CN104844698B - 一种促进微生物细胞转运葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的方法及其在生物基产品发酵中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进微生物细胞转运葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的方法及其在生物基产品发酵中的应用。本发明提供的五种转运蛋白具有转运葡萄糖，木糖或阿拉伯糖的能力。本发明促进微生物细胞转运的方法是将转运蛋白导入微生物菌株中，得到的重组微生物菌株获得或提高葡萄糖、木糖、阿拉伯糖转运能力，进而能够利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖生产燃料乙醇等生物基发酵产品。

Description

一种促进微生物细胞转运葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的方法及 其在生物基产品发酵中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，促进微生物细胞转运葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的方法。主要涉及转运蛋白(GLT-1，XYT-1，XAT-1，LAT-1和MtLAT-1)和编码基因以及在导入微生物菌株后使其获得或提高葡萄糖、木糖或阿拉伯糖转运能力及其在微生物发酵生产生物基产品中的应用。

背景技术

生物质是地球上数量最大的可再生资源，同时也是分布最为广泛的碳水化合物。面临能源危机及资源短缺，利用可再生的生物质生产生物能源为人类可持续发展提供了希望。生物质主要由纤维素，半纤维素及木质素构成，其降解物主要包括葡萄糖，木糖，阿拉伯糖等单糖及部分寡糖。

为提高对生物质降解物的利用率，研究者对多种微生物进行了代谢工程改造。其中工程酿酒酵母具有易培养，产率高，对代谢抑制物及乙醇具有较高的耐受性以及研究背景清楚，遗传操作简单的特点，成为了利用生物质降解物进行乙醇发酵的主要菌株。但是由于很多发酵工业重要微生物如酿酒酵母不能利用木糖及阿拉伯糖，使其有效的利用生物质降解物进行生物基化学品(乙醇、丁醇等)发酵生产受到了限制。随后，虽然研究者的不断努力，将真菌或细菌的代谢途径经过遗传改造的导入构建工程菌株(如工程酿酒酵母)，使其能够的以木糖及阿拉伯糖等为碳源进行乙醇等生物基化学品发酵，但仍然存在着诸多的问题，例如，细胞内氧化还原代谢不平衡，戊糖代谢缓慢，缺乏有效的戊糖转运蛋白等等。此外，碳源阻遏效应存在于几乎所有的微生物，使工程菌株(如工程酿酒酵母)在利用生物质降解物的混合糖进行发酵的过程中，不能同时利用全糖中的各种成分而导致发酵时间的延长，发酵效率的降低。在利用混合糖进行发酵时，当葡萄糖用尽时，其发酵液中的乙醇含量已达到较高的浓度，将会极大的降低戊糖的发酵率。近期有研究表明，葡萄糖的阻遏效应主要发生在糖转运，因此，为了提高酿酒酵母对全糖的利用率，寻找木糖或阿拉伯糖转运蛋白成了研究的热点。

在五碳糖转运蛋白方面，过去的研究多集中在利用己糖转运蛋白等底物广谱性转运蛋白来转运五碳糖，而对于特异性五碳糖转运蛋白(Pentose Specific Transporter)的研究才刚刚起步。2011年，美国伊利诺伊大学赵慧民教授实验室分别从粗糙脉孢菌和毕赤酵母中鉴定了两个木糖特异转运蛋白(An25和Xyp29)(Du et al.2010.Discovery andcharacterization of novel d-xylose-specific transporters from Neurosporacrassa and Pichia stipitis.Mol Biosyst,6(11):2150-2156)。作为半纤维素的主要成分之一，阿拉伯糖的利用对木质纤维素彻底转化利用至关重要，国际上关于阿拉伯糖转运蛋白研究逐渐开始涉及，2011年，芬兰VTT科学家Richard实验室从Ambrosiozymemonospora酵母中克隆两个阿拉伯糖特异性转运转运(LAT1，LAT2)，但该阿拉伯糖转运蛋白亲和力不高(Verho et al.2011.Cloning of two genes(LAT1,2)encoding specific L-arabinose transporters of the L-arabinose fermenting yeast Ambrosiozymamonospora.Appl Biochem Biotechnol,164(5):604-611.)，寻找亲和力更高的阿拉伯糖转运蛋白是研究阿拉伯糖转化利用的核心问题之一。

不同于细菌木寡糖转运蛋白，丝状真菌的糖转运蛋白根据转运能量的来源可以将转运蛋白分为初级主动转运蛋白(primary active transporters)和次级转运蛋白(secondary transporters)。初级主动转运蛋白通过利用ATP水解、光子吸收、电子流、底物脱羧或甲基转移反应等释放的能量实现转运过程，典型代表是ATP结合盒(ATP bindingcassette，ABC)超家族；而次级转运蛋白则是利用由于物质在膜内外浓度不同造成的电化学渗透势能来转运底物，典型代表是主要协助转运蛋白超家族(major facilitatorsuperfamily，MFS)(详见参考文献：孙林峰，王佳伟，颜宁，MFS超家族转运蛋白结构与分子机制的研究.生命科学,第23卷第11期,1052-1056.)。依据转运的机制，MFS又分为简单转运蛋白(Uniporter)，又称协助扩散蛋白(Facilitated Diffusion Protein)，同向转运蛋白(Symporter)以及反向转运蛋白(Antiporter)。Uniporter，依靠底物浓度梯度驱动转运，转运蛋白主要起着协助运输的作用。Symporter，向同一个方向同时转运两种及以上的底物，并以其中一种底物的电化学梯度作为推动力，常见的有sugar/H+，glucose/Na+，phosphate/H+，nucleoside/H+以及nitrate/H+等等。Antiporter，向反方向协同转运两种及以上的底物，驱动力来源和Symporter一样，这一类里很多都是drag/H+反向转运蛋白。真菌中的糖转运蛋白主要是Uniporter和Symporter/H+类型(Reddy et al.2012.Acollection of programs for the study of transport protein evolution.FEBS J,279(11):2036-2046)。早在1974年已有报道指出，脉孢菌在主动转运糖进入细胞的同时会协同转运质子(Slayman et al.1974.Depolarization of the plasma membrane ofNeurospora during active transport of glucose:evidence for a proton-dependentcotransport system.Proc Natl Acad Sci USA,71(5):1935-1939.)，但在分子水平上哪些糖转运蛋白的作用，导致了表观上电势的变化至今仍没有被阐释。此外，由于自然界中脉孢菌能生长在各种干枯的木质纤维上，可以预见其糖转运蛋白家族具有很高的功能多样性。同时，在长期的进化适应过程中，细胞面对不同的生长环境，如酸性－碱性，碳充足—碳匮乏，会有很好的策略来协同这些转运蛋白之间的转运工作，以使得其能高效地吸收外界的营养。全面系统的了解糖转运蛋白动力类型和生化特征，对于研究丝状真菌环境适应性，理清纤维素降解菌利用木质纤维素的机制有重要意义。更进一步地，这种高效的糖转运吸收方式，有可能对改造工程菌(包括酵母，曲霉，木霉)以充分利用培养基中的残糖发酵，提高糖的转化利用率有一定的指导意义。

发明内容

本发明第一方面，提供了一种分离的糖转运蛋白多肽，所述的多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.:10(MtLAT-1)、8(LAT-1)、6(XAT-1)、4(XYT-1)、或2(GLT-1)中任一条所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO.:10、8、6、4、或2中任一条所述氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、具有戊糖和/或己糖转运活性的衍生多肽；

(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；

(d)氨基酸序列与SEQ ID NO.:10、8、6、4、或2中任意一条所述氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、更佳地≥95％、98％)，并具有戊糖和/或己糖转运活性的衍生多肽；

其中，所述的戊糖和/或己糖转运活性是指将戊糖和/或己糖自细胞外转运至细胞内。

在另一优选例中，(d)中所述的衍生多肽来源于以下一种或多种菌株：嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、柄孢霉(Podosporaanserina)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、土曲霉(Aspergillusterreus)、鞭毛藻丛赤壳菌(Nectria haematococca)、斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、绿色木霉(Trichoderma virens)、肉原毛平革菌(Phanerochaete carnosa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

在另一优选例中，所述的细胞为微生物细胞。

在另一优选例中，所述的多肽具有将选自以下一种或多种糖类自细胞外转运至细胞内的活性：阿拉伯糖、木糖、和葡萄糖。

在另一优选例中，所述的戊糖包括阿拉伯糖、或木糖；

在另一优选例中，所述的己糖包括葡萄糖。

在另一优选例中，序列如SEQ ID NO.:10所示的多肽具有将阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:8所示的多肽，具有阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:6所示的多肽，具有将木糖和/或阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:4所示的多肽，具有将木糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:2所示的多肽，具有将葡萄糖自细胞外转运至细胞内的活性。

本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为选自下组的序列：

(A)编码本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列；

(B)编码SEQ ID NO.:10、8、6、4、或2中任一所示多肽的核苷酸序列；

(C)如SEQ ID NO.:9、7、5、3、或1中任一所示的核苷酸序列；

(D)与(A)-(C)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，和/或所述的宿主细胞的染色体整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核或原核细胞，优选为真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞表达一个或多个本发明第一方面所述的多肽。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括酵母(Saccharomyces)属、克鲁维酵母菌属、梭状芽胞杆菌属、或丝状真菌。

在另一优选例中，所述的酵母属包括的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)；

所述克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)包括马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxiamus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)，树干毕赤酵母(Pichia stipites)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)；

所述梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.)包括梭热杆菌(Clostridiumthermocellum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)、热乙酸菌(Moorella thermoacetica)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticu)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)；

所述丝状真菌包括嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。

本发明第五方面，提供了本发明第一方面所述多肽、本发明第二方面所述多核苷酸、本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述宿主细胞的用途，(i)用于将戊糖和/或己糖自细胞外转运至细胞内；(ii)用于制备乙醇。

本发明第六方面，提供了一种制备乙醇和/或促进宿主细胞转运戊糖和/或己糖的方法，包括步骤：在戊糖或己糖的存在下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括将培养物中的乙醇分离和提纯的步骤。

在另一优选例中，当本发明第四方面所述宿主细胞的表达SEQ ID NO.:10、或8所示的多肽时，所述的戊糖为阿拉伯糖。

在另一优选例中，当本发明第四方面所述的宿主细胞表达SEQ ID NO.:6所示的多肽时，所述的戊糖为阿拉伯糖、和/或木糖。

在另一优选例中，当本发明第四方面所述的宿主细胞表达SEQ ID NO.:4所示的多肽时，所述的戊糖为木糖。

在另一优选例中，当本发明第四方面所述的宿主细胞表达SEQ ID NO.:2所示的多肽时，所述的己糖为葡萄糖。

本发明第七方面一种制备重组乙醇发酵菌株的方法，包括步骤：将本发明第三方面所述的载体转入到出发菌株，从而获得重组乙醇发酵菌株。

在另一优选例中，所述重组乙醇发酵菌株的乙醇发酵活性是出发菌株的1.2-5倍，较佳地，为1.5-2倍。

在另一优选例中，所述的重组乙醇发酵菌株为以戊糖(如阿拉伯糖和/或木糖)和/或己糖(如葡萄糖)为碳源的菌株。

在另一优选例中，所述的出发菌株包括酿酒酵母，例如酿酒酵母BSW2AP、酿酒酵母EBY.VW4000，优选为酿酒酵母BSW2AP菌株

本专利的目的在于提供了五种新的糖转运蛋白，其具体核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列如下

a.葡萄糖转运蛋白基因GLT-1(NCU01633，来源于粗糙脉胞孢霉,Neurosporacrassa)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

葡萄糖转运蛋白基因GLT-1(NCU01633，来源于粗糙脉胞孢霉,Neurosporacrassa)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.2；

b.木糖转运蛋白基因XYT-1(NCU05627，来源于粗糙脉胞孢霉，Neurosporacrassa)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

木糖转运蛋白基因XYT-1(NCU05627，来源于粗糙脉胞孢霉,Neurospora crassa)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.4

c.木糖及阿拉伯糖转运蛋白基因XAT-1(NCU01132，来源于粗糙脉胞孢霉,Neurospora crassa)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；

木糖及阿拉伯糖转运蛋白基因XAT-1(NCU01132，来源于粗糙脉胞霉,Neurosporacrassa)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.6；

d.阿拉伯糖转运蛋白基因LAT-1(NCU02188，来源于粗糙脉胞孢霉,Neurosporacrassa)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；

阿拉伯糖转运蛋白基因LAT-1(NCU02188，来源于粗糙脉胞孢霉,Neurosporacrassa)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.8；

e.阿拉伯糖转运蛋白基因MtLAT-1(MYCTH_95427，来源于嗜热毁丝霉，Myceliophora thermophila)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示；

阿拉伯糖转运蛋白基因MtLAT-1(MYCTH_95427，来源于嗜热毁丝霉,Myceliophorathermophila)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.10。

此外，还包含了与以上所述五个转运蛋白氨基酸残基序列全长或局部结构域同源度在75％以上的蛋白；该同源度在75％以上的蛋白来自于但不限于以下菌：嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、柄孢霉(Podosporaanserina)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、土曲霉(Aspergillusterreus)、鞭毛藻丛赤壳菌(Nectria haematococca)、斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、绿色木霉(Trichoderma virens)、肉原毛平革菌(Phanerochaete carnosa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等。

所应用的微生物包括但不限于以下菌：酵母属(Saccharomyces sp.)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces sp.)的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxiamus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)，树干毕赤酵母(Pichia stipites)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)、(Clostridiumphytofermentans)、梭热杆菌(Clostridium thermocellum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)、热乙酸菌(Moorellathermoacetica)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticu)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。

另一方面，本发明还提供一种使微生物获得或提高对葡萄糖、木糖或阿拉伯糖利用的方法，是将上述转运蛋白导入微生物细胞(如上述所列)中，所得微生物工程菌株可以将葡萄糖、木糖或阿拉伯糖从微生物胞外转运至胞内，从而提高微生物对葡萄糖、木糖或阿拉伯糖的利用效率和相应发酵生产生物基产品的能力。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为糖转运蛋白的在酿酒酵母中的绿色荧光定位图；

图2为携带GLT-1基因的重组表达质粒pRS426-LAT的物理图谱；

图3为GLT-1对葡萄糖的转运的测定；

图4为含有GLT-1的酿酒酵母EGLT在葡萄糖平板上的生长；

图5为XYT-1对木糖转运能力的测定；

图6A为XAT-1对木糖转运能力的测定；

图6B为XAT-1对阿拉伯糖转运能力的测定；

图7为LAT-1对阿拉伯糖转运能力的测定；

图8为LAT-1对阿拉伯糖转运类型的测定；

图9为MtLAT-1对阿拉伯糖转运能力的测定；

图10为MtLAT-1对阿拉伯糖转运类型的测定；

图11为携带XYT-1的酿酒酵母XXYT在木糖上的生长曲线；

图12为携带LAT-1基因的重组表达质粒p426LAT的物理图谱；

图13为携带MtLAT-1基因的重组表达质粒p426MtLAT的物理图谱；

图14为表达LAT-1或MtLAT-1的酿酒酵母BSWLAT有氧条件下在阿拉伯糖上的生长曲线(A)及L-阿拉伯糖消耗曲线(B)；

图15为携带LAT-1或MtLAT-1的酿酒酵母BSWLAT厌氧条件下在阿拉伯糖上的生长曲线(A)，L-阿拉伯糖消耗曲线(B)和乙醇生产曲线(C)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现并鉴定了数个能够赋予微生物细胞戊糖或己糖(尤其是戊糖特异性)利用能力的糖转运蛋白。利用本发明蛋白可以使酵母等微生物以阿拉伯糖、木糖为碳源进行发酵，从而使微生物对碳源的利用不受葡萄糖的阻遏效应影响，从而更高效、更经济地获得如乙醇等的生物基产品。在此基础上，完成了本发明。

定义

如本文所用，术语“活性多肽”、“本发明多肽及其衍生多肽”、“本发明转运蛋白”、“戊糖和/或己糖转运蛋白”、“SEQ ID NO.:10、8、6、4、或2所示多肽”，均指具有将戊糖和/或己糖自细胞外向细胞内转运活性的MtLAT-1(SEQ ID NO.:10)、LAT-1(SEQ ID NO.:8)、XAT-1(SEQ ID NO.:6)、XYT-1(SEQ ID NO.:4)、或GLT-1(SEQ ID NO.:2)所示的多肽及其衍生多肽。

如本文所用，术语“戊糖”指的是含有5个碳原子的糖类，通常，所述的戊糖包括五碳醛糖(如核糖、来苏糖、阿拉伯糖、木糖)和五碳酮糖(如核酮糖、木酮糖)，优选地，所述的戊糖包括阿拉伯糖、木糖等可用于微生物发酵的五碳糖。

如本文所用，术语“己糖”指的是含有6个碳原子的糖类，通常，所述的己糖包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。优选地，所述的己糖为葡萄糖等可用于微生物发酵的六碳糖。

分离的多肽及编码多核苷酸

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明多肽具有将戊糖和/或己糖自细胞外向细胞内转运的活性，优选地，所述的多肽具有将选自以下一种或多种糖类自细胞外转运至细胞内的活性：阿拉伯糖、木糖、和葡萄糖。

例如：

序列如SEQ ID NO.:10所示的多肽或其衍生多肽具有将阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:8所示的多肽或其衍生多肽，具有阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:6所示的多肽或其衍生多肽，具有将木糖和/或阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:4所示的多肽或其衍生多肽，具有将木糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.:2所示的多肽或其衍生多肽，具有将葡萄糖自细胞外转运至细胞内的活性。

本发明多肽优选序列为SEQ ID NO.:10、8、6、4、或2所示的多肽，该术语还包括具有与所示多肽具有相同或相似功能的这些多肽的变异形式及衍生多肽。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物或活性衍生物。这些类似物与天然本发明多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指具有SEQ ID NO.:9、7、5、3、或1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.:10、8、6、4、或2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:10、8、6、4、或2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中得到有关序列。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

载体

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

本发明中，将编码本发明多肽多核苷酸序列插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明的宿主细胞优选为对糖类具有利用能力并能够进一步产生乙醇等生物基发酵产品的宿主细胞。优选包括酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces sp.)的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxiamus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)，树干毕赤酵母(Pichia stipites)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、运动发酵单孢菌(Zymomonasmobilis)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.)的梭热杆菌(Clostridium thermocellum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)、热乙酸菌(Moorella thermoacetica)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticu)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明方法获得的重组多肽可以在细胞膜上跨膜表达。

应用

利用编码本发明转运蛋白的多核苷酸可以制备一种新的重组菌株，所述的菌株可以利用原先具有或不具有戊糖或己糖转运能力的出发菌株，通过导入本发明载体，赋予出发菌株新的或更强的戊糖或己糖转运能力，从而提高碳源的利用率。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物均由金唯智生物科技有限公司合成。

本发明中，葡萄糖，木糖和阿拉伯糖购自sigma试剂公司；

间苯腙氯羰氰(CCCP)购自sigma公司；

同位素标记的葡萄糖，木糖和阿拉伯糖均购自美国Radiolabeled化工有限公司。

实施例1.GLT-1是葡萄糖转运蛋白，使微生物获得转运和利用葡萄糖能力

一、GLT-1基因表达载体的构建

利用引物GLT-F(序列：5’-CGCGGATCCATGGGTCTCTTCTCGAAAAAGTC-3’)(SEQ IDNO.:11)和GLT-R(序列：5’-CCGGAATTCCTAAACCTCTCCATGGCTTGAGG-3’)(SEQ ID NO.:12)从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增GLT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HFbuffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，GLT-F 2.5μL，GLT-R 2.5μL，cDNA 1μL，Phusion DNApolymerase0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，65℃30s，72℃1.5min,35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶BamHI和EcoRI将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献(Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeast for improved biofuelproduction.Science.330,84-86.)]，进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明GLT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带GLT-1基因的重组表达质粒，命名为pRS426-GLT,其物理图谱如图2。将质粒pRS426-GLT和pRS426-PGK1转入酿酒酵母EBY.VW4000(Wieczorke,R.,et al.,1999.Concurrent knock-out of at least20transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomycescerevisiae.FEBS Lett.464,123-128.)中，分别命名为EGLT和E426。

二、GLT-1对葡萄糖的转运的测定

1、分别挑取EGLT和对照菌株E426单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基(配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L)中30℃培养过夜(10-12小时)至菌体浓度为1.5-2.0(OD600)；

2、离心收集菌体(4000rpm,5min)后，用冰预冷assay buffer(100mM Tris-Citrate buffer pH 5.0)洗三次，重悬至OD600为20；

3、将菌体分装至1.5mL离心管(100ul/管)中，其中三个用于烘干称其干重，其余置于冰上，以备使用。

4、反应前将菌体于30摄氏度，放置5min。

5、100ul细胞悬液加入50ul不同浓度同位素标记的葡萄糖溶液(糖浓度：400mM，250mM，100mM，50mM，10mM，5mM)，反应120s后加入1mL冰水终止反应，

6、10000rpm离心1min来收集细胞，冰水洗涤两次，离心，去上清。

7、用500mL，0.1mM NaOH重选菌体，转移至装有3mL Ultima Gold scintillatioinfluid小瓶中，测定其放射量，并计算单位细胞干重单位时间的转运量。

最终结果如图3所示。酿酒酵母EBY.VW4000缺失17个己糖转运蛋白和3个麦芽糖/葡萄糖转运蛋白，而失去了转运葡萄糖的能力。由于GLT-1的导入，重组酵母EGLT恢复了对葡萄糖的转运能力，其中如图3，GLT对葡萄糖的亲和力Km为18.42±3.38mM，最大转运速率为30.75±1.34mmol/h/gram DCW。

三、GLT-1使微生物具有利用葡萄糖的能力

1、分别挑取EGLT和对照菌株E426单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基(配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L)中30℃培养过夜(10-12小时)至菌体浓度为1.5-2.0；

2、离心收集菌体(4000rpm,5min)后，用冰预冷双蒸水洗三次，重悬至OD600为2；

3、等梯度稀释菌夜(10⁰,10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5)；

4、将等梯度稀释的酵母点在以2％麦芽糖为碳源的SC-URA平板中(配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L，2％琼脂)，置于30℃培养箱中培养。

结果如图4所示,相比对照菌株(E426)，重组酵母(EGLT)快速利用葡萄糖的能力。说明GLT-1的导入，酿酒酵母恢复了以葡萄糖为碳源进行生长的能力。

综合所述，GLT-1对葡萄糖具有较高的转运能力(30.75±1.34mmol/h/gram DCW)和亲和性(Km为18.42±3.38mM)，并且GLT-1导入酿酒酵母后，可使其恢复利用葡萄糖为碳源的能力。

实施例2.XYT-1是木糖转运蛋白，使微生物获得转运木糖能力

一、XYT-1基因表达载体的构建

利用引物XYT-F(序列：5’-GGACTAGTATGGTTCTGGGGAAAAAGTCAATC-3’)(SEQ IDNO.:13)和XYT-R(序列：5’-CCCAAGCTTCTAAACCCTATGGTTAATAACCTT-3’)(SEQ ID NO.:14)从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增XYT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HFbuffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，XYT-F 2.5μL，XYT-R 2.5μL，cDNA 1μL，Phusion DNApolymerase 0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，60℃30s，72℃1.5min,35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶SpeI和HindIII将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献(Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeast for improved biofuelproduction.Science.330,84-86.)]，进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明XYT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带XYT-1基因的重组表达质粒，命名为pRS426-XYT。将质粒pRS426-XYT和pRS426-PGK1转入酿酒酵母EBY.VW4000(Wieczorke,R.,et al.,1999.Concurrent knock-out of at least20 transportergenes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.FEBSLett.464,123-128.)中，分别命名为EXYT和E426。

二、XYT-1对木糖的转运的测定

XYT-1对木糖的转运能力的测定参见实施例1，其结果如图5所示。由于XYT-1的导入，重组酵母EXYT具有木糖的转运能力，XYT-1对木糖的亲和力Km为7.58±0.60mM，最大转运速率为49.61±1.20μmol/h/gram DCW。

实施例3.XAT-1是木糖和阿拉伯糖转运蛋白，使微生物获得转运木糖和阿拉伯糖能力

一、XAT-1基因表达载体的构建

利用引物XAT-F(序列：5’-CGCGGATCCATGAAGCCATTTCTGGGGCTC-3’)(SEQ ID NO.:15)和XAT-R(序列：5’-CCCAAGCTTCTACGACTCCCGATTACCTCCAT-3’)(SEQ ID NO.:16)从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增XAT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer10μL，10mM dNTPs 1μL，XAT-F 2.5μL，XAT-R2.5μL，cDNA 1μL，Phusion DNA polymerase0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，65℃30s，72℃1.5min,35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶BamHI和HindIII将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献(Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeast for improved biofuelproduction.Science.330,84-86.)]，进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明XAT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带XAT-1基因的重组表达质粒，命名为pRS426-XAT。将质粒pRS426-XAT和pRS426-PGK1转入酿酒酵母EBY.VW4000(Wieczorke,R.,et al.,1999.Concurrent knock-out of at least20 transportergenes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.FEBSLett.464,123-128.)中，分别命名为EXAT和E426。

二、XAT-1对木糖和阿拉伯糖转运的测定

XAT-1对木糖和阿拉伯糖的转运能力的测定参见实施例1，其结果如图6所示。由于XAT-1的导入，重组酵母EXAT具有木糖和阿拉伯糖的转运能力,其中，XAT-1对木糖的亲和力Km为18.17±3.23mM，最大转运速率为54.11±3.83μmol/h/gram DCW(图6A)；XAT-1对阿拉伯糖的亲和力Km为61.93±17.68mM，大转运速率为65.84±11.76μmol/h/gram DCW(图6B)。

实施例4.LAT-1是阿拉伯糖转运蛋白，使微生物获得转运阿拉伯糖转运能力

一、LAT-1基因表达载体的构建

利用引物ELAT-F(序列：5’-CGCGGATCCATGGGGCTCGGGCTTAAGCTAC-3’)(SEQ IDNO.:17)和ELAT-R(序列：5’-CGGAATTCCTAAACCTTCTCATGCTCATGCAC-3’)(SEQ ID NO.:18)从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增LAT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HFbuffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，ELAT-F 2.5μL，ELAT-R 2.5μL，cDNA 1μL，Phusion DNApolymerase 0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，65℃30s，72℃1.5min,35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶BamHI和HindIII将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献(Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeast for improved biofuelproduction.Science.330,84-86.)]，进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明LAT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带LAT-1基因的重组表达质粒，命名为pRS426-LAT。将质粒pRS426-LAT和pRS426-PGK1转入酿酒酵母EBY.VW4000(Wieczorke,R.,et al.,1999.Concurrent knock-out of at least20 transportergenes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.FEBSLett.464,123-128.)中，分别命名为ELAT和E426。

二、LAT-1对阿拉伯糖转运的测定

LAT-1对木糖和阿拉伯糖的转运能力的测定参见实施例1，其结果如图7所示。由于LAT-1的导入，重组酵母ELAT具有阿拉伯糖的转运能力，LAT-1对阿拉伯糖的亲和力Km为25.12±2.98mM，最大转运速率为116.7±4.06mmol/h/gram DCW。

三、LAT-1转运类型的测定

真菌中的糖转运蛋白主要是Uniporter和Symporter/H+类型，Uniporter，依靠底物浓度梯度驱动转运，转运蛋白主要起着协助运输的作用。Symporter/H+，向同一个方向同时转运糖类及H+，并以H+的电化学梯度作为推动力。为了鉴定LAT-1的转运类型设计了如下实验：

其中，CCCP(间苯腙氯羰氰)具有破坏细胞质子梯度的作用，因此不同CCCP浓度下，测定LAT-1对阿拉伯糖的转运能力，从而鉴定LAT-1的转运类型。

1、挑取ELAT单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基(配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L)中30℃培养过夜(10-12小时)至菌体浓度为1.5-2.0(OD600)；

2、离心收集菌体(4000rpm,5min)后，用冰预冷assay buffer(100mM Tris-Citrate buffer pH 5.0)洗三次，重悬至OD600为20；

3、将菌体分装至1.5mL离心管(100ul/管)中，每管50μL，其中三个用于烘干称其干重，其余置于冰上，以备使用。

4、反应前加入1μL不同浓度的CCCP(终浓度分别为：0μM，0.5μM，1.0μM，25μM，50μM)，于30℃培养箱中，放置10min。

5、50ul细胞悬液加入50ul 50mM同位素标记的阿拉伯糖溶液，于30℃下反应120s后，加入1mL冰水终止反应，

6、10000rpm离心1min来收集细胞，冰水洗涤两次，离心，去上清。

7、用500mL 0.1mM NaOH重选菌体，转移至装有3mL Ultima Gold scintillatioinfluid小瓶中，测定其放射量，并计算其单位干重单位时间的转运量。

其实验结果如图8所示，随着CCCP浓度的增高，ELAT对阿拉伯糖的转运能力逐渐下降，说明LAT-1的转运类型为Symporter/H+，当CCCP浓度分别25μM时，其对阿拉伯糖的转运速率降到了最低，此时LAT-1依靠细胞内外的阿拉伯糖浓度梯度为动力，转运阿拉伯糖。有实验证明当转运蛋白的转运类型为Symporter/H+时，会有较大的转运速率，具有更好的应用前景。

实施例5.MtLAT-1是阿拉伯糖转运蛋白，使微生物获得转运阿拉伯糖能力

一、MtLAT-1基因表达载体的构建

利用引物MtLAT-F(序列：5’-CGCGGATCCATGAAGCTGCCCACGATTTAC-3’)(SEQ IDNO.:19)和MtLAT-R(序列：5’-CCGGAATTCTTAAACCTTCTCCTGCTCGCC-3’)(SEQ ID NO.:20)从嗜热毁丝霉的cDNA中PCR扩增MtLAT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HFbuffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，MtLAT-F 2.5μL，MtLAT-R 2.5μL，cDNA 1μL，Phusion DNApolymerase 0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，67℃30s，72℃1.5min，35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶BamHI和EcoRI将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献(Galazka,J.M.,et al.,2010.Cellodextrin transport in yeast for improved biofuelproduction.Science.330,84-86.)]，进行双酶切，并将这两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明MtLAT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带MtLAT-1基因的重组表达质粒，命名为pRS426-MtLAT。将质粒pRS426-MtLAT和pRS426-PGK1转入酿酒酵母EBY.VW4000(Wieczorke,R.,et al.,1999.Concurrent knock-out of at least 20transportergenes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.FEBSLett.464,123-128.)中，分别命名为EMtLAT和E426。

二、MtLAT-1阿拉伯糖转运的测定

MtLAT-1对阿拉伯糖的转运能力的测定参见实施例1，其结果如图9所示。由于MtLAT-1的导入，重组酵母EMtLAT具有木糖和阿拉伯糖的转运能力,其中，MtLAT-1对阿拉伯糖的亲和力Km为10.29±0.35mM，大转运速率为10.29±3.6mmol/h/gram DCW。

三、MtLAT-1转运类型的测定

实验方法参加实施例4所述，其实验结果如图10，实验说明MtLAT-1对阿拉伯糖的转运类型为Symporter/H+；MtLAT-1的转运速率随CCCP浓度的增加而降低，当CCCP为25μM时，其转运速率降到了最低。

实施例6.XYT-1促进酿酒酵母木糖生长和乙醇发酵

将实施例2所述的质粒pRS426-XYT和pRS426-PGK1转入含有毕赤酵母木糖代谢途径的酿酒酵母EBY.VW4000(Wieczorke,R.,et al.,1999.Concurrent knock-out of atleast 20transporter genes is required to block uptake of hexoses inSaccharomyces cerevisiae.FEBS Lett.464,123-128.)中，分别命名为XXYT和X426。

分别挑取XXYT和对照菌株X426单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基(配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L)中30℃培养过夜(10-12小时)，之后分别转入以2％木糖为碳源40mL SC-URA培养基中，最终OD600为1，100mL三角瓶中培养(250rpm，30℃)，每个一段时间取样并测其OD600。

结果如图11所示：相对于对照菌株X426，XXYT具有利用木糖生长的能力。结果说明XYT-1具有转运木糖的能力，同时可以让酿酒酵母重新获得利用木糖为碳源生长的能力。

实施例7.LAT-1和MtLAT-1促进酿酒酵母阿拉伯糖生长和乙醇发酵

LAT-1为阿拉伯糖转运蛋白，本实施例的目的是通过LAT-1基因在酿酒酵母中的表达来确定LAT-1的功能及对重组酿酒酵母的作用。

一、LAT-1及MtLAT-1基因表达载体的构建

利用引物KanMX-F(序列：5’-GGGAATTCCATATGGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTC-3’)(SEQID NO.:21)和KanMX-R(序列：5’-ATGGGCCCCGACACTGGATGGCGGCGTTAG-3’)(SEQ ID NO.:22)从质粒pUG-6(Gueldener,U,et al.,2002.A second set of loxP marker cassettes forCre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast.Nucleic Acids Res.30(6))中PCR扩增遗传霉素G418的抗性基因kanMX的编码阅读框，PCR的反应体系为：5×phusion HF buffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，KanMX-F2.5μL，KanMx-R 2.5μL，pUG6质粒1μL，Phusion DNA polymerase 0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，60℃30s，72℃1.0min,35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶NdeI和ApaI将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献(Galazka,J.M.,etal.,2010.Cellodextrin transport in yeast for improved biofuelproduction.Science.330,84-86.)略有改动]，进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序验证，KanMX基因的重组表达质粒，命名为p426kanmx4。使用引物ELAT-F(序列：5’-CGCGGATCCATGGGGCTCGGGCTTAAGCTAC-3’)(SEQ ID NO.:17)和ELATF-R(序列：5’-CGGAATTCCTAAACCTTCTCATGCTCATGCAC-3’)(SEQID NO.:18)从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增LAT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，LAT-F 2.5μL，LAT-R2.5μL，cDNA 1μL，PhusionDNA polymerase 0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，64℃30s，72℃1.5min,35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶SpeI和EcoRI将PCR产物和质粒pRS426-PGK1URA::KanMX进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明LAT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带LAT-1基因的重组表达质粒，命名为p426LAT，其物理图谱如图12所示。

使用引物MtLAT-F(序列：5’-CGCGGATCCATGAAGCTGCCCACGATTTAC-3’)(SEQ IDNO.:19)和MtLATF-R(序列：5’-CCGGAATTCTTAAACCTTCTCCTGCTCGCCGAC-3’)(SEQ ID NO.:20)从嗜热毁丝霉的cDNA中PCR扩增MtLAT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，LAT-F2.5μL，LAT-R 2.5μL，cDNA 1μL，PhusionDNA polymerase 0.5μL，水32.5μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，64℃30s，72℃1.5min,35个循环；最后72℃10min，4℃10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶BamHI和EcoRI将PCR产物和质粒pRS426-PGK1URA::KanMX进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明MtLAT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带MtLAT-1基因的重组表达质粒，命名为p426MtLAT，其物理图谱如图13所示。

将质粒p426LAT，p426MtLAT和p426kanmx转入酿酒酵母BSW2AP(Wang,et al.,2013.Improvement of L-Arabinose Fermentation by Modifying the MetabolicPathway and Transport in Saccharomyces cerevisiae.Biomed Res Int.)中。

二、LAT-1及MtLAT-1促进重组酿酒酵母在L-arabinose中的生长。

分别挑取分别含有p426LAT，p426MtLAT和p426kanmx的酿酒酵母转化子单克隆，将其接种在50mL以1.5％L-阿拉伯糖及0.5％D-葡萄糖为碳源的SC-URA-LEU培养基(配方：无氨基酵母氮源6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖20g/L，组氨酸和色氨酸各20mg/L，同时添加400μg/mL G418)中30℃培养过夜(10-12小时)，之后分别转入以2％L-阿拉伯糖为碳源40mL SC-URA-LEU培养基中(添加400μg/mL G418)，最终OD600为1.0，分别在250mL三角瓶(视为有氧培养)及100mL厌氧瓶(视为限氧培养)中培养(250rpm,25℃)，每个一段时间取样并测其OD600。结果如图14和图15所示。

在图14中，在菌株BSW2AP中过表达LAT-1及MtLAT-1后，在有氧条件下相对于对照菌株具有较快的生长速率，其L-阿拉伯糖的消耗速率也明显加快。说明在有氧条件下，LAT-1及MtLAT-1可以加强微生物对阿拉伯糖的利用，促进微生物的生长。

在图15中，菌株BSW2AP过表达LAT-1及MtLAT-1后，在限氧条件下相对于对照菌株具有较快的生长速率，其L-阿拉伯糖的消耗速率及乙醇的生产速率也明显加快。说明在限氧条件下，LAT-1及MtLAT-1可以加强微生物对阿拉伯糖的利用，促进微生物的生长，有利用乙醇的生产。

相对于对照菌株BSW426,BSWLAT在50小时后具有较快的生长，说明在限氧的条件下，LAT-1的表达有利用阿拉伯糖发酵酿酒酵母对阿拉伯糖的利用，促进酵母的代谢。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞的染色体整合有外源的编码如SEQ IDNO.:2所示的葡萄糖转运蛋白的多核苷酸；和/或所述宿主细胞含有载体，所述载体包含所述的多核苷酸，所述葡萄糖转运蛋白具有将葡萄糖自细胞外转运至细胞内的活性；

并且所述的宿主细胞的染色体还整合有外源的编码阿拉伯糖转运蛋白的多核苷酸，或者所述宿主细胞还含有载体，所述载体包含所述的外源的编码阿拉伯糖转运蛋白的多核苷酸；其中，所述阿拉伯糖转运蛋白具有将阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性，并且所述阿拉伯糖转运蛋白的序列选自SEQ ID NO.:6、8和10；并且，所述的宿主细胞为酵母(Saccharomyces)属、克鲁维酵母菌属、梭状芽胞杆菌属或丝状真菌。

2.如权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞的染色体还整合有外源的编码木糖转运蛋白的多核苷酸，或者所述宿主细胞还含有载体，所述载体包含所述的外源的编码木糖转运蛋白的多核苷酸；其中，所述木糖转运蛋白具有将木糖自细胞外转运至细胞内的活性，并且所述木糖转运蛋白的序列为SEQ ID NO.:4。

3.如权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于，所述的酵母属为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)或裂殖酵母(Saccharomyces pombe)。

4.如权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于，所述克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxiamus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、或脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)。

5.如权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于，所述梭状芽孢杆菌属(Clostridiumsp.)为梭热杆菌(Clostridium thermocellum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、或丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)；

所述丝状真菌为嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)或粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)。

6.一种如权利要求1-5中任一所述宿主细胞的用途，其特征在于，(i)用于将己糖自细胞外转运至细胞内；和/或(ii)用于制备乙醇。

7.一种促进宿主细胞转运戊糖的方法，其特征在于，包括步骤：在戊糖的存在下，培养权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的戊糖为阿拉伯糖和/或木糖。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法用于制备乙醇，并且所述方法还包括将培养物中的乙醇分离和提纯的步骤。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述宿主细胞还表达SEQ ID NO.:6所示的多肽时，还将戊糖自细胞外转运至细胞内，所述的戊糖为木糖。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述的宿主细胞还表达SEQ ID NO.:6所示的多肽时，还将戊糖自细胞外转运至细胞内，所述的戊糖为阿拉伯糖和木糖。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述的宿主细胞表达SEQ ID NO.:4所示的多肽时，还将戊糖自细胞外转运至细胞外，所述的戊糖为阿拉伯糖和木糖。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在己糖和戊糖存在下，培养权利要求1所述的宿主细胞，其中，所述的己糖为葡萄糖。

13.一种制备重组乙醇发酵菌株的方法，其特征在于，包括步骤：将SEQ ID NO.:2所示的葡萄糖转运蛋白和序列选自SEQ ID NO.:6、8和10的阿拉伯糖转运蛋白转入到出发菌株，从而获得重组乙醇发酵菌株，其中，所述的出发菌株为酿酒酵母、或克鲁维酵母菌；

并且，所述葡萄糖转运蛋白具有将葡萄糖自细胞外转运至细胞内的活性，且所述阿拉伯糖转运蛋白具有将阿拉伯糖自细胞外转运至细胞内的活性。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述重组乙醇发酵菌株的乙醇发酵活性是出发菌株的1.2-5倍。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的重组乙醇发酵菌株为以戊糖和己糖为碳源的菌株，其中己糖为葡萄糖，而戊糖为阿拉伯糖。

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