ES2741836T3 - Variantes de transportador de Gal2 y sus usos - Google Patents

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Abstract

Polipéptido, que comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, en el que el polipéptido tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y en el que el polipéptido tiene una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de transportador de Gal2 y sus usos
La presente invención se refiere a polipéptidos que son variantes de Gal2 que comprenden al menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 y opcionalmente otra sustitución o sustituciones de aminoácidos. La presente invención se refiere además con moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos y a células huésped que contienen dichas moléculas de ácido nucleico. La presente invención se refiere además con un procedimiento para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica, que comprenden la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico, preferiblemente en dichas células huésped. La presente invención también se refiere a el uso de los polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos o células huésped para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica y/o para la fermentación recombinante de biomaterial que contiene pentosa o pentosas, preferiblemente D xilosa y/o L-arabinosa.
Antecedentes de la invención
La levadura Saccharomyces cerevisiae para cerveza, vino y para hornear ya se ha utilizado durante siglos para la producción de pan, vino y cerveza debido a su característica de fermentar azúcar en etanol y dióxido de carbono. En biotecnología, S. cerevisiae se usa particularmente en la producción de etanol para fines industriales, además de la producción de proteínas heterólogas. El etanol se utiliza en numerosas ramas de la industria como un sustrato inicial para las síntesis. El etanol está ganando cada vez más importancia como combustible alternativo, debido a la presencia cada vez más escasa de petróleo, el aumento de los precios del petróleo y la creciente demanda de gasolina en todo el mundo. Además, S. cerevisiae también se usa para la producción de otros biocombustibles o compuestos bioquímicos valiosos como isobutanol, ácido succínico, farnesen/farnesan o artemisinina.
Para hacer posible una producción de biocombustible con un precio favorable y eficiente, el uso de biomasa que contiene lignocelulosa, como por ejemplo paja, residuos de la industria de la madera y la agricultura y el componente orgánico de los residuos domésticos cotidianos, se presenta como un sustrato inicial. En primer lugar, dicha biomasa es muy conveniente y, en segundo lugar, está presente en grandes cantidades. Los tres componentes principales de la lignocelulosa son lignina, celulosa y hemicelulosa. La hemicelulosa, que es el segundo polímero que se encuentra con más frecuencia después de la celulosa, es un heteropolímero altamente ramificado. Consiste en pentosas (L-arabinosa, D-xilosa), ácidos urónicos (ácido 4-O-metil-D-glucurónico, ácido D-galacturónico) y hexosas (D-manosa, D-galactosa, L-ramnosa, D-glucosa). Aunque la hemicelulosa se puede hidrolizar más fácilmente que la celulosa, contiene las pentosas L-arabinosa y D-xilosa, que normalmente no pueden ser convertidas por la levadura S. cerevisae.
Para poder utilizar las pentosas para las fermentaciones, estas deben ingresar primero en la célula a través de la membrana plasmática. Aunque la S. cerevisiae no puede metabolizar la D-xilosa o la L-arabinosa, puede absorber la D-xilosa o la L-arabinosa en la célula. Sin embargo, S. cerevisiae no tiene un transportador específico. El transporte se realiza mediante los transportadores de hexosa. Sin embargo, la afinidad de los transportadores a la D-xilosa es claramente menor que a la D-glucosa (Kotter y Ciriacy, 1993). En levaduras que son capaces de metabolizar D-xilosa, como por ejemplo P. stipitis, C. shehatae o P. tannophilus (Du Preez et al., 1986), existen dos transportadores inespecíficos de baja afinidad, que transportan D-glucosa, y también simportadores específicos de protones de alta afinidad solo para D-xilosa (Hahn-Hagerdal et al., 2001).
En experimentos anteriores, se encontraron algunas levaduras, como por ejemplo Candida tropicalis, Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Candida shehatae, que por naturaleza fermentan D-xilosa o L-arabinosa o al menos la pueden asimilar. Sin embargo, estas levaduras carecen totalmente de la capacidad de fermentar la L-arabinosa y la D-xilosa en etanol, o solo tienen un rendimiento de etanol muy bajo (Dien et al., 1996). Además, aún se sabe muy poco acerca de la absorción de D-xilosa y L-arabinosa. En la levadura C. shehatae se asume un simportador de protones (Lucas y Uden, 1986). En S. cerevisiae, se sabe por la galactosa permeasa Gal2 que puede transportar D-xilosa pero también transporta L-arabinosa, que es muy similar en estructura a D-galactosa. (Kou et al., 1970). La mayoría de los transportadores de hexosa pueden mediar la absorción de D-xilosa.
La fermentación alcohólica de pentosas en cepas de levadura biotecnológicamente modificadas de S. cerevisiae, en la que, inter alia, se utilizaron diversos genes de la cepa de levadura Pichia stipitis para la modificación genética de S. cerevisiae, se describió en los últimos años particularmente en relación con la fermentación de xilosa. La manipulación se concentró aquí particularmente en la introducción de los genes para la asimilación inicial de xilosa de Pichia stipitis, una levadura que fermenta la xilosa, en S. cerevisiae, es decir, en una levadura que se usa tradicionalmente en la producción de etanol a partir de hexosa (Jin et al. 2004).
Jeppson et al. (2006) describen la fermentación de xilosa por S. cerevisiae mediante la introducción de una vía metabólica de xilosa que es similar a la de las levaduras Pichia stipitis y Candida shehatae, que usan la xilosa de manera natural, o es similar a la vía metabólica bacteriana.
Katahira et al. (2006) describen los hidrolizados de ácido sulfúrico de la biomasa de lignocelulosa, como las astillas de madera, como un material importante para la producción de bioetanol combustible. En este estudio, se construyó una cepa de levadura recombinante, que es capaz de fermentar xilosa y celooligosacáridos. Para esto, diversos genes se integraron en esta cepa de levadura y en particular, para la expresión intercelular de la xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa de Pichia stipitis y la xiluloquinasa de S. cerevisiae y para la presentación de beta-glucosidasa de Aspergillus acleatus en la superficie celular. En la fermentación de hidrolizados de ácido sulfúrico de astillas de madera, la xilosa y los celooligosacáridos se fermentaron completamente con la cepa recombinante después de 36 horas.
Pitkanen et al. (2005) describen la obtención y caracterización de aislados de quimiostato de xilosa de una cepa de S. cervisiae, que sobreexpresa genes de Pichia stipitis que codifican para la xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa y el gen que codifica la xiluloquinasa endógena. Los aislados se obtuvieron a partir de cultivos de quimiostatos aerobios en xilosa como fuente de carbono única o principal. Bajo condiciones aeróbicas en medio mínimo con 30 g/l de xilosa, la tasa de crecimiento de los aislados de quimiostato fue 3 veces mayor que la de la cepa original (0,15 h-1 en comparación con 0,05 Ir1). La tasa de absorción de xilosa se incrementó casi el doble. Las actividades de las enzimas clave de la vía metabólica del fosfato de pentosa (transquetolasa, transaldolasa) aumentaron dos veces, mientras que las concentraciones de sus sustratos (pentosa-5-fosfatos, sedoheptulosa-7-fosfato) se redujeron en consecuencia.
Brat et al. (2009) cribaron bases de datos de ácidos nucleicos para detectar secuencias que codifican isomerasas de xilosa putativas y finalmente pudieron clonar y expresar con éxito un nuevo tipo altamente activo de isomerasa de xilosa de la bacteria anaeróbica Clostridium phytofermentans en S. cerevisiae. La expresión heteróloga de esta enzima confiere a las células de la levadura la capacidad de metabolizar la D-xilosa y usarla como la única fuente de carbono y energía.
Demeke et al. (2013) desarrollaron un casete de expresión que contenía 13 genes, incluido C. phytofermentans xylA, que codificaba la D-xilosa isomerasa y enzimas de la vía del fosfato de pentosa e insertaron el casete en dos copias en el genoma de la cepa industrial de S. cerevisiae Ethanol Red. La posterior mutagénesis por EMS, el barajado del genoma y la selección en hidrolizado de lignocelulosa enriquecida con D-xilosa, seguido de múltiples rondas de manipulación evolutiva en medio complejo con D-xilosa, establecieron gradualmente una fermentación de D-xilosa altamente eficiente.
Becker y Boles (2003) describen la manipulación y la selección de una cepa de laboratorio de S. cerevisiae que puede usar la L-arabinosa para el crecimiento y para fermentarla a etanol. Esto fue posible debido a la sobreexpresión de una vía metabólica bacteriana de L-arabinosa, que consiste en AraA de Bacillus subtilis y AraB y AraD de Escherichia coli y la sobreexpresión simultánea de la galactosa permeasa de levadura que transporta L-arabinosa en la cepa de levadura. El análisis molecular de la cepa seleccionada mostró que la precondición predeterminada para el uso de L-arabinosa es una actividad más baja de la L-ribuloquinasa. Sin embargo, inter alia, se reporta un crecimiento muy lento de esta cepa de levadura.
Wiedemann y Boles (2008) muestran que la expresión de los genes optimizados por codón de la L-arabinosa isomerasa de Bacillus licheniformis y L-ribuloquinasa y L-ribulosa-5-P 4-epimerasa de Escherichia coli mejoró fuertemente las tasas de conversión de L-arabinosa.
Farwick et al. (2014) desarrollaron un nuevo sistema para el cribado y manipulación de transportadores de pentosa que ya no están inhibidos por la glucosa. Este sistema se basó en una cepa de levadura fermentadora de D-xilosa que tenía eliminaciones de todos los transportadores de hexosa y todas las hexo/glucoquinasas (cepa hxt°hxk°). La D-glucosa ya no puede utilizarse como fuente de carbono, pero interfiere con la utilización de D-xilosa al nivel de transporte. Como resultado, los transportadores mutantes que permiten la absorción de D-xilosa en la presencia de concentraciones crecientes de D-glucosa podrían seleccionarse fácilmente. Usando este sistema en la manipulación evolutiva y las metodologías de mutagénesis, los autores pudieron generar transportadores de D-xilosa específicos a partir de transportadores de hexosa de S. cerevisiae. Algunos de estos transportadores mutantes tuvieron un intercambio en una posición correspondiente a N376 del transportador de galactosa Gal2. Sin embargo, aunque demostraron ser resistentes a la glucosa, la mayoría de ellos tenían una tasa de absorción reducida para la xilosa.
El documento WO 2008/080505 A1 divulga un transportador de arabinosa de Pichia stipitis, que permite a las células de levadura absorber L-arabinosa. El documento EP 11 001 841.3 divulga un transportador específico de arabinosa de la planta Arabidopsis thaliana para la construcción de levaduras que fermentan pentosa.
Los documentos WO 2012/049170 A2 y WO 2012/049173 A1 divulgan células de levadura que fermentan pentosa y glucosa que contienen y expresan entre otros ácidos nucleicos, un polipéptido con actividad de arabinosa permeasa que comprende una mutación en la posición T219 a asparagina o N376 a serina de Gal2 que vuelve al transportador resistente contra el efecto inhibitorio de la glucosa.
Todavía existe la necesidad en la técnica de transportadores específicos de pentosa, en particular transportadores específicos de D-xilosa, que tengan una mayor afinidad y/o una mayor actividad por las pentosas, en particular combinadas con resistencia a la glucosa, que permitan tomar específicamente la D-xilosa y/o L-arabinosa en células, como las células de levadura, con altas tasas de absorción incluso a bajas concentraciones de pentosa y por lo tanto para promover la utilización y fermentación de pentosas, en particular D-xilosa y/o L-arabinosa y en particular en la presencia simultánea de glucosa.
Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar transportadores mejorados y/o más específicos, que transporten pentosa o pentosas, tales como D-xilosa y/o L-arabinosa con actividades más altas y/o afinidades más altas.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención, este objetivo se resuelve mediante un polipéptido, que comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1,
en el que el polipéptido tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y en el que el polipéptido tiene una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo.
De acuerdo con la presente invención, este objetivo se resuelve mediante una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, este objetivo se resuelve mediante una célula huésped, que contiene una molécula de ácido nucleico de la presente invención y que expresa preferiblemente dicha molécula de ácido nucleico, en la que dicha célula huésped es preferiblemente una célula de hongo y más preferiblemente una célula de levadura, tal como especies Saccharomyces, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. o Yarrowia sp.
De acuerdo con la presente invención, este objetivo se resuelve mediante un procedimiento para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica, que comprenden la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, preferiblemente en una célula huésped de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, este objetivo se resuelve utilizando un polipéptido de acuerdo con la presente invención, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o una célula huésped de acuerdo con la presente invención para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica,
y/o para la fermentación recombinante de biomaterial que contiene pentosa o pentosas, preferiblemente D-xilosa y/o L-arabinosa.
Descripción de las realizaciones preferidas de la invención
Antes de que la presente invención se describa con más detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no está limitada a los procedimientos, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir solo realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Para los fines de la presente invención, todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad.
Variantes de Gal2
Como se discutió anteriormente, la presente invención proporciona variantes de Gal2.
En particular, la presente invención proporciona un polipéptido, que comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
El polipéptido de la presente invención tiene una identidad de secuencia de 90 % o 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y tiene una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo.
Preferiblemente, el polipéptido de la presente invención es Gal2 de Saccharomyces cerevisiae.
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos o proteínas de tipo salvaje de Gal2 de CEN.PK2-1C y CEN.PK113-7D. Gal2 de CEN.PK2-1C es una proteína de 574 aminoácidos. http://www.yeastgenome.org/cgibin/FUNGI/getSeq.pl?seq=YLR081W_CEN.PK113-7D.
Los polipéptidos, preferiblemente las variantes de Gal2, de acuerdo con la invención comprenden al menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o de una secuencia de aminoácidos, que es al menos un 90 % idéntica, preferiblemente 95 % idéntica, y más preferiblemente 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Como se usa en el presente documento, el término "en una posición correspondiente a" significa la posición respectiva en la SEQ ID NO: 1 que, sin embargo, en cadenas polipeptídicas relacionadas puede tener otro número de posición relativa. La sustitución equivalente puede determinarse comparando una posición en ambas secuencias, que puede alinearse con el propósito de comparación. La posición relativa del aminoácido puede variar debido a la diferente longitud del polipéptido relacionado, o eliminaciones o adiciones de aminoácidos en el polipéptido relacionado.
Los polipéptidos, preferiblemente las variantes de Gal2, de acuerdo con la invención tienen una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo, en particular una función de transporte de D-xilosa y/o L-arabinosa in vitro y/o in vivo.
Preferiblemente, la pentosa es D-xilosa y/o L-arabinosa.
Como se usa en el presente documento, si no se indica lo contrario, el término "xilosa" significa lo mismo que D-xilosa, "arabinosa" significa lo mismo que L-arabinosa, y "glucosa" significa lo mismo que D-glucosa.
Como se usa en el presente documento, el término "porcentaje ( %) idéntico" se refiere a la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos. La identidad se puede determinar comparando una posición en ambas secuencias, que puede alinearse con el propósito de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por el mismo aminoácido, las moléculas se consideran idénticas en esa posición.
Como se usa en el presente documento, el término "equivalente funcional" se refiere a secuencias de aminoácidos que no son 100 % idénticas a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y comprenden adiciones y/o inserciones y/o eliminaciones y/o sustituciones y/o intercambios de aminoácidos, que no alteran ni cambian la actividad o función de la proteína en comparación con la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, es decir, un "equivalente funcional", por ejemplo, abarca una secuencia de aminoácidos con sustituciones de aminoácidos conservadoras o eliminaciones y/o inserciones más pequeñas, siempre que estas modificaciones no afecten sustancialmente la función de transporte de la L-arabinosa in vitro y/o in vivo.
Generalmente, una persona experimentada en la técnica es consciente del hecho de que algunos intercambios de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una proteína no tienen influencia en la estructura (secundaria o terciaria), la función y/o la actividad de esa proteína. Las secuencias de aminoácidos con tales intercambios de aminoácidos "neutros" en comparación con las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento están dentro del alcance de la presente invención.
En una realización preferida, los polipéptidos, preferiblemente las variantes de Gal2, de acuerdo con la presente invención, que comprenden al menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 de la SEQ ID NO: 1, comprenden la sustitución de aminoácido T354A.
Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a T354 aumenta la actividad de la función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo en comparación con el polipéptido sin dicha sustitución o sustituciones de aminoácidos.
Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a T354 aumenta la afinidad del polipéptido para pentosa o pentosas en comparación con el polipéptido sin dicha sustitución o sustituciones de aminoácidos.
- sustitución o sustituciones adicionales de aminoácidos.
En una realización, los polipéptidos, preferiblemente las variantes de Gal2, de acuerdo con la presente invención comprenden otra sustitución o sustituciones de aminoácidos:
preferiblemente sustitución o sustituciones de aminoácidos en una posición correspondiente a V71 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Dicha sustitución adicional de aminoácidos es preferiblemente V71I.
La presente invención proporciona preferiblemente los siguientes polipéptidos/variantes de Gal2:
- T354A
-T354A/V71I
Moléculas de ácido nucleico
Como se discutió anteriormente, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido de acuerdo con la presente invención.
En una realización, la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende además:
- secuencias vector de ácidos nucleicos, preferiblemente secuencias de vectores de expresión, y/o
- secuencias promotoras de ácido nucleico y secuencias terminadoras de ácido nucleico,
y/o
- comprende otra secuencia reguladora de ácidos nucleicos.
En una realización, la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende ADNds, ADNss, PNA, CNA, ARN o ARNm o combinaciones de estos.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprenden preferiblemente secuencias de ácido nucleico, que son (excepto por la adición de la sustitución o sustituciones de aminoácidos de acuerdo con la invención) idénticas a la secuencia de ácido nucleico de origen natural o están optimizadas por codones para el uso en una célula huésped.
La molécula de ácido nucleico usada de acuerdo con la presente invención es preferiblemente un constructo de expresión de ácido nucleico.
Los constructos de expresión de ácido nucleico de acuerdo con la invención son casetes de expresión que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, o vectores de expresión que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un casete de expresión, por ejemplo.
Un constructo de expresión de ácido nucleico comprende preferiblemente secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras, que están unidas operativamente con la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o polipéptidos de la invención.
El constructo de expresión de ácido nucleico puede comprender además secuencias de reconocimiento 5' y/o 3' y/o marcadores de selección.
Células huésped
Como se discutió anteriormente, la presente invención proporciona células huésped que contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Preferiblemente, las células huésped de la presente invención expresan dicha molécula de ácido nucleico.
Preferiblemente, una célula huésped de acuerdo con la presente invención es una célula de hongos y más preferiblemente una célula de levadura.
La célula de levadura es preferiblemente un miembro de un género seleccionado del grupo de especies de Saccharomyces, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. o Yarrowia sp.
La célula de levadura es más preferiblemente un miembro de una especie seleccionada del grupo de S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus, K. fragilis, H. polymorpha, P. pastoris y Y. lipolytica, tales como S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha, P. pastoris o Y. lipolytica.
En una realización preferida, la célula huésped pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae.
Cuando la molécula de ácido nucleico/secuencia que codifica el polipéptido (preferiblemente la variante o variantes de Gal2) de la presente invención se expresa en una célula huésped (preferiblemente una célula de levadura), a la célula huésped se le imparte la capacidad de absorber D-xilosa y/o L-arabinosa, que luego puede metabolizarse aún más. A través de esto, la célula puede crecer en D-xilosa y/o L-arabinosa como una fuente de carbono. Preferiblemente, la célula huésped (preferiblemente la célula de levadura) tiene una tasa de absorción aumentada para D-xilosa y/o L-arabinosa en comparación con una célula que no contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
En una realización preferida, la célula huésped (preferiblemente la célula de levadura) de la presente invención contiene además
- moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de una vía metabólica de xilosa (preferiblemente xilosa isomerasa y xiluloquinasa),
y/o
- moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de una vía metabólica de arabinosa (preferiblemente isomerasa de arabinosa, riboquinasa, ribulosa 5-P 4-epimerasa).
Tal célula huésped tiene preferiblemente
- una tasa aumentada de utilización de D-xilosa y/o L-arabinosa
y/o
- una tasa de crecimiento más rápida con D-xilosa y/o L-arabinosa en comparación con una célula que no contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Por ejemplo, la célula huésped (preferiblemente la célula de levadura) de la presente invención puede contener además moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de una ruta metabólica de arabinosa, en particular para arabinosa isomerasa, ribuloquinasa, ribulosa-5-P 4-epimerasa.
Se prefieren las proteínas de la ruta metabólica de la arabinosa bacteriana, en particular la araB L-ribuloquinasa de E. coli, la araD L-ribulosa-5-P 4-epimerasa de E. coli y la araA L-arabinosa-isomerasa de B. licheniformis. En una realización preferida, una célula huésped (preferiblemente una célula de levadura) de acuerdo con esta invención se modifica por la introducción y expresión de los genes araA (L-arabinosa-isomerasa), araB (L-ribuloquinasa) y araD (L-ribulosa-5-P-4-epimerasa) y además sobreexpresa un gen TAL1 (transaldolasa), como lo describen, por ejemplo, los inventores en el documento EP 1499708 B1 y además contiene al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Dependiendo del uso previsto de la célula de levadura, dicha célula de levadura puede contener, expresar o sobreexpresar otras secuencias de ácido nucleico que codifican otras proteínas, como la transaldolasa TALI y/o TAL2, la transquetolasa TKL1 y/o TKL2, D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa RPE1, ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa RKI1 o las secuencias correspondientes de otros organismos que codifican las mismas actividades enzimáticas. Por ejemplo, la célula huésped (preferiblemente la célula de levadura) de la presente invención puede sobreexpresar adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de una ruta metabólica de la xilosa, en particular para la isomerasa de la xilosa y la xiluloquinasa.
Los preferidos son Clostridium phytofermentans o Piromyces xylA xilosa isomerasa y S. cerevisiae XKS1 xiluloquinasa.
En una realización preferida, una célula huésped (preferiblemente una célula de levadura) de acuerdo con esta invención se modifica mediante la introducción y/o sobreexpresión de los genes xylA (xiloseisomerasa), XKS1 (xiluloquinasa) y además sobreexpresa un gen TAL1 (transaldolasa).
Dependiendo del uso previsto de la célula de levadura, dicha célula de levadura puede contener, expresar o sobreexpresar otras secuencias de ácido nucleico que codifican otras proteínas, como la transaldolasa TALI y/o TAL2, la transquetolasa TKL1 y/o TKL2, D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa RPE1, ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa RKI1 o las secuencias correspondientes de otros organismos que codifican las mismas actividades enzimáticas. Procedimientos y usos para la producción de bioetanol
Como se discutió anteriormente, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica.
Dicho procedimiento comprende la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, preferiblemente en una célula huésped de acuerdo con la presente invención.
Como se discutió anteriormente, la presente invención proporciona el uso de
- un polipéptido de acuerdo con la presente invención,
- una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o
- una célula huésped de acuerdo con la presente invención,
para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica,
y/o para la fermentación recombinante de biomaterial que contiene pentosa o pentosas, preferiblemente D-xilosa y/o L-arabinosa.
El término "compuestos de base biológica" u "otros compuestos de base biológica", como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos y sustancias químicas, que se obtienen a partir de materiales biológicos y materiales crudos (biomasa), en particular utilizando microorganismos.
Los (otros) compuestos de base biológica pueden ser compuestos, que se seleccionan entre, pero no se limitan a:
ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido málico u otros ácidos orgánicos,
1-butanol, isobutanol, 2-butanol, otros alcoholes,
aminoácidos, alcanos, terpenos, isoprenoides, disolventes, compuestos farmacéuticos, vitaminas.
Descripción adicional de realizaciones preferidas
Los inventores han identificado variantes de Gal2 que exhiben
- aumento de la actividad de la función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo y/o
- aumento de la afinidad para pentosa o pentosas
en comparación con el tipo salvaje o con un polipéptido Gal2 sin la sustitución o sustituciones de aminoácidos respectivas.
Los inventores, por lo tanto, han identificado variantes de Gal2 que, por lo tanto, confieren a una célula huésped (preferiblemente una célula de levadura) la capacidad de absorber D-xilosa y/o D-arabinosa y preferiblemente, la capacidad de una mayor absorción de pentosa o pentosas, preferiblemente D-xilosa y/o D-arabinosa.
Para esto, también se debe hacer referencia a los ejemplos y figuras.
- Absorción de L-arabinosa y D-xilosa
Para que la pentosa o pentosas, en particular, D-xilosa y/o L-arabinosa, pueda ser metabolizada por S. cerevisiae, primero debe ser absorbida por la célula.
Todos los transportadores de hexosa probados para la pentosa D-xilosa tienen una afinidad mucho mayor a las hexosas que a la D-xilosa. Para la L-arabinosa, se asume una situación similar. De todas las cepas construidas hasta ahora, que pueden utilizar pentosas (D-xilosa o L-arabinosa), se reporta un crecimiento relativamente lento. Sobre todo, la lenta y pobre absorción de las pentosas se menciona como una razón para esto (Becker y Boles, 2003; Richard et al., 2002). En las fermentaciones en una mezcla de azúcar, que consiste en D-glucosa y D-xilosa o D-glucosa y L-arabinosa, los azúcares no se convierten simultáneamente. Debido a la alta afinidad de los transportadores de D-glucosa, la D-glucosa se metaboliza al principio. Se produce un llamado cambio diaúxico. Solo después de que se agota la D-glucosa, la pentosa se convierte en una segunda fase de crecimiento claramente más lenta (Kuyper etal., 2005a; Kuyper et al., 2005b). La ausencia de transportadores específicos para pentosas se da como una explicación.
- Gal2
La hexosa galactosa es transportada por el transportador de alta afinidad Gal2 (Km= 1 a 5 mM) que es igualmente afín para la glucosa (Km= 1,5 a 1,9) (ver, por ejemplo, Reifenberger et al., 1997). Al igual que los otros genes estructurales necesarios para la utilización de galactosa (GAL1, galactosa quinasa; GAL10, mutarotasa/UDP-glucosa-4-epimerasa; GAL7, galactosa-1-fosfato uridil transferasa), su expresión se reprime en presencia de glucosa y también necesita la inducción por galactosa. Gal2 también es objetivo de la inactivación de catabolitos (Horak y Wolf, 1997). Gal2 es uno de los pocos transportadores que puede transportar L-arabinosa. Como la mayoría de los otros transportadores de hexosa, puede transportar D-xilosa. Sin embargo, su afinidad por la L-arabinosa y la D-xilosa es bastante baja. Por lo tanto, a bajas concentraciones de D-xilosa o L-arabinosa, la actividad de absorción es muy baja.
Farwick et al. (2014) desarrollaron transportadores mutantes que permiten la absorción de D-xilosa en presencia de D-glucosa. Algunos de estos transportadores mutantes tuvieron un intercambio de aminoácidos en una posición correspondiente a N376 del transportador de galactosa Gal2. Sin embargo, aunque demostraron ser resistentes a la glucosa, la mayoría de ellos tenían una tasa de absorción reducida para la xilosa.
Los polipéptidos de la presente invención exhiben una mayor tasa de absorción y/o afinidad por la xilosa, en particular en combinación con mutaciones que los hacen resistentes a la inhibición por la glucosa.
Se tuvieron que usar diversos procedimientos de mutagénesis, así como manipulación evolutiva bajo condiciones muy específicas con cepas de levadura manipuladas con una variedad de diferentes modificaciones, para encontrar transportadores de pentosa derivados de Gal2 mejorados. Estos transportadores debían ser probados en sistemas de detección elaborados, con pruebas de crecimiento y ensayos de consumo de azúcar. Finalmente, los transportadores mutantes tuvieron que ser secuenciados y a partir de una variedad de mutaciones, se tuvieron que aclarar cuáles fueron finalmente responsables de las propiedades mejoradas.
La D-xilosa representa hasta el 35 % del total de azúcares en la biomasa lignocelulósica rica en xilano, como maderas duras y paja (ver Demeke et al. 2013). Biomasa con cantidades significativas de arabinosa (fuente de los datos: Departamento de Energía de los Estados Unidos http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/search1.cgi):
Tipo de biomasa L-arabinosa [ %]
Pasto varilla 3,66
Tipo de biomasa L-arabinosa [ %]
Bothriochloa Grande 3,55
Festuca alta 3,19
Robinia 3
Rastrojo de maíz 2,69
Paja de trigo 2,35
Bagazo de caña de azúcar 2,06
Lespedeza china 1,75
Sorgo bicolor 1,65
Las variantes de Gal2 de acuerdo con la invención también son de gran importancia para su utilización.
Las posibilidades para el uso de un transportador de pentosa funcional y al mismo tiempo específico en la levadura S. cerevisiae son, en primer lugar, la producción a partir de hidrolizados lignocelulósicos de bioetanol y la producción de productos precursores de alto grado para otras síntesis químicas, particularmente cuando las concentraciones de pentosa son bajas y en la presencia simultánea de glucosa.
La siguiente lista se origina en el estudio "Productos químicos de mayor valor agregado a partir de biomasa" (ver www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf). Aquí, 30 productos químicos se clasificaron como particularmente valiosos, que se pueden producir a partir de biomasa.
Figure imgf000009_0001
Tan pronto como estos productos químicos se producen a partir de lignocelulosas por bioconversión (por ejemplo, fermentaciones con levaduras), es importante tener un transportador o transportadores específicos, altamente activos para los azúcares de hemicelulosa, arabinosa y xilosa.
Los siguientes ejemplos y dibujos ilustran la presente invención sin limitar, sin embargo, los mismos a esto. Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Prueba de crecimiento de Gal2_T354A en EBY.VW4000
Los transformantes se cultivaron en 5 ml de SCM-ura con 20 g/l de maltosa a 30°, se lavaron con agua y se ajustaron a una OD600 de 1. De allí siguió una dilución en serie. Se hicieron gotear 5 j l en el medio respectivo y se incubó durante tres días a 30°. Como control de la dilución se tomó SCM-ura con 20 g/l de maltosa. Las células de los transportadores mutados se hicieron gotear sobre SCD-ura con un 0,2 % y un 2 % de glucosa, así como un SCG-ura con un 0,2 % y un 2 % de D-galactosa para probar su funcionalidad. Además, se utilizaron para la comparación el tipo salvaje de CEN.PK2 y Ethanol Red, así como Gal2_ep3.1. El transportador de galactosa con la mutación T354A es de HDY.GUF10.
Figura 2: Prueba de crecimiento de Gal2_T354A en AFY10
Los transformantes se cultivaron en 5 ml de SCE-ura-leu con etanol al 2 % a 30°, se lavaron con agua y se ajustaron a una OD600 de 1. De allí siguió una dilución en serie. Se hicieron gotear 5 j l en el medio respectivo y se incubó durante cinco días a 30°. Como control de la dilución, se tomó SCE-ura-leu con etanol al 2 %. Las células de los transportadores mutados se hicieron gotear sobre SCX-ura-leu con D-xilosa al 0,2 % y 2 %, así como con SC-ura-leu con D-xilosa al 1 % con D-glucosa al 4 % y SC-ura-leu con D-xilosa al 0,2 % y D-glucosa al 2 % para probar su funcionalidad. Además, se utilizaron para la comparación el tipo salvaje de CEN.PK2 y Ethanol Red, así como Gal2_ep3.1. El transportador de galactosa con la mutación T354A es de HDY.GUF10.
Figura 3: Prueba de goteo de Gal2_T354A en combinación con V71I y L280R en EBY.VW4000 después de cuatro días a 30°. Se hacen gotear varias diluciones de izquierda a derecha (sin diluir, 1:10, 1:100, 1:1.000).
Figura 4: Prueba de goteo de Gal2_T354A en combinación con V71I y L280R en AFY10 después de seis días a 30°. Se hacen gotear varias diluciones de izquierda a derecha (sin diluir, 1:10, 1:100, 1:1.000).
Ejemplos
Procedimientos
Cepas y medios
- Bacterias
E.coli SURE (Stratageno)
Medio completo LBtriptono al 1 %, extracto de levadura al 0,5 %, NaCl al 0,5 %, pH 7,5 (véase Sambrooky Russell, 2001)
Para la selección en una resistencia antibiótica codificada por plásmidos, se añadieron 40 pg/ml de ampicilina al medio después de esterilizar en autoclave. Los medios de cultivo sólidos contenían adicionalmente agar al 1,9 %. El cultivo tuvo lugar a 37 °C.
- Levadura
CEN.PK2-1C
MATa leu2-3,112 ura3-52 trp1-289 his3-A1 MAL2-8 SUC2(EUROSCARF, Frankfurt)
- Cepa EBY.VW4000
EBY.VW4000 (Genotipo: MATa leu2-3,112ura3-52 trp1-289 his3-A1 MAL2-8c SUC2 Ahxt1-17Agal2 stlA::loxP agt1A::loxP mph2A::loxP mph3A::loxP) (Wieczorke et al., 1999)
Cepa Ethanol Red
Disponible de Lesaffre, Lille, Francia. Descrito en Demeke et al. (2013).
Cepa HDY.GUF10
Xilosa y arabinosa que consumen la cepa de S. cerevisiae industrial derivada de Ethanol Red (Dietz 2013). Cepa AFY10
EBY.VW4000 glk1A::loxP hxk1A::loxP hxk2A::loxP ylr446wA::loxP pyk2A::pPGK1-opt.XKS1-tPGK1 pTPI1-TAL1-tTALI pTDH3-TKL1-tTKL1 pPFK1-RPE1-tRPE1 pFBA-RKI1-tRKI1 loxP (Farwick et al., 2014).
Cepa AFY10X
AFY10 YEp-kanR_optXI (Farwick et al., 2014).
- medio selectivo sintético completo SC
Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio al 0,67 %, sulfato de amonio al 0,5 %, dihidrogenofosfato de potasio 20 mM, pH 6,3, solución de aminoácido/nucleobase sin los aminoácidos correspondientes para los marcadores de auxotrofia de los plásmidos utilizados, fuente de carbono en la concentración respectiva indicada.
Concentración de los aminoácidos y nucleobases en el medio sintético completo (Zimmermann, 1975): adenina (0,08 mM), arginina (0,22 mM), histidina (0,25 mM), isoleucina (0,44 mM), leucina (0,44 mM), lisina (0,35 mM), metionina (0,26 mM), fenilalanina (0,29 mM), treonina (0,48 mM), triptófano (0.19 mM), tirosina (0,34 mM), uracilo (0,44 mM) y valina (0,49 mM). Como fuentes de carbono, se usaron L-arabinosa, D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, etanol y maltosa, según se indica.
Los medios sólidos completos y selectivos contienen además agar al 1,9 %. El cultivo de las células de levadura tuvo lugar a 30 °C.
Plásmidos
Figure imgf000011_0001
Preparación de ADN
- Aislamiento de ADN plasmídico de E. coli
Las preparaciones a pequeña escala de ADN plasmídico de cultivos de E. coli se realizaron utilizando el kit GeneJET™ Plasmid Miniprep (Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El kit QUIAGEN Plasmid Maxi se utilizó para preparaciones a gran escala.
- Aislamiento de ADN plasmídico y genómico de S. cerevisiae
Para el aislamiento de ADN genómico y plasmídico de células de levadura, se cosecharon 5-10 ml de cultivos en fase estacionaria por centrifugación (1 min, 2.000x g) y se lavaron una vez en 1 ml de ddH2O estéril. La pella celular se resuspendió en 400 pl de regulador YP 1 mediante agitación en vórtice y luego se lisó mediante la adición de 400 pl de regulador YP 2, 1/3 a 2/3 de volumen de perlas de vidrio (0 0,25-0,5 mm) y 8 minutos de agitación en un VXR básico Vibrax (IKA) a 2.000 rpm. Los residuos celulares se sedimentaron por centrifugación (30 segundos, 16.000x g) y se transfirieron 650 pl del sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo. Se agregaron 325 pl de regulador YP 3 frío y la muestra se agitó en vórtice y luego se incubó en hielo durante 10 minutos para la precipitación de proteínas y otros contaminantes. La muestra se centrifugó (10-15 min, 4 °C, 16.000x g), se transfirieron 700 pl del sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo y se agregaron 700 pl de isopropanol. Después de mezclar vigorosamente, la muestra se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la precipitación del ADN, que luego se sedimentó mediante centrifugación (>30 min, temperatura ambiente, 16.000x g). La pella de ADN se lavó dos veces con 500 pl de etanol frío (-20 °C) al 70 % (v/v), con etapas de centrifugación de 5 minutos a temperatura ambiente y 16.000x g, luego se secó a temperatura ambiente durante 10 minutos y se disolvió en 15-30 pl de ddH2O estéril según el tamaño de la pella de ADN.
- Determinación de la concentración de ADN
La concentración de ADN se mide por fotometría espectral en un intervalo de longitud de onda de 240-300 nm. Si la pureza del ADN, determinada por el cociente E260nm/E280nm es 1,8, entonces la extinción E260nm= 1,0 corresponde a una concentración de ADN de 50 |jg ADNds/ml (Sambrook y Russell, 2001).
- Purificación de ADN de productos de PCR
La purificación de los productos de PCR se realizó con el "Kit de purificación de PCR QIAquick" de la compañía Qiagen, de acuerdo con la información del fabricante.
Digestión de ADN con endonucleasas de restricción (digestión por restricción)
Para la escisión de ADN específica de sitio, se utilizaron las endonucleasas de restricción de Biolaboratorios de Nueva Inglaterra (NEB) o Fermentas con los reguladores proporcionados y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usualmente, se usaron 1-3 unidades por jg de ADN para la reacción, que se incubó durante 2-12 horas. Este procedimiento se utilizó para preparar vectores para la clonación por recombinación, para confirmar plásmidos ensamblados correctamente o para degradar específicamente un determinado plásmido de una mezcla.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Se usaron diferentes polimerasas para diferentes experimentos de PCR en este trabajo. Para la confirmación de la eliminación o integración del gen genómico, se utilizó la polimerasa Crimson Taq (NEB). Para la amplificación de los ORFs (para la secuenciación), genes para la clonación recombinante o la amplificación de casetes integrativos para la eliminación o integración del gen genómico, se utilizaron las polimerasas de Phusion o Q5 (NEB). La composición de las reacciones de PCR y el programa de PCR correspondiente se muestran en las Tablas a continuación. Las temperaturas de recocido de los pares de cebadores se calcularon con la herramienta calculadora Tm en la página de inicio de NEB. Todas las PCR se realizaron en un gradiente Mastercycler (Eppendorf), Ciclador térmico Piko (Finnzymes) o cicladorde PCR Progene (Techne).
Composición de las reacciones de PCR con la polimerasa Crimson Taq Componente reacción de 15 pl reacción de 25 pl concentración final 5x regulador de reacción Crimson Taq 3 j l 5 j l 1x
Mezcla dNTP 2 mM 1,5 j l 2,5 j l 200 jM cada uno
cebador 10 jM (cada uno) 0,3 0,5 j l 0,2 jM cada uno plantilla de ADN variable variable variable
ADN polimerasa Crimson Taq 0,15 j l 0,25 j l 0,025 U /jl
agua libre de nucleasas a 15 j l a 25 j l
Programa de PCR para reacciones con polimerasa Crimson Taq Etapa temperatura (°C) tiempo desnaturalización inicial 95 1 min
95 22 seg
30-35 ciclos 45-68 35 seg
68 1 min/kb
Etapa temperatura (°C) tiempo extensión final 68 5 min
retención 4-10
Composición de las reacciones de PCR con polimerasa Phusion o Q5 componente reacción de 25 pl reacción de 50 pl concentración final 5x regulador de reacción Phusion HF/Q5 5 pl 10 pl 1x
Mezcla de dNTPs 2 mM 2,5 pl 5 pl 200 pM cada uno
Cebador 10 pM (cada uno) 0,5 pl 1 pl 200 pM cada uno Plantilla de ADN variable variable variable
ADN polimerasa Phusion/Q5 de Alta
fidelidad 0,25 pl 0,5 pl 0,02 U/pl
agua libre de nucleasas a 25 pl a 50 pl
Programa de PCR para reacciones con polimerasa Phusion o Q5 Etapa temperatura (°C) Tiempo
desnaturalización inicial 98°C 1 min
98°C 10 seg
50-72°C 20 seg
15-35 ciclos
15 seg/kb (para plásmidos)
72°C
30 seg/kb (para ADNg)
extensión final 72°C 5 min
retención 4-10°C
PCR por fusión
Se utilizó una PCR por fusión para la construcción del ORF de HXT7-N370F para la clonación por recombinación. En la primera etapa, dos fragmentos superpuestos de HXT7 se amplificaron en dos reacciones de PCR Q5 separadas con p426H7_HXT7 como una plantilla. Las reacciones de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1,5 % y los fragmentos correctos se purificaron a partir de las piezas de gel correspondientes. Se usó una cantidad molar igual de ambos fragmentos (20 ng como mínimo) en una reacción de PCR Q5 sin cebadores. Esta reacción de PCR se realizó durante 6 ciclos, antes de que se agregaran 1 pl de cebador directo e inverso (de soluciones madre 10 pM). La reacción se llevó a cabo durante otros 20 ciclos.
PCR propensa a errores (PCRep)
Para la generación de ORF mutagenizados aleatoriamente de GAL2, se aplicó el kit de mutagénesis aleatoria GeneMorph II (Agilent Technologies). Se siguió el protocolo del fabricante. La reacción de PCR se ejecutó durante 33 ciclos. La cantidad de ADN de plantilla se varió para lograr diferentes tasas de mutación (ver la Tabla a continuación) El análisis de los productos de epPCR reveló que se han cumplido las especificaciones de amplificación deseadas. Los fragmentos de PCR se purificaron y se usaron como plantillas para una reacción de PCR de Phusion para extender los extremos de los fragmentos con salientes homólogos.
Cantidad de ADN de plantilla utilizado en diferentes PCRep y
tasa de mutación cantidad de plantilla (intervalo aceptable) amplificación
deseado encontrado
Mediano (4,5-9 mut/kb) 205 ng (100-500 ng) 10-100 «45
alto (9-16 mut/kb) 23 ng (0,1-100 ng) 100-10.000 «250
Electroforesis en gel de agarosa para la separación de ADN o ARN
Los fragmentos en muestras de ADN o ARN se separaron por tamaño utilizando geles de agarosa con concentraciones que oscilan entre agarosa al 0,7 y al 2,0 % (p/v) (Sambrook y Russell, 2001). Se usó 1x regulador TAE para la preparación de geles y como regulador de ejecución. El DNA Ladder GeneRuler de 1 kb (Fisher Scientific) se usó para dimensionar los fragmentos de a Dn . Las muestras de ADN se mezclaron con 1/5 de volumen de 6x colorante de carga de ADN antes de cargarlas en el gel. Las muestras de ARN se mezclaron con el mismo volumen de colorante de carga de ARN 2x, se incubaron a 96 °C durante 10 minutos y se almacenaron en hielo antes de la carga. Los geles se ejecutaron a hasta 6-10 V/cm durante 30 a 45 minutos, dependiendo de la corriente, el porcentaje de gel y los tamaños de fragmentos esperados. El ADN y el ARN se visualizaron mediante luz UV (254 nm) después de la incubación del gel en un baño de bromuro de etidio.
Purificación de ADN y extracción de ADN a partir de geles de agarosa
Para purificar el ADN (por ejemplo, a partir de reacciones de PCR o después de digestiones de restricción) y para extraer el ADN de los geles de agarosa, se usó el kit Extracto II NucleoSpin® (Macherey-Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Secuenciación de ADN
La secuenciación de muestras de ADN fue realizada por GATC Biotech AG (Konstanz, Alemania). Las muestras contenían 30-100 ng/pl (plásmidos) o 10-50 ng/pl (productos de PCR) de ADN. Los cebadores adecuados (10 pM) se enviaron a GATC Biotech junto con la muestra de ADN.
Transformación de E. coli
Las células de E. coli se transformaron por electroporación de acuerdo con el protocolo de Dower (Dower et al., 1988) y Wirth (Wirth, 1989) utilizando un Pulsador de Genes Bio-Rad. Se añadió ADN (a partir de E. coli o preparaciones de ADN de levadura) a las células de E. coli competentes congeladas y la muestra se incubó y se descongeló durante 10 minutos en hielo. La suspensión celular se transfirió luego a cubetas de electroporación y se pulsó directamente. El Pulsador de Genes Bio-Rad se ajustó a un voltaje de 2,5 kV por cm, una resistencia de 200 O y una capacidad de 25 pF. Inmediatamente después del pulso, las células se mezclaron con 1 ml de medio SOC precalentado y se transfirieron a un tubo eppendorf. Las células se incubaron a 37 °C durante 45 min a 600­ 800 rpm en un termomezclador (Eppendorf) antes de sembrarlas en placas de agar LB selectivas que contenían canamicina o ampicilina. En el caso de que las células se transformaran con un plásmido codificador de HXT7, la incubación se realizó a temperatura ambiente durante 4 horas sin agitación o a 20-25 °C con agitación durante 2 horas.
Transformación de S. cerevisiae
Para la transformación de S. cerevisiae, se utilizaron dos protocolos diferentes del procedimiento de ADN/PEG portador de LiAc/SS de Gietz et al. (Gietz y Schiestl, 2007a, Gietz y Schiestl, 2007b) con pequeñas desviaciones. Los cultivos líquidos se cultivaron en un medio adecuado a una OD de 0,6-1,0. La centrifugación del cultivo y para las etapas de lavado se acortaron a 2 minutos a 3.000x g. El ADN portador monocatenario se usó como una solución de 10 mg/ml, permitiendo un volumen de 54 pl o 74 pl de ADN en la mezcla de transformación, respectivamente. La duración del choque térmico fue de 35 minutos. Después de la transformación, toda la suspensión celular se sembró sobre placa directamente en el medio de selección o en caso de transformaciones con un marcador de selección dominante, se transfirió a 5 ml de medio líquido apropiado para la regeneración. Después de la regeneración, las células se sedimentaron, se resuspendieron en 50-100 j l de medio y se sembraron en placas.
Las cantidades de ADN para transformaciones fueron aproximadamente 500 ng para plásmidos individuales, > 1.000 ng cada uno para cotransformaciones con plásmidos múltiples y > 2.000 ng y más para casetes de ADN integrativos (por ejemplo, para la eliminación de genes).
Optimización por codones de genes
El ORF de algunos genes ha sido optimizado por codones. Los codones se han adaptado al uso de codones de S. cerevisiae según lo determinado por los codones preferidos de los genes glicolíticos. Descrito en Wiedemann et al. (Wiedemann y Boles, 2008).
Construcción de plásmidos por recombinación homóloga (clonación recombinante)
Los plásmidos se construyeron in vivo mediante recombinación homóloga de fragmentos de ADN adecuados (esqueleto del vector e inserto o insertos) en S. cerevisiae. Para este propósito, el vector respectivo se linealizó en el sitio de inserción por digestión por restricción. Opcionalmente, el esqueleto del vector resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior extracción del gel. Los insertos se diseñaron para tener secuencias flanqueantes (> 30 pb) homólogas a la región objetivizada para la inserción o en caso de múltiples fragmentos de inserciones, entre sí. Los insertos se amplificaron por PCR y se podrían proporcionar secuencias homólogas utilizando cebadores con los extremos 5' correspondientes (salientes homólogos). S. cerevisiae se transformó con los fragmentos de ADN y los transformantes se sembraron sobre placas en medio selectivo. Las colonias se seleccionaron para inocular medio líquido selectivo. El ADN se aisló de estos cultivos y se usó para la transformación de E. coli para la separación y proliferación de plásmidos. Los plásmidos que contienen el gen inhibidor de la girasa ccdB son tóxicos para la mayoría de las cepas de E. coli, por lo que para estos plásmidos se utilizó la cepa de E. coli DB3.1 resistente a ccdB. Los plásmidos se aislaron de cultivos de una sola colonia de E. coli y se verificaron mediante digestión de restricción analítica y secuenciación de ADN. Se establecieron cultivos madre de glicerol para los clones correctos.
Eliminación o inserción de genes genómicos por recombinación homóloga
Para las eliminaciones de genes en el genoma de S. cerevisiae, los casetes marcadores se integraron en el gen respectivo mediante recombinación homóloga (Carter y Delneri, 2010, Güldener et al., 1996, Sauer, 1987). Los casetes marcadores se amplificaron por PCR utilizando cebadores con extremos 5' homólogos al gen objetivo para permitir la inserción dirigida al sitio. Los casetes están compuestos de un gen marcador dominante (kanMX4/G418, hphNT1/Higromicina B, natNT2/clonNAT), flanqueados por un promotor (pTEF) y un terminador (tTEF, tCYC1 y tADH1, respectivamente) y sitios loxP. Estos sitios permiten la escisión de los casetes de marcadores integrados en el genoma por la recombinasa cre, que borra el marcador para otra ronda de eliminación de genes. Después de la transformación de S. cerevisiae con un casete de eliminación, las células se sembraron sobre placa en medio selectivo y se sembró una réplica sobre placa una sola vez en el mismo medio. Las colonias individuales se volvieron a separar para obtener clones individuales, que luego se recogieron y se cultivaron en medio selectivo. El ADN se aisló de estos cultivos y la integración correcta se confirmó mediante PCR con diferentes combinaciones de cebadores. Los cebadores para confirmación se denominan como se ve en la tabla a continuación. Se establecieron cultivos madre de glicerol para los clones correctos.
Nomenclatura de los cebadores utilizados para la confirmación de la integración genómica por PCR
nombre posición dirección
A1 corriente arriba del sitio de integración corriente abajo
A2 dentro de la región que se ve reemplazada por la integración corriente arriba (continuación)
nombre posición dirección
A3 dentro de la región que se ve reemplazada por la integración corriente abajo A4 corriente abajo del sitio de integración corriente arriba K2 dentro del casete de eliminación/gen que está integrado corriente arriba K3 dentro del casete de eliminación/gen que está integrado corriente abajo
Para reciclar el marcador, las células se transformaron con un plásmido que codifica la recombinasa cre bajo el control del promotor GAL1 inducible por galactosa (pSH47 o pNatCre). Después de una breve inducción de la recombinasa, las células se seleccionaron para la pérdida del marcador dominante mediante sembrado sobre placa en réplica. Dado que la expresión completa de la recombinasa es letal en las cepas hxt0, se usó la expresión basal de la recombinasa bajo condiciones no inductoras para estas cepas. La eliminación del casete se controló de nuevo mediante PCR (ver arriba). La integración de los casetes de genes para la sobreexpresión de genes se realizó en consecuencia. Dentro de estos casetes, solo el marcador dominante está flanqueado por sitios loxP y se corta, el resto del casete permanece en el genoma.
Lista de cebadores
Figure imgf000016_0001
(continuación)
Figure imgf000017_0001
Procedimientos para el cultivo de células y experimentos de fermentación
Determinación espectrofotométrica de la densidad celular
La concentración celular en un cultivo líquido se cuantificó espectrofotométricamente midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600). Las muestras del cultivo celular o sus diluciones se colocaron en una cubeta de poliestireno (PS) y se analizaron en un espectrofotómetro pro Ultrospec 2100 (GE Healthcare, Estados Unidos) a 600 nm.
Cultivos madre de glicerol
Para el almacenamiento a largo plazo de cepas específicas y E. coli que contiene plásmidos, se prepararon cultivos madre de glicerol. Para este propósito, los cultivos estacionarios de S. cerevisiae o los cultivos en crecimiento de E. coli se mezclaron 1:1 con glicerol al 50 % (v/v) y se almacenaron a -80 °C.
Cultivo de agar semisólido
El procedimiento de cultivo de agar semisólido se eligió para expandir la biblioteca de ADNc del plásmido (en E. coli). Mediante este procedimiento, se pueden minimizar los sesgos de representación que pueden ocurrir durante el crecimiento en cultivo líquido. La incubación se realiza a 30 °C, ayudando a estabilizar los clones inestables (Hanahan et al., 1991, Sassone-Corsi, 1991). El protocolo se puede encontrar en el sitio web de Life Technologies. En resumen, el medio LB concentrado 2x se mezcla con 3 g/l de agarosa SeaPrep mientras se agita, se esteriliza en autoclave y se enfría a 37 °C. El antibiótico y 4105 a 6105 (por 450 ml de medio) se añaden al medio y se mezclan durante 2 minutos. Luego, las botellas se incuban en un baño de hielo a 0 °C durante 1 hora y luego se transfieren cuidadosamente a 30 °C durante 40-45 horas de incubación (sin perturbaciones). Después del crecimiento, las células se pueden sedimentar del agar semisólido mediante centrifugación a 10.400x g.
Ensayos de mancha de dilución en serie (pruebas de goteo)
Para facilitar la comparación del crecimiento de diferentes cepas de S. cerevisiae bajo diversas condiciones de crecimiento, se realizó un ensayo de mancha de dilución en serie. Las células se cultivaron en cultivo líquido hasta la fase exponencial en medio apropiado, se recogieron por centrifugación (2.000x g, 2 min), se lavaron dos veces con agua estéril y luego se resuspendieron a una OD600 de 1,0 en medio selectivo sin fuente de carbono. A partir de esta suspensión celular, se preparó una dilución en serie diez veces en medio selectivo (cuatro etapas de dilución). Se sembraron 6 pl de cada suspensión celular en placas del medio para examinarlas y se dejaron secar. Las placas se incubaron a 30 °C.
Fermentaciones aerobias por tandas
Las fermentaciones aerobias por tandas se realizaron en matraces de agitación de diferentes tamaños (volumen 5-10x del volumen de cultivo) en agitadores rotatorios (150-180 rpm) generalmente a 30 °C. La manipulación evolutiva se realizó como una fermentación aerobia por tandas en serie (ver detalles a continuación)
Fermentaciones anaerobias por tandas
Para las fermentaciones anaerobias por tandas, los matraces de agitación se sellaron con un tapón de goma y un cierre de fermentación. El volumen de los matraces fue igual al volumen de cultivo de 100 ml. Los cultivos se agitaron continuamente a 120 rpm en un agitador magnético a 30 °C. En este trabajo, las fermentaciones se realizaron a OD600= 10. Para este fin, las células cultivadas se cosecharon y se ajustaron a una OD600 de 20 en 50 ml de medio de fermentación sin fuente de carbono. Para comenzar el experimento, esta suspensión celular se añadió a los matraces preparados que contenían 50 ml de medio de fermentación suplementado con una fuente de carbono concentrado 2x. Las muestras para la determinación de la concentración celular y para el análisis de HPLC se tomaron a través de la inserción de una aguja y jeringa estériles.
Fermentaciones anaerobias en un fermentador
Algunas fermentaciones con cepas industriales de S. cerevisiae se realizaron en un fermentador Infors Multifors (2x 1,41) con un volumen de trabajo de 800 ml y equipado con sensores de temperatura, pH, O2 y CO2. El fermentador se llenó con 530 ml de medio de fermentación concentrado (sin fuente de carbono y suplementos) y luego se esterilizó en autoclave. Antes del inicio de la fermentación, se agregaron al medio concentrado 250 ml de solución de fuente de carbono concentrada, 100 pl/l de Antiespumante 204 y los otros suplementos (vitaminas, elementos traza y antibióticos). El fermentador se purgó con gas de nitrógeno para crear inicialmente condiciones anaerobias. Se aplicó una alimentación de gas de nitrógeno al espacio de cabeza (0,4 l/min) durante el experimento para mantener las condiciones anaerobias. La salida de gas se enfrió para condensar y devolver vapor y luego se canalizó a través de una botella de lavado de gas. El cultivo se agitó a 300 rpm, la temperatura se mantuvo a 35 °C y el pH se mantuvo a 5,0 mediante la adición automática de KOH 2M o H2PO42M. El inóculo de las células (en 20 ml de medio de fermentación) se agregó cuando todos los parámetros establecidos se alcanzaron y se mantuvieron constantes. Durante las fermentaciones, se tomaron muestras para la determinación del peso seco celular y el análisis por HPLC. Se utilizó el software Iris 5.2 (Infors) para operar el fermentador y monitorear el experimento.
Determinación de masa celular seca
Para determinar la masa celular seca, se filtraron al vacío 5-10 ml de un cultivo líquido a través de un filtro prelavado y se secaron (como se describe a continuación) (nitrocelulosa, tamaño de poro 0,45 pm) y posteriormente se lavaron dos veces con ddH2O. Los filtros se secaron en un horno de microondas a 120-150 W durante 15 minutos y se dejaron enfriar y se secaron más en un desecador durante otros 15 minutos. Los filtros se pesaron antes del filtrado y después del secado para medir el peso seco de la célula. El procedimiento descrito ha sido adaptado de Ask etal. (Ask et al., 2013).
Manipulación evolutiva
La manipulación evolutiva se realizó como una fermentación aerobia por tandas en serie. Los transformantes se inocularon primero en SCE2 selectivo para obtener biomasa y luego se cultivaron en medio SC y SM selectivo con 20 g/l de xilosa para adaptar la cepa a la utilización de xilosa. Después de estos cultivos iniciales, las células se cambiaron a medio con 10 g/l de xilosa y concentraciones crecientes de glucosa para aplicar una presión evolutiva. Cuando estaban alcanzando la fase exponencial tardía a la fase estacionaria temprana, las células se cosecharon mediante centrifugación (2.000x g, 2 min) y se transfirieron a medio fresco a una OD600 de 0,2. Las concentraciones de glucosa aumentaron cada vez que se pudo ver una adaptación o el crecimiento no se vio afectado negativamente por la concentración de glucosa actual. A todos los medios, líquidos y sólidos, se agregó G418 para seleccionar el fondo de la cepa AFY10. Los medios líquidos además contenían 0,5 g/l de 2-deoxi-D-glucosa (2-DOG) para suprimir la formación de mutantes supresores del fenotipo hxk0. Las cepas hxk0, pero no las de tipo salvaje, son resistentes al 2-DOG (Subtil y Boles, 2012). La falta de consumo de glucosa se ha confirmado mediante la separación de muestras de cultivo en placas de medios de glucosa y también mediante análisis de HPLC.
Análisis de metabolitos por HPLC
Para el análisis de los metabolitos, muestras libres de células (5-10 min, 4 °C, 16.000x g) se mezclaron con 1/9 de volumen de ácido 5-sulfosalicílico al 50 % (p/v) y se centrifugaron (5-10 min, 4 °C, 16.000x g). El sobrenadante se analizó en un sistema UHPLC+ por Thermo Scientific (Dionex UltiMate 3000) equipado con una columna HyperREZ XP Carbohidrato H+ 8 pm y un detector de índice de refracción (Thermo Shodex RI-101). La separación se llevó a cabo a una temperatura de la columna de 65 °C con ácido sulfúrico 5 mM como fase móvil con una tasa de flujo de 0,6 ml/min. El software Chromeleon 6.80 se utilizó para controlar el sistema y analizar los datos. Se analizaron cinco estándares (mezclas de D-glucosa, D-xilosa, xilitol, acetato, glicerol y etanol con concentraciones de 0,01-3 % (p/v)) para la cuantificación de los diferentes compuestos.
Ensayos de absorción de azúcar
Los ensayos de absorción de azúcar se realizaron según lo descrito por Bisson et al. (Bisson y Fraenkel, 1983) con modificaciones de acuerdo con Walsh et al. (Walsh et al., 1994).
Los transformantes de la cepa EBY.VW4000 se cultivaron en YEPE selectivo a una OD de 1,1-1,6, se cosecharon por centrifugación y se lavaron dos veces en regulador de absorción enfriado con hielo (temperatura ambiente, 3 min, 3.000x g). Las células se mantuvieron en hielo de aquí en adelante. La pella celular se resuspendió en regulador de absorción enfriado con hielo a una concentración de 60 mgww/ml y se dividió en partes alícuotas a 110 pl. Una alícuota de suspensión celular y una solución de azúcar se incubaron en un baño de agua a 30 °C durante 4-5 minutos. Se pipetearon 100 pl de la suspensión celular a la solución de azúcar (50 pl), se mezclaron brevemente mediante pipeteo y se incubaron durante 5 (D-[U-14C]-glucosa) o 20 segundos (D-[1-14C]-xilosa). La reacción de absorción se detuvo transfiriendo 100 pl de la mezcla a 10 ml de regulador de extinción en hielo, que se filtró inmediatamente a través de un filtro de membrana Durapore (tamaño de poro de 0,22 pm, Milliporo). El filtro se lavó dos veces con 10 ml de solución reguladora de extinción en hielo, se transfirió a un vial de centelleo que contenía 4 ml de cóctel de centelleo (Rotiszint eco plus, Roth) y se agitó vigorosamente. Además de esta muestra de filtro (cpmfiitro), se transfirieron 10 |jl de cada reacción directamente a un vial de centelleo con 4 ml de cóctel de centelleo para la determinación de los recuentos totales en la reacción (cpmtotal). Para determinar un valor para el azúcar que está enlazado inespecíficamente a la superficie celular o al filtro (cpmblanco), se mezclaron unas pocas muestras de 33,3 j l de solución de azúcar y 66,6 j l de suspensión celular en 10 ml de regulador de extinción en hielo y se trataron como se describe anteriormente. La radioactividad de todos los viales se analizó en un contador de centelleo líquido Wallac 1409.
Se utilizaron soluciones madre de glucosa o xilosa 2M, 500 mM o 20 mM (en H2O) para preparar las soluciones de azúcar para los ensayos (tres veces la concentración deseada en la reacción de absorción (S, concentración de sustrato), alícuotas de 50 jl). La absorción se midió a concentraciones de azúcar de 0,2, 1, 5, 25 y 100 mM para glucosa y 1, 5, 25, 66, 100, 200 y 500 mM para xilosa. La inhibición de la absorción de xilosa por la glucosa se midió a 25, 66 y 100 mM de xilosa con 25 y 100 mM de glucosa sin marcar adicional. Las soluciones de azúcar contenían 0,135 a 0,608 jC i de D-[U-14C]-glucosa (290-300 mCi/mmol) o D-[1-14C]-xilosa (55 mCi/mmol) (American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, Estados Unidos).
Los datos de los ensayos de absorción se utilizaron para los siguientes cálculos:
La cantidad de azúcar (Aazúcar, en nmol) absorbida durante el tiempo de incubación (t, en segundos) a una cierta concentración de azúcar (S, en mM):
Aazúcar _ ((cpmmuestra — cpmblanco)/(cpmtotal.10)).S100 ^ l
Velocidad de transporte (en nmol min-1mgww"1) calculada por miligramos de célula (m, en mgww):
V — (Aazúcar60 s)/(tm)
El cálculo de Km (constante de Michaelis), Vmax (velocidad de absorción inicial máxima) y Ki (constante del inhibidor para la inhibición competitiva) se realizó mediante análisis de regresión no lineal y ajuste de curva global en Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) con valores de tres mediciones independientes.
Procedimientos bioinformáticos
Las secuencias de ADN se obtuvieron de la base de datos del genoma de Saccharomyces (SGD, (Cherry et al., 2012)). Las alineaciones de secuencia para las proteínas transportadoras se realizaron utilizando el servidor de alineación múltiple PRALINE ((Simossis y Heringa, 2005)) con configuraciones estándar más la predicción de la estructura transmembrana de PHOBIUS (Kall et al., 2004). Los árboles filogenéticos se calcularon a partir de las alineaciones PRALINE con la filogenia ClustalW2 (Larkin et al., 2007) y se visualizaron con el software Phylodendron (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/java/apps/trees/). Las similitudes e identidades entre las secuencias de proteínas se calcularon a partir de las alineaciones de PRALINE utilizando SIAS (http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html). Las figuras para alineaciones de secuencias se crearon con el software ALINE (Bond y Schuttelkopf, 2009).
Ejemplo 1 T354A
1.1 Investigación de Gal2_T354A
El Ethanol Red es una cepa industrial, que es un candidato prometedor para las fermentaciones de hidrolizados lignocelulósicos. Los genes que codifican enzimas para la vía metabólica de xilosa y arabinosa podrían integrarse en el genoma, dando como resultado la cepa HDY.GUF5 (Demeke et al., 2013). HDY.GUF5 se desarrolló más a fondo en xilosa y se manipuló mediante manipulación genética, lo que finalmente dio como resultado la cepa HDY.GUF9 (Dietz 2013). HDY.GUF9 fue evolucionado aún más por la manipulación evolutiva en arabinosa, dando como resultado la cepa HDY.GUF10. Esta cepa también tuvo un comportamiento de crecimiento mejorado en la xilosa. La tasa de consumo de xilosa mejoró en aproximadamente un 80 %, y la tasa de consumo de arabinosa en aproximadamente un 25 %. La determinación de la tasa de absorción de xilosa con los ensayos de absorción de azúcar radiactivos reveló que HDY.GUF10 tenía una tasa de absorción de xilosa 35 % mayor que la de HDY.GUF9. Dado que Gal2 es el único transportador en S. cerevisiae que puede transportar xilosa y arabinosa en cantidades significativas, se aisló el gen GAL2 de ambas cepas y se secuenció. Se encontró una sustitución de aminoácidos en Gal2_HDY.GUF10 en comparación con Gal2_HDY.GUF9, que es T354A, probablemente ubicado dentro del canal de transporte en la hélice transmembrana 7 en el lado extracelular. Esta posición puede desempeñar un papel para la alteración de la conformación del transportador. La secuencia deseada se amplificó a partir del ADN cromosómico de HDY.GUF10 y se clonó en p426 para investigar el Gal2p modificado. Como control se utilizó Gal2p de Ethanol Red. Los vectores recibidos se transformaron en las cepas de evaluación para probar el crecimiento en varios medios.
1.2 Prueba para la funcionalidad de Gal2_T354A
Primero se realizó una prueba de crecimiento con los vectores en VW4000 en medios de glucosa y maltosa. El transportador de galactosa de tipo salvaje CEN.PK2, así como Gal2_ep3.1 se utilizaron como controles y como comparación. El tipo salvaje Gal2p de la cepa industrial Ethanol Red mostró el mismo crecimiento que el tipo salvaje de CEN.PK2, como se esperaba. El crecimiento de Gal2_GUF10 fue similar al crecimiento de ambos tipos salvajes en galactosa, mientras que el crecimiento en glucosa se parecía al crecimiento del mutante propenso a error (Figura 1).
Además, esto también se hizo con AFY10 para investigar la especificidad de la xilosa y la afinidad a la glucosa de los transformantes. El Gal2_EtOH Red de tipo salvaje no fue capaz de crecer en una concentración baja de xilosa, como 0,2 %. Sin embargo, se observó el crecimiento de Gal2_GUF10 en este medio. Aún así, el crecimiento de Gal2_GUF10 fue inferior a Gal2_ep3.1 en xilosa al 2 %. Por lo tanto, Gal2_GUF10 parece tener una mayor afinidad por la xilosa. En el medio con glucosa adicional, solo el mutante propenso a error mostró crecimiento (Figura 2).
Ejemplo 2 T354A/V71I
2.1 Efecto de T354A en combinación con otras mutaciones
El intercambio de aminoácidos T354A en Gal2 se encontró en la cepa Ethanol Red HDY.GUF10 que se desarrolló en arabinosa originada de la cepa HDY.GUF9. Esto indica que se mejoraron las propiedades de transporte de Gal2 para arabinosa. También se demostró que la mutación T354A en Gal2 de HDY.GUF10 podría restaurar el crecimiento en concentraciones bajas de xilosa. La secuencia de Ethanol Red Gal2 y Gal2_HDY.GUF9 difiere en dos aminoácidos de Gal2 de la cepa CEN.PK(L280R y V71I). Para determinar los efectos de estas dos diferencias, se realizaron constructos de expresión de plásmidos con Gal2 de CEN.PK que tienen V71I y L280R solo o en combinación con T354A. Para determinar sus propiedades, se realizaron pruebas de goteo de crecimiento después de la transformación de los constructos con las cepas de cribado EBY.VW4000 y AFY10. Como controles, se usaron CEN.PK Gal2 de tipo salvaje, vector p426_vector vacío y T354A solo en CEN.PK Gal2.
2.2 Crecimiento de células con Gal2_T354A en combinación con L280R y V71I en hexosas
Las siguientes variantes de Gal2 se construyeron en vectores de expresión: T354A, T354A+V71I, T354A+L280R, L280R e I71V. Fueron transformados en células EBY.VW4000 competentes. Luego se realizaron pruebas de goteo en diferentes fuentes de carbono.
Como se puede ver (Figura 3), los V71I y L280R por sí solos no tienen efecto en la absorción de glucosa o galactosa. El T354A por sí solo afecta fuertemente el crecimiento de la glucosa. La combinación de V71I y T354A no media crecimiento en glucosa. Sin embargo, la combinación de T354A y L280R puede mediar el crecimiento en glucosa. Sin embargo, el crecimiento es más lento que con Gal2 de tipo salvaje.
2.3 Crecimiento de células con Gal2_T354A en combinación con L280R y V71I en xilosa y mezclas de azúcar
Los diversos constructos se transformaron en células AFY10 junto con el vector YEp181_pHXT7-optXI_Clos, y se realizaron pruebas de goteo de crecimiento de dilución en serie.
Ninguna variante puede mediar el crecimiento en las placas de mezcla de xilosa-glucosa, lo que indica que todos los transportadores mutantes están inhibidos por la glucosa. El crecimiento con altas concentraciones de xilosa (20 g/l) no es muy diferente entre los diversos constructos. Sin embargo, el crecimiento en bajas concentraciones de xilosa (2 g/l) muestra diferencias significativas: L280R media el crecimiento como Gal2 de tipo salvaje; el crecimiento de la combinación de L280R y T354A se parece a T354A por sí solo o al control de vector vacío. V71I media un crecimiento muy lento en 2 g/l de xilosa. Sin embargo, la combinación de V71I y T354A media el crecimiento como el Gal2 tipo salvaje (Figura 4), mientras que, en contraste, T354A y V71I por sí solos median un crecimiento pobre en bajas concentraciones de xilosa. Esto demuestra que el intercambio de aminoácidos V71I en Gal2 de Ethanol Red es responsable de la baja actividad de absorción de xilosa, especialmente a bajas concentraciones de xilosa. Este defecto es suprimido por el intercambio adicional de T354A. Esto explica el comportamiento de crecimiento mejorado de GUF-10 en comparación con GUF-9. Como GUF-10 se desarrolló en un medio de arabinosa, se puede concluir que también la absorción de arabinosa de Gal2 a partir de Ethanol Red mejora con la mutación T354A al suprimir el intercambio de V71I.
Las características divulgadas en la descripción anterior, en las reivindicaciones y/o en los dibujos adjuntos pueden ser, por separado y en cualquier combinación de estos, material para realizar la invención en diversas formas de estos.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Polipéptido, que comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1,
en el que el polipéptido tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y en el que el polipéptido tiene una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo. 2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido es Gal2 de Saccharomyces cerevisiae.
3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a T354 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 es T354A.
4. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una sustitución de aminoácidos adicional en una posición correspondiente a V71 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, tal como la sustitución de aminoácidos V71I.
5. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a T354 aumenta la actividad de la función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo en comparación con el polipéptido sin tal sustitución de aminoácido.
6. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la sustitución o sustituciones de aminoácidos en una posición correspondiente a T354 aumenta la afinidad del polipéptido para pentosa o pentosas en comparación con el polipéptido sin dicha sustitución de aminoácido.
7. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la pentosa es D-xilosa y/o L-arabinosa.
8. Una molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8, que comprende además secuencias vector de ácido nucleico, preferiblemente secuencias vector de expresión, y/o que comprende secuencias promotoras de ácido nucleico y secuencias terminadoras de ácido nucleico y/o que comprende otras secuencias reguladoras de ácido nucleico
y/o en el que la molécula de ácido nucleico comprende ADNds, ADNss, PNA, CNA, ARN o ARNm o combinaciones de estos.
10. Célula huésped, que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 y que expresa preferiblemente dicha molécula de ácido nucleico, en la que dicha célula huésped es preferiblemente una célula de hongo y más preferiblemente una célula de levadura, tal como la especie de Saccharomyces, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. o Yarrowia sp, en la que preferiblemente la célula huésped pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae.
11. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, que tiene una tasa de absorción aumentada para D-xilosa y/o L-arabinosa en comparación con una célula que no contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o 9.
12. La célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, que contiene además - moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de una vía metabólica de xilosa (preferiblemente xilosa isomerasa y xiluloquinasa),
y/o
- moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de una vía metabólica de arabinosa (preferiblemente arabinosa isomerasa, ribuloquinasa, ribulosa-5-P 4-epimerasa), en la que, preferiblemente, la célula huésped tiene una mayor tasa de consumo de D-xilosa y/o L-arabinosa y/o una tasa de crecimiento más rápida con D-xilosa y/o L-arabinosa en comparación con una célula que no contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o 9.
13. Procedimiento para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica, que comprende la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, preferiblemente en una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, o una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para la producción de bioetanol y/u otros compuestos de base biológica y/o para la fermentación recombinante de biomaterial que contiene pentosa o pentosas, preferiblemente D-xilosa y/o L-arabinosa.
15. El procedimiento de la reivindicación 13 o el uso de la reivindicación 14, en el que los otros compuestos de base biológica se seleccionan de
1-butanol, isobutanol, 2-butanol, otros alcoholes,
ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido málico, otros ácidos orgánicos
aminoácidos, alcanos, terpenos, isoprenoides, disolventes, compuestos farmacéuticos, vitaminas.
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