JP2017536815A - Ｇａｌ２輸送体のバリアントおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｔ３５４に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換、および任意選択でさらなるアミノ酸置換（複数可）を含むＧａｌ２バリアントであるポリペプチドに関する。本発明は、さらに、ポリペプチドをコードする核酸分子および前記核酸分子を含有する宿主細胞に関する。本発明は、さらに、バイオエタノールおよび／または他のバイオベース化合物を産生するための方法であって、前記核酸分子を、好ましくは前記宿主細胞において発現させることを含む方法に関する。本発明は、バイオエタノールおよび／もしくは他のバイオベース化合物を産生するため、ならびに／または、ペントース（複数可）、好ましくはＤ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースを含有するバイオマテリアルの組み換え発酵を行うための、ポリペプチド、核酸分子または宿主細胞の使用にも関する。

Description

本発明は、Ｔ３５４に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換、および任意選択でさらなるアミノ酸置換（複数可）を含むＧａｌ２バリアントであるポリペプチドに関する。本発明は、さらに、ポリペプチドをコードする核酸分子および前記核酸分子を含有する宿主細胞に関する。本発明は、さらに、バイオエタノールおよび／または他のバイオベース化合物（ｂｉｏ−ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を産生するための方法であって、前記核酸分子を、好ましくは前記宿主細胞において発現させることを含む方法に関する。本発明は、バイオエタノールおよび／もしくは他のバイオベース化合物を産生するため、ならびに／または、ペントース（複数可）、好ましくはＤ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースを含有するバイオマテリアルの組み換え発酵を行うための、ポリペプチド、核酸分子または宿主細胞の使用にも関する。

ビール酵母、ワイン酵母およびパン酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、糖を発酵させてエタノールおよび二酸化炭素を生じさせるその特徴のために、数世紀にわたってパン、ワインおよびビールの生産に使用されてきた。バイオテクノロジーにおいては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、特に、異種タンパク質の産生に加えて、工業目的のエタノール産生において使用されている。エタノールは、工業の多数の支流において合成の最初の基質として使用されている。油の存在の不足が増していること、油の価格が上昇していること、および世界的にガソリンの必要性が継続的に増していることに起因して、代替燃料としてのエタノールの重要性が増している。さらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、イソブタノール、コハク酸、ファルネセン／ファルネサンまたはアルテミシニンのような他のバイオ燃料または価値のある生化学的化合物の産生のためにも使用されている。

価格が好都合なものであり、かつ効率的なバイオ燃料の産生を可能にするために、例えば、麦わら、木材産業および農業の廃棄物、ならびに日常の家庭の廃棄物の有機成分などの、リグノセルロースを含有するバイオマスの使用が最初の基質として提示される。第１に、前記バイオマスは、非常に都合のよいものであり、第２に、多量に存在する。リグノセルロースの３つの主要な成分は、リグニン、セルロースおよびヘミセルロースである。ヘミセルロースは、セルロースに次いで、２番目に頻繁に存在するポリマーであり、高度に分枝したヘテロポリマーである。ヘミセルロースは、ペントース（Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース）、ウロン酸（４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸）およびヘキソース（Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース）からなる。ヘミセルロースはセルロースよりも容易に加水分解することができるが、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅが通常変換することができないペントースＬ−アラビノースおよびＤ−キシロースを含有する。

発酵にペントースを使用できるようにするためには、これらをまず、原形質膜を通して細胞に侵入させなければならない。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＤ−キシロースもＬ−アラビノースも代謝することができないが、Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースを細胞内に取り込むことはできる。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、特異的な輸送体を有さない。輸送は、ヘキソース輸送体によって起こる。しかし、輸送体のＤ−キシロースに対する親和性はＤ−グルコースに対するものよりも明確に低い（ＫｏｔｔｅｒおよびＣｉｒｉａｃｙ、１９９３年）。例えばＰ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅまたはＰ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓなどの、Ｄ−キシロースを代謝することができる酵母では（Ｄｕ Ｐｒｅｅｚら、１９８６年）、Ｄ−グルコースを輸送する非特異的な低親和性輸送体と、Ｄ−キシロースのみに対する特異的な高親和性プロトン共輸送体の両方が存在する（Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌら、２００１年）。

以前の実験において、例えばＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅなどの、生来Ｄ−キシロースもしくはＬ−アラビノースを発酵させるか、または少なくとも同化することができる酵母がいくつか見いだされた。しかし、これらの酵母は、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースを発酵させてエタノールを生じさせる能力を完全に欠く、または非常に低いエタノール収量しか有さない（Ｄｉｅｎら、１９９６年）。さらに、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの取り込みに関してはほとんど分かっていない。酵母Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅでは、プロトン共輸送が仮定される（ＬｕｃａｓおよびＵｄｅｎ、１９８６年）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、ガラクトース透過酵素Ｇａｌ２から、それによりＤ−キシロースを輸送することが可能であるが、Ｄ−ガラクトースと構造が非常に類似したＬ−アラビノースも輸送されることが公知である（Ｋｏｕら、１９７０年）。大多数のヘキソース輸送体は、Ｄ−キシロースの取り込みを媒介することができる。

とりわけ酵母株Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓの種々の遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子改変のために使用した、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのバイオテクノロジーにより改変された酵母株におけるペントースのアルコール発酵が、近年、特にキシロースの発酵と関連して記載されている。工学操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、ここでは、特に、最初のキシロース同化のための遺伝子をキシロース発酵酵母であるＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓから、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに、すなわちヘキソースからのエタノール産生に伝統的に使用されている酵母に導入することに集中している（Ｊｉｎら、２００４年）。

Ｊｅｐｐｓｏｎら（２００６年）は、天然にキシロースを使用する酵母Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅにおけるものと同様であるか、または細菌代謝経路と同様であるキシロース代謝経路を導入することによる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるキシロース発酵について記載している。

Ｋａｔａｈｉｒａら（２００６年）は、燃料バイオエタノールの産生のための重要な材料として木材チップなどのリグノセルロースバイオマスの硫酸加水分解産物を記載している。この研究では、キシロースおよびセロオリゴ糖を発酵させることができる組み換え酵母株が構築された。このために、すなわち、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼ、ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のキシルロキナーゼの細胞間発現のため、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｌｅａｔｕｓ由来のベータ−グルコシダーゼの細胞表面上への提示のために、種々の遺伝子がこの酵母株に組み込まれた。木材チップの硫酸加水分解産物の発酵では、キシロースおよびセロオリゴ糖が組み換え株によって３６時間後に完全に発酵された。

Ｐｉｔｋａｎｅｎら（２００５年）は、キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓの遺伝子ならびに内在性キシルロキナーゼをコードする遺伝子を過剰発現するＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ株のキシロースケモスタット分離株の入手および特徴付けについて記載している。分離株は、単一のまたは主要な炭素源としてのキシロースについての好気性ケモスタット培養物から得られた。３０ｇ／ｌのキシロースを伴う最少培地での好気条件下で、ケモスタット分離株の成長速度は、元の株の成長速度の３倍であった（０．０５ｈ^−１と比較して０．１５ｈ^−１）。キシロース取り込み速度はほぼ２倍に上昇した。ペントースリン酸代謝経路の重要な酵素（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ）の活性は２倍に上昇した一方、それに従って、それらの基質（ペントース−５−リン酸、セドヘプツロース−７−リン酸）の濃度は低下した。

Ｂｒａｔら（２００９年）は、推定キシロースイソメラーゼをコードする配列について核酸データベースをスクリーニングし、最終的に、嫌気性細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来の高度に活性な新しい種類のキシロースイソメラーゼをクローニングし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて首尾よく発現させることができた。この酵素の異種発現により、酵母細胞にＤ−キシロースを代謝する能力およびそれを唯一の炭素源およびエネルギー源として使用する能力が付与される。

Ｄｅｍｅｋｅら（２０１３年）は、Ｄ−キシロースイソメラーゼ、およびペントースリン酸経路の酵素をコードするＣ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｘｙｌＡを含めた１３種の遺伝子を含有する発現カセットを開発し、カセットを工業用Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株であるＥｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄのゲノムに２コピーで挿入した。その後のＥＭＳ変異誘発、ゲノムシャッフリングおよびＤ−キシロース富化リグノセルロース加水分解産物における選択、続いてＤ−キシロースを伴う複合培地中での多数ラウンドの進化的な工学操作により、高度に効率的なＤ−キシロース発酵が徐々に確立された。

ＢｅｃｋｅｒおよびＢｏｌｅｓ（２００３年）は、成長のためにＬ−アラビノースを使用し、それを発酵してエタノールを生じさせることができるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの実験室株の工学操作および選択について記載している。これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡｒａＡならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡｒａＢおよびＡｒａＤからなる細菌のＬ−アラビノース代謝経路を過剰発現させること、ならびに、酵母株においてＬ−アラビノースを輸送する酵母ガラクトース透過酵素を同時に過剰発現させることによって可能であった。選択された株の分子解析から、Ｌ−アラビノースの使用のため予め決定された前提条件が、Ｌ−リブロキナーゼのより低い活性であることが示された。しかし、とりわけ、この酵母株では非常に遅い成長が報告されている。

ＷｉｅｄｅｍａｎｎおよびＢｏｌｅｓ（２００８年）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＬ−アラビノースイソメラーゼならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＬ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−Ｐ ４−エピメラーゼのコドン最適化された遺伝子を発現させることにより、Ｌ−アラビノース変換速度が強力に改善されたことを示している。

Ｆａｒｗｉｃｋら（２０１４年）は、もはやグルコースによって阻害されないペントース輸送体のスクリーニングおよび工学操作のための新しいシステムを開発した。このシステムは、全てのヘキソース輸送体および全てのヘキソ／グルコキナーゼが欠失したＤ−キシロース発酵酵母株（ｈｘｔ^０ ｈｘｋ^０株）に基づくものであった。Ｄ−グルコースはもはや炭素源として使用され得ないが、輸送レベルでＤ−キシロース利用に干渉する。結果として、漸増濃度のＤ−グルコースの存在下でＤ−キシロースの取り込みを可能にする変異体輸送体を容易に選択することができた。進化的な工学操作および変異誘発手法においてこのシステムを使用して、著者らは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅヘキソース輸送体から特異的なＤ−キシロース輸送体を生成することができた。これらの変異体輸送体のいくつかは、ガラクトース輸送体Ｇａｌ２のＮ３７６に対応する位置における交換を有した。しかし、これらは、グルコースに対する耐性を証明したが、大半で、キシロース取り込み速度が低下した。

ＷＯ ２００８／０８０５０５ Ａ１には、酵母細胞がＬ−アラビノースを取り込めるようにする、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来のアラビノース輸送体が開示されている。ＥＰ １１ ００１ ８４１．３には、ペントース発酵酵母を構築するための植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの特異的なアラビノース輸送体が開示されている。

ＷＯ ２０１２／０４９１７０ Ａ２およびＷＯ ２０１２／０４９１７３ Ａ１には、他の核酸のなかでも、輸送体をグルコースの阻害効果に対して耐性にするＧａｌ２のＴ２１９位置におけるアスパラギンへの変異またはＮ３７６におけるセリンへの変異を含む、アラビノース透過酵素活性を有するポリペプチドを含有し発現するペントースおよびグルコース発酵酵母細胞が開示されている。

国際公開第２０１２／０４９１７０号 国際公開第２０１２／０４９１７３号

ペントースに対するより高い親和性および／またはより高い活性を、特にグルコース耐性と組み合わせて有し、低ペントース濃度においてさえもＤ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースを酵母細胞などの細胞に高い取り込み速度で特異的に取り込ませること、したがって、特に、グルコースが同時に存在する中で、ペントース、特にＤ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースの利用および発酵を促進することを可能にする特異的なペントース輸送体、特に、特異的なＤ−キシロース輸送体が当技術分野で依然として必要とされている。

したがって、本発明の目的は、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースなどのペントース（複数可）をより高い活性および／またはより高い親和性で輸送する、改善されたかつ／またはより特異的な輸送体を提供することである。

本発明によると、この目的は、配列番号１のアミノ酸配列のＴ３５４に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％または好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるペントース輸送機能を有するポリペプチドによって解決される。

本発明によると、この目的は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子によって解決される。

本発明によると、この目的は、本発明の核酸分子を含有し、好ましくは前記核酸分子を発現する宿主細胞であって、好ましくは真菌細胞、より好ましくは酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．またはＹａｒｒｏｗｉａ ｓｐである宿主細胞によって解決される。

本発明によると、この目的は、バイオエタノールおよび／または他のバイオベース化合物を産生するための方法であって、本発明による核酸分子を、好ましくは本発明による宿主細胞において発現させることを含む方法によって解決される。

本発明によると、この目的は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸分子、または本発明による宿主細胞を、バイオエタノールおよび／もしくは他のバイオベース化合物を産生するため、ならびに／または、ペントース（複数可）、好ましくはＤ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースを含有するバイオマテリアルの組み換え発酵を行うために使用することによって解決される。

本発明を以下により詳細に記載する前に、本明細書に記載されている特定の方法体系、プロトコールおよび試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、本明細書において引用された全ての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

Ｇａｌ２バリアント
上記の通り、本発明は、Ｇａｌ２バリアントを提供する。

特に、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列のＴ３５４に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを提供する。

本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％または好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるペントース輸送機能を有する。

本発明のポリペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ２であることが好ましい。

配列番号１は、ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＣおよびＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤのＧａｌ２の野生型タンパク質またはアミノ酸配列である。

ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＣのＧａｌ２は、５７４アミノ酸のタンパク質である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＦＵＮＧＩ／ｇｅｔＳｅｑ．ｐｌ？ｓｅｑ＝ＹＬＲ０８１Ｗ＿ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ

本発明によるポリペプチド、好ましくはＧａｌ２バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、なお一層好ましくは少なくとも９０％同一、さらに一層好ましくは９５％同一、さらに一層好ましくは９９％同一であるアミノ酸配列のＴ３５４に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

本明細書で使用される場合、「に対応する位置における」という用語は、配列番号１におけるそれぞれの位置を意味するが、関連するポリペプチド鎖において、それは、別の相対的な位置番号を有し得る。等価の置換は、比較のためにアラインメントすることができる両方の配列における位置を比較することによって決定することができる。アミノ酸の相対的な位置は、関連するポリペプチドの長さが異なること、または関連するポリペプチドにおけるアミノ酸の欠失もしくは付加に起因して変動し得る。

本発明によるポリペプチド、好ましくはＧａｌ２バリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるペントース輸送機能、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるＤ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノース輸送機能を有する。

ペントースは、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースであることが好ましい。

本明細書で使用される場合、別段の指定がなければ、「キシロース」という用語はＤ−キシロースと同じものを意味し、「アラビノース」という用語はＬ−アラビノースと同じものを意味し、「グルコース」という用語はＤ−グルコースと同じものを意味する。

本明細書で使用される場合、「パーセント（％）同一」という用語は、２つのアミノ酸配列間の配列同一性を指す。同一性は、比較のためにアラインメントすることができる両方の配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の等価の位置が同じアミノ酸によって占められている場合、分子はその位置において同一であるとみなされる。

本明細書で使用される場合、「機能的等価物」という用語は、配列番号１のアミノ酸配列と１００％同一ではなく、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、タンパク質の活性または機能を変更または変化させないアミノ酸の付加および／または挿入および／または欠失および／または置換および／または交換を含むアミノ酸配列を指す、すなわち、「機能的等価物」は、例えば、保存的アミノ酸置換またはより小さな欠失および／もしくは挿入がｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるＬ−アラビノース輸送機能に実質的に影響を及ぼさない限り、これらの改変を有するアミノ酸配列を包含する。

一般に、タンパク質のアミノ酸配列内のいくつかのアミノ酸の交換は、そのタンパク質の（二次または三次）構造、機能および／または活性に影響を及ぼさないという事実は、当業者には知られている。本明細書に開示されているアミノ酸配列と比較してそのような「中性」のアミノ酸の交換を伴うアミノ酸配列は、本発明の範囲内に入る。

好ましい実施形態では、配列番号１のＴ３５４に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む本発明によるポリペプチド、好ましくはＧａｌ２バリアントは、アミノ酸置換Ｔ３５４Ａを含む。

Ｔ３５４に対応する位置におけるアミノ酸置換により、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるペントース輸送機能の活性が、そのようなアミノ酸置換（複数可）を有さないポリペプチドと比較して増大することが好ましい。

Ｔ３５４に対応する位置におけるアミノ酸置換により、ポリペプチドのペントース（複数可）に対する親和性が、そのようなアミノ酸置換（複数可）を有さないポリペプチドと比較して増大することが好ましい。

− さらなるアミノ酸置換（複数可）
一実施形態では、本発明によるポリペプチド、好ましくはＧａｌ２バリアントは、さらなるアミノ酸置換（複数可）：
好ましくは配列番号１のアミノ酸配列のＶ７１に対応する位置におけるアミノ酸置換（複数可）
を含む。

前記さらなるアミノ酸置換は、Ｖ７１Ｉであることが好ましい。
本発明は、好ましくは、以下のポリペプチド／Ｇａｌ２バリアント：
− Ｔ３５４Ａ
− Ｔ３５４Ａ／Ｖ７１Ｉ
を提供する。

核酸分子
上記の通り、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。

一実施形態では、本発明の核酸分子は、
− ベクター核酸配列、好ましくは発現ベクター配列、
ならびに／または、
− プロモーター核酸配列およびターミネーター核酸配列
をさらに含み、
かつ／または、
− 他の調節核酸配列を含む。

一実施形態では、本発明の核酸分子は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡまたはこれらの組合せを含む。

本発明による核酸分子は、（本発明によるアミノ酸置換（複数可）の追加以外は）天然に存在する核酸配列と同一であるかまたは宿主細胞における使用に関してコドン最適化された、核酸配列を含むことが好ましい。

本発明に従って使用される核酸分子は、核酸発現構築物であることが好ましい。

本発明による核酸発現構築物は、例えば、本発明による核酸分子を含む発現カセット、または本発明による核酸分子もしくは発現カセットを含む発現ベクターである。

核酸発現構築物は、本発明のポリペプチド（複数可）をコードする核酸配列と作動可能に連結したプロモーター配列およびターミネーター配列などの調節配列を含むことが好ましい。

核酸発現構築物は、５’および／もしくは３’認識配列ならびに／または選択マーカーをさらに含んでよい。

宿主細胞
上記の通り、本発明は、本発明による核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。

本発明の宿主細胞は、前記核酸分子を発現することが好ましい。

好ましくは、本発明による宿主細胞は、真菌細胞、より好ましくは酵母細胞である。

酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．またはＹａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．の群より選択される属のメンバーであることが好ましい。

酵母細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ、Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの群より選択される種のメンバー、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａであることがより好ましい。

好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に属する。

本発明のポリペプチド（好ましくはＧａｌ２バリアント（複数可））をコードする核酸分子／配列が宿主細胞（好ましくは酵母細胞）において発現されると、宿主細胞に、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースを取り込む能力が付与され、これらは、その後、さらに代謝され得る。これを通じて、細胞は、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースを炭素源として成長することができる。

宿主細胞（好ましくは酵母細胞）は、本発明による核酸分子を含有しない細胞と比較してＤ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースの取り込み速度が上昇していることが好ましい。

好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞（好ましくは酵母細胞）は、
−キシロース代謝経路のタンパク質（好ましくはキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ）をコードする核酸分子、
ならびに／または、
− アラビノース代謝経路のタンパク質（好ましくはアラビノースイソメラーゼ、リブロキナーゼ、リブロース−５−Ｐ ４−エピメラーゼ）をコードする核酸分子
さらに含有する。

そのような宿主細胞は、
− Ｄ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノース利用速度の上昇
ならびに／または、
− 本発明による核酸分子を含有しない細胞と比較して、Ｄ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースを用いたより速い成長速度
を有することが好ましい。

例えば、本発明の宿主細胞（好ましくは酵母細胞）は、アラビノース代謝経路のタンパク質、特に、アラビノースイソメラーゼ、リブロキナーゼ、リブロース−５−Ｐ ４−エピメラーゼをコードする核酸分子をさらに含有してよい。

細菌のアラビノース代謝経路のタンパク質、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒａＢ Ｌ−リブロキナーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒａＤ Ｌ−リブロース−５−Ｐ ４−エピメラーゼ、およびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ａｒａＡ Ｌ−アラビノース−イソメラーゼが好ましい。

好ましい実施形態では、本発明による宿主細胞（好ましくは酵母細胞）を遺伝子ａｒａＡ（Ｌ−アラビノース−イソメラーゼ）、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）およびａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ）の導入および発現によって改変し、さらに、例えば、ＥＰ １ ４９９ ７０８ Ｂ１において本発明者らにより記載されている通り、ＴＡＬ１（トランスアルドラーゼ）遺伝子を過剰発現させ、これに加えて、本発明による核酸分子を少なくとも１つ含有させる。

酵母細胞の意図された使用に応じて、前記酵母細胞に、トランスアルドラーゼＴＡＬ１および／もしくはＴＡＬ２、トランスケトラーゼＴＫＬ１および／もしくはＴＫＬ２、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼＲＰＥ１、リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼＲＫＩ１、または同じ酵素活性をコードする他の生物体由来の対応する配列などの、さらなるタンパク質をコードするさらなる核酸配列を含有、発現または過剰発現させることができる。

例えば、本発明の宿主細胞（好ましくは酵母細胞）に、キシロース代謝経路のタンパク質、特にキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする核酸分子をさらに過剰発現させることができる。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたはＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｘｙｌＡキシロースイソメラーゼおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＸＫＳ１キシルロキナーゼが好ましい。

好ましい実施形態では、本発明による宿主細胞（好ましくは酵母細胞）を、遺伝子ｘｙｌＡ（キシロースイソメラーゼ）、ＸＫＳ１（キシルロキナーゼ）の導入および／または過剰発現によって改変し、さらに、ＴＡＬ１（トランスアルドラーゼ）遺伝子を過剰発現させる。

酵母細胞の意図された使用に応じて、前記酵母細胞に、トランスアルドラーゼＴＡＬ１および／もしくはＴＡＬ２、トランスケトラーゼＴＫＬ１および／もしくはＴＫＬ２、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼＲＰＥ１、リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼＲＫＩ１、または同じ酵素活性をコードする他の生物体由来の対応する配列などの、さらなるタンパク質をコードするさらなる核酸配列を含有、発現または過剰発現させることができる。

バイオエタノールを産生するための方法および使用
上記の通り、本発明は、バイオエタノールおよび／または他のバイオベース化合物を産生するための方法を提供する。

前記方法は、本発明による核酸分子を、好ましくは本発明による宿主細胞において発現させることを含む。

上記の通り、本発明は、
バイオエタノールおよび／もしくは他のバイオベース化合物を産生するため、ならびに／または、ペントース（複数可）、好ましくはＤ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースを含有するバイオマテリアルの組み換え発酵を行うための、
− 本発明によるポリペプチド、
− 本発明による核酸分子、または、
− 本発明による宿主細胞
の使用を提供する。

「バイオベース化合物」または「他のバイオベース化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、特に微生物を使用することによって、生物材料および原料（バイオマス）から得られる化学化合物および物質を指す。

（他の）バイオベース化合物は、これらに限定されないが、
乳酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸または他の有機酸、
１−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、他のアルコール、
アミノ酸、アルカン、テルペン、イソプレノイド、溶媒、医薬化合物、
ビタミン
から選択される化合物であってよい。

好ましい実施形態についてのさらなる記載
本発明者らは、
野生型またはそれぞれのアミノ酸置換（複数可）を有さないＧａｌ２ポリペプチドと比較して、
− ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／もしくはｉｎ ｖｉｖｏにおけるペントース輸送機能の活性の増大、ならびに／または
− ペントース（複数可）に対する親和性の増大
を示すＧａｌ２バリアントを同定した。

したがって、本発明者らは、宿主細胞（好ましくは酵母細胞）に、Ｄ−キシロースおよび／またはＤ−アラビノースを取り込む能力、好ましくは、ペントース（複数可）、好ましくはＤ−キシロースおよび／またはＤ−アラビノースの取り込みを増加する能力をこのように付与するＧａｌ２バリアントを同定した。

これに関して、実施例および図面も参照する。

− Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースの取り込み
ペントース（複数可）、特に、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって代謝されるのを可能にするには、これらがまず細胞に取り込まれなければならない。

ペントースであるＤ−キシロースについて試験したヘキソース輸送体は全て、ヘキソースに対してＤ−キシロースに対するものよりもはるかに高い親和性を有する。Ｌ−アラビノースについても同様の状況が仮定される。ペントース（Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノース）を利用することができる今までに構築された全ての株については、成長が比較的遅いことが報告されている。とりわけ、ペントースの取り込みが遅く乏しいことがこの理由として挙げられている（ＢｅｃｋｅｒおよびＢｏｌｅｓ、２００３年；Ｒｉｃｈａｒｄら、２００２年）。Ｄ−グルコースとＤ−キシロースまたはＤ−グルコースとＬ−アラビノースからなる糖混合物における発酵では、糖は同時には変換されない。輸送体のＤ−グルコースに対する親和性が高いことに起因して、Ｄ−グルコースが最初に代謝される。いわゆるディオーキシーシフト（ｄｉａｕｘｉｃ ｓｈｉｆｔ）が起こる。Ｄ−グルコースが使い尽くされた後に初めて、ペントースが、第２の明確により遅い成長相で変換される（Ｋｕｙｐｅｒら、２００５年ａ；Ｋｕｙｐｅｒら、２００５年ｂ）。これはペントースに特異的な輸送体が存在しないことにより説明される。

− Ｇａｌ２
ヘキソースであるガラクトースは、グルコースに対しても同等に親和性（Ｋ_ｍ＝１．５〜１．９）である高親和性輸送体Ｇａｌ２（Ｋ_ｍ＝１〜５ｍＭ）によって輸送される（例えば、Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９７年を参照されたい）。ガラクトースを利用するために必要な他の構造遺伝子（ＧＡＬ１、ガラクトースキナーゼ；ＧＡＬ１０、ムタロターゼ／ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ；ＧＡＬ７、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）と同じく、Ｇａｌ２の発現は、グルコースの存在下で抑圧され、またガラクトースによる誘導も必要である。Ｇａｌ２はまた、異化産物不活化の標的でもある（ＨｏｒａｋおよびＷｏｌｆ、１９９７年）。Ｇａｌ２は、Ｌ−アラビノースを輸送することができるごく少ない輸送体のうちの１つである。他のヘキソース輸送体の大部分と同じく、Ｇａｌ２は、Ｄ−キシロースを輸送することができる。しかし、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースに対する親和性はかなり低い。したがって、低Ｄ−キシロース濃度または低Ｌ−アラビノース濃度では、取り込み活性は非常に低い。

Ｆａｒｗｉｃｋら（２０１４年）は、Ｄ−グルコースの存在下でＤ−キシロースの取り込みを可能にする変異体輸送体を開発した。これらの変異体輸送体のいくつかは、ガラクトース輸送体Ｇａｌ２のＮ３７６に対応する位置におけるアミノ酸の交換を有した。しかし、これらのグルコースに対する耐性は証明されたが、それらの大部分で、キシロース取り込み速度が低下した。

本発明のポリペプチドは、特に、それらをグルコースによる阻害に対して耐性にする変異と組み合わせて、キシロースに対する取り込み速度および／または親和性の増大を示す。

改善されたＧａｌ２由来のペントース輸送体を見いだすために、種々の変異誘発方法を使用する必要があっただけでなく、非常に特異的な条件下で、種々の異なる改変を有する工学操作された酵母株を用いて、進化的に工学操作する必要があった。これらの輸送体を綿密なスクリーニングシステムにおいて成長試験および糖取り込みアッセイを用いて試験する必要があった。最後に、変異体輸送体を配列決定する必要があり、また種々の変異からいずれが最終的に性質の改善に関与するかを解明する必要があった。

Ｄ−キシロースは、硬材および麦わらなどのキシランに富んだリグノセルロース系バイオマス中の糖全体の最大３５％を占める（Ｄｅｍｅｋｅら、２０１３年を参照されたい）。有意な量のアラビノースを有するバイオマス（データ源：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｅｒｅ．ｅｎｅｒｇｙ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｐｒｏｇｓ／ｓｅａｒｃｈ１．ｃｇｉ）：
バイオマスの型 Ｌ−アラビノース［％］
スイッチグラス ３．６６
アブラススキ（Ｌａｒｇｅ ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ） ３．５５
ヒロハノウシノケグサ ３．１９
ニセアカシア ３
トウモロコシ茎葉 ２．６９
麦わら ２．３５
サトウキビバガス（Ｓｕｇａｒ ｃａｎ ｂａｇａｓｓｅ） ２．０６
メドハギ １．７５
モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ） １．６５

本発明によるＧａｌ２バリアントはまた、その利用が非常に重要である。

酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける機能的であり同時に特異的であるペントース輸送体の使用の可能性は、第一には、リグノセルロース加水分解産物からのバイオエタノールの産生、および、特にペントース濃度が低くグルコースが同時に存在する場合の、さらなる化学合成のための高品質の前駆産物の産生である。

以下の一覧は、「Ｔｏｐ Ｖａｌｕｅ Ａｄｄｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｆｒｏｍ Ｂｉｏｍａｓｓ」試験に由来する（ｗｗｗ１．ｅｅｒｅ．ｅｎｅｒｇｙ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｐｄｆｓ／３５５２３．ｐｄｆを参照されたい）。ここでは、バイオマスから産生することができる３０種の化学物質が特に価値があるとカテゴリー化された。

これらの化学物質がリグノセルロースから生物変換（例えば酵母を用いた発酵）によって産生されたらすぐに、ヘミセルロース糖であるアラビノースおよびキシロースに対して特異的な高度に活性な輸送体（複数可）を有することが重要である。

以下の実施例および図面は本発明を例示するが、本発明はそれらに限定されない。

図１：ＥＢＹ．ＶＷ４０００におけるＧａｌ２＿Ｔ３５４Ａの成長試験。形質転換体を、２０ｇ／ｌのマルトースを伴うＳＣＭ−ｕｒａ、５ｍｌ中、３０℃で培養し、水で洗浄し、ＯＤ_６００を１に調整した。その後、段階希釈した。それぞれの培地に５μｌを滴下し、それを３０℃で３日間インキュベートした。希釈に対する対照として２０ｇ／ｌのマルトースを伴うＳＣＭ−ｕｒａを取得した。変異させた輸送体の細胞を、０．２％グルコースを伴うＳＣＤ−ｕｒａおよび２％グルコースを伴うＳＣＤ−ｕｒａ、ならびに、０．２％Ｄ−ガラクトースを伴うＳＣＧ−ｕｒａおよび２％Ｄ−ガラクトースを伴うＳＣＧ−ｕｒａに滴下して、それらの機能性を試験した。さらに、ＣＥＮ．ＰＫ２およびＥｔｈａｎｏｌ ＲｅｄならびにＧａｌ２＿ｅｐ３．１の野生型を比較のために使用した。変異Ｔ３５４Ａを有するガラクトース輸送体はＨＤＹ．ＧＵＦ１０に由来する。

図２：ＡＦＹ１０におけるＧａｌ２＿Ｔ３５４Ａの成長試験。形質転換体を、２％エタノールを伴うＳＣＥ−ｕｒａ−ｌｅｕ、５ｍｌ中、３０℃で培養し、水で洗浄し、ＯＤ_６００を１に調整した。その後、段階希釈した。それぞれの培地に５μｌを滴下し、それを３０℃で５日間インキュベートした。希釈に対する対照として、２％エタノールを伴うＳＣＥ−ｕｒａ−ｌｅｕを取得した。変異させた輸送体の細胞を、０．２％Ｄ−キシロースを伴うＳＣＸ−ｕｒａ−ｌｅｕおよび２％Ｄ−キシロースを伴うＳＣＸ−ｕｒａ−ｌｅｕ、ならびに１％Ｄ−キシロースと４％Ｄ−グルコースと共に伴うＳＣ−ｕｒａ−ｌｅｕおよび０．２％Ｄ−キシロースと２％Ｄ−グルコースを伴うＳＣ−ｕｒａ−ｌｅｕに滴下して、それらの機能性を試験した。さらに、ＣＥＮ．ＰＫ２およびＥｔｈａｎｏｌ ＲｅｄならびにＧａｌ２＿ｅｐ３．１の野生型を比較のために使用した。変異Ｔ３５４Ａを有するガラクトース輸送体はＨＤＹ．ＧＵＦ１０に由来する。

図３：３０℃で４日後のＥＢＹ．ＶＷ４０００におけるＧａｌ２＿Ｔ３５４ＡとＶ７１ＩおよびＬ２８０Ｒの組合せの滴下試験。いくつかの希釈物を左から右に滴下した（無希釈、１：１０、１：１００、１：１０００）。

図４：３０℃で６日後のＡＦＹ１０におけるＧａｌ２＿Ｔ３５４ＡとＶ７１ＩおよびＬ２８０Ｒの組合せの滴下試験。いくつかの希釈物を左から右に滴下した（無希釈、１：１０、１：１００、１：１０００）。

（実施例）
方法
株および培地

− 細菌
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）

完全培地ＬＢ １％トリプトン、０．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年を参照されたい）

プラスミドによりコードされる抗生物質耐性に関する選択のために、オートクレーブ処理した後に培地に４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した。固形培養培地は１．９％寒天をさらに含有した。培養は３７℃で行った。

− 酵母
ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ
ＭＡＴａ ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ ＭＡＬ２−８^ｃ ＳＵＣ２（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）

ＥＢＹ．ＶＷ４０００株
ＥＢＹ．ＶＷ４０００（遺伝子型：ＭＡＴａ ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｈｉｓ３−Δ１ ＭＡＬ２−８ｃ ＳＵＣ２ Δｈｘｔ１−１７Δｇａｌ２ ｓｔｌΔ：：ｌｏｘＰ ａｇｔ１Δ：：ｌｏｘＰ ｍｐｈ２Δ：：ｌｏｘＰ ｍｐｈ３Δ：：ｌｏｘＰ）（Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅら、１９９９年）

Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ株
Ｌｅｓａｆｆｒｅ、Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅから入手可能。Ｄｅｍｅｋｅら（２０１３年）に記載されている。

ＨＤＹ．ＧＵＦ１０株
Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄに由来する、キシロースおよびアラビノースを消費する工業用Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（Ｄｉｅｔｚ ２０１３年）。

ＡＦＹ１０株
ＥＢＹ．ＶＷ４０００ ｇｌｋ１Δ：：ｌｏｘＰ ｈｘｋ１Δ：：ｌｏｘＰ ｈｘｋ２Δ：：ｌｏｘＰ ｙｌｒ４４６ｗΔ：：ｌｏｘＰ ｐｙｋ２Δ：：ｐＰＧＫ１−ｏｐｔ．ＸＫＳ１−ｔＰＧＫ１ ｐＴＰＩ１−ＴＡＬ１−ｔＴＡＬ１ ｐＴＤＨ３−ＴＫＬ１−ｔＴＫＬ１ ｐＰＦＫ１−ＲＰＥ１−ｔＲＰＥ１ ｐＦＢＡ−ＲＫＩ１−ｔＲＫＩ１ ｌｏｘＰ（Ｆａｒｗｉｃｋら、２０１４年）。

ＡＦＹ１０Ｘ株
ＡＦＹ１０＋ＹＥｐ−ｋａｎＲ＿ｏｐｔＸＩ（Ｆａｒｗｉｃｋら、２０１４年）。

− 合成完全選択的培地ＳＣ
０．６７％酵母ニトロゲンベース アミノ酸および硫酸アンモニウム不含、０．５％硫酸アンモニウム、２０ｍＭのリン酸二水素カリウム、ｐＨ６．３、使用するプラスミドの栄養要求性マーカーの対応するアミノ酸を伴わないアミノ酸／核酸塩基溶液、それぞれ示されている濃度の炭素源

合成完全培地中のアミノ酸および核酸塩基の濃度（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、１９７５年）：アデニン（０．０８ｍＭ）、アルギニン（０．２２ｍＭ）、ヒスチジン（０．２５ｍＭ）、イソロイシン（０．４４ｍＭ）、ロイシン（０．４４ｍＭ）、リシン（０．３５ｍＭ）、メチオニン（０．２６ｍＭ）、フェニルアラニン（０．２９ｍＭ）、トレオニン（０．４８ｍＭ）、トリプトファン（０．１９ｍＭ）、チロシン（０．３４ｍＭ）、ウラシル（０．４４ｍＭ）およびバリン（０．４９ｍＭ）。炭素源として、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、エタノールおよびマルトースを示されている通り使用した。

固形完全培地および選択的培地は１．９％寒天をさらに含有した。酵母細胞の培養は３０℃で行った。

ＤＮＡの調製
− Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡの単離
Ｅ．ｃｏｌｉ培養物からのプラスミドＤＮＡの小規模調製をＧｅｎｅＪＥＴ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の説明書に従って使用して行った。大規模調製にはＱＵＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用した。

− Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの単離
酵母細胞からゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを単離するために、定常期培養物５〜１０ｍｌを遠心分離（１分、２０００×ｇ）によって回収し、１ｍｌの滅菌ｄｄＨ_２Ｏで１回洗浄した。細胞ペレットを４００μｌのＹＰ緩衝液１に、ボルテックスすることによって再懸濁させ、次いで、４００μｌのＹＰ緩衝液２、１／３〜２／３Ｖｏｌのガラスビーズ（φ０．２５〜０．５ｍｍ）を添加し、ＶＸＲ ｂａｓｉｃ Ｖｉｂｒａｘ（ＩＫＡ）において２０００ｒｐｍで８分振とうすることによって溶解させた。細胞片を遠心分離（３０秒、１６０００×ｇ）によってペレット化し、上清６５０μｌを新しいエッペンドルフチューブに移した。３２５μｌの冷ＹＰ緩衝液３を添加し、タンパク質および他の混入物を沈殿させるために、試料をボルテックスし、次いで、氷上で１０分間インキュベートした。試料を遠心分離し（１０〜１５分、４℃、１６０００×ｇ）、上清７００μｌを新しいエッペンドルフチューブに移し、イソプロパノール７００μｌを添加した。勢いよく混合した後、試料を室温で１０分間インキュベートしてＤＮＡを沈殿させ、次いでこれを遠心分離（≧３０分、室温、１６０００×ｇ）によってペレット化した。ＤＮＡペレットを、冷（−２０℃）７０％（ｖ／ｖ）エタノール５００μｌを用いて２回、室温、１６０００×ｇで５分の遠心分離ステップを伴って洗浄し、次いで、室温で１０分間乾燥させ、ＤＮＡペレットのサイズに応じて１５〜３０μｌの滅菌ｄｄＨ２Ｏに溶解させた。

− ＤＮＡ濃度の決定
ＤＮＡ濃度は、２４０〜３００ｎｍの波長範囲のスペクトル測光法によって測定される。Ｅ２６０ｎｍ／Ｅ２８０ｎｍの商によって決定されたＤＮＡの純度が１．８である場合、吸光度Ｅ２６０ｎｍ＝１．０は、５０μｇのｄｓＤＮＡ／ｍｌのＤＮＡ濃度に対応する（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）。

− ＰＣＲ産物のＤＮＡ精製
ＰＣＲ産物の精製は、Ｑｉａｇｅｎ社の「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」を製造者による情報に従って用いて行った。

制限エンドヌクレアーゼを用いたＤＮＡの消化（制限消化）
ＤＮＡの部位特異的切断のために、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）またはＦｅｒｍｅｎｔａｓからの制限エンドヌクレアーゼを、提供された緩衝液と共に、製造者の説明書に従って使用した。ＤＮＡ１μｇ当たり通常１〜３ユニットを反応に使用し、これを２〜１２時間インキュベートした。この方法を使用して、組み換えクローニングのためのベクターを調製するか、正確に組み立てられたプラスミドを確認するか、または混合物からある特定のプラスミドを特異的に分解した。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
この研究では、異なるＰＣＲ実験に異なるポリメラーゼを使用した。ゲノムの遺伝子欠失または組み込みを確認するために、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用した。ＯＲＦ（配列決定のため）、ゲノムの遺伝子欠失または組み込みのための組み込みカセットの組み換えクローニングまたは増幅のための遺伝子を増幅するために、ＰｈｕｓｉｏｎまたはＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用した。ＰＣＲ反応物の組成および対応するＰＣＲプログラムを下の表に示す。プライマー対のアニーリング温度はＮＥＢホームページ上のＴ_ｍ計算機ツールを用いて算出した。ＰＣＲは全てＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ勾配（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、Ｐｉｋｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）またはＰｒｏｇｅｎｅ ＰＣＲ ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｅｃｈｎｅ）で実施した。

融合ＰＣＲ
組み換えクローニング用のＨＸＴ７−Ｎ３７０ＦのＯＲＦを構築するために融合ＰＣＲを使用した。第１のステップでは、ＨＸＴ７のオーバーラップしている２つの断片を、ｐ４２６Ｈ７＿ＨＸＴ７を鋳型として用いた２つの別々のＱ５ ＰＣＲ反応で増幅し、ＰＣＲ反応物を１．５％アガロースゲルで分離し、正確な断片を対応するゲル小片から精製した。等モル量の両方の断片（最低２０ｎｇ）を、プライマーを用いないＱ５ ＰＣＲ反応に使用した。このＰＣＲ反応を６サイクル行った後、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（１０μＭのストックから）を１μｌ添加した。次いで、反応をさらに２０サイクル行った。

エラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）
ＧＡＬ２のランダム変異誘発されたＯＲＦを生成するために、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を適用した。製造者のプロトコールに従った。ＰＣＲ反応を３３サイクル行った。異なる変異率を達成するために、鋳型ＤＮＡの量を変動させた（下表を参照されたい）。ｅｐＰＣＲ産物の分析により、所望の増幅規格に適合することが明らかになった。ＰＣＲ断片を精製し、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ反応の鋳型として使用して、断片の末端を相同な突出部を用いて伸長させた。

ＤＮＡ分離またはＲＮＡ分離のためのアガロースゲル電気泳動
ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料中の断片を、アガロースゲルを０．７％（ｗ／ｖ）アガロースから２．０％（ｗ／ｖ）アガロースの範囲の濃度で使用してサイズによって分離した（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）。１×ＴＡＥ緩衝液をゲルの調製のため、および泳動緩衝液として使用した。ＤＮＡ断片のサイズ決定のためにＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。ＤＮＡ試料を、ゲルにローディングする前に１／５Ｖｏｌの６×ＤＮＡローディング色素と混合した。ＲＮＡ試料を同じ体積の２×ＲＮＡローディング色素と混合し、９６℃で１０分間インキュベートし、ローディングする前に氷上で保管した。ゲルを、電流、ゲル百分率および予測される断片サイズに応じて６〜１０Ｖ／ｃｍまで、３０〜４５分間流した。ゲルを臭化エチジウム浴中でのインキュベーション後、ＤＮＡおよびＲＮＡをＵＶ光（２５４ｎｍ）によって可視化した。

アガロースゲルからのＤＮＡ精製およびＤＮＡ抽出
ＤＮＡを精製するため（例えばＰＣＲ反応からまたは制限消化後に）、およびアガロースゲルからＤＮＡを抽出するために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ−Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を製造者の説明書に従って使用した。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ試料の配列決定はＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った。試料は３０〜１００ｎｇ／μｌ（プラスミド）または１０〜５０ｎｇ／μｌ（ＰＣＲ産物）のＤＮＡを含有した。適切なプライマー（１０μＭ）をＤＮＡ試料と一緒にＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈに送付した。

Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、Ｄｏｗｅｒ（Ｄｏｗｅｒら、１９８８年）およびＷｉｒｔｈ（Ｗｉｒｔｈ、１９８９年）のプロトコールに従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用して電気穿孔によって形質転換した。ＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ調製物または酵母ＤＮＡ調製物に由来する）を凍結したコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に添加し、試料をインキュベートし、氷上で１０分間解凍した。次いで、細胞懸濁物を電気穿孔キュベットに移し、直接パルスを印加した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを、１ｃｍ当たり２．５ｋＶの電圧、２００Ωの抵抗および２５μＦの容量に設定した。パルスを印加したすぐ後に、細胞を、予め加温したＳＯＣ培地１ｍｌと混合し、エッペンドルフチューブに移した。細胞を、３７℃、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において６００〜８００ｒｐｍで４５分間インキュベートした後、カナマイシンまたはアンピシリンを含有する選択的ＬＢ寒天プレートにプレーティングした。細胞を、ＨＸＴ７をコードするプラスミドで形質転換した場合には、インキュベーションを室温で４時間、振とうせずに、または２０〜２５℃で振とうしながら２時間実施した。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換のために、Ｇｉｅｔｚら（ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ、２００７年ａ、ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ、２００７年ｂ）のＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ法の２つの異なるプロトコールを少し変更して使用した。液体培養物を、適切な培地でＯＤが０．６〜１．０になるまで成長させた。培養物の遠心分離および洗浄ステップは３０００×ｇで２分に短縮した。一本鎖キャリアＤＮＡを１０ｍｇ／ｍｌ溶液として使用し、形質転換ミックス中のＤＮＡの体積をそれぞれ５４μｌまたは７４μｌにした。熱ショックの持続時間は３５分であった。形質転換後、再生のために、細胞懸濁物全体を選択培地に直接プレーティングしたか、または、優性選択マーカーを用いた形質転換の場合には、適切な液体培地５ｍｌに移した。再生後、細胞をペレット化し、培地５０〜１００μｌに再懸濁させ、広げてプレーティングした（ｐｌａｔｅ ｏｕｔ）。

形質転換のためのＤＮＡ量は、単一のプラスミドについてはおよそ５００ｎｇ、多数のプラスミドを用いた同時形質転換についてはそれぞれ≧１０００ｎｇ、ならびに組込みＤＮＡカセット（例えば遺伝子欠失用）については≧２０００ｎｇおよびそれ超であった。

遺伝子のコドン最適化
いくつかの遺伝子のＯＲＦはコドン最適化されたものであった。コドンは、解糖遺伝子の好ましいコドンによって決定されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのコドン使用に適合させたものであった。Ｗｉｅｄｅｍａｎｎら（ＷｉｅｄｅｍａｎｎおよびＢｏｌｅｓ、２００８年）に記載されている。

相同組み換え（組み換えクローニング）によるプラスミド構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける適切なＤＮＡ断片（ベクターの骨格および挿入物（複数可））の相同組み換えによってｉｎ ｖｉｖｏにおいてプラスミドを構築した。この目的のために、それぞれのベクターを挿入の部位において制限消化によって直線化した。任意選択で、得られたベクターの骨格をアガロースゲル電気泳動およびその後のゲル抽出によって精製した。挿入物は、挿入のために標的化された領域と、または、多数の挿入断片の場合には互いと相同な隣接配列（＞３０ｂｐ）を有するように設計した。挿入物をＰＣＲによって増幅し、対応する５’末端（相同な突出部）を有するプライマーを使用することによって、相同な配列をもたらすことができた。ＤＮＡ断片を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換し、形質転換体を選択的培地に広げてプレーティングした。コロニーを採集して選択的液体培地に接種した。プラスミドの分離および増殖のために、ＤＮＡをこれらの培養物から単離し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。ジャイレース阻害剤遺伝子ｃｃｄＢを含有するプラスミドは、大半のＥ．ｃｏｌｉ株に対して毒性であり、したがって、ｃｃｄＢ耐性株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１をこれらのプラスミドに使用した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ単一コロニー培養物から単離し、分析的な制限消化およびＤＮＡ配列決定によって検証した。正確なクローンについてグリセロールストック培養物を設けた。

相同組み換えによるゲノム遺伝子欠失または挿入
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムにおける遺伝子欠失のために、マーカーカセットを相同組み換えによってそれぞれの遺伝子に組み込んだ（ＣａｒｔｅｒおよびＤｅｌｎｅｒｉ、２０１０年、Ｇｕｌｄｅｎｅｒら、１９９６年、Ｓａｕｅｒ、１９８７年）。マーカーカセットを、標的遺伝子と相同な５’末端を有するプライマーを使用したＰＣＲによって増幅して、部位特異的挿入を可能にした。カセットは、プロモーター（ｐＴＥＦ）およびターミネーター（それぞれｔＴＥＦ、ｔＣＹＣ１およびｔＡＤＨ１）およびｌｏｘＰ部位に挟まれた、優性マーカー遺伝子（ｋａｎＭＸ４／Ｇ４１８、ｈｐｈＮＴ１／ハイグロマイシンＢ、ｎａｔＮＴ２／ｃｌｏｎＮＡＴ）で構成される。これらの部位により、ゲノムに組み込まれたマーカーカセットを、別のラウンドの遺伝子欠失のためにマーカーを取り除くｃｒｅリコンビナーゼによって切除することが可能になる。欠失カセットを用いたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換後、細胞を選択的培地に広げてプレーティングし、同じ培地に一度複製プレーティングした。単一のコロニーを再度画線して単一のクローンを得、次いでこれを採集し、選択的培地で成長させた。ＤＮＡをこれらの培養物から単離し、正確な組み込みを、異なるプライマーの組合せを用いたＰＣＲによって確認した。確認用のプライマーは、下記の表において見られる通り名付けた。正確なクローンについてグリセロールストック培養物を設けた。

マーカーを再利用するために、細胞を、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１−プロモーターの制御下でｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミド（ｐＳＨ４７またはｐＮａｔＣｒｅ）で形質転換した。リコンビナーゼを軽く誘導した後、細胞を、複製プレーティングによって優性マーカーの欠如について選択した。ｈｘｔ^０株ではリコンビナーゼの完全な発現は致死的であるので、これらの株に対しては非誘導条件下でのリコンビナーゼの基底の発現を使用した。カセットの除去をＰＣＲによって再度制御した（上記を参照されたい）。遺伝子を過剰発現させるための遺伝子カセットの組み込みを適宜行った。これらのカセットの中では、優性マーカーのみがｌｏｘＰ部位で挟まれ、切除され、カセットの残部はゲノム内に残る。

細胞培養および発酵実験のための方法
細胞密度の分光光度測定による決定
液体培養物中の細胞濃度を、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ_６００）を測定することによって分光光度的に定量化した。細胞培養の試料またはその希釈物をポリスチレン（ＰＳ）キュベットに入れ、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ分光光度計（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）で６００ｎｍにおいて分析した。

グリセロールストック培養物
特定の株およびプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの長時間にわたる保管のために、グリセロールストック培養物を調製した。この目的のために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの定常培養物またはＥ．ｃｏｌｉの成長培養物を５０％（ｖ／ｖ）グリセロールと１：１で混合し、−８０℃で保管した。

半固形寒天培養
プラスミドｃＤＮＡライブラリーを増大させる（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて）ために、半固形寒天培養法を選択した。この方法によると、液体培養物における成長中に生じ得る代表的な偏りを最小化することができる。不安定なクローンの安定化を補助するためにインキュベーションを３０℃で行う（Ｈａｎａｈａｎら、１９９１年、Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ、１９９１年）。プロトコールは、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのウェブサイトにおいて見ることができる。簡単に述べると、２倍濃縮したＬＢ培地と３ｇ／ｌのＳｅａＰｒｅｐアガロースを撹拌しながら混合し、オートクレーブ処理し、３７℃に冷却する。抗生物質および４・１０^５〜６・１０^５（培地４５０ｍｌ当たり）を培地に添加し、２分間混合する。次いで、ボトルを氷浴中０℃で１時間インキュベートし、次いで、３０℃で４０〜４５時間のインキュベーションに穏やかに移行する（乱さずに）。成長させた後、１０４００×ｇで遠心分離することによって細胞を半固形寒天からペレット化することができる。

段階希釈スポットアッセイ（滴下試験）
種々の成長条件下での異なるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の成長を容易に比較するために、段階希釈スポットアッセイを実施した。細胞を適切な培地中の液体培養で対数期まで成長させ、遠心分離（２０００×ｇ、２分）によって収集し、滅菌水で２回洗浄し、次いで、炭素源を伴わない選択的培地中にＯＤ_６００が１．０になるように再懸濁させた。この細胞懸濁物から、選択的培地中１０倍段階希釈物を調製した（４回の希釈ステップ）。各細胞懸濁物６μｌを検査される培地のプレート上にスポットし、乾燥させた。プレートを３０℃でインキュベートした。

好気性バッチ発酵
種々のサイズ（培養物の体積の５〜１０倍の体積）の振とうフラスコ中、回転式振とう機（１５０〜１８０ｒｐｍ）、通常３０℃で好気性バッチ発酵を行った。段階的な好気性バッチ発酵として進化的な工学操作を行った（詳細は以下を参照されたい）

嫌気性バッチ発酵
嫌気性バッチ発酵については、振とうフラスコをゴム栓および発酵ロック（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｏｃｋ）で密閉した。フラスコの体積は培養物の体積１００ｍｌに適応させた。培養物を、３０℃で磁気スターラーにおいて１２０ｒｐｍで継続的に撹拌した。この研究では、発酵をＯＤ_６００＝１０で行った。この目的のために、成長した細胞を回収し、炭素源を伴わない発酵培地５０ｍｌ中、ＯＤ_６００を２０に設定した。実験を開始するために、この細胞懸濁物を、２倍濃縮した炭素源を補充した発酵培地５０ｍｌを含有する調製フラスコに添加した。細胞濃度を決定するため、およびＨＰＬＣ分析のための試料を、挿入した滅菌針およびシリンジによって取得した。

発酵槽における嫌気性発酵
工業用Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を用いた一部の発酵は、作業体積が８００ｍｌであり、温度、ｐＨ、Ｏ２およびＣＯ２センサーを備えたＩｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ発酵槽（２×１．４ｌ）で行った。発酵槽を濃縮した発酵培地（炭素源および補充物質を伴わない）５３０ｍｌで満たし、次いで、オートクレーブ処理した。発酵を開始する前に、濃縮した炭素源溶液２５０ｍｌ、１００μｌ／ｌのＡｎｔｉｆｏａｍ ２０４および他の補充物質（ビタミン、微量元素および抗生物質）を濃縮した培地に添加した。発酵槽を窒素ガスでパージして最初に嫌気条件を創出した。実験の間、嫌気条件を維持するためにヘッドスペースへの窒素ガスの供給（０．４ｌ／分）を適用した。ガスの出口を冷却して蒸気を凝縮させ、戻し、次いで、ガス洗浄ボトルを通じてパイプ移送した。培養物を３００ｒｐｍで撹拌し、温度を３５℃に維持し、２ＭのＫＯＨまたは２ＭのＨ_２ＰＯ_４の自動添加によってｐＨを５．０に維持した。全ての設定パラメーターが達せられ、一定になったら、細胞の接種材料（発酵培地２０ｍｌ中）を添加した。発酵中、細胞乾燥重量の決定およびＨＰＬＣ分析のための試料を取得した。Ｉｒｉｓ ５．２ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｆｏｒｓ）を使用し発酵槽を作動させ、実験をモニターした。

細胞乾燥質量の決定
細胞乾燥質量を決定するために、液体培養物５〜１０ｍｌを、予洗し、乾燥させた（下記の通り）フィルター（ニトロセルロース、孔径０．４５μｍ）を通して真空濾過し、その後、ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した。フィルターを電子レンジにおいて１２０〜１５０Ｗで１５分間乾燥させ、冷却し、デシケーター中でさらに１５分間乾燥させた。細胞乾燥重量を測定するために、濾過前および乾燥後にフィルターを秤量した。記載されている方法の出典はＡｓｋら（Ａｓｋら、２０１３年）である。

進化的な工学操作
進化的な工学操作を段階的な好気性バッチ発酵として行った。形質転換体をまず選択的ＳＣＥ_２に接種してバイオマスを得、次いで、２０ｇ／ｌのキシロースを伴う選択的ＳＣおよびＳＭ培地で成長させて株をキシロース利用に適応させた。これらの最初の培養後、細胞を１０ｇ／ｌのキシロースおよび漸増濃度のグルコースを伴う培地に切り換えて進化的圧力を適用した。細胞が対数期後期〜定常期初期に到達したら、細胞を遠心分離（２０００×ｇ、２分）によって回収し、新鮮な培地にＯＤ_６００が０．２になるように移した。適応を見ることができたか現行のグルコース濃度によって成長が負の影響を受けなかったたびにグルコース濃度を上昇させた。全ての培地に、液体および固形のＧ４１８を添加して、ＡＦＹ１０株バックグラウンドを選択した。液体培地には、ｈｘｋ^０表現型のサプレッサー変異体の形成を抑制するために０．５ｇ／ｌの２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＯＧ）をさらに含有させた。ｈｘｋ^０株は２−ＤＯＧに対して耐性であるが、野生型株は２−ＤＯＧに対して耐性ではない（ＳｕｂｔｉｌおよびＢｏｌｅｓ、２０１２年）。培養試料をグルコース培地プレートに画線することによって、およびＨＰＬＣ分析によってもグルコース消費の欠如が確認された。

ＨＰＬＣによる代謝産物分析
代謝産物を分析するために、無細胞試料（５〜１０分、４℃、１６０００×ｇ）を、１／９体積の５０％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸と混合し、遠心分離した（５〜１０分、４℃、１６０００×ｇ）。上清をＨｙｐｅｒＲＥＺ ＸＰ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｈ^＋８μｍカラムおよび屈折率検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−１０１）を備えたＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＵＨＰＬＣ＋システム（Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００）で分析した。カラム温度６５℃、５ｍＭの硫酸を移動相として用いて０．６ｍｌ／分の流量で分離を行った。システムを制御するため、およびデータを解析するためにＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ６．８０ソフトウェアを使用した。５種の標準物質（０．０１〜３％（ｗ／ｖ）の濃度のＤ−グルコース、Ｄ−キシロース、キシリトール、酢酸塩、グリセロールおよびエタノールの混合物）を異なる化合物の定量化について分析した。

糖取り込みアッセイ
糖取り込みアッセイを、Ｗａｌｓｈら（Ｗａｌｓｈら、１９９４年）による改変と共に、Ｂｉｓｓｏｎら（ＢｉｓｓｏｎおよびＦｒａｅｎｋｅｌ、１９８３年）に記載されているようにして行った。

ＥＢＹ．ＶＷ４０００株の形質転換体を、選択的ＹＥＰＥ中でＯＤが１．１〜１．６になるまで成長させ、遠心分離によって回収し、氷冷の取り込み緩衝液で２回洗浄した（室温、３分、３０００×ｇ）。ここから細胞を氷上で維持した。細胞ペレットを氷冷の取り込み緩衝液に６０ｍｇ_ｗｗ／ｍｌの濃度に再懸濁させ、１１０μｌの一定分量にした。細胞懸濁物の一定分量１つおよび糖溶液１つを水浴中、３０℃で４〜５分間インキュベートした。細胞懸濁物１００μｌを糖溶液（５０μｌ）にピペットで入れ、ピペッティングによって軽く混合し、５秒間（Ｄ−［Ｕ−^１４Ｃ］−グルコース）または２０秒間（Ｄ−［１−^１４Ｃ］−キシロース）インキュベートした。混合物１００μｌを氷冷のクエンチ緩衝液１０ｍｌに移すことによって取り込み反応を停止させ、それをすぐにＤｕｒａｐｏｒｅメンブランフィルター（孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。フィルターを氷冷のクエンチ緩衝液１０ｍｌで２回洗浄し、シンチレーション反応混液（Ｒｏｔｉｓｚｉｎｔ ｅｃｏ ｐｌｕｓ、Ｒｏｔｈ）４ｍｌを含有するシンチレーションバイアルに移し、徹底的に振とうした。反応における総計数（ｃｐｍ_{ｔｏｔａｌ}）を決定するために、このフィルター試料（ｃｐｍ_{ｆｉｌｔｅｒ}）に加えて、各反応物１０μｌを、シンチレーション反応混液４ｍｌを伴うシンチレーションバイアルに直接移した。細胞表面またはフィルターに非特異的に結合した糖についての値（ｃｐｍｂｌａｎｋ）を決定するために、３３，３μｌ糖溶液および６６，６μｌ細胞懸濁物の少数の試料を氷冷のクエンチ緩衝液１０ｍｌ中に混合し、上記の通り処理した。全てのバイアルの放射能をＷａｌｌａｃ １４０９液体シンチレーションカウンターで分析した。

（Ｈ_２Ｏ中）２Ｍ、５００ｍＭまたは２０ｍＭのグルコースまたはキシロースのストック溶液を使用して、アッセイ用の糖溶液を調製した（取り込み反応における所望の濃度の３倍（Ｓ、基質濃度）、５０μｌの一定分量）。グルコースについては０．２、１、５、２５および１００ｍＭ、ならびにキシロースについては１、５、２５、６６、１００、２００および５００ｍＭの糖濃度で取り込みを測定した。キシロースの取り込みのグルコースによる阻害を、追加的な２５および１００ｍＭの非標識グルコースを伴う２５、６６および１００ｍＭのキシロースで測定した。糖溶液は、０．１３５〜０．６０８μＣｉのＤ−［Ｕ−^１４Ｃ］−グルコース（２９０〜３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）またはＤ−［１−^１４Ｃ］−キシロース（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有した。

取り込みアッセイのデータを以下の算出のために使用した：
インキュベーション時間（ｔ、秒単位）の間ある特定の糖濃度（Ｓ、ｍＭ単位）において取り込まれた糖の量（Ａ_{ｓｕｇａｒ}、ｎｍｏｌ単位）：
Ａ_{ｓｕｇａｒ}＝（（ｃｐｍ_{ｓａｍｐｌｅ}−ｃｐｍ_{ｂｌａｎｋ}）／（ｃｐｍ_{ｔｏｔａｌ}・１０））・Ｓ・１００μｌ

細胞（ｍ、ｍｇ_ｗｗ単位）のミリグラム数当たりで算出される輸送速度（ｎｍｏｌ・ｍｉｎ^−１・ｍｇ_ｗｗ ^−１単位）：
Ｖ＝（Ａ_{ｓｕｇａｒ}・６０ｓ）／（ｔ・ｍ）

Ｋ_ｍ（ミカエリス定数）、Ｖ_ｍａｘ（最大の取り込み初速度）およびＫ_ｉ（競合阻害についての阻害剤定数）の算出を、Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）において、３つの独立した測定値を用いて非線形回帰分析および全体的な曲線あてはめによって行った。

バイオインフォマティクス法
ＤＮＡ配列をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＧＤ、（Ｃｈｅｒｒｙｙら、２０１２年））から入手した。輸送体タンパク質についての配列アラインメントを、ＰＲＡＬＩＮＥ多重アラインメントサーバー（（ＳｉｍｏｓｓｉｓおよびＨｅｒｉｎｇａ、２００５年））を使用し、標準の設定とそれに加えてＰＨＯＢＩＵＳ膜貫通構造予測（Ｋａｅｌｌら、２００４年）を用いて行った。系統樹を、ＣｌｕｓｔａｌＷ２系統学（Ｌａｒｋｉｎら、２００７年）を用いたＰＲＡＬＩＮＥアラインメントから算出し、Ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔ／ｍｏｌｂｉｏ／ｊａｖａ／ａｐｐｓ／ｔｒｅｅｓ／）を用いて可視化した。タンパク質配列間の類似性および同一性を、ＳＩＡＳ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｅｄ．ｍｅｄ．ｕｃｍ．ｅｓ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｉａｓ．ｈｔｍｌ）を使用してＰＲＡＬＩＮＥアラインメントから算出した。配列アラインメントの図をＡＬＩＮＥソフトウェア（ＢｏｎｄおよびＳｃｈｕｔｔｅｌｋｏｐｆ、２００９年）を用いて作成した。

（実施例１ Ｔ３５４Ａ）
１．１ Ｇａｌ２＿Ｔ３５４Ａの調査
Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄは、リグノセルロース加水分解産物の発酵に関する有望な候補である工業用株である。キシロースおよびアラビノース代謝経路に関する酵素をコードする遺伝子をゲノムに組み込み、ＨＤＹ．ＧＵＦ５株を得ることができた（Ｄｅｍｅｋｅら、２０１３年）。ＨＤＹ．ＧＵＦ５をキシロースに対してさらに進化させ、遺伝子工学によって工学操作し、最終的にＨＤＹ．ＧＵＦ９株を得た（Ｄｉｅｔｚ ２０１３年）。ＨＤＹ．ＧＵＦ９を進化的な工学操作によってアラビノースに対してさらに進化させ、ＨＤＹ．ＧＵＦ１０株を得た。この株は、キシロースでの成長挙動も改善されていた。キシロース消費速度は約８０％、アラビノース消費速度は約２５％改善された。放射性糖取り込みアッセイを用いたキシロース取り込み速度の決定により、ＨＤＹ．ＧＵＦ１０のキシロース取り込み速度がＨＤＹ．ＧＵＦ９よりも３５％高いことが明らかになった。Ｇａｌ２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてキシロースおよびアラビノースを有意な量で輸送することができる唯一の輸送体であるので、ＧＡＬ２遺伝子を両方の株から単離し、配列決定した。Ｇａｌ２＿ＨＤＹ．ＧＵＦ１０において、Ｇａｌ２＿ＨＤＹ．ＧＵＦ９と比較してアミノ酸置換が１つ見いだされ、これは、おそらく細胞外側の膜貫通へリックス７内の輸送チャネル内に位置するＴ３５４Ａである。この位置は、輸送体のコンフォメーションの変更に関して役割を果たし得る。改変されたＧａｌ２ｐを調査するために、ＨＤＹ．ＧＵＦ１０の染色体ＤＮＡから所望の配列を増幅し、ｐ４２６にクローニングした。対照として、Ｅｔｈａｎｏｌ ＲｅｄのＧａｌ２ｐを使用した。受け入れたベクターをスクリーニング株中へ形質転換して、いくつかの培地における成長を試験した。

１．２ Ｇａｌ２＿Ｔ３５４Ａの機能性に関する試験
まず、グルコースおよびマルトース培地においてＶＷ４０００中のベクターを用いて成長試験を実施した。野生型ＣＥＮ．ＰＫ２、ならびにＧａｌ２＿ｅｐ３．１のガラクトース輸送体を対照として、かつ比較として使用した。予測通り、工業用株であるＥｔｈａｎｏｌ ＲｅｄのＧａｌ２ｐ野生型はＣＥＮ．ＰＫ２の野生型と同じ成長を示した。Ｇａｌ２＿ＧＵＦ１０の成長は、ガラクトースに関してはどちらの野生型とも同様の成長であったが、グルコースでの成長はエラープローン変異体の成長と同様に見えた（図１）。

さらに、この試験を、形質転換体のキシロース特異性およびグルコース親和性を調査するために、ＡＦＹ１０を用いても行った。野生型Ｇａｌ２＿ＥｔＯＨ Ｒｅｄは、０．２％のような低キシロース濃度では成長することができなかった。しかし、Ｇａｌ２＿ＧＵＦ１０の成長はこの培地で観察された。それにもかかわらず、Ｇａｌ２＿ＧＵＦ１０の成長は２％キシロースではＧａｌ２＿ｅｐ３．１よりも劣っていた。したがって、Ｇａｌ２＿ＧＵＦ１０は、より高いキシロース親和性を有すると思われる。追加的なグルコースを伴う培地では、エラープローン変異体のみが成長を示した（図２）。

（実施例２ Ｔ３５４Ａ／Ｖ７１Ｉ）
２．１ Ｔ３５４Ａと他の変異の組合せの効果
ＨＤＹ．ＧＵＦ９株に由来し、アラビノースに対して進化させたものであるＥｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ ＨＤＹ．ＧＵＦ１０株では、Ｇａｌ２におけるアミノ酸の交換Ｔ３５４Ａが見いだされた。これは、Ｇａｌ２のアラビノースに対する輸送特性が改善されたことを示す。ＨＤＹ．ＧＵＦ１０のＧａｌ２におけるＴ３５４Ａ変異により、低キシロース濃度での成長が回復し得ることも示された。Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ Ｇａｌ２およびＧａｌ２＿ＨＤＹ．ＧＵＦ９の配列は、ＣＥＮ．ＰＫ株のＧａｌ２から２つのアミノ酸が異なる（Ｌ２８０ＲおよびＶ７１Ｉ）。これらの２つの差異の効果を決定するために、ＣＥＮ．ＰＫのＧａｌ２を用いて、Ｖ７１ＩおよびＬ２８０Ｒを単独で、またはＴ３５４Ａと組み合わせて有するプラスミド発現構築物を作製した。それらの性質を決定するために、スクリーニング株ＥＢＹ．ＶＷ４０００およびＡＦＹ１０を用いて構築物を形質転換した後に成長滴下試験を実施した、対照として、ＣＥＮ．ＰＫ Ｇａｌ２野生型、ｐ４２６＿空ベクターおよびＣＥＮ．ＰＫ Ｇａｌ２におけるＴ３５４Ａ単独を使用した。

２．２ Ｌ２８０ＲおよびＶ７１Ｉと組み合わせたＧａｌ２＿Ｔ３５４Ａを含む細胞のヘキソースでの成長
以下のＧａｌ２のバリアントを発現ベクターにおいて構築した：Ｔ３５４Ａ、Ｔ３５４Ａ＋Ｖ７１Ｉ、Ｔ３５４Ａ＋Ｌ２８０Ｒ、Ｌ２８０ＲおよびＩ７１Ｖ。これらをコンピテントＥＢＹ．ＶＷ４０００細胞中へ形質転換した。次いで、異なる炭素源での滴下試験を実施した。

見られ得るように（図３）、Ｖ７１ＩおよびＬ２８０Ｒは単独ではグルコースまたはガラクトースの取り込みに対する効果を有さない。Ｔ３５４Ａ単独では、グルコースでの成長が強力に損なわれる。Ｖ７１ＩとＴ３５４Ａの組合せでは、グルコースでの成長は媒介されない。しかし、Ｔ３５４ＡとＬ２８０Ｒの組合せでは、グルコースでの成長を媒介することができる。しかし、成長はＧａｌ２野生型を用いた場合よりも遅い。

２．３ Ｌ２８０ＲおよびＶ７１Ｉと組み合わせたＧａｌ２＿Ｔ３５４Ａを含む細胞のキシロースおよび糖混合物での成長
種々の構築物を、ベクターＹＥｐ１８１＿ｐＨＸＴ７−ｏｐｔＸＩ＿Ｃｌｏｓと一緒にＡＦＹ１０細胞中へ形質転換し、段階希釈成長滴下試験を実施した。

いずれのバリアントもキシロース−グルコース混合物プレートでの成長を媒介することができず、これにより、変異体輸送体が全てグルコースによって阻害されることが示される。高キシロース濃度（２０ｇ／ｌ）を用いた成長は種々の構築物の間で大きな差異はない。しかし、低キシロース濃度（２ｇ／ｌ）での成長では有意差を示す：Ｌ２８０ＲではＧａｌ２野生型と同様の成長が媒介される；Ｌ２８０ＲとＴ３５４Ａの組合せの成長はＴ３５４Ａ単独または空ベクター対照と同様に見える。Ｖ７１Ｉでは２ｇ／ｌのキシロースで非常に遅い成長が媒介される。しかし、Ｖ７１ＩとＴ３５４Ａの組合せでは、Ｇａｌ２野生型と同様の成長が媒介され（図４）、対照的に、Ｔ３５４ＡおよびＶ７１Ｉ単独では、低キシロース濃度で不十分な成長が媒介される。これにより、Ｅｔｈａｎｏｌ ＲｅｄのＧａｌ２におけるアミノ酸の交換Ｖ７１Ｉが、とりわけ低キシロース濃度での低キシロースの取り込み活性に関与することが実証される。この欠陥は、Ｔ３５４Ａの追加的な交換によって抑制される。これによりＧＵＦ−１０の成長挙動がＧＵＦ−９と比較して改善されることが説明される。ＧＵＦ−１０はアラビノース培地に対して進化させたものであるので、Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ由来のＧａｌ２によるアラビノースの取り込みも、Ｔ３５４Ａ変異により、Ｖ７１Ｉ交換が抑制されることによって改善されると結論づけることができる。

以上の明細書、特許請求の範囲および／または添付の図面に開示されている特徴は、別々におよびそれらの任意の組合せでのいずれによっても、本発明をその多様な形態で理解するための材料となり得る。

Claims (17)

1. 配列番号１のアミノ酸配列のＴ３５４に対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドであって、
   前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％または好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有し、かつ
   前記ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるペントース輸送機能を有する、ポリペプチド。
2. Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ２である、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 配列番号１のアミノ酸配列のＴ３５４に対応する位置における前記アミノ酸置換がＴ３５４Ａである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 配列番号１のアミノ酸配列のＶ７１に対応する位置におけるさらなるアミノ酸置換、例えばアミノ酸置換Ｖ７１Ｉを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. Ｔ３５４に対応する位置における前記アミノ酸置換により、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるペントース輸送機能の活性が、そのようなアミノ酸置換を有さない前記ポリペプチドと比較して増大する、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
6. Ｔ３５４に対応する位置における前記アミノ酸置換（複数可）により、ペントース（複数可）に対する前記ポリペプチドの親和性が、そのようなアミノ酸置換を有さない前記ポリペプチドと比較して増大する、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 前記ペントースが、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースである、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. 請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
9. ベクター核酸配列、好ましくは発現ベクター配列をさらに含み、かつ／またはプロモーター核酸配列およびターミネーター核酸配列を含み、かつ／または他の調節核酸配列を含み、
   かつ／またはここで前記核酸分子は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡもしくはｍＲＮＡもしくはこれらの組合せを含む、
   請求項８に記載の核酸分子。
10. 請求項８または９のいずれか一項に記載の核酸分子を含有し、好ましくは前記核酸分子を発現する宿主細胞であって、
    ここで、前記宿主細胞は、好ましくは真菌細胞、より好ましくは酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．またはＹａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．である、宿主細胞。
11. Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に属する、請求項１０に記載の宿主細胞。
12. 請求項８または９に記載の核酸分子を含有しない細胞と比較してＤ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースの取り込み速度が上昇している、請求項１０または１１に記載の宿主細胞。
13. − キシロース代謝経路のタンパク質（好ましくはキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ）をコードする核酸分子、
    ならびに／または
    − アラビノース代謝経路のタンパク質（好ましくはアラビノースイソメラーゼ、リブロキナーゼ、リブロース−５−Ｐ ４−エピメラーゼ）をコードする核酸分子
    をさらに含有する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
14. 請求項８または９に記載の核酸分子を含有しない細胞と比較して、Ｄ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースの消費速度が増大しており、かつ／またはＤ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースを用いた成長速度がより速い、請求項１３に記載の宿主細胞。
15. バイオエタノールおよび／または他のバイオベース化合物を産生するための方法であって、請求項８または９に記載の核酸分子を、好ましくは請求項１０から１４のいずれか一項に記載の宿主細胞において、発現させることを含む、方法。
16. バイオエタノールおよび／もしくは他のバイオベース化合物を産生するため、ならびに／または、ペントース（複数可）、好ましくはＤ−キシロースおよび／もしくはＬ−アラビノースを含有するバイオマテリアルの組み換え発酵を行うための、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項８もしくは９に記載の核酸分子、または請求項１０から１４のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用。
17. 前記他のバイオベース化合物が、以下：
    １−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、他のアルコール、
    乳酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、他の有機酸
    アミノ酸、アルカン、テルペン、イソプレノイド、溶媒、医薬化合物、
    ビタミン
    から選択される、請求項１５に記載の方法または請求項１６に記載の使用。