CN113373073B - 一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法 - Google Patents

一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法，是通过在酿酒酵母中表达具有左旋葡聚糖激酶活性的蛋白，在酿酒酵母中建立左旋葡聚糖代谢途径，并在建立了左旋葡聚糖代谢途径的己糖转运蛋白全缺酿酒酵母重组菌株中利用表达转运蛋白Gal2p的突变体实现。同时本发明还提供了相关表达左旋葡聚糖转运蛋白Gal2pQ341A或Gal2pW455A和左旋葡聚糖激酶的重组酿酒酵母菌株YLGR341和YLGR455。实验证实，应用本发明提供的提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法在左旋葡聚糖的发酵中，Gal2p点突变菌株的生长与未点突变菌株相比优势明显，左旋葡聚糖利用能力明显高于未点突变菌株；其中点突变菌株YLGR341和YLGR455分别是未点突变菌株YLGR00G的3.70倍和3.72倍。

Description

一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的 方法
技术领域
本发明涉及一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法及其专用重组菌株，属于生物工程技术领域。
背景技术
木质纤维素是天然和可再生的资源，并且种类繁多来源广泛，利用木质纤维素生产燃料和化学品可以保障能源安全和减少环境污染，促进碳中和。
木质纤维素经预处理，打开纤维素、半纤维素、以及木质素之间的交联。获得的纤维素组分通常用纤维素酶水解获得葡萄糖，再加以利用。或者，纤维素还可以通过快速解热工艺，热解获得左旋葡聚糖(Levoglucosan，LG)(Jiang et al.2019)。某些微生物中存在着LG代谢途径，简单的讲，LG被左旋葡聚糖激酶(LGK)或者脱水乙酰胞壁酸激酶(AnmK)催化，生成6-磷酸葡萄糖，从而进入糖酵解途径。因此，木质纤维素原料预处理，分离获得纤维素，纤维素热解获得LG，LG被微生物代谢转化为化工产品，这样的工艺路线是可行的。例如，目前已有工作利用天然代谢左旋葡聚糖的菌株Rhodosporidium toruloides和Rhodotorulaglutinis产油脂(Lian,Garcia-Perez and Chen 2013)，Aspergillus terreus产衣康酸，Aspergillus niger产柠檬酸(Layton et al.2011)。也可以通过代谢工程策略，赋予某些不利用LG的菌株，例如大肠杆菌，利用LG的生产乙醇、苯乙烯等化学品的能力(Layton etal.2011,Lian et al.2016)。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是食品级安全的微生物，广泛地应用于食品、饮料和生物燃料的生产中，具有糖耐受性高、发酵速率高和生长旺盛等优点，但是在天然的酿酒酵母菌株中缺乏LG的代谢途径，因此不能利用LG。
Xie等从Aspergillus niger中分离纯化出了一个具有LGK活性的蛋白，并将其转入酿酒酵母中表达，并测得酶活是0.05U/mg(Xie et al.2005)。但鲜见高效利用LG生长代谢的菌株被报道。申请人推测，一方面可能酿酒酵母运输蛋白不能很好的运输LG到细胞内，另一方面可能是未找到合适的在酵母中高效表达的LGK。
酿酒酵母中有18个己糖转运蛋白，包括Hxt1p至Hxt17p和Gal2p(Reznicek etal.2015)，其中Gal2p底物广泛，可以转运半乳糖和葡萄糖，此外还对木糖和阿拉伯糖等戊糖具有一定的亲和力，适合作为候选LG运输蛋白。但经检索发现，有关显著提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法及其专用重组菌株还未见报道。
主要参考文献：
Chen,Y.,L.Daviet,M.Schalk,V.Siewers&J.Nielsen(2013)Establishing aplatform cell factory through engineering of yeast acetyl-CoAmetabolism.Metab Eng,15,48-54.
Jiang,L.Q.,A.Q.Zheng,J.G.Meng,X.B.Wang,Z.L.Zhao&H.B.Li(2019)Acomparative investigation of fast pyrolysis with enzymatic hydrolysis forfermentable sugars production from cellulose.Bioresour Technol,274,281-286.
Layton,D.S.,A.Ajjarapu,D.W.Choi&L.R.Jarboe(2011)Engineeringethanologenic Escherichia coli for levoglucosan utilization.BioresourTechnol,102,8318-22.
Lian,J.,M.Garcia-Perez&S.Chen(2013)Fermentation of levoglucosan witholeaginous yeasts for lipid production.Bioresour Technol,133,183-9.
Lian,J.,R.McKenna,M.R.Rover,D.R.Nielsen,Z.Wen&L.R.Jarboe(2016)Production of biorenewable styrene:utilization of biomass-derived sugars andinsights into toxicity.J Ind Microbiol Biotechnol,43,595-604.
Reznicek,O.,S.J.Facey,P.P.de Waal,A.W.Teunissen,J.A.de Bont,J.G.Nijland,A.J.Driessen&B.Hauer(2015)Improved xylose uptake in Saccharomycescerevisiae due to directed evolution of galactose permease Gal2 for sugar co-consumption.J Appl Microbiol,119,99-111.
Shen,Y.,X.Chen,B.Peng,L.Chen,J.Hou&X.Bao(2012)An efficient xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae strain obtained throughadaptive evolution and its global transcription profile.Appl MicrobiolBiotechnol,96,1079-91.
Wieczorke,R.,S.Krampe,T.Weierstall,K.Freidel,C.P.Hollenberg&E.Boles(1999)Concurrent knock-out of at least 20transporter genes is required toblock uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.Febs Letters,464,123-128.
Xie,H.J.,X.L.Zhuang,H.X.Zhang,Z.H.Bai&H.Y.Qi(2005)Screening andidentification of the levoglucosan kinase gene(lgk)from Aspergillus niger byLC-ESI-MS/MS and RT-PCR.FEMS Microbiol Lett,251,313-9.
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法及其专用重组菌株。
本发明所述提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法，是通过在酿酒酵母中表达具有左旋葡聚糖激酶活性的蛋白，在酿酒酵母中建立左旋葡聚糖代谢途径，并在建立了左旋葡聚糖代谢途径的己糖转运蛋白全缺酿酒酵母重组菌株中利用表达转运蛋白Gal2p的突变体实现，其特征在于：所述转运蛋白Gal2p突变体是命名为酿酒酵母内源的己糖转运蛋白Gal2p的点突变体Gal2pQ341A，其突变位点是SEQ ID NO:8所示的其野生型转运蛋白Gal2p的氨基酸序列第341位的谷氨酰胺突变为丙氨酸；或是命名为酿酒酵母内源的己糖转运蛋白Gal2p的点突变体Gal2pW455A，其突变位点是SEQ ID NO:8所示的其野生型转运蛋白Gal2p的氨基酸序列第455位的色氨酸突变为丙氨酸。
上述提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法中：所述在酿酒酵母中表达具有左旋葡聚糖激酶活性的蛋白优选是表达昆虫红酵母(Rhodotorulatoruloides)来源的脱水乙酰胞壁酸激酶(AnmK)。
本发明公开了一种含基因片段GAL2Q341A的表达载体，其特征在于：所述表达载体命名为pJFE3-GAL2Q341A，是将质粒pJFE3用限制性内切酶SalI进行线性化处理，随后将该线性化的质粒和基因片段GAL2 Q341A利用Gibson组装获得。
本发明公开了一种含基因片段Gal2pW455A的表达载体，其特征在于：所述表达载体命名为pJFE3-GAL2W455A，是将质粒pJFE3用限制性内切酶SalI进行线性化处理，随后将该线性化的质粒和基因片段Gal2pW455A利用Gibson组装获得。
本发明还公开了一株表达左旋葡聚糖转运蛋白Gal2pQ341A和左旋葡聚糖激酶的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株命名为YLGR341，是将表达载体pJFE3-GAL2Q341A利用醋酸锂完整细胞转化法转化带有左旋葡聚糖代谢途径的酿酒酵母菌株YLGR000，在SC-HIS-URA营养缺陷型固体培养基中筛选获得；其中所述SC-HIS-URA营养缺陷型固体培养基的配方是：1.7g/L酵母基础氮源，5g/L硫酸铵，0.77g/L CSM-HIS，20g/L琼脂粉，调节pH至6.0～6.5，添加20g/L麦芽糖作为碳源。
本发明还公开了一株表达左旋葡聚糖转运蛋白Gal2pW455A和左旋葡聚糖激酶的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株命名为YLGR455，是将表达载体pJFE3-GAL2W455A利用醋酸锂完整细胞转化法转化带有左旋葡聚糖代谢途径的酿酒酵母菌株YLGR000，在SC-HIS-URA营养缺陷型固体培养基中筛选获得；其中所述SC-HIS-URA营养缺陷型固体培养基的配方是：1.7g/L酵母基础氮源，5g/L硫酸铵，0.77g/L CSM-HIS，20g/L琼脂粉，调节pH至6.0～6.5，添加20g/L麦芽糖作为碳源。
实验证实，应用本发明提供的提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法在左旋葡聚糖的发酵中，Gal2p点突变菌株的生长与未点突变菌株相比优势明显，左旋葡聚糖利用能力明显高于未点突变菌株。本发明的有益效果体现在：在以左旋葡聚糖为唯一碳源的培养基中进行发酵时，本发明提供的表达左旋葡聚糖转运蛋白Gal2pQ341A或Gal2pW455A和左旋葡聚糖激酶的重组酿酒酵母菌株的生长和左旋葡聚糖利用率显著提高。其中表达转运蛋白突变子基因GAL2Q341A或GAL2W455A的重组菌株YLGR341或YLGR455在添加5g/L的左旋葡聚糖为唯一碳源的培养基的发酵中，重组菌株的生长与表达野生型转运蛋白基因GAL2的菌株YLGR00G相比具有明显的优势，在48h时，重组菌株YLGR341的左旋葡聚糖利用率达到了73.3％；重组菌株YLGR455的左旋葡聚糖利用率达到了73.7％，分别是菌株YLGR00G的3.70倍和3.72倍。
附图说明
图1：质粒pIYC04-Rho的组成结构示意图。
图2：表达转运蛋白及其突变体的重组质粒的组成结构示意图。
图3：表达转运蛋白和的重组菌株对左旋葡聚糖的利用。
其中，左图是各菌株利用左旋葡聚糖生长的情况；右图是各菌株发酵液中左旋葡聚糖浓度降低的情况，也就是菌株利用左旋葡聚糖的情况。发酵培养基以5g/L的左旋葡聚糖为唯一碳源。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、菌株、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。本发明涉及的方法均为遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。例如Methods in yeast genetics and genomics:a Cold Spring Harbor Laboratory coursemanual 2015edition(Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2005)。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。
实施例1：构建能在酿酒酵母中表达Rhodotorula toruloides来源的脱水乙酰胞壁酸激酶(AnmK)的重组菌株YLGR000
委托DNA序列合成公司合成密码子优化的编码Rhodotorula toruloides来源的AnmK(GenBank：CDR43051.1)的基因，具体序列见序列表SEQ ID NO:1，合成时基因两边带入NotI酶切位点。将质粒pIYC04(Chen et al.2013)用限制性内切酶NotI进行线性化处理，随后将线性化的质粒和基因片段PG-Rho利用GIBSON组装技术，组装获得重组质粒pIYC04-Rho。质粒pIYC04-Rho的组成结构见图1。
利用醋酸锂完整细胞转化法将重组质粒pIYC04-Rho转化至酿酒酵母己糖转运蛋白全缺菌株EBY.VW4000(Wieczorke et al.1999)中。在SC-HIS营养缺陷型固体培养基(1.7g/L酵母基础氮源，5g/L硫酸铵，0.77g/LCSM-HIS，20g/L琼脂粉，调节pH至6.0～6.5，添加20g/L麦芽糖作为碳源)中筛选获得的带有pIYC04-Rho的重组菌株，命名为YLGR000。其中，培养基配方中CSM-HIS是仅缺少组氨酸的酵母必需营养混合物，属于市售产品。
实施例2：克隆GAL2、GAL2Q341A、GAL2W455A基因并构建它们的表达载体
本实施例中PCR使用的均为市售PCR Mix产品，仅需加入模板和引物片段。PCR中各循环用于DNA合成的时间根据片段长度计算，具体计算公式参考PCR Mix产品说明书，本实施例中使用的产品为每分钟1000bp。
(1)基因片段GAL2的获得和其表达载体pJFE3-GAL2的构建
基因片段GAL2(Gene ID:850770)编码酿酒酵母己糖运输蛋白Gal2p(GenBank:CAA97640.1)。
以酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D的基因组DNA为模板，用引物GAL2-1-up(SEQ IDNO:2)和GAL2-2-dn(SEQ ID NO:3)获得基因片段GAL2，其中PCR退火温度为54℃。其中，基因组DNA也可使用其他常见酿酒酵母模式菌株的基因组DNA，基因组DNA可使用市售各种酿酒酵母染色体提取试剂盒提取。其中，引物GAL2-1-up和GAL2-2-dn上包含了一段和质粒pJFE3(Shen et al.2012)上SalI酶切位点两端同源的序列，用于和质粒pJFE3的Gibson组装。
将质粒pJFE3用限制性内切酶SalI进行线性化处理，随后将线性化的质粒和基因片段GAL2利用Gibson组装获得GAL2的表达载体，命名为pJFE3-GAL2。pJFE3-GAL2的组成结构见图2。
(2)基因片段GAL2Q341A的获得和其表达载体pJFE3-GAL2Q341A的构建
基因片段GAL2Q341A编码Gal2p的点突变体Gal2pQ341A。Gal2pQ341A是Gal2p第341位谷氨酰氨突变为丙氨酸的突变子。
以酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D的基因组为模板，用引物GAL2-1-up和Q341A-1-dn(SEQ ID NO:4)扩增出片段GAL2Q341A-1，退火温度为57℃；用引物Q341A-2-up(SEQ ID NO:5)、GAL2-2-dn扩增出目的片段GAL2Q341A-2，退火温度为54℃。随后进行片段GAL2Q341A-1和GAL2Q341A-2的重叠延伸PCR，以片段GAL2Q341A-1和GAL2Q341A-2互为引物和模板先在不加其他引物的条件下扩增10个循环，这10个循环的退火温度为60℃，之后加入引物GAL2-1-up和GAL2-2-dn继续扩增20个循环，这20个循环的退火温度为54℃，得到的最终片段即为GAL2Q341A。
将质粒pJFE3用限制性内切酶SalI进行线性化处理，随后将线性化的质粒和基因片段GAL2 Q341A利用Gibson组装获得GAL2的表达载体，命名为pJFE3-GAL2Q341A(图2)。
(3)基因片段GAL2W455A的获得和其表达载体pJFE3-GAL2W455A的构建
基因片段GAL2W455A编码Gal2p的点突变体Gal2pW455A。Gal2pW455A是Gal2p第455位色氨酸突变为丙氨酸的突变子。
以酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D的基因组为模板，用引物GAL2-1-up和W455A-1-dn(SEQ ID NO:6)扩增出片段GAL2W455A-1，退火温度为57℃，用引物W455A-2-up(SEQ ID NO:7)和GAL2-2-dn扩增出目的片段GAL2W455A-2，退火温度为54℃。随后进行片段GAL2W455A-1和GAL2W455A-2的重叠延伸PCR，以片段GAL2W455A-1和GAL2W455A-2互为引物和模板先在不加其他引物的条件下扩增10个循环，这10个循环的退火温度为60℃，之后加入引物GAL2-1-up和GAL2-2-dn继续扩增20个循环，这20个循环的退火温度为54℃，得到的最终片段GAL2W455A。
将质粒pJFE3用限制性内切酶SalI进行线性化处理，随后将线性化的质粒和基因片段GAL2W455A利用Gibson组装获得GAL2的表达载体，命名为pJFE3-GAL2W455A(图2)。
实施例3：构建引入LGK和转运蛋白的重组酿酒酵母
将表达载体pJFE3-GAL2、pJFE3-GAL2Q341A和pJFE3-GAL2W455A利用常规的醋酸锂完整细胞转化法分别依次转化带有左旋葡聚糖代谢途径的酿酒酵母菌株YLGR000，在SC-HIS-URA营养缺陷型固体培养基(1.7g/L酵母基础氮源，5g/L硫酸铵，0.77g/L CSM-HIS，20g/L琼脂粉，调节pH至6.0～6.5，添加20g/L麦芽糖作为碳源)中筛选转化子。
正确的转化子分别依次命名为YLGR00G、YLGR341和YLGR455。
实施例4：重组菌株在左旋葡聚糖中的发酵
将菌株YLGR00G、YLGR341、YLGR455进行在以左旋葡聚糖为唯一碳源的培养基中的发酵实验，观察左旋葡聚糖的利用情况。
发酵过程如下：从固体平板中分别依次挑取重组菌株YLGR341和YLGR455与对照菌株YLGR00G单菌落在5mL的SC-URA-HIS液体培养基中活化24h，碳源为20g/L的葡萄糖或麦芽糖。吸取2mL菌液转移到20mL新鲜SC-UAR-HIS培养基中继续震荡培养12h，8000rpm离心3min去掉上清。加入2mL无菌水重悬菌体并再次离心，此过程为清洗菌体，洗去残留的原培养基。把菌泥再次悬于20mL发酵培养基中，发酵培养基为添加了5g/L左旋葡聚糖为碳源的SC-UAR-HIS培养基，发酵条件为30℃,200rpm，发酵时间48h，初始OD600为1,定期取样500μL，测定OD600,后样品12000rpm离心1min，将上清用0.45μm微孔滤膜过滤然后利用HPLC测定上清液中左旋葡聚糖的含量。
上述SC-UAR-HIS培养基的配方是：1.7g/L酵母基础氮源，5g/L硫酸铵，0.77g/LCSM-HIS，调节pH至6.0～6.5。碳源根据实验具体需求添加。固体培养基添加20g/L琼脂粉。
HPLC利用层析柱为Aminex HPX-87H离子交换柱，以5mM稀硫酸为流动相，流速为0.6mL/min，柱温箱温度为45℃，利用示差折光检测器(RID-10A)检测左旋葡聚糖和代谢物。
发酵结果如图3所示，重组菌株YLGR341和YLGR455与对照菌株YLGR00G相比，左旋葡聚糖的利用能力显著提升，生长优势明显。其中，发酵48h，YLGR341的左旋葡聚糖利用率能够达到73.3％，YLGR455的左旋葡聚糖利用率能够达到73.7％，分别是转运蛋白未点突变的菌株YLRG00G的利用率的3.70和3.72倍，这表明点突变的转运蛋白Gal2pQ341A和Gal2pW455A能够提高对左旋葡聚糖的转运能力，Gal2pQ341A和Gal2pW455A突变体能够提高菌株的左旋葡聚糖利用能力。
序列表
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<120>一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法
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<211>1392
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 编码Rhodotorula toruloides来源的AnmK的基因
<400> 1
atggttaatg cttctactaa tgtgaatggt gctaatggta atgctaatgg tcatgctaat 60
ggtgatgcta atggttctaa tggtgtcaat ggtgcttcac atggtgctcc attggacttc 120
actgttttgg gtttaaattc tggtacttct atggatggta ttgattgtgc tttgtgtaga 180
tttagacaag attctcctga agctccaatg cattttgaat tgttgaaata tggtgaagtt 240
ccacttccac aaggtattaa gaaaagagtt atgaaaatga ttttgcataa tagaactact 300
cctgaagaat tgtctgaagt taatgttcaa ttgggtgaaa cttttgctga tgctgttgaa 360
tcttttattt cttctaatgg tattgataga tctactattg atgctttggc ttctcatggt 420
caaactattt ggttgttgtc tatgcctgaa gaaggtcaag ttaaatctgc tttgactatg 480
gctgaaggtt cttttttggc ttcaagaact ggtattactt ctattactga ttttagaatt 540
tctgatcaag ctgctggtag acaaggtgct ccattgatag cattttttga tgctttgttg 600
ttgcatcatc caactaaatt gagagcttgt caaaatattg gtggtattgc taatgtttgt 660
tttattccac ctgatcatca aggtggtgtt gatgcttgtt ttgattttga tactggtcct 720
ggtaatgttt ttattgatgc tgctgttaga tattttacta atggtgaaca agaatatgat 780
agagatggtg ctatgggtaa aagaggtaaa gttaatcaag ctatggttga tagatttttg 840
caacataaat attttggttt ggaaccacca aaaactactg gtagagaagt ttttagagat 900
actattgctc atgatttgat taaagaaggt gaatctttgg gtatgtctgc tgatgatatt 960
gttgctactg ttactaggat tcctgctcaa gctattgttg atcattatag aagatatgct 1020
ccatctcaag atattgatga aatttttatg tgtggtggtg gtgctaagaa tcctaatatt 1080
gttgctttca tccaagaatc ttacccaaat actaaaatta tgatgttgga tgaagctggt 1140
gttcctggtg atgctaaaga ggcttgtact tttgcttggc aaggtatgga ggctttggtt 1200
ggtagatcta ttcctgttcc aactagagtt gaaactagaa gaccatttgt tttgggtaaa 1260
gtttctcctg gtgaaaatta tagatctgtt ttgagaaaag gtatggcttt tggtggtgat 1320
tctgatcaat tgccatgggt tcatgaaatg gttaattatg ttgatggtaa agtttttaat 1380
aataaatggt aa 1392
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 引物GAL2-1-up
<400> 2
gttttaatta caaaggatcc tctagagtcg aatggcagtt gaggagaaca atatg 55
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 引物GAL2-2-dn
<400> 3
ctatcgattt caattcaatt caatcctgca ggtcgattat tctagcatgg ccttgtac 58
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列
<221>引物Q341A-1-dn
<400> 4
gtaccgtagt agaaaaaata attgttaccg gttaattgag cgaacatttg aacaaatac 59
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<221>引物Q341A-2-up
<400> 5
gttgatgggt gtatttgttc aaatgttcgc tcaattaacc ggtaacaatt attttttc 58
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列
<221>引物W455A-1-dn
<400> 6
cgacttgact ctcagtggga atgattctgc tgtgatgaca gcggcaactg gcgcccagg 59
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213>人工序列
<221>引物W455A-2-up
<400> 7
ctgttatgcc acaacctggg cgccagttgc cgctgtcatc acagcagaat c 51
<210> 8
<211>574
<212> PRT
<213>人工序列
<221>野生型转运蛋白Gal2p的氨基酸序列
<400> 8
MAVEENNMPV VSQQPQAGED VISSLSKDSH LSAQSQKYSN DELKAGESGS EGSQSVPIEI 60
PKKPMSEYVT VSLLCLCVAF GGFMFGWDTG TISGFVVQTD FLRRFGMKHK DGTHYLSNVR 120
TGLIVAIFNI GCAFGGIILS KGGDMYGRKK GLSIVVSVYI VGIIIQIASI NKWYQYFIGR 180
IISGLGVGGI AVLCPMLISE IAPKHLRGTL VSCYQLMITA GIFLGYCTNY GTKSYSNSVQ 240
WRVPLGLCFA WSLFMIGALT LVPESPRYLC EVNKVEDAKR SIAKSNKVSP EDPAVQAELD 300
LIMAGIEAEK LAGNASWGEL FSTKTKVFQR LLMGVFVQMF QQLTGNNYFF YYGTVIFKSV 360
GLDDSFETSI VIGVVNFAST FFSLWTVENL GHRKCLLLGA ATMMACMVIY ASVGVTRLYP 420
HGKSQPSSKG AGNCMIVFTC FYIFCYATTW APVAWVITAE SFPLRVKSKC MALASASNWV 480
WGFLIAFFTP FITSAINFYY GYVFMGCLVA MFFYVFFFVP ETKGLSLEEI QELWEEGVLP 540
WKSEGWIPSS RRGNNYDLED LQHDDKPWYK AMLE 574

Claims (2)

1.一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法，是通过在酿酒酵母中表达具有左旋葡聚糖激酶活性的蛋白，在酿酒酵母中建立左旋葡聚糖代谢途径，并在建立了左旋葡聚糖代谢途径的己糖转运蛋白全缺酿酒酵母重组菌株中利用表达转运蛋白Gal2p的突变体实现，其特征在于：所述转运蛋白Gal2p突变体是命名为酿酒酵母内源的己糖转运蛋白Gal2p的点突变体Gal2pQ341A，所述突变体是SEQ ID NO:8所示的其野生型转运蛋白Gal2p的氨基酸序列第341位的谷氨酰胺突变为丙氨酸；或是命名为酿酒酵母内源的己糖转运蛋白Gal2p的点突变体Gal2pW455A，所述突变体是SEQ ID NO:8所示的其野生型转运蛋白Gal2p的氨基酸序列第455位的色氨酸突变为丙氨酸。
2.根据权利要求1所述提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法，其特征在于：所述在酿酒酵母中表达具有左旋葡聚糖激酶活性的蛋白是表达昆虫红酵母(Rhodotorula toruloides)来源的脱水乙酰胞壁酸激酶(AnmK)。
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