上的Tm计算器工具计算出引物对的退火温度。在Mastercycler gradient(Eppendorf)、Piko热循环仪(Finnzymes)或Progene PCR循环仪(Techne)中进行所有PCR。
使用Crimson Taq聚合酶的PCR反应物的组成
Figure BDA0001275396720000151
用于使用Crimson Taq聚合酶的反应物的PCR程序
Figure BDA0001275396720000152
使用Phusion或Q5聚合酶的PCR反应物的组成
Figure BDA0001275396720000153
用于使用Phusion或Q5聚合酶的反应物的PCR程序
Figure BDA0001275396720000154
融合PCR
融合PCR用于构建HXT7-N370F的ORF以便重组克隆。在第一步中，使用p426H7_HXT7作为模板在两个单独的Q5PCR反应中扩增HXT7的两个重叠片段。使PCR反应物在1.5％琼脂糖胶凝中分离并且从相应凝胶块纯化正确的片段。将等摩尔量的两种片段(最小20ng)用于无引物的Q5PCR反应中。此PCR反应运行6个循环，随后添加1μl正向和反向引物(来自10μM储备液)。反应接着再运行20个循环。
易错PCR(epPCR)
为了生成GAL2的随机诱变ORF，使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(AgilentTechnologies)。已遵循制造商的方案。已运行PCR反应33个循环。已改变模板DNA的量以便达成不同突变率(参见下表)。epPCR产物分析揭露已符合所需扩增规格。将PCR片段纯化并且用作Phusion PCR反应的模板以延伸具有同源突出的片段末端。
不同epPCR中所用模板DNA的量和
Figure BDA0001275396720000161
用于DNA或RNA分离的琼脂糖凝胶电泳
使用具有浓度范围介于0.7至2.0％(w/v)的琼脂糖的琼脂糖凝胶通过大小分离DNA或RNA样品中的片段(Sambrook和Russell,2001)。将1×TAE-缓冲液用于凝胶制备并且用作运行缓冲液。使用GeneRuler 1 kb DNA梯(Fisher Scientific)确定DNA片段的大小。将DNA样品与1/5体积的6×DNA负载染料混合，随后负载于凝胶上。将RNA样品与相同体积的2×RNA负载染料混合，在96℃下培育10分钟并且在负载之前储存于冰上。视电流、凝胶百分比和预期片段大小而定，使凝胶在至多6-10V/cm下运行30至45分钟。在凝胶溴化乙锭浴中培育之后，通过UV光(254nm)观测DNA和RNA。
DNA纯化和从琼脂糖凝胶提取DNA
为了纯化DNA(例如从PCR反应物或在限制性消化之后)和从琼脂糖凝胶提取DNA，根据制造商的说明书使用
Figure BDA0001275396720000162
Extract II试剂盒(Macherey-Nagel)。
DNA测序
由GATC生物技术股份公司(德国康斯坦茨)进行DNA样品的测序。样品含有30-100ng/μl(质粒)或10-50ng/μl(PCR产物)DNA。将合适的引物(10μM)与DNA样品一起递送至GATC生物技术股份公司。
大肠杆菌的转化
根据Dower(Dower等人,1988)和Wirth(Wirth,1989)的方案使用Bio-Rad GenePulser通过电穿孔转化大肠杆菌细胞。将DNA(来自大肠杆菌或酵母DNA制备物)添加至冷冻的感受态大肠杆菌细胞中，培育样品并且在冰上解冻10分钟。接着将细胞悬浮液转移至电穿孔小池并且直接脉冲。将Bio-Rad Gene Pulser设定成电压2.5kV/cm、电阻200Ω和电容25μF。紧接在脉冲之后，将细胞与1ml预温热的SOC培养基混合并且转移至艾本德管。细胞在恒温混匀仪(艾本德)中在37℃下以600-800rpm培育45分钟，随后接种于含有卡那霉素(kanamycin)或氨苄西林的选择性LB琼脂板上。在细胞用编码HXT7的质粒转化的情况下，培育是在室温下在无振荡的情况下进行4小时或在20-25℃下在振荡下进行2小时。
酿酒酵母的转化
为了转化酿酒酵母，使用偏差很小的Gietz等人(Gietz和Schiestl,2007a,Gietz和Schiestl,2007b)的LiAc/SS载体DNA/PEG方法的两种不同方案。液体培养物在合适的培养基中生长至0.6-1.0的OD。培养物的离心和用于洗涤步骤的离心被缩短至在3000×g下2分钟。单股载体DNA是以10mg/ml溶液形式使用，使得转化混合物中DNA的体积分别是54μl或74μl。热休克的持续时间是35分钟。在转化之后，将全细胞悬浮液直接接种于选择培养基上，或在转化有显性选择标记的情况下，转移至5ml适当液体培养基进行再生。在再生细胞集结之后，使其再悬浮于50-100μl培养基中并且接种出。
用于转化的DNA量是单个质粒大约500ng、用于共转化的多个质粒各≥1000ng和整合DNA盒(例如用于基因缺失)≥2000ng和更多。
基因的密码子优化
一些基因的ORF已经密码子优化。如通过糖酵解基因的优选密码子所确定，密码子已被适配成酿酒酵母的密码子使用。描述于Wiedemann等人(Wiedemann和Boles,2008)中。
通过同源重组(重组克隆)构建质粒
通过合适DNA片段(载体主链和插入物)在酿酒酵母中的同源重组来活体内构建质粒。出于此目的，相应载体在插入位点处通过限制性消化而经线性化。任选地，通过琼脂糖凝胶电泳和后续凝胶提取纯化所得载体主链。插入物被设计成侧翼序列(>30bp)与插入目标区同源或在具有多个插入片段的情况下彼此同源。插入物是通过PCR扩增并且可能通过使用具有对应5'端(同源突出端)的引物而具备同源序列。酿酒酵母用DNA片段转化并且将转化体接种在选择性培养基上。挑取菌落以接种选择性液体培养基。将DNA从这些培养物分离并且用于大肠杆菌转化以便进行质粒分离和增殖。含有旋转酶抑制剂基因ccdB的质粒对大部分大肠杆菌菌株具有毒性，因此将ccdB抗性菌株大肠杆菌DB3.1用于这些质粒。将质粒从大肠杆菌单菌落培养物分离并且通过分析型限制性消化和DNA测序加以验证。为正确的克隆株建立丙三醇储备培养物。
通过同源重组的基因组基因缺失或插入
为了使酿酒酵母基因组中的基因缺失，将标记盒通过同源重组整合到相应基因中(Carter和Delneri,2010，Güldener等人,1996，Sauer,1987)。标记盒是使用5'端与目标基因同源的引物通过PCR使得能够定点插入来加以扩增。所述盒由显性标记基因(kanMX4/G418、hphNT1/潮霉素B、natNT2/clonNAT)构成，侧接以启动子(pTEF)和终止子(分别是tTEF、tCYC1和tADH1)以及loxP位点。这些位点允许通过cre重组酶切除基因组整合的标记盒，所述cre重组酶清除标记以进行另一轮基因缺失。在酿酒酵母用缺失盒转化之后，将细胞接种在选择性培养基上并且将复制物接种在相同培养基上一次。再次将单个菌落划线以获得单个克隆株，接着将其挑取并且在选择性培养基中生长。从这些培养物分离DNA并且使用不同引物组合通过PCR确认正确的整合。如下表中所见称呼用于确认的引物。为正确的克隆株建立丙三醇储备培养物。
用于通过PCR确认基因组整合的引物的命名
Figure BDA0001275396720000181
为了标记的再循环，用在半乳糖诱导型GAL1启动子(pSH47或pNatCre)控制下的编码cre重组酶的质粒转化细胞。在简单诱导重组酶之后，通过复制物接种选择丧失显性标记的细胞。由于重组酶的完全表达在hxt0菌株中是致死的，所以对这些菌株使用重组酶在非诱导条件下的基本表达。再次通过PCR控制盒的去除(参见上文)。据此进行基因盒的整合以便基因的过度表达。在这些盒内，仅显性标记侧接loxP位点并且被切除，所述盒的其余部分保留在基因组中。
引物清单
Figure BDA0001275396720000191
用于细胞培养的方法和发酵实验
细胞密度的分光光度测定
通过在600nm下测量光密度(OD600)而以分光光度法定量液体培养物中的细胞浓度。将细胞培养物或其稀释液的样品置于聚苯乙烯(PS)比色杯中并且在Ultrospec2100pro分光光度计(GE Healthcare,USA)中在600nm下加以分析。
丙三醇储备培养物
为了长时间特定菌株和含有质粒的大肠杆菌，制备丙三醇储备培养物。出于此目的，将酿酒酵母的稳态培养物或大肠杆菌的生长培养物与50％(v/v)丙三醇1:1混合并且储存在-80℃下。
半固体琼脂培养
选择半固体琼脂培养方法以扩大质粒cDNA文库(在大肠杆菌中)。通过此方法可以使在液体培养物生长期间可能存在的代表性偏差减到最小。在30℃下进行培育有助于使不稳定的克隆株稳定(Hanahan等人,1991，Sassone-Corsi,1991)。可以在生命技术网站找到方案。简单来说，将2×浓缩的LB培养基在搅拌时与3g/l SeaPrep琼脂糖混合，高压灭菌并且冷却到37℃。将抗生素和4·105至6·105(每450ml培养基)添加至培养基中并且混合2分钟。接着将瓶子在冰浴中在0℃下培育1小时并且随后平缓地转移至30℃以培育(无干扰)40-45小时。在生长之后，可以通过在10400×g下离心而从半固体琼脂集结细胞。
连续稀释液斑点分析(液滴测试)
为了容易比较不同酿酒酵母菌株在各种生长条件下的生长，进行连续稀释液斑点分析。细胞在适当培养基中以液体培养形式生长至指数期，通过离心(2000×g，2min)收集，用无菌水洗涤两次并且随后再悬浮于无碳源的选择性培养基中使得OD600达到1.0。由此细胞悬浮液制备在选择性培养基中的十倍连续稀释液(四个稀释步骤)。将6μl各细胞悬浮液点样在培养基板上以待检查并且允许干燥。各板在30℃下培育。
好氧分批发酵
在不同大小(培养物体积的5-10倍体积)的振荡烧瓶中在旋转振荡器(150-180rpm)上通常在30℃下进行好氧分批发酵。随着连续的好氧分批发酵来进行进化工程改造(详情参见下文)
厌氧分批发酵
对于厌氧分批发酵，用橡皮塞和发酵水塞密封振荡烧瓶。烧瓶的体积匹配100ml的培养物体积。培养物在30℃下在磁性搅拌器上以120rpm连续搅拌。在此研究中，在OD600＝10下进行发酵。出于此目的，收集生长细胞并且将在50ml无碳源的发酵培养基中的OD600设定成20。为了开始实验，将此细胞悬浮液添加至含有50ml补充有2×浓缩碳源的发酵培养基的制备烧瓶中。经由插入的无菌针头和注射器获取用于测定细胞浓度和用于HPLC分析的样品。
在发酵罐中的厌氧发酵
在具有800ml工作体积并且装备有温度、pH值、O2和CO2传感器的InforsMultifors发酵罐(2×1.4l)中进行一些使用工业酿酒酵母菌株的发酵。用530ml浓缩发酵培养基(无碳源和补充剂)填充发酵罐并且随后高压灭菌。在发酵开始之前，将250ml浓缩碳源溶液、100μl/l消泡剂204和其它补充剂(维生素、微量元素和抗生素)添加至浓缩培养基中。用氮气净化发酵罐以便在最初产生厌氧条件。在实验期间施加氮气进料至顶部空间(0.4l/min)以维持厌氧条件。冷却出气口以使蒸汽冷凝回流并且随后通过管道穿过气体洗涤瓶。培养物在300rpm下搅拌，温度保持在35℃并且通过自动化添加2M KOH或2M H2PO4使pH值保持在5.0。当达到所有设定参数并且恒定时，添加细胞接种物(在20ml发酵培养基中)。在发酵期间获取样品用于细胞干重测定和HPLC分析。使用Iris 5.2软件(Infors)操作发酵罐并且监测实验。
测定细胞干质量
为了测定细胞干质量，将5-10ml液体培养物经由预先洗涤过并干燥(如下所述)的滤膜(硝化纤维素，孔径0.45μm)真空过滤并且随后用ddH2O洗涤两次。滤膜在微波烘箱中在120-150W下干燥15分钟，静置冷却并且在干燥器中再另外干燥15分钟。滤膜在过滤之前和在干燥之后称重以测量细胞干重。已根据Ask等人(Ask等人,2013)调适所述方法。
进化工程改造
以连续的好氧分批发酵形式进行进化工程改造。转化体首先接种在选择性SCE2中以获得生物质并且随后在具有20g/l木糖的选择性SC和SM培养基中生长以使菌株适应于木糖利用。在这些初始培养之后，将细胞切换到具有10g/l木糖的培养基中并且增加葡萄糖浓度以施加进化压力。当其达到后指数期至早稳定期时，细胞通过离心(2000×g，2分钟)收集并且转移至新鲜培养基以使得OD600达到0.2。每次增加葡萄糖浓度，可以看见适应性或生长未受当前葡萄糖浓度负面影响。向所有培养基(液体和固体)中添加G418以选择AFY10菌株背景。液体培养基另外含有0.5g/l 2-脱氧-D-葡萄糖(2-DOG)以抑制hxk0表型的抑制突变体的形成。hxk0菌株，而非野生型菌株，对2-DOG具有抗性(Subtil和Boles,2012)。已通过将培养物样品在葡萄糖培养基板上划线并且还通过HPLC分析证实不存在葡萄糖消耗。
通过HPLC的代谢物分析
为了分析代谢物，将无细胞样品(5-10分钟，4℃，16000×g)与1/9体积的50％(w/v)5-磺基水杨酸混合并且离心(5-10分钟，4℃，16000×g)。在装备有HyperREZ XPCarbohydrate H+8μm管柱和折射率检测器(Thermo Shodex RI-101)的Thermo ScientificUHPLC+系统(Dionex UltiMate 3000)中分析清液层。在65℃的管柱温度下使用5mM硫酸作为流动相以0.6ml/min的流动速率进行分离。使用Chromeleon 6.80软件控制系统并且分析数据。分析五种标准品(0.01-3％(w/v)浓度的D-葡萄糖、D-木糖、木糖醇、乙酸盐、丙三醇和乙醇的混合物)以进行不同化合物的定量。
糖吸收分析
如Bisson等人(Bisson和Fraenkel,1983)所述，根据Walsh等人(Walsh等人,1994)的修改来进行糖吸收分析。
菌株EBY.VW4000的转化体在选择性YEPE中生长以使得OD达到1.1-1.6，通过离心收集并且冰冷的吸收缓冲液中洗涤两次(RT，3分钟，3000×g)。细胞自此保持在冰上。将细胞集结粒再悬浮于冰冷的吸收缓冲液中达到60mgww/ml的浓度并且等分成110μl。将一个细胞悬浮液等分试样和一种糖溶液在水浴中在30℃下培育4-5分钟。将100μl细胞悬浮液吸移到糖溶液(50μl)中，通过吸液简单混合并且培育5(D-[U-14C]-葡萄糖)或20秒(D-[l-14C]-木糖)。通过将100μl混合物转移至10ml冰冷的淬灭缓冲液中来停止吸收反应，立刻经由Durapore膜滤器(0.22μm孔径，Millipore)过滤。将滤膜用10ml冰冷的淬灭缓冲液洗涤两次，转移至含有4ml闪烁混合液(Rotiszint eco plus,Roth)的闪烁瓶中并且充分振荡。除此过滤样品(cpm过滤)之外，将10μl各反应物直接转移至具有4ml闪烁混合液的闪烁瓶中以测定反应物中的总计数(cpm总共)。为了测定非特异性结合于细胞表面或滤膜的糖的值(cpm空白)，将33,3μl糖溶液和66,6μl细胞悬浮液的数种样品混合在10ml冰冷的淬灭缓冲液中并且如上所述处理。在Wallac 1409液体闪烁法计数器中分析所有小瓶的放射性。
使用2M、500mM或20mM葡萄糖或木糖(在H2O中)的储备溶液制备用于分析的糖溶液(吸收反应中所需浓度的三倍(S，底物浓度)，50μl等分试样)。在0.2、1、5、25和100mM葡萄糖和1、5、25、66、100、200和500mM木糖的糖浓度下测量吸收。在25、66和100mM木糖以及额外25和100mM未经标记的葡萄糖下测量葡萄糖对木糖吸收的抑制。糖溶液含有0.135至0.608μCiD-[U-14C]-葡萄糖(290-300mCi/mmol)或D-[l-14C]-木糖(55mCi/mmol)(AmericanRadiolabeled Chemicals Inc.,St.Louis,MO,USA)。
将吸收分析的数据用于以下计算：
在培育时间(t，秒)内在特定糖浓度(S，mM)下吸收的糖量(A糖，nmol)：
A糖＝((cpm样品-cpm空白)/(cpm总共·10))·S·100μl
每毫克细胞(m，mgww)计算所得的转运速度(nmol·min-1·mgww -1)：
V＝(A糖·60s)/(t·m)
使用三个非依赖性测量值在Prism 5(GraphPad Software,Inc.)中通过非线性回归分析和整体曲线拟合进行Km(米氏常数)、Vmax(最大初始吸收速度)和Ki(竞争性抑制的抑制常数)的计算。
生物信息学方法
从酵母属基因组数据库(SGD，(Cherry等人,2012))获得DNA序列。使用PRALINE多序列比对服务器((Simossis和Heringa,2005))在标准设定加上PHOBIUS跨膜结构预测下进行转运蛋白的序列比对(
Figure BDA0001275396720000221
等人,2004)。系统发生树是使用ClustalW2系统发生(Larkin等人,2007)由PRALINE比对计算所得并且使用Phylodendron软件(http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/java/apps/trees/)目测。蛋白质序列之间的相似性和一致性是使用SIAS(http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html)由PRALINE比对计算所得。使用ALINE软件(Bond和Schuttelkopf,2009)创建序列比对图。
实例1T354A
1.1Gal2_T354A的研究
Ethanol Red是一种工业菌株，它是用于木质纤维水解产物发酵的有前景的候选物。可以将编码木糖和阿拉伯糖代谢途径的酶的基因整合到基因组中，从而产生菌株HDY.GUF5(Demeke等人,2013)。HDY.GUF5针对木糖进一步进化并且通过基因工程进行工程改造，最后产生菌株HDY.GUF9(Dietz 2013)。HDY.GUF9通过针对阿拉伯糖的进化工程改造而进一步进化，产生菌株HDY.GUF10。此菌株还具有关于木糖的经改善的生长行为。木糖消耗率提高约80％，阿拉伯糖消耗率提高约25％。使用放射性糖吸收分析测定木糖吸收率揭露，HDY.GUF10的木糖吸收率比HDY.GUF9高35％。由于Gal2是酿酒酵母中唯一可以转运大量木糖和阿拉伯糖的转运体，所以从两种菌株分离GAL2基因并且测序。与Gal2_HDY.GUF9相比，在Gal2_HDY.GUF10中发现一个氨基酸取代，它是T354A，可能位于细胞外侧跨膜螺旋7的转运通道内。此位置可能发挥改变转运体构象的作用。将所需序列从HDY.GUF10的染色体DNA扩增并且克隆到p426中以便研究经修饰的Gal2p。使用Ethanol Red的Gal2p作为对照物。将所接收的载体转化到筛选菌株中以测试在数种培养基上的生长。
1.2Gal2_T354A的功能测试
首先，使用含载体的VW4000在葡萄糖和麦芽糖培养基上进行生长测试。将野生型CEN.PK2的半乳糖转运体以及Gal2_ep3.1用作对照物并且用作比较物。工业菌株EthanolRed的Gal2p野生型显示类似CEN.PK2野生型的相同生长，正如所预期。在半乳糖上Gal2_GUF10的生长类似两种野生型的生长，而在葡萄糖上的生长看起来类似易错突变体的生长(图1)。
此外，这也使用AFY10来进行，以便研究转化体的木糖特异性和葡萄糖亲和力。野生型Gal2_EtOH Red不能在低木糖浓度(如0.2％)上生长。然而，在此培养基上观察到Gal2_GUF10的生长。尽管如此，Gal2_GUF10在2％木糖上的生长仍不如Gal2_ep3.1。因此，Gal2_GUF10似乎具有较高木糖亲和力。在具有额外葡萄糖的培养基上，仅易错突变体显示生长(图2)。
实例2T354A/V71I
2.1T354A与其它突变组合的作用
在来源于菌株HDY.GUF9并在阿拉伯糖上进化的菌株Ethanol Red HDY.GUF10中发现Gal2的氨基酸更换T354A。这表明Gal2对阿拉伯糖的转运特性得到改善。还显示HDY.GUF10的Gal2中的T354A突变可以恢复在低木糖浓度的生长。Ethanol Red Gal2和Gal2_HDYGUF9的序列中的两个氨基酸与菌株CEN.PK的Gal2不同(L280R和V71I)。为了测定这两个差异的作用，用CEN.PK的Gal2制造质粒表达构建体，所述构建体具有仅V71I和L280R或与T354A的组合。为了测定其特性，在构建体转化之后用筛选菌株EBY.VW4000和AFY10进行生长液滴测试。使用CEN.PK Gal2野生型、p426_空载体和仅含T354A的CEN.PK Gal2作为对照物。
2.2具有Gal2T354A与L280R和V71I的组合的细胞在己糖上的生长
在表达载体中构建以下Gal2的变异体：T354A、T354A+V71I、T354A+L280R、L280R和17IV。将其转化到感受态EBY.VW4000细胞中。接着在不同碳源上进行液滴测试。
可以看出(图3)，仅V71I和L280R对葡萄糖或半乳糖的吸收没有作用。仅T354A强烈削弱在葡萄糖上的生长。V71I和T354A的组合不介导在葡萄糖上的生长。然而，T354A和L280R的组合可以介导在葡萄糖上的生长。然而，生长比Gal2野生型更慢。
2.3具有Gal2T354A与L280R和V71I的组合的细胞在木糖和糖类混合物上的生长
将各种构建体与载体YEp181_pHXT7-optXI_Clos一起转化到AFY10细胞中，并且进行连续稀释液生长液滴测试。
没有变异体可以介导在木糖-葡萄糖混合物板上的生长，表明突变型转运体都受葡萄糖抑制。在高木糖浓度(20g/l)下的生长在各种构建体之间没有很大不同。然而，在低木糖浓度(2g/l)下的生长显示显著差异：L280R介导类似Gal2野生型的生长；L280R和T354A的组合的生长看起来类似仅T354A或空白载体对照物。V71I介导在2g/l木糖上的极慢生长。然而，V71I和T354A的组合介导类似Gal2野生型的生长(图4)，而相比之下，T354A和V71I仅介导在低木糖浓度下的较差生长。这表明Ethanol Red的Gal2中的氨基酸交换V71I是造成低木糖吸收活性的原因，尤其在低木糖浓度下。此缺陷受额外的T354A更换抑制。这解释了GUF-10与GUF-9相比改善的生长行为。由于GUF-10在阿拉伯糖培养基上的进化，可以推断出Ethanol Red的Gal2的阿拉伯糖吸收也通过抑制V71I更换而因T354A突变得以改善。
上述实施方式、权利要求书和/或附图之所公开的特征可以单独地和以其任何组合形式作为用于以多样化形式实现本发明的材料。
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Figure BDA0001275396720000251
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序列表
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<151> 2014-10-22
<160> 7
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 1
Met Ala Val Glu Glu Asn Asn Met Pro Val Val Ser Gln Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ala Gly Glu Asp Val Ile Ser Ser Leu Ser Lys Asp Ser His Leu Ser
20 25 30
Ala Gln Ser Gln Lys Tyr Ser Asn Asp Glu Leu Lys Ala Gly Glu Ser
35 40 45
Gly Pro Glu Gly Ser Gln Ser Val Pro Ile Glu Ile Pro Lys Lys Pro
50 55 60
Met Ser Glu Tyr Val Thr Val Ser Leu Leu Cys Leu Cys Val Ala Phe
65 70 75 80
Gly Gly Phe Met Phe Gly Trp Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val
85 90 95
Val Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe Gly Met Lys His Lys Asp Gly
100 105 110
Thr His Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu Ile Val Ala Ile Phe
115 120 125
Asn Ile Gly Cys Ala Phe Gly Gly Ile Ile Leu Ser Lys Gly Gly Asp
130 135 140
Met Tyr Gly Arg Lys Lys Gly Leu Ser Ile Val Val Ser Val Tyr Ile
145 150 155 160
Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr
165 170 175
Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Ala Val
180 185 190
Leu Cys Pro Met Leu Ile Ser Glu Ile Ala Pro Lys His Leu Arg Gly
195 200 205
Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ala Gly Ile Phe Leu
210 215 220
Gly Tyr Cys Thr Asn Tyr Gly Thr Lys Ser Tyr Ser Asn Ser Val Gln
225 230 235 240
Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala Trp Ser Leu Phe Met Ile
245 250 255
Gly Ala Leu Thr Leu Val Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Cys Glu Val
260 265 270
Asn Lys Val Glu Asp Ala Lys Leu Ser Ile Ala Lys Ser Asn Lys Val
275 280 285
Ser Pro Glu Asp Pro Ala Val Gln Ala Glu Leu Asp Leu Ile Met Ala
290 295 300
Gly Ile Glu Ala Glu Lys Leu Ala Gly Asn Ala Ser Trp Gly Glu Leu
305 310 315 320
Phe Ser Thr Lys Thr Lys Val Phe Gln Arg Leu Leu Met Gly Val Phe
325 330 335
Val Gln Met Phe Gln Gln Leu Thr Gly Asn Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr
340 345 350
Gly Thr Val Ile Phe Lys Ser Val Gly Leu Asp Asp Ser Phe Glu Thr
355 360 365
Ser Ile Val Ile Gly Val Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Phe Ser Leu
370 375 380
Trp Thr Val Glu Asn Leu Gly Arg Arg Lys Cys Leu Leu Leu Gly Ala
385 390 395 400
Ala Thr Met Met Ala Cys Met Val Ile Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr
405 410 415
Arg Leu Tyr Pro His Gly Lys Ser Gln Pro Ser Ser Lys Gly Ala Gly
420 425 430
Asn Cys Met Ile Val Phe Thr Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Tyr Ala Thr
435 440 445
Thr Trp Ala Pro Val Ala Trp Val Ile Thr Ala Glu Ser Phe Pro Leu
450 455 460
Arg Val Lys Ser Lys Cys Met Ala Leu Ala Ser Ala Ser Asn Trp Val
465 470 475 480
Trp Gly Phe Leu Ile Ala Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile
485 490 495
Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met Gly Cys Leu Val Ala Met Phe
500 505 510
Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu
515 520 525
Glu Ile Gln Glu Leu Trp Glu Glu Gly Val Leu Pro Trp Lys Ser Glu
530 535 540
Gly Trp Ile Pro Ser Ser Arg Arg Gly Asn Asn Tyr Asp Leu Glu Asp
545 550 555 560
Leu Gln His Asp Asp Lys Pro Trp Tyr Lys Ala Met Leu Glu
565 570
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
aacacaaaaa caaaaagttt ttttaatttt aatcaaaaaa tggcagttga ggagaacaa 59
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gaatgtaagc gtgacataac taattacatg actcgagtta ttctagcatg gccttgtacc 60
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ttattttttc tactacggtg ccgttatttt caagtcag 38
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gacttgaaaa taacggcacc gtagtagaaa aaataattg 39
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gtctgaatat gttaccattt ccttgctttg tttgtg 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
aaacaaagca aggaaatggt aacatattca gacatg 36

Claims (9)

1.一种多肽，由氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多肽在T354处和V71处进行氨基酸取代得到，其中T354处氨基酸取代为T354A且 V71处氨基酸取代为V71I。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其另外包含载体核酸序列；和/或包含启动子核酸序列和终止子核酸序列；和/或包含其它调控核酸序列；和/或其中所述核酸分子包含dsDNA、ssDNA、PNA、CNA、RNA，或其组合。
4.一种宿主细胞，其含有权利要求2或3中任一权利要求所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
6.根据权利要求4或5所述的宿主细胞，其另外含有编码木糖代谢途径的蛋白质的核酸分子，和/或编码阿拉伯糖代谢途径的蛋白质的核酸分子。
7.一种用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法，其包含权利要求2所述的核酸分子的表达；所述其它生物基化合物是选自1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、乳酸、乙酸、丁二酸、苹果酸或类异戊二烯。
8.根据权利要求7所述的用于生产生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法，其包含所述核酸分子在权利要求4至5中任一项所述的宿主细胞中的表达。
9.一种权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4至5中任一项所述的宿主细胞的用途，其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生产，和/或用于含有戊糖的生物材料的重组发酵；所述其它生物基化合物是选自1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、乳酸、乙酸、丁二酸、苹果酸或类异戊二烯。
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