TWI531649B - 藉由破壞ｇｎｔＲ而改善生產力之異丙醇生產細菌 - Google Patents

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Description

藉由破壞gntR而改善生產力之異丙醇生產細菌
本發明關於一種異丙醇生產細菌及使用其之異丙醇生產方法。
丙烯為聚丙烯等的合成樹脂或石油化學製品的重要基礎原料，而被廣泛地使用於汽車用保險桿或食品容器、薄膜、醫療機器等。
從來自植物的原料所製造出的異丙醇，可經過脫水步驟而轉換成丙烯，因此可期望作為碳中和的丙烯原料。另外，丙酮亦被廣泛地使用作為溶劑及塑膠原料。依據京都議定書，在2008年至2012年之間，所有的已開發國家有義務使二氧化碳排出量比1990年削減5%，現在，碳中和的丙烯由於其具有泛用性，故對於地球環境而言極為重要。
利用來自植物的原料生產異丙醇的細菌已為眾人所知。例如在國際公開2009/008377號中揭示了一種細菌，其係經修改成以葡萄糖作為原料而生產異丙醇，還記載了異丙醇的選擇性高，因此作為工業生產用生物觸媒具有優異的性質。
在可製造異丙醇的大腸菌之中，異丙醇的原料為葡萄糖，因此藉由糖解及異化所得到大量的化合物全部可變成副產物。另一方面，該等化合物會有成為大腸菌生長所需要的物質的情況，因此無法完全抑制該等副反應所消耗的葡萄糖量。因此，為了使副產物最小化且異丙醇的產量提升，而有各種探討正在進行。
例如在國際公開2009/008377號小冊子中揭示了一種異丙醇生成細菌，其導入了乙醯醋酸去羧酶、異丙醇脫氫酵素、CoA轉移酶及硫解酶的各基因，而可從來自植物的原料產生異丙醇。而且記載了此異丙醇生產細菌的能力為：生產速度0.6g/L/hr、累積量28.4g/L。
在國際公開2009/049274號及Appl.Environ.Biotechnol.,73(24)，pp.7814-7818，(2007)中揭示了一種大腸菌，其導入了乙醯CoA乙醯基轉移酶、乙醯乙醯CoA轉移酶、乙醯醋酸去羧酶及、二級醇脫氫酵素的各基因，而可製造異丙醇。而且記載了該等細菌的能力為：生產速度0.4g/L/hr、產率43.5%、累積量4.9g/L。
在國際公開2009/028582號中揭示了一種大腸菌，其導入了乙醯醋酸去羧酶、異丙醇脫氫酵素、乙醯CoA：醋酸酯CoA-轉移酶及乙醯CoA乙醯基轉移酶的各基因而可製造異丙醇。而且記載了此細菌的能力為累積量9.7g/L。
在Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(6),pp.1219-1224，(2008)中揭示了一種大腸菌，其導入了硫解酶、CoA-轉移酶、乙醯醋酸酯去羧酶、一級二級醇脫氫酵素之各基因而可製造異丙醇。並且記載了此細菌的能力為：生產速度0.6g/L/hr、產率51%、累積量13.6g/L。
在國際公開2009/103026號之中揭示了一種大腸菌，其導入了乙醯醋酸去羧酶、乙醯CoA：醋酸酯CoA-轉移酶及乙醯CoA乙醯基轉移酶及異丙醇脫氫酵素之各基因而可製造異丙醇。並且記載了可期待此細菌的能力為：產率50%、生產速度0.4g/L/hr、最終產量14g/L。
在國際公開2009/247217號之中揭示了一種大腸菌，其導入了乙醯醋酸酯去羧酶、CoA轉移酶、硫解酶及2-丙基醇脫氫酵素之各基因，而可製造異丙醇。並且記載了此細菌的能力為最終產量2g/L。
此處，異丙醇脫氫酵素、二級醇脫氫酵素、一級二級醇脫氫酵素及2-丙基醇脫氫酵素為雖然名稱相異然而催化相同反應的酵素；CoA轉移酶、乙醯乙醯CoA轉移酶、乙醯CoA：醋酸酯CoA-轉移酶以及CoA-轉移酶為雖然名稱相異然而催化相同反應的酵素。另外，乙醯醋酸去羧酶與乙醯醋酸酯去羧酶為雖然名稱相異然而催化相同反應的酵素，硫解酶與乙醯CoA乙醯基轉移酶也是雖然名稱相異然而催化相同反應的酵素。所以，依據該等文獻所得到的異丙醇生產大腸菌雖然生產力各有所不同，然而利用於製造異丙醇的酵素，係與國際公開第2009/008377號所記載的乙醯醋酸去羧酶、異丙醇脫氫酵素、CoA轉移酶及硫解酶這4種為同樣的酵素，在以提升生產力或產率等為目標的情況，過去探討了這4種酵素。
在日本特開平5-260979號中記載了在Bacillus subtillis之中，若破壞該大腸菌所保有的GntR基因，則D-核糖的生產力會提升。
另外，將異丙醇轉換為丙酮的方法，在日本特開平7-53433號及特開平11-335315號是使用一種銅系觸媒作為固體觸媒，使異丙醇脫氫而藉此製造丙酮。另外，在英國專利第665376號中使用一種將氧化鋅微粒子與氧化鋯微粒子以物理方式混合而得的觸媒。一般而言已知若使用微生物生產物質則會含有雜質。在這點，該等技術任一者皆並非使用微生物之製造方法，因此並無以含有雜質的異丙醇作為原料使用的記載。
丙酮可藉由氫化而容易地轉換為異丙醇，將此異丙醇進一步藉由脫水反應製成丙烯之後，使其與苯反應而得到異丙苯的程序。亦即，使丙酮藉由兩階段反應轉換為丙烯，藉此以作為異丙苯法的原料而再利用的程序，已經被文獻提出(參照例如日本特開平2-174737號公報)。
在如上述般的再利用之中，需要將由丙酮高選擇性地製造丙烯的方法，確立為在工業上實用性。另外還已知一種方法，在Cu(25%)-氧化鋅(35%)-氧化鋁(40%)觸媒的存在下、在400℃進行丙酮的氫化反應而得到丙烯(參照例如東德專利DD84378號公報)。但是在此方法中，儘管反應溫度為高達400℃的高溫，但丙酮轉化率低，而為89%。另外在該方法中，因為丙烯受到氫化而產生丙烷的副反應的緣故，丙烯選擇性為89%而仍然不足。
然而，可生產異丙醇的上述大腸菌之任一者皆難以算是具有足夠的生產能力，在異丙醇生產大腸菌方面，使異丙醇的生產力提升為有待解決的一大課題。另外也需要提供一種將所得到的異丙醇有效利用的方法。
本發明目的為提供一種大腸菌，係使異丙醇的生產力大幅提升；使用該大腸菌之異丙醇生產方法及丙酮生產方法；進一步由使用該大腸菌所得到含有丙酮的異丙醇生產丙烯的方法。
本發明鑑於上述狀況而完成，本發明之異丙醇生產大腸菌、異丙醇生產方法及丙酮生產方法如以下所述：
[1]　一種異丙醇生產大腸菌，其轉錄抑制因子GntR活性去活化，而且具備：異丙醇生產系統、及伴隨該GntR活性的去活化以維持或強化異丙醇生產能力的酵素活性模式的輔酶群。
[2]　如[1]所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，前述輔酶群的酵素活性模式選自：
(1)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性、葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性及磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性的野生型的維持、
(2)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性的去活化與葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性的強化、
(3)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性的去活化、葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性的強化與磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性的去活化。
[3]　如[2]所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，前述葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性係來自編碼來自埃希氏菌屬細菌的葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)的基因。
[4]　如[1]～[3]之任一者所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，前述異丙醇生產系統係藉由乙醯醋酸去羧酶、異丙醇脫氫酵素、CoA轉移酶及硫解酶之各酵素基因所構築。
[5]　如[1]～[4]之任一者所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，前述異丙醇生產系統係藉由前述乙醯醋酸去羧酶、異丙醇脫氫酵素、CoA轉移酶及硫解酶之各酵素基因所構築，且各酵素基因各自獨立而來自選自梭菌屬細菌、桿菌屬細菌及埃希氏菌屬細菌所構成之群中至少1種原核生物。
[6]　如[4]或[5]所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，前述乙醯醋酸去羧酶活性係來自編碼來自丙酮丁醇梭菌的酵素之基因，前述異丙醇脫氫酵素活性係來自編碼來自拜氏梭菌的酵素之基因，前述CoA轉移酶活性及硫解酶活性係來自編碼來自大腸桿菌的各酵素之基因。
[7]　如[4]所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，前述異丙醇脫氫酵素及前述乙醯醋酸去羧酶之至少一個活性係來自作為基因改造體所導入的基因。
[8]　如[7]所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，前述異丙醇脫氫酵素之基因改造體係序列編號40所表示之鹼基序列，前述乙醯醋酸去羧酶之基因改造體係序列編號43所表示之鹼基序列。
[9]　如[4]～[8]之任一者所記載的異丙醇生產大腸菌，其中，進一步在蔗糖非PTS基因群之內至少具有蔗糖水解酵素基因。
[10]　一種異丙醇生產方法，包含使用如[1]～[9]之任一者所記載的異丙醇生產大腸菌，而從來自植物的原料生產異丙醇。
[11]　一種丙酮生產方法，包含使用如[1]～[9]之任一者所記載的異丙醇生產大腸菌，而從來自植物的原料得到異丙醇；及使所得到的異丙醇與作為觸媒的複合氧化物接觸，而該複合氧化物含有氧化鋅與含至少1種第4族元素的氧化物，且以共沉澱法所調製。
[12]　一種丙烯之製造方法，包含使異丙醇在反應溫度50～300℃的範圍與作為觸媒的固體酸物質及含Cu的氫化觸媒接觸，該異丙醇，係使用如[1]～[9]之任一者所記載的記載的異丙醇生產大腸菌而從來自植物的原料所得到，且含有丙酮。
[13]　如[12]所記載的丙烯之製造方法，其中，前述含Cu的氫化觸媒係進一步含有第6族、第12族、及第13族之中至少一種元素的觸媒。
[14]　如[12]或[13]所記載的丙烯之製造方法，其中，前述固體酸物質係沸石。
依據本發明，可提供一種可高效生產異丙醇的大腸菌、使用該大腸菌之異丙醇生產方法及丙酮生產方法；進一步可提供一種從使用該大腸菌所得到含有丙酮的異丙醇生產丙烯的方法。
本發明之異丙醇生產大腸菌，轉錄抑制因子GntR活性去活化，而且具備異丙醇生產系統與伴隨該GntR活性的去活化以維持或強化異丙醇生產能力的酵素活性模式的輔酶群之異丙醇生產大腸菌。
在本發明之異丙醇生產大腸菌中，由於GntR活性去活化，而且具備上述既定酵素活性模式的輔酶群，因此可高效生產異丙醇。
亦即本發明為了提高異丙醇的生產力作各種探討的結果，發現了藉由使葡萄糖酸代謝的負控制因子的GntR活性去活化，可提升由該大腸菌所產生的生成物異丙醇的生產力。
另外還發現了存在有酵素，其在此時會影響藉由GntR活性的去活化而改善的異丙醇生產能力。該等酵素的活性模式造成GntR活性的去活化，藉此可維持或強化改善後的異丙醇生產能力。
本發明中之「輔酶群」是指對這種異丙醇生產能力造成影響的一個或兩個以上的酵素。另外，輔酶群的各酵素活性會發生去活化、活性化或強化，本發明中的「輔酶群的酵素活性模式」是指可維持或增加僅藉由使GntR活性去活化所得到經改善的異丙醇產量的各酵素的酵素活性模式，並包含一個或兩個以上的酵素組合。
前述輔酶群除了具備異丙醇生產系統且使GntR活性去活化以外，亦可為僅由原本的酵素(在本發明中，只要沒有特別註明除外的事項，「酵素」亦包括單獨不會表現出酵素活性的「因子」)所構成的酵素群。
例如除了具備發揮既定異丙醇生產能力的異丙醇生產系統，且藉由基因重组技術使GntR去活化以外並未作任何人為變更的異丙醇生產大腸菌、及除了具備賦予用於提高異丙醇的生產能力的改變的異丙醇生產系統，且藉由基因重组技術使GntR去活化以外並未作任何人為變更的異丙醇生產大腸菌，皆被包含於前述異丙醇生產大腸菌。
輔酶群的酵素活性模式適合的例子可列舉以下的模式：
(1)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性、葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性及磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性的野生型的維持、
(2)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性的去活化與葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性的強化、
(3)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性的去活化、葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性的強化與磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性的去活化。
從異丙醇生產能力的觀點看來，其中以上述(3)之輔酶群的酵素活性模式為較佳。
此外，本發明所關連之輔酶群及其酵素活性模式不受該等所限定，包含GntR活性的去活化，只要是可使異丙醇生產大腸菌中的異丙醇產量增加的輔酶群及其酵素活性模式，則任一者皆包含於本發明中。另外，輔酶群不一定要由多種酵素所構成，以1種酵素構成亦可。
此外，本發明中之「去活化」是指將去活化前的大腸菌中該因子或酵素的活性定為100時，藉由現有全部的測定系統所測得該因子或酵素的活性為其1/10以下的狀態。
本發明中之「藉由基因重组技術」的文字，只要是在原有基因的鹼基序列插入其他的DNA、或基因的某部分因為取代、缺損或該等的組合而在鹼基序列上發生改變的情況，則全部包括在內，例如可為發生突變的結果所得到者。
在本發明中因子或酵素活性去活化的大腸菌，是指藉由菌體外以至菌體內的任何方法使原本的活性受損而得到的細菌。該等細菌可藉由例如破壞編碼該蛋白質或酵素的基因(基因破壞)而製作出來。
本發明中之基因破壞，可列舉為了使某基因的機能無法發揮而使該基因的鹼基序列發生變異、插入其他DNA、以及使基因的某部分缺損。基因破壞的結果，例如該基因變得無法轉錄至mRNA，構造基因無法被轉譯。或者因為被轉錄的mRNA不完全，轉譯的構造蛋白質之胺基酸序列發生變異或缺損，而無法發揮原有的機能。
基因破壞株的製作，只要能夠得到該酵素或蛋白質不會表現的破壞株，則可使用任何方法。破壞基因的方法已有文獻報告出各種方法(自然育種、添加突變劑、紫外線照射、放射線照射、隨機突變、轉位子、破壞特定位置的基因)，而從可只破壞某特定基因的觀點看來，以藉由同源重组進行的基因破壞為佳。藉由同源重组的手段係記載於J.Bacteriol.,161,1219-1221(1985)或J.Bacteriol.,177,1511-1519(1995)或Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,97,6640-6645(2000)，藉由該等方法及其應用，只要是同業技術者即可輕易實施。
本發明中「活性」的「強化」泛指強化前的異丙醇生產大腸菌中的各種酵素活性在強化之後提高。
強化的方法只要使異丙醇生產大腸菌所具有的各種酵素的活性提高，則並無特別限制，可列舉由菌體外導入的酵素基因所產生的強化、由菌體內的酵素基因增強所產生的強化、以及該等的組合。
由菌體外導入的酵素基因所產生的強化，具體而言可列舉將編碼比來自宿主的酵素更高活性的酵素的基因由宿主細菌的菌體外導入菌體內，所導入的酵素基因造成酵素活性增加，或以該酵素活性取代宿主原有的酵素活性，進一步可列舉使來自宿主的酵素基因或來自菌體外的酵素基因的數目增加為2以上、或該等的組合。
增強菌體內的酵素基因表現所產生的強化，具體而言可列舉將增強酵素基因表現的鹼基序列由宿主細菌的菌體外導入菌體內，使宿主細菌在基因上所保有的酵素基因的啟動子取代為其他啟動子，藉此使酵素基因的表現強化、以及該等的組合。
在本發明中「宿主」意指將一個以上的基因由菌體外導入的結果，而成為本發明之異丙醇生產大腸菌的該大腸菌。
以下針對本發明作說明。
本發明中的GntR是指對於經由恩納杜道夫路徑的葡萄糖酸代謝所相關的操縱組(operon)作負向控制的轉錄因子。意指抑制負責控制葡萄糖酸的獲取與代謝的兩個基因群(GntI與GntII)的作用的GntR轉錄抑制因子的總稱。
本發明中之葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)是指分類為依據國際生物化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號5.3.1.9，催化由D-葡萄糖-6-磷酸產生D-果糖-6-磷酸的反應的酵素的總稱。
本發明中之葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)是指分類為依據國際生物化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號1.1.1.49，催化由D-葡萄糖-6-磷酸產生D-葡萄糖酸-1,5-內酯-6-磷酸的反應的酵素的總稱。
這樣的酵素可列舉例如來自Deinococcus radiophilus等的Deinococcus屬菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等的Aspergillus屬菌、Acetobacter hansenii等的Acetobacter屬菌、Thermotoga maritima等的Thermotoga屬菌、Cryptococcus neoformans等的Cryptococcus屬菌、Dictyostelium discoideum等的Dictyostelium屬菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等的Pseudomonas屬、Saccharomyces cerevisiae等的Saccharomyces屬、Bacillus megaterium等的Bacillus屬菌、Escherichia coli等的Escherichia屬菌的酵素。
在本發明中所使用的葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)之基因，可利用具有編碼由上述各來源生物所得到的葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素的基因之鹼基序列之DNA，或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可例示具有來自Deinococcus radiophilus等的Deinococcus屬菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等的Aspergillus屬菌、Acetobacter hansenii等的Acetobacter屬菌、Thermotoga maritima等的Thermotoga屬菌、Cryptococcus neoformans等的Cryptococcus屬菌、Dictyostelium discoideum等的Dictyostelium屬菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等的Pseudomonas屬、Saccharomyces cerevisiae等的Saccharomyces屬、Bacillus megaterium等的Bacillus屬菌、Escherichia coli等的Escherichia屬菌的基因的鹼基序列之DNA。較佳者可列舉來自Deinococcus屬菌、Aspergillus屬菌、Acetobacter屬菌、Thermotoga屬菌、Pseudomonas屬、Bacillus屬菌、Escherichia屬等的原核生物，特佳為具有來自Escherichia coli的基因的鹼基序列之DNA。
本發明中之磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)是指分類為依據國際生物化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號1.1.1.44，催化由6-磷酸-D-葡萄糖酸產生D-核酮糖-5-磷酸與CO2的反應的酵素的總稱。
本發明中之異丙醇生產大腸菌是指具備異丙醇生產系統的大腸菌，並保有藉由基因重组技術所導入或修改的異丙醇生 產能力的大腸菌。這種異丙醇生產系統，只要可使對象的大腸菌產生異丙醇，則任一者皆可。
適合的例子可列舉異丙醇的生產所相關的酵素活性的強化。本發明中的異丙醇生產大腸菌係由菌體外賦予乙醯醋酸去羧酶活性、異丙醇脫氫酵素活性、CoA轉移酶活性及前述硫解酶活性這4種酵素活性，或在菌體內增強其活性表現、或兼具這兩者為更佳。
本發明中之硫解酶是指分類為依據國際生物化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號2.3.1.9，催化由乙醯CoA產生乙醯乙醯CoA的反應的酵素的總稱。
這樣的酵素可列舉例如來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等的梭菌屬細菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等的埃希氏菌屬細菌、嗜鹽菌種(Halobacterium sp.)細菌、膠團桿菌(Zoogloea ramigera)等的動膠菌屬細菌、根瘤菌種(Rhizobium sp.)細菌、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)等的慢生根瘤菌屬細菌、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)等的念珠菌屬細菌、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)等的柄桿菌屬細菌、山丘鏈黴菌(Streptomyces collinus)等的鏈黴菌屬細菌、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)等的腸球菌屬細菌的酵素。
在本發明中所使用的硫解酶之基因，可利用具有編碼由上述各來源生物所得到的硫解酶的基因的鹼基序列之DNA或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可例示具有來自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等的梭菌屬細菌、大腸桿菌等的埃希氏菌屬細菌、嗜鹽菌種之細菌、膠團桿菌等的動膠菌屬細菌、根瘤菌種之細菌、日本慢生根瘤菌等的慢生根瘤菌屬細菌、熱帶念珠菌等的念珠菌屬細菌、新月柄桿菌等的柄桿菌屬細菌、山丘鏈黴菌等的鏈黴菌屬細菌、糞腸球菌等的腸球菌屬細菌的基因的鹼基序列之DNA。較佳者可列舉來自梭菌屬細菌或埃希氏菌屬細菌等的原核生物，特佳為具有來自丙酮丁 醇梭菌或大腸桿菌的基因的鹼基序列之DNA。
本發明中之乙醯醋酸去羧酶是指分類為依據國際生物化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號4.1.1.4，催化由乙醯醋酸產生丙酮的反應的酵素的總稱。
這樣的酵素可列舉例如來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等的梭菌屬細菌、多黏桿菌(Bacillus polymyxa)等的桿菌屬細菌的酵素。
導入本發明之宿主細菌的乙醯醋酸去羧酶之基因，可利用具有編碼由上述各來源生物所得到的乙醯醋酸去羧酶的基因的鹼基序列之DNA，或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可列舉來自梭菌屬細菌或桿菌屬細菌，可例示如具有來自丙酮丁醇梭菌、多黏桿菌的基因的鹼基序列之DNA。特佳為具有來自丙酮丁醇梭菌的基因的鹼基序列之DNA。
本發明中之異丙醇脫氫酵素是指分類為依據國際生物化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號1.1.1.80，催化由丙酮產生異丙醇的反應的酵素的總稱。
這樣的酵素可列舉例如來自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等的梭菌屬細菌的酵素。
導入本發明宿主細菌的異丙醇脫氫酵素之基因，可利用具有編碼由上述各來源生物所得到的異丙醇脫氫酵素的基因的鹼基序列之DNA，或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可列舉來自梭菌屬細菌，例如具有來自拜氏梭菌的基因之鹼基序列之DNA。
本發明中之CoA轉移酶是指分類為依據國際生物化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號2.8.3.8，催化由乙醯乙醯CoA產生乙醯醋酸的反應的酵素的總稱。
這樣的酵素可列舉例如來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等的梭菌屬細菌、腸道羅斯氏菌(Roseburia intestinalis)等的羅斯氏菌屬細 菌、普拉氏糞生菌(Faecalibacterium prausnitzii)等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌(Coprococcus)屬細菌、布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)等的錐蟲、大腸桿菌(Escherichia coli：大腸菌)等的埃希氏菌屬細菌的酵素。
在本發明中所使用的CoA轉移酶之基因，可利用具有編碼由上述各來源生物所得到的CoA轉移酶的基因的鹼基序列之DNA，或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可例示具有來自丙酮丁醇梭菌等的梭菌屬細菌、腸道羅斯氏菌等的羅斯氏菌屬細菌、普拉氏糞生菌等的Faecalibacterium屬細菌、糞球菌屬細菌、布魯氏錐蟲等的錐蟲、大腸桿菌等的埃希氏菌屬細菌的基因之鹼基序列之DNA。較佳者可列舉來自梭菌屬細菌或埃希氏菌屬細菌，特佳為具有來自丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌的基因的鹼基序列之DNA。
從酵素活性的觀點看來，上述4種酵素分別以來自選自梭菌屬細菌、桿菌屬細菌及埃希氏菌屬細菌所構成之群中至少1種為佳，其中以乙醯醋酸去羧酶及異丙醇脫氫酵素來自梭菌屬細菌，CoA轉移酶活性及硫解酶活性來自埃希氏菌屬細菌的情況為更佳。
其中從酵素活性的觀點看來，本發明所關連之4種酵素係分別以來自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大腸桿菌中之任一者為佳，以乙醯醋酸去羧酶來自丙酮丁醇梭菌的酵素，CoA轉移酶及硫解酶分別來自丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌的酵素，異丙醇脫氫酵素來自拜氏梭菌的酵素為較佳，從酵素活性的觀點看來，上述4種酵素係以乙醯醋酸去羧酶活性來自丙酮丁醇梭菌，前述異丙醇脫氫酵素活性來自拜氏梭菌為特佳，CoA轉移酶活性及硫解酶活性來自大腸桿菌為特佳。
本發明中該等酵素的活性可設定為由菌體外導入菌體內所得的活性，或使宿主細菌在基因上所保有的酵素基因的啟動子活性強化或取代為其他啟動子，藉此使酵素基因增強表現所得的活性。
酵素活性的導入可藉由例如使用基因重组技術將編碼酵素的基因由宿主細菌的菌體外導入菌體內而進行。此時，所導入的酵素基因對於宿主細胞而言為同種或異種任一者皆可。將基因由菌體外導入菌體內時所必要的基因DNA之調製、DNA的切斷及連結、轉殖、PCR(Polymerase Chain Reaction)、作為引子所使用的寡核苷酸的設計、合成等的方法，可藉由業界人士所周知的常法進行。該等方法係記載於Sambrook,J.,et al.,”Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)等。
在本發明中酵素活性經過強化的大腸菌，是指藉由任何方法使該酵素活性強化後的大腸菌。該等大腸菌可使用例如使用與前述同樣的基因重组技術，將編碼該酵素及蛋白質的基因使用質體由菌體外導入菌體內，或使宿主大腸菌在基因上所保有的酵素基因的啟動子活性強化或取代為其他啟動子，藉此增強酵素基因表現等的方法而製作出來。
本發明中的基因的啟動子只要可控制上述任一者的基因的表現即可，而以恆常在微生物內發揮機能的強力啟動子，且即使葡萄糖的存在下表現不易受到抑制的啟動子為佳。具體而言，可例示甘油醛3-磷酸脫氫酵素(以下會有稱為GAPDH的情形)的啟動子或絲胺酸羥甲基轉移酶的啟動子。
本發明中的啟動子意指結合具有σ因子的RNA聚合酶，而可使轉錄開始的部位。例如來自大腸桿菌的GAPDH啟動子在GenBank accession number X02662之鹼基序列資料之中，記載於鹼基編號397-440。
來自大腸菌的CoA轉移酶基因(atoD及atoA)與硫解酶基因(atoB)會依照atoD、atoA、atoB的順序，在大腸菌基因上形成操縱組(Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins等)，因此藉由改變atoD的啟動子，可同時控制CoA轉移酶基因與硫解酶基因的表現。
由此可知，在CoA轉移酶活性及硫解酶活性是由宿主大腸 菌的基因所得到的情況，從獲得充足的異丙醇生產能力的觀點看來，以藉由將負責控制兩酵素基因的表現的啟動子取代為其他啟動子等以增強兩酵素基因的表現為佳。為了增強CoA轉移酶活性及硫解酶活性的表現所使用的啟動子可列舉前述來自大腸桿菌的GAPDH啟動子等。
在本發明中，具備異丙醇生產系統的異丙醇生產大腸菌的例子可例示WO2009/008377號所記載的pIPA/B株或pIaaa/B株。另外，該大腸菌包括在異丙醇的生產所相關的酵素之中，藉助強化該大腸菌基因上各基因的表現而進行CoA轉移酶活性與硫解酶活性的增強，並以質體強化各基因表現使異丙醇脫氫酵素活性與乙醯醋酸去羧酶活性的增強之後所得到的菌株(會有稱為pIa/B：：atoDAB株的情形)。
從更有效地提升異丙醇生產力的觀點看來，在本發明中以包含去活化的GntR活性為佳。含有去活化的GntR以及去活化的葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性與經過強化的葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性為更佳，以含有去活化的GntR活性、去活化的葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性、去活化的磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性與經過強化的葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性為最佳。藉由該等組合，與其以外的各因子或酵素的組合相比，可使異丙醇的生產力驚人地提升。
本發明中之異丙醇生產大腸菌，其合適形態係使上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B：：atoDAB株的GntR活性去活化所得到之菌株。
更合適的形態為使上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B：：atoDAB株的GntR活性與葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性去活化，並強化葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性所得到之菌株。
特別合適的形態為使上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B：：atoDAB株的GntR活性與葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性與磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性去活化，而強化葡萄糖-6- 磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性的菌株。
本發明中之異丙醇生產大腸菌還可進一步導入編碼蔗糖利用酶的基因群。藉此可由蔗糖生產異丙醇。
編碼蔗糖利用酶的基因，包含編碼微生物的蔗糖利用路徑之中，PTS系統與非PTS系統所相關的酵素群的基因。
具體而言，編碼蔗糖PTS所相關的酵素群的基因可列舉編碼ScrA(進行蔗糖的獲取)、ScrY(進行蔗糖的磷酸化)、ScrB(在微生物內部進行蔗糖的分解)、ScrR(控制編碼ScrA、Y、B的基因的表現)、ScrK(進行果糖的磷酸化)的基因。
另外，編碼蔗糖非PTS所相關的酵素群的蔗糖非PTS基因群，具體而言係由編碼CscB(蔗糖通透酶：進行蔗糖的獲取)、CscA(蔗糖水解酵素：在微生物內部進行蔗糖的分解)、CscK(果糖激酶：進行果糖的磷酸化)、CscR(抑制子蛋白質：控制編碼CscB、A、及K的基因的表現)的基因所構成的基因群。
本發明中之導入異丙醇生產大腸菌的蔗糖利用酶基因，其中可列舉編碼非PTS系所相關的酵素群之基因，其中可列舉至少含CscA的一種以上的酵素組合之基因。可列舉例如僅cscA；cscA及cscK的組合；cscA及cscB的組合；cscA及cscR的組合；cscA、cscR及cscK的組合；cscA、cscR及cscB之組合等。從有效地生產異丙醇的觀點看來，其中亦可選擇僅導入編碼CscA的基因。
前述蔗糖水解酵素(轉化酶，CscA)之基因，可利用具有編碼由保有此酵素的生物所得到的蔗糖水解酵素(轉化酶，CscA)的基因的鹼基序列之DNA、或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可列舉來自伊文氏桿菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，比菲德氏菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)，可例示如具有來自大腸桿菌O157株的基因的鹼基序列之DNA。特佳為具有來自大腸桿菌O157株的基因 的鹼基序列之DNA。另外，cscA以附加有將cscA轉移至菌體的胞外質所用的訊號序列為佳。
前述抑制子蛋白質(CscR)之基因，可利用具有編碼由保有此酵素的生物所得到的抑制子蛋白質(CscR)的基因的鹼基序列之DNA、或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可列舉來自伊文氏桿菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，比菲德氏菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)，可例示如具有來自大腸桿菌O157株的基因的鹼基序列之DNA。特佳為具有來自大腸桿菌O157株的基因的鹼基序列之DNA。
前述果糖激酶(CscK)之基因，可利用具有編碼由保有此酵素的生物所得到的果糖激酶(CscK)的基因的鹼基序列之DNA、或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可列舉來自伊文氏桿菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，比菲德氏菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)，可例示如具有來自大腸桿菌O157株的基因的鹼基序列之DNA。特佳為具有來自大腸桿菌O157株的基因的鹼基序列之DNA。
前述蔗糖通透酶(CscB)之基因，可利用具有編碼由保有此酵素的生物所得到的蔗糖通透酶(CscB)的基因的鹼基序列之DNA、或基於其周知的鹼基序列所合成出的合成DNA序列。適合者可列舉來自伊文氏桿菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，比菲德氏菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)，可例示如具有來自大腸桿菌O157株的基因的鹼基序列之DNA。特佳為具有來自大腸桿菌O157株的基因的鹼基序列之DNA。
在本發明所關連之異丙醇生產大腸菌中，前述異丙醇生產 系統所關連之各酵素，宜為上述異丙醇生產系統的酵素之中，異丙醇脫氫酵素及乙醯醋酸脫氫酵素之至少一種酵素活性，亦可來自以基因改造體的形式所導入的導入基因。
在本發明之中，使該酵素基因的鹼基序列發生缺損、取代、附加等改變全部皆包括在「基因改造體」之內。具體而言，可列舉在該酵素基因的鹼基序列之中，僅變更密碼子，而基於僅變更該密碼子的鹼基序列所合成出的胺基酸序列並未改變者；或僅變更該酵素基因的啟動子區域，而基於僅變更該啟動子區域的鹼基序列所合成的胺基酸序列並未改變者等。
經過修改的酵素基因可為宿主原有的基因，或可來自其他種微生物的酵素基因。
另外，僅編碼異丙醇脫氫酵素的酵素基因或僅乙醯醋酸脫氫酵素酵素基因經過基因改造，或該等同時經基因改造皆可。
就基因改造體而言，只要對基因改造的上述任一酵素基因作變更的結果，對宿主賦予或強化所對應酵素的酵素活性以增強目標物質的生產能力，則可加上任何改變。
適合的基因改造體為基於大腸菌的密碼子使用頻率而對於密碼子的使用作改變之後的改造基因。藉由製作出這種基因改造體，可提升異丙醇的生產力。
在本發明中「對於密碼子的使用作改變」意指在編碼並且決定胺基酸序列的鹼基序列上，將對應於各胺基酸的3鹼基排列的密碼子加以改變。在本發明中「密碼子改變」意指不改變胺基酸序列，而僅改變鹼基序列。
前述異丙醇脫氫酵素之基因改造體，宜具有序列編號40所示的鹼基序列。另外，前述乙醯醋酸脫氫酵素之基因改造體，宜具有序列編號43所示的鹼基序列。藉由使用該等基因改造體，分別可適當地增強異丙醇脫氫酵素及乙醯醋酸脫氫酵素之各酵素活性。
在本發明中大腸菌意指藉由使用任何手段而能夠具有從來自植物的原料生產異丙醇的能力的大腸菌，而與是否原本就 具有從來自植物的原料生產異丙醇的能力無關。
此處，上述基因重组對象的大腸菌亦可具有異丙醇生產能力，而只要上述各基因的導入及變更為可行的，則任一種大腸菌皆可。
較佳可為預先賦予異丙醇生產能力的大腸菌，藉此可更有效地生產異丙醇。
這樣的異丙醇生產大腸菌可列舉例如WO2009/008377號小冊子所記載的可賦予乙醯醋酸去羧酶活性、異丙醇脫氫酵素活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性，並且可從來自植物的原料產生異丙醇之異丙醇生成大腸菌等。
本發明之異丙醇生產方法包含使用上述異丙醇生產大腸菌，而從來自植物的原料生產異丙醇，亦即包含：使上述異丙醇生產大腸菌與來自植物的原料接觸而培養(以下稱為培養步驟)；與藉由接觸而回收所得到的異丙醇(以下稱為回收步驟)。
上述異丙醇生產方法所使用來自植物的原料只要是由植物所得到的碳源而為來自植物的原料，則不受特別限制。在本發明中，來自植物的原料是指根、莖、幹、枝、葉、花、種子等器官、含有該等的植物體、及該等植物器官的分解產物，甚至植物體、植物器官、及由該等的分解產物所得到的碳源之內，在培養時可被微生物當作碳源利用的物質也包含在來自植物的原料。
在這種來自植物的原料所包含的碳源中，一般可列舉澱粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等的糖類、及富含該等成分的草木物質分解產物、纖維素水解物等，以及該等的組合，甚至在本發明中的碳源還可包含來自植物油的甘油或脂肪酸。
本發明中之來自植物的原料的例子，適合者可列舉穀物等農作物、玉米、米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、綿等、及該等的組合，其原料的使用形態有未加工品、搾汁、粉碎物等，然而並未受到特別限定。另外還可為只有上述碳源的形態。
在培養步驟中，異丙醇生產大腸菌與來自植物的原料的接觸一般而言，藉由以含有來自植物的原料的培養基培養異丙醇生產大腸菌而進行。
來自植物的原料與異丙醇生產大腸菌的接觸密度，依照異丙醇生產大腸菌的活性而有所不同，而一般而言，培養基中來自植物的原料濃度，可將以葡萄糖換算的初始糖濃度定為相對於混合物的總質量而言的20質量%以下，從大腸菌的耐糖性的觀點看來，宜將初始糖濃度定在15質量%以下。此其他各成分只要以微生物的培養基通常所添加的量作添加即可，並未受到特別限制。
另外，培養基中之異丙醇生產大腸菌的含量會依照大腸菌的種類及活性而有所不同，一般而言將培養開始時所投入的前培養菌液(OD660nm=4~8)之量定為相對於培養液而言的0.1質量%~30質量%，從控制培養條件的觀點看來，宜定為1質量%~10質量%。
異丙醇生產大腸菌的培養所使用的培養基，只要是含有碳源、氮源、無機離子、以及微生物為了產生乳酸所需要的有機微量元素、核酸、維生素類等通常所使用的培養基，則並無特別限制。
進行本發明之培養時，培養條件並無特別限制，例如可在好氣條件下適當地將pH與溫度控制在pH4~9(宜為pH6~8)、溫度20℃~50℃(宜為25℃~42℃)的範圍內而進行培養。
通往前述混合物中的氣體通氣量並無特別限制，而在氣體僅使用空氣的情況下，一般而言0.02vvm~2.0vvm(vvm；通氣容量[mL]/液體容量[mL]/時間[分鐘])，從抑制對大腸菌的物理傷害的觀點看來，以在0.1vvm~1.5vvm進行為佳。
培養步驟，可由培養開始持續至混合物中來自植物的原料消耗完為止，或異丙醇生產大腸菌的活性消失為止。在培養步驟的時間，會依照混合物中的異丙醇生產大腸菌數目及活性以及來自植物的原料量而有所不同，一般而言只要在1小時以上 即可(宜為4小時以上)。另一方面，藉由再次投入來自植物的原料或異丙醇生產大腸菌，培養期間可無限制地持續，而從處理效率的觀點看來，一般而言可定為5天以下，宜為72小時以下。其他條件只要直接適用通常的培養所使用的條件即可。
回收培養液中所累積的異丙醇之方法並無特別限制，而可採用例如以離心分離等將菌體由培養液除去後，以蒸餾或膜分離等通常的分離方法分離出異丙醇的方法。
此外，本發明之異丙醇的生產方法中，在生產異丙醇的培養步驟之前亦可包含用以使所使用的異丙醇生產大腸菌成為適當的菌數或適度的活性狀態的前培養步驟。前培養步驟只要因應異丙醇生產細菌的種類，藉由通常所使用的培養條件進行培養即可。
本發明之異丙醇的生產方法宜包含：對含有前述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物中供給氣體，並且培養該異丙醇生產大腸菌之培養步驟；與將藉由前述培養所產生的異丙醇由混合物分離而回收之回收步驟。
依據此方法，而對混合物供給氣體同時進行生產大腸菌的培養(通氣培養)。藉由此通氣培養所生產的異丙醇被釋放至混合物中，並且由混合物蒸散，此結果，可輕易將所產生的異丙醇由混合物分離。另外，由於使所產生的異丙醇由混合物連續地分離，故可抑制混合物中的異丙醇濃度上昇。因此並沒有必要特別考慮異丙醇生產大腸菌對於異丙醇的耐性。
此外，在本方法中的混合物只要以大腸菌的培養一般所使用的基本培養基為主體即可。關於培養條件，可直接適用前述事項。
在回收步驟中，將培養步驟所產生並由混合物所分離出的異丙醇回收。此回收方法只要可收集由通常的培養產生的混合物所蒸散的氣態或飛沫狀異丙醇即可。這種方法可列舉收容在一般所使用的密閉容器等的收集構件等，而從能夠以高純度只回收異丙醇的觀點看來，其中以包含使捕捉異丙醇所用的捕捉 液與由混合物分離的異丙醇接觸的程序為佳。
在本方法中，異丙醇能夠以溶於捕捉液或混合物的形態回收。這樣的回收方法可列舉例如國際公開2009/008377號小冊子所記載的方法等。所回收的異丙醇可使用HPLC等通常的偵測手段作確認。所回收的異丙醇亦可因應必要進一步精製。這樣的精製方法可列舉蒸餾等。
在所回收的異丙醇為水溶液狀態的情況，本異丙醇的生產方法在回收步驟以外，還可進一步包含脫水步驟。異丙醇的脫水可藉由常法進行。
能夠以溶於捕捉液或混合物的形態進行回收的異丙醇生產方法所可適用的裝置可列舉例如國際公開2009/008377號小冊子之圖1所示的生產裝置。
在此生產裝置中，在收容異丙醇生產細菌與含有來自植物的原料的培養基的培養槽連結有用於由裝置外部注入氣體的注入管，並可對培養基通氣。
另外，在培養槽中，透過連結管連結有阱槽，其係收容有作為捕捉液的阱液。此時，移動至阱槽的氣體或液體與阱液接觸，而發生起泡作用。
藉此，藉由在培養槽通氣培養所生成的異丙醇會因為通氣而蒸散，可輕易地由培養基分離，並且在阱槽之中被阱液所補足。此結果，能夠以更進一步精製的形態連續且簡便地生產異丙醇。
以本發明之異丙醇的生產方法可高效生產異丙醇，以同樣的方法通常所得到的產量比不採用本發明的情況還高。生產力會依照生產方法的條件或所使用的異丙醇生產大腸菌的狀態而有所不同，而可定為50~100g/L/72hr，宜為55~80g/L/72hr。
本發明之異丙醇生產大腸菌能夠以這樣的方式高效生產異丙醇，因此例如在使用本發明之大腸菌觸媒以製造異丙醇的情況，培養72小時可累積75g/L以上的異丙醇，可獲得遠比以往觸媒還高的生產力。
另外，在本發明之異丙醇生產大腸菌中，也會同時生產出異丙醇前驅物的丙酮。在將所得到的丙酮以周知的方法精製後，宜藉由使用周知的方法(例如日本特許第2786272號公報記載的方法)轉換成異丙醇。藉此可進一步提高由糖原料轉換成異丙醇的轉換效率。
本發明所關連之丙酮生產方法為一種丙酮生產方法，包含使用前述異丙醇生產大腸菌，從來自植物的原料得到異丙醇(以下稱為異丙醇生產步驟)；及使所得到的異丙醇與作為觸媒的複合氧化物接觸(以下稱為丙酮生產步驟)，而該複合氧化物含有氧化鋅與含第4族元素至少1種的氧化物，且以共沉澱法所調製。
藉由使以共沉澱法所調製的前述複合氧化物與使用前述異丙醇生產大腸菌所得到的異丙醇接觸而發生脫氫反應，可由異丙醇生產丙酮。藉此，可有效地利用使用前述異丙醇生產大腸菌所生產的異丙醇，而有效地進行物質生產。
關於異丙醇生產步驟所使用的異丙醇生產大腸菌、來自植物的原料，以及異丙醇生產的條件等，可直接適用先前關於異丙醇的生產所述的事項。
在丙酮生產步驟中，使用含有氧化鋅與含至少1種第4族元素的氧化物，且以共沉澱法所調製的複合氧化物作為觸媒。
第4族元素意指週期表的第4族元素，可列舉鈦、鋯及鉿等。從高選擇性生產丙酮的觀點看來，以鋯為佳。
作為觸媒所可使用的複合氧化物可列舉ZnO：ZrO2、ZnO：TiO2、CuO：ZnO：Al2O3等，從觸媒活性、及丙酮的選擇性的觀點看來，以ZnO：ZrO2為佳。
關於氧化鋅與含至少1種第4族元素的氧化物的比率並無特別限制，而從觸媒活性及丙酮選擇性的觀點看來，以定在50：50~99：1為佳，定在65：35~95：5為較佳。氧化鋅的比率只要在50以上即可表現出較高的觸媒活性，只要在99以下即可表現出較高的丙酮選擇性，因此為適合。
複合氧化物係以共沉澱法所調製之物。由於可作為觸媒使用的複合氧化物係以共沉澱法所調製，因此具有觸媒組成的均勻性、觸媒調製時容易作控制等優點。
共沉澱法是作為製造多成分系統的複合氧化物的方法一般所使用的調製法，藉著在2種以上的金屬鹽的混合水溶液中加入如鹼水溶液般的沉澱劑、可使其均勻地沉澱出固體。
具體的觸媒調製方法為將硝酸鋅等的水溶性鋅鹽的水溶液與硝酸鋯等的水溶性鋯鹽的水溶液以成為所希望的金屬氧化物之組成的方式混合，將此水溶液滴入碳酸鈉等的鹼水溶液中，使其成為鹼性而沉澱出氫氧化物固體。將此產生的沉澱物濾出，並且水洗、乾燥之後燒成，藉此可製造。
另外，在實施本發明時，所使用的觸媒量並未受到特別限定，而在例如使用固定床流通裝置進行反應的情況，將原料(異丙醇)之每小時的供給量(質量)除以觸媒質量之值，亦即以WHSV表示，希望在0.01~200/h的範圍，較佳為0.02~100/h的範圍為適合。
本發明中的脫氫反應，可以批次式或連續式等的反應形式進行。在連續式的情況，例如使原料流通至填充有觸媒的管狀反應器，並回收由反應器流出的反應生成物。
進行脫氫反應時的反應溫度通常可定為100℃~500℃，宜為150℃~450℃、更佳為200℃~400℃。在丙酮與異丙醇、氫之間有平衡關係，反應溫度高的情況，丙酮的平衡組成變高。因此只要反應溫度在100℃以上，則異丙醇不會大量殘存，故為適合。另外只要在500℃以下，則不會導致不希望發生的副反應增加，故為適合。反應壓力並無特別限定，宜定為0.1MPa~1.0MPa，而情況會依反應溫度而定。
在回收反應生成物之後亦可因應必要、適當地追加進行精製等。關於丙酮的精製方法等，可適用該業界所周知或公開的精製方法。
本發明所關連之丙烯生產方法包含：使用前述異丙醇生產 大腸菌，而從來自植物的原料得到含有丙酮的異丙醇(以下稱為異丙醇生產步驟)；及使所得到含有丙酮的異丙醇，在作為觸媒的含Cu的氫化觸媒及固體酸物質的存在下、在反應溫度50~300℃的範圍使丙酮與氫反應(以下稱為觸媒反應步驟)。此外在說明書之中，以下亦將含Cu的氫化觸媒簡記為「氫化觸媒」。
在前述丙烯生產方法中，由前述異丙醇生產大腸菌所得到的異丙醇會藉由前述固體酸物質，而使異丙醇脫水產生丙烯及水。
關於異丙醇生產步驟所使用的異丙醇生產大腸菌及來自植物的原料並且、異丙醇生產的條件等，可直接適用先前關於異丙醇的生產所述的事項。
在前述觸媒反應步驟中，以異丙醇生產步驟所得到含有丙酮的異丙醇作為原料，使用含Cu的氫化觸媒及固體酸物質，在既定條件下使丙酮與氫反應。
前述觸媒反應步驟所使用的氫氣可使用分子狀態的氫氣，亦可依照反應條件使用可產生氫氣的環己烷等的烴類所產生的氫氣。氫氣原則上只要相對於丙酮為等莫耳以上即可，從分離回收的觀點看來，宜為相對於丙酮而言的1~10倍莫耳、較佳為1~5倍莫耳即可。例如只要將氫氣每小時的供給量相對於丙酮每小時的供給量設定在前述範圍即可。在欲將丙酮的轉化率抑制在100%以下的情況，藉著將氫氣的量相對於丙酮的量而言減低1倍莫耳即可對應。
在前述觸媒反應步驟之中，所供給的氫氣會與丙酮的氧原子鍵結而成為水，可由反應器出口取出。另外，超過丙酮當量的氫，只要沒有發生預測以外的副反應，本質上並不會消耗。
在對反應器供給氫氣的情況，通常為連續供給，然而並未受到此方法特別限定。氫的供給形態可為間歇性供給，係在反應開始時供給氫氣之後，在反應中停止供給，經過某一定時間後再度供給，而在液相反應的情況，使氫氣溶於溶劑而供給亦無妨。
另外，氫氣可將氫氣由反應器取出而再利用。這樣的氫氣回收程序可為例如在反應器後部，藉由氣液分離器分離成反應液與反應氣體，以分離膜等將氫氣由反應氣體分離，並再度供給至反應器的入口。在採用此回收程序的情況，可將與輕沸點餾出物一起由塔頂回收而得的氫氣供給至反應器。所供給的氫氣壓力一般而言與反應器的壓力同等，而只要因應氫的供給方法亦可適當地變更。
在實施本發明時，亦可在反應系統內，對於觸媒以及起始物質(丙酮、異丙醇及氫)供給非活性的溶劑或氣體，以稀釋的狀態進行前述反應。
前述觸媒反應步驟所適用的反應溫度為50℃~300℃。在未滿50℃的情況，無法得到足夠的丙酮或異丙醇的轉化率，另外，若超過300℃，則發生預測以外的副反應或丙烯的聚合等而無法維持足夠的丙烯的選擇率。從經濟性的觀點看來，反應溫度宜在150℃~250℃的範圍，較佳為150~200℃。
在進行前述反應情況，其他方法及條件並無特別限制，可採用例如以下所示般的條件及方法。作為起始物質的丙酮、異丙醇與氫氣的接觸、或氫氣的供給方法，可採氣液向流及氣液併流的任一者，另外，液體及氣體的方向可採液體下降-氣體上昇、液體上昇-氣體下降、液氣體皆上昇、液氣體皆下降的任一者。另外，實施壓力宜為0.1氣壓~500氣壓，更佳為0.5氣壓~100氣壓。
前述固體酸物質為通常的固體酸，可列舉沸石、二氧化矽、氧化鋁、二氧化矽氧化鋁、γ氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯等的金屬氧化物等。從高觸媒活性、及高丙烯選擇性的觀點看來，該等之中尤其以沸石為佳。
沸石只要依照被認為在前述反應之中以原料及中間體的形式存在的異丙醇及目標之丙烯的分子大小而選擇適合的沸石即可。
沸石由於與異丙醇或丙烯的分子大小相近，因此尤其以具 有氧10~12員環的細孔的沸石為佳。具有氧10~12員環的沸石可列舉鎂鹼沸石、片沸石、ZSM-5、ZSM-11、ZSM-12、NU-87、theta-1、隕球纖石、X型沸石、Y型沸石、USY型沸石、絲光沸石、脫鋁絲光沸石、β-沸石、MCM-22、MCM-56等。該等之中尤其以β-沸石為佳。
為了得到高活性，沸石中的矽與鋁的組成比(矽/鋁)係以在2/1~200/1的範圍為佳，活性及熱安定性的層面看來，以在5/1~100/1的範圍為特佳。甚至還可使用以Ga、Ti、Fe、Mn、B等鋁以外的金屬取代沸石骨架所含的鋁，所謂同型取代的沸石。另外，沸石亦可使用以金屬離子修飾自身而得之物。
固體酸物質的形狀並沒有特別限制，可為球狀、圓柱狀、擠出物狀、破碎狀的任何一種。此外，其粒子大小亦無特別限制，通常在0.01mm~100mm的範圍，只要因應反應器的大小選擇即可。固體酸物質可單獨使用一種，或可使用兩種以上。
前述含Cu的氫化觸媒可列舉直接含有金屬Cu者、以金屬化合物的形式含有Cu者等。前述金屬化合物可列舉例如CuO、Cu2O等的金屬氧化物；及CuCl2等的金屬氯化物等。另外亦可使該等觸媒擔持於擔體。
從得到較高的選擇性、或較長的觸媒壽命的觀點看來，前述含Cu的氫化觸媒係以進一步含有週期表的第6族、第12族及第13族之中至少一種元素為佳。合適的元素在第6族可列舉Cr、Mo等；第12族可列舉Zn等；第13族可列舉Al、In等。這樣的氫化觸媒可列舉銅-鉻、雷尼銅(Raney copper)、銅-鋅等的銅系觸媒。
另外，在前述含Cu的氫化觸媒中，亦可添加PbSO4、FeCl2、SnCl2等的金屬鹽；K、Na等的鹼金屬或鹼金屬鹽；BaSO4等，藉此，前述含Cu的氫化觸媒之活性或丙烯的選擇率會有提升的情況。前述金屬鹽、鹼金屬或鹼金屬鹽添加至前述氫化觸媒的添加量並無特別限制，而主要從選擇性的觀點看來，以0.01質量%~10.00質量%為佳。
在市面上可取得的含Cu的氫化觸媒可列舉例如CuO-ZnO-Al2O3、CuO-Cr2O3-BaO等。
氫化觸媒的形狀沒有特別限制、球狀、圓柱狀、擠出物狀、破碎狀任一者皆可。另外，其粒子的大小亦無特別限制，通常在0.01mm~100mm的範圍，只要因應反應器的大小選擇即可。
在本發明所關連之丙烯之製造方法中，可對填充前述氫化觸媒及固體酸物質的反應器供給前述丙酮及氫，而使丙酮與氫反應。反應器中所填充的氫化觸媒及固體酸物質的合計量(以下記載為「觸媒量」)並未受到特別限定，而例如在使用具備固定床反應器的固定床流通裝置進行反應的情況，作為起始物質的丙酮每小時的供給量(質量)除以觸媒量(重量)之值，亦即以WHSV表示，宜在0.1~200/h，更佳為0.2~100/h的範圍。
固體酸物質與氫化觸媒量之比例並未受到特別限定，而固體酸物質：氫化觸媒(質量比)通常為1：0.01~1：100，宜為1：0.05~1：50為佳。固體酸物質：氫化觸媒量之比例只要在1：0.01以上，則會有獲得足夠的丙酮轉化率的傾向，此外，固體酸物質：氫化觸媒量的比例只要在1：100以內，則會有脫水反應充分進行，丙烯的產率足夠的傾向。
在前述反應經過某時間之後觸媒活性降低的情況，以周知的方法進行再生即可恢復氫化觸媒及固體酸物質的活性。
在本發明中，作為觸媒只要使用固體酸物質與氫化觸媒這2種成分即可。另外，該觸媒的使用方法並無特別限定，例如可使用酸觸媒成分的固體酸物質與氫化觸媒加以物理混合製成公分級粒徑的觸媒粒子、或可將兩者微細化而混合後，然後成形為公分級粒徑的觸媒粒子，亦可以固體酸物質作為擔體並於其上擔持氫化觸媒、以氫化觸媒作為擔體並於其上擔持固體酸物質亦可。另外還可不將氫化觸媒與固體酸物質加以混合等而分別使用。
尤其從高活性及高選擇性並且工業上可取得的觀點看來，以使用氫化觸媒，且構成固體酸物質的沸石使用β-沸石為 佳。例如氫化觸媒亦可擔持於沸石。其調製方法可列舉使Cu的硝酸鹽等的水溶液浸滲至沸石並且燒成之方法；由於Cu可溶於有機溶劑，故使被稱為配位子的有機分子以與Cu結合的錯合物的形式添加至有機溶劑中，而調製成溶液，使該溶液浸滲至沸石並且燒成之方法；甚至在錯合物之中，某種物質由於在真空下氣化故以蒸鍍等使其擔持於沸石之方法等。
另外，氫化觸媒亦可擔持於沸石以外的擔體。可擔持氫化觸媒的擔體可列舉二氧化矽、氧化鋁、二氧化矽氧化鋁、二氧化鈦、氧化鎂、二氧化矽氧化鎂、鋯、氧化鋅、碳(活性碳)、酸性白土、矽藻土等。從較高活性及較高選擇性的觀點看來，該等之中以從二氧化矽、氧化鋁、二氧化矽氧化鋁、二氧化鈦、氧化鎂、二氧化矽氧化鎂、鋯、氧化鋅、碳(活性碳)之中選擇至少一種為佳。
在本發明中所使用的反應器可列舉固定床反應器、流動床反應器等，而從防止觸媒的磨耗或粉化的觀點看來，以固定床反應器為佳。
在本發明中，將氫化觸媒及固體酸物質填充於反應器的方法並未受到特別限定。在反應器採用固定床反應器的情況，氫化觸媒及固體酸物質的填充方法會有對反應結果造成大幅影響的情形。如前述般，認為在本發明中氫化與脫水反應會階段性地發生。所以，在有效使用觸媒的意義上，以及在抑制非目標的副反應的意義上，因應反應各階段依序將適當的觸媒種類填充至反應器為合適的填充方法。
尤其是在為了提升反應速率，而使氫氣壓力或反應溫度上昇的情況，會發生在低氫氣壓力或低反應溫度所未觀察到預測以外的副反應，這是一般的化學反應之中時常觀察到的現象。在這樣的情況中，尤其是觸媒的填充方法，有可能會對反應結果造成大幅影響。
因此，可因應反應的各階段將適當的觸媒種類依序填充至反應器，亦可使氫化觸媒與固體酸物質的混合比產生梯度而填 充至反應器。將氫化觸媒與固體酸物質填充至反應器的方法，可列舉例如在反應器中，(1)將氫化觸媒及固體酸物質混合而填充的方法；(2)以形成由氫化觸媒所構成之層(上游側，亦即入口側)與由固體酸物質所構成之層(下游側，亦即出口側)的方式填充的方法；(3)填充擔持氫化觸媒的固體酸物質的方法；(4)以形成由氫化觸媒所構成之層(上游側，亦即入口側)與由固體酸物質及氫化觸媒所構成之層(下游側，亦即出口側)的方式填充的方法；(5)形成由氫化觸媒所構成之層(上游側，亦即入口側)與由擔持氫化觸媒的固體酸物質所構成之層(下游側，亦即出口側)的方式填充的方法；(6)以形成由氫化觸媒及固體酸物質所構成之層(上游側，亦即入口側)與由固體酸物質所構成之層(下游側，亦即出口側)的方式填充的方法；(7)以形成由擔持氫化觸媒的固體酸物質所構成之層(上游側，亦即入口側)與由固體酸物質所構成之層(下游側，亦即出口側)的方式填充的方法。此外，上游側是指反應器的入口側，亦即表示起始物質在反應的前半所通過的層，下游側是指反應器的出口側，亦即表示起始物質、中間體及反應生成物等在反應的後半所通過的層。此外，起始物質意指丙酮及氫，而在以氣液向流的方式對反應器供給丙酮及氫氣的情況，前述上游側(入口側)意指丙酮在反應的前半所通過的層。
為了維持丙烯的產量，亦可採用將兩個或3個反應器並排，於一個反應器中的觸媒再生的期間，以剩下的一個或兩個反應器實施反應的旋轉木馬式。進一步在有3個反應器的情況，可採用將其他兩個反應器直列連接以減少產量變動的方法。另外，在以流動床流通反應方式或移動床反應方式實施的情況，由反應器連續或間歇地將一部分或全部的觸媒取出並補充相當的分量，藉此可維持一定的活性。
[實施例]
以下記載本發明之實施例，然而本發明並不受該等所限制。此外，所記載的「%」只要沒有特別解釋，則為質量基準。
(異丙醇生產株之製作)
將本實施例所使用的大腸菌株與質體的一覧表揭示於表1及表2。
[實施例1]
<B：：atoDAB株的製作>
大腸桿菌MG1655株的基因DNA中全部的鹼基序列已為周知(GenBank accession number U00096)，也有文獻報告出編碼大腸桿菌MG1655株的CoA轉移酶α次單元的基因(以下會有簡記為atoD的情形)之鹼基序列。亦即atoD係記載於GenBank accession number U00096所記載的大腸桿菌MG1655株基因序列的2321469~2322131。
為了使上述基因表現出來所須要的啟動子之鹼基序列，可使用GenBank accession number X02662的鹼基序列資料之中，397-440所記載來自大腸桿菌的甘油醛3-磷酸脫氫酵素(以下會有稱為GAPDH的情形)之啟動子序列。為了取得GAPDH啟動子，將大腸桿菌MG1655株的基因DNA使用於樣板，藉由cgctcaattgcaatgattgacacgattccg(序列編號1)、及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列編號2)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素MfeI及EcoRI切割，而得到編碼約100bp的GAPDH啟動子的DNA片段。將所得到的DNA片段與將質體pUC19(GenBank accession number X02514)以限制酵素EcoRI切割進一步與鹼性磷酸酶處理後的產物混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將10個所得到的菌落分別以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，並回收質體，選出以限制酵素EcoRI及KpnI切割時GAPDH啟動子並未被切出的部分，進一步確認DNA序列，將GAPDH啟動子已正確插入者定為pUCgapP。將所得到的pUCgapP以限制酵素EcoRI及KpnI切割。
進一步為了取得atoD，而將大腸桿菌MG1655株的基因DNA使用於樣板，藉由cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(序列編號3)、及gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(序列編號4)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素EcoRI及KpnI切割，而得到約690bp的atoD片段。將此DNA片段與先以限制酵素EcoRI及KpnI切割的pUCgapP混合，使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。由所得到的菌體回收質體，並確認atoD 已正確插入，將此質體命名為pGAPatoD。
此外，大腸桿菌MG1655株可由美國菌種保存中心取得。
如上述般，也已經有文獻報告出大腸桿菌MG1655株的基因DNA中的atoD的鹼基序列。使用基於大腸桿菌MG1655株的atoD的5'附近區域的基因資訊所製作的gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(序列編號5)與tactgcagcgttccagcaccttatcaacc(序列編號6)，以大腸桿菌MG1655株的基因DNA為鑄型而進行藉由PCR，而增幅約1.1kbp的DNA斷片。
另外，使用基於大腸桿菌MG1655株的GAPDH啟動子的序列資料所製作的ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列編號7)與基於大腸桿菌MG1655株的atoD的序列資料所製作的序列編號4的引子，以先前製作的表現載體pGAPatoD為鑄型而進行PCR，而得到由GAPDH啟動子與atoD所構成約790bp的DNA片段。
分別將由上述所得到的片段以限制酵素PstI與XbaI、XbaI與KpnI切割，將此片段與將溫度敏感性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)[Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,241,185-191(2000)]以PstI與KpnI切割所得到的片段混合，使用連接酶結合後，轉殖至DH5α株，而得到在30℃生長於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基在30℃培養一晚，並由所得到的菌體回收質體。將此質體轉殖至大腸桿菌B株(ATCC11303)，並於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基，並在30℃培養一晚。將所得到的培養菌體塗佈在含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並在42℃培養而得到菌落。將所得到的菌落以不含抗生物質的LB液態培養基在30℃培養2小時，塗佈在不含抗生物質的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，分別使其生長於不含抗生物質的LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇氯黴素敏感性的純株。進一步由該等純株的染色體DNA進行PCR，藉此增幅含有GAPDH啟動子與atoD的約790bp斷片，選出atoD啟動子區域被取代為GAPDH啟動子的菌株，將滿足以上的純株命名為大腸桿菌B：：atoDAB。
此外，大腸桿菌B株(ATCC11303)可由細胞‧微生物‧基因銀行的美國菌種保存中心取得。
[實施例2]
<質體pIaz的製作>
梭菌屬細菌之乙醯醋酸去羧酶係記載於GenBank accession number M55392；異丙醇脫氫酵素係記載於GenBank accession number AF157307。
為了使上述基因群表現出來所需要的啟動子之鹼基序列，可使用在GenBank accession number X02662之鹼基序列資料之中，397-440所記載來自大腸桿菌的甘油醛3-磷酸脫氫酵素(以下會有稱為GAPDH的情形)的啟動子序列。
為了取得GAPDH啟動子，將大腸桿菌MG1655株的基因DNA使用於樣板，藉由cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(序列編號18)、及cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(序列編號19)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素NdeI、SphI切割，而得到相當於約110bp的GAPDH啟動子之DNA片段。將所得到的DNA片段與將質體pBR322(GenBank accession number J01749)以限制酵素NdeI及SphI切割所得到的片段混合，使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，並由所得到的菌體回收質體pBRgapP。
為了取得異丙醇脫氫酵素基因，將Clostridium beijerinckii NRRL B-593的基因DNA使用於樣板，藉由aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列編號8)、及gcggatccttataatataactactgctttaattaagtc(序列編號9)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素SphI、BamHI切割，而得到約1.1kbp的異丙醇脫氫酵素片段。將所得到的DNA片段與將質體pBRgapP以限制酵素SphI及BamHI切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，由所得到的菌體回收質體，並確認IPAdh已正確插入，將此質體命名為pGAP-IPAdh。
為了取得乙醯醋酸去羧酶基因，將Clostridium acetobutylicum ATCC824的基因DNA使用於樣板，藉由caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(序列編號10)、及ggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc(序列編號11)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素BamHI、EcoRI切割，而得到約700bp的乙醯醋酸去羧酶片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pGAP-IPAdh以限制酵素BamHI及EcoRI切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，由所得到的菌體回收質體，並確認adc已正確插入，將此質體命名為pIa。
為了取得葡萄糖6磷酸-1-脫氫酵素基因(zwf)，將大腸桿菌B株的基因DNA(GenBank accession No.CP000819)使用於樣板，以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素切割，而得到約1500bp的葡萄糖6磷酸1-脫氫酵素片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pIa以限制酵素切割所得到的 片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，將所得到的質體定為pIaz。
將此質體pIaz轉殖至實施例1所製作的大腸桿菌B：：atoDAB勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB。
[實施例3]
<大腸桿菌B株△pgi株的製作>
大腸桿菌MG1655之基因DNA中全部的鹼基序列已為周知(GenBank accession number U00096)，也已經有文獻報告出編碼大腸桿菌的磷酸葡萄糖異構脢(以下會有稱為pgi的情形)的基因之鹼基序列(GenBank accession number X15196)。為了選殖編碼pgi的基因(1,650bp)之鹼基序列附近區域，合成出以caggaattcgctatatctggctctgcacg(序列編號14)、cagtctagagcaatactcttctgattttgag(序列編號15)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(序列編號16)及gacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(序列編號17)所表示的4種寡核苷酸引子。序列編號14的引子在5'端具有EcoRI識別部位，序列編號15及16的引子在5'端具有XbaI識別部位，而序列編號17的引子在5'端具有PstI識別部位。
調製大腸桿菌MG1655株(ATCC700926)的基因DNA，以所得到的基因DNA作為鑄型，以序列編號14與序列編號15的引子對進行PCR，藉此增幅約1.0kb的DNA斷片(以下會有稱為pgi-L斷片的情形)。另外，以序列編號16與序列編號17的引子對進行PCR，而藉此增幅約1.0kb的DNA斷片(以下會有稱為pgi-R斷片的情形)。將該等DNA斷片以瓊脂糖電泳分離、回收，分別將pgi-L斷片以EcoRI及XbaI切割，將pgi-R 斷片以XbaI及PstI切割。將此切割斷片2種與將溫度敏感性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)之EcoRI及PstI切割物混合，並以T4DNA連接酶反應後，轉殖至大腸桿菌DH5α勝任細胞(東洋紡績公司製)，而得到在30℃生長於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板的轉殖體。由所得到的轉殖體回收質體，並確認了編碼pgi的基因的5'上游附近斷片與3'下游附近斷片這兩個斷片正確插入pTH18cs1。將所得到的質體以XbaI切割後，藉由T4DNA聚合酶進行平端化處理。將本DNA斷片與將pUC4K質體(GenBank accession number X06404)(Pharmacia)以EcoRI切割所得到的康黴素耐性基因進一步藉由T4DNA聚合酶進行平端化處理的DNA斷片，使用T4DNA連接酶連結。然後轉殖至大腸桿菌DH5α勝任細胞，而得到在30℃生長於含氯黴素10μg/ml與康黴素50μg/ml的LB洋菜平板的轉殖體。由所得到的轉殖體回收質體，確認康黴素耐性基因已正確插入編碼pgi的基因的5'上游附近斷片與3'下游附近斷片之間，將其定為pTH18cs1-pgi。
將以如此的方式得到的質體pTH18cs1-pgi轉殖至大腸桿菌B株(ATCC11303)，並於含有氯黴素10μg/ml與康黴素50μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有康黴素50μg/ml的LB液態培養基，並在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素50μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以含有康黴素50μg/ml的LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈在含有康黴素50μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由出現的菌落中隨機撿選100個菌落，使其分別生長於含有康黴素50μg/ml的LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，選擇僅生長於含有康黴素的LB洋菜平板的氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進行PCR，藉此選出pgi基因被取代為康黴素耐性基因且可得到約 3.3kbp斷片的增幅之菌株，將所得到的菌株命名為B株pgi基因缺損株(以下會有簡記為B△pgi株的情形)。
此外，大腸桿菌MG1655株及大腸桿菌B株可由美國菌種保存中心取得。
[實施例4]
<pIaaa/B△pgi株的製作>
已經有文獻報告出大腸桿菌的硫解酶及大腸桿菌的CoA轉移酶的胺基酸序列與基因的鹼基序列。亦即，編碼硫解酶的基因係記載於GenBank accession number U00096所記載的大腸桿菌MG1655株基因序列的2324131~2325315。另外，編碼CoA轉移酶的基因係記載於上述大腸桿菌MG1655株基因序列的2321469~2322781。藉著使該等與來自後述梭菌屬細菌的乙醯醋酸去羧酶基因、異丙醇脫氫酵素基因一起表現，可進行異丙醇的生產。
為了取得異丙醇脫氫酵素基因，將Clostridium beijerinckii NRRL B-593的基因DNA使用於樣板，藉由aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列編號20)、及gcggatccggtaccttataatataactactgctttaattaagtc(序列編號21)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素SphI、BamHI切割，而得到約1.1kbp之異丙醇脫氫酵素片段。將所得到的DNA片段與將實施例2所製作的質體pBRgapP以限制酵素SphI及BamHI切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，並由所得到的菌體回收質體pGAP-IPAdh。
為了取得來自大腸桿菌的硫解酶基因，將大腸桿菌MG1655株的基因DNA使用於樣板，以PCR法增幅，並將所得到的DNA片段以限制酵素切割，而得到約1.2kbp的硫解酶 片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pGAP-IPAdh以限制酵素切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合之後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，並由所得到的菌體回收質體pGAP-IPAdh-atoB。
為了取得來自大腸桿菌的CoA轉移酶基因，將大腸桿菌MG1655株的基因DNA使用於樣板，以PCR法增幅，並將所得到的DNA片段以限制酵素切割，而得到約600bp的CoA轉移酶α次單元片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pGAP-IPAdh-atoB以限制酵素切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，並由所得到的菌體回收質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD。
進一步將大腸桿菌MG1655株的基因DNA使用於樣板，以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素切割，而得到約600bp的CoA轉移酶β次單元片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD以限制酵素切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，並由所得到的菌體回收質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA。
為了取得乙醯醋酸去羧酶基因，將Clostridium acetobutylicum ATCC824的基因DNA使用於樣板，以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素切割，而得到約700bp 之乙醯醋酸去羧酶片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA以限制酵素切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，並由所得到的菌體回收質體pGAP-IPAdh-Adc-atoB-atoD-atoA，而定為pIaaa。
將此質體pIaaa，轉殖至實施例3所製作的大腸桿菌B△pgi勝任細胞，以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaaa/B△pgi株。
[實施例5]
<B：：atoDAB△pgi株的製作>
將實施例3所製作的pTH18cs1-pgi轉殖至實施例1所製作的B：：atoDAB，於含有氯黴素10μg/ml與康黴素50μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有康黴素50μg/ml的LB液態培養基，並在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素50μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以含有康黴素50μg/ml的LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈在含有康黴素50μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，使其分別生長於含有康黴素50μg/ml的LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇僅生長於含有康黴素的LB洋菜平板的氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進行PCR，藉此選出pgi基因被取代為康黴素耐性基因且可得到約3.3kbp斷片的增幅之菌株，將所得到的菌株命名為B株atoD基因強化、pgi基因缺損株(以下會有簡記為B：：atoDAB△pgi株的情形)。
此外，大腸桿菌MG1655株及大腸桿菌B株可由美國菌種保存中心取得。
[實施例6]
<B：：atoDAB△gntR株的製作>
大腸桿菌B株的基因DNA中全部的鹼基序列已為周知(GenBank accession No.CP000819)，編碼GntR的鹼基序列係記載於GenBank accession No.CP000819所記載的大腸桿菌B株基因序列的3509184~3510179。為了選殖編碼GntR的鹼基序列(gntR)之附近區域，而合成出ggaattcgggtcaattttcaccctctatc(序列編號30)、gtgggccgtcctgaaggtacaaaagagatagattctc(序列編號31)、ctcttttgtaccttcaggacggcccacaaatttgaag(序列編號32)、ggaattcccagccccgcaaggccgatggc(序列編號33)所表示的4種寡核苷酸引子。序列編號30及33的引子分別在5'端具有EcoRI識別部位。
調製大腸桿菌B株的基因DNA(GenBank accession No.CP000819)，以所得到的基因DNA為鑄型，並以序列編號30與序列編號31的引子對進行PCR，而藉此增幅約1.0kb的DNA斷片(以下會有稱為gntR-L斷片的情形)。另外，以序列編號32與序列編號33的引子對進行PCR，而藉此增幅約1.0kb的DNA斷片(以下會有稱為gntR-R斷片的情形)。將該等DNA斷片以瓊脂糖電泳分離、回收，以gntR-L與gntR-R斷片為鑄型，並以序列編號30與序列編號33的引子對進行PCR，而藉此增幅約2.0kb的DNA斷片(以下會有稱為gntR-LR斷片的情形)。將此gntR-LR斷片以瓊脂糖電泳分離、回收，並以EcoRI切割，與溫度敏感性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)的EcoRI切割物混合，以T4DNA連接酶反應後，轉殖至大腸桿菌DH5α勝任細胞(東洋紡績公司製)，而得到在30℃生長於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板的轉殖體。由所得到的轉殖體回收質體，並確認gntLR斷片正確插入pTH18cs1，將此質體定為pTH18cs1-gntR。
將以如此的方式所得到的質體pTH18cs1-gntR轉殖至實施例1所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB株，並於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基，並在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素與氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈於LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，分別使其生長於LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進行PCR，藉此選出gntR基因缺損且可得到約2.0kbp斷片的增幅之菌株，將所得到的菌株命名為B株atoD基因強化、gntR基因缺損株(以下會有簡記為B：：atoDAB△gntR株的情形)。
[實施例7]
<pGAP-Ia/B：：atoDAB△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIa轉殖至實施例6所製作的大腸桿菌B：：atoDAB△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIa/B：：atoDAB△gntR株。
[實施例8]
<pIaz/B：：atoDAB△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIaz轉殖至實施例6所製作的大腸桿菌B：：atoDAB△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB△gntR株。
[實施例9]
<B：：atoDAB△pgi△gntR株的製作>
將實施例6所製作的質體pTH18cs1-gntR轉殖至實施例5所製作的大腸桿菌B：：atoDAB△pgi株，於含有氯黴素10μg/ml 的LB洋菜平板在30℃培養一晚而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基，並在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素與氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈在LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，分別使其生長於LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進行PCR，藉此選出gntR基因缺損且可得到約2.0kbp斷片的增幅之菌株，將所得到的菌株命名為B株atoD基因強化、pgi基因缺損、gntR基因缺損株(以下會有簡記為B：：atoDAB△pgi△gntR株的情形)。
此外，大腸桿菌MG1655株及大腸桿菌B株可由美國菌種保存中心取得。
[實施例10]
<pIa/B：：atoDAB△pgi△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIa轉殖至實施例9所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIa/B：：atoDAB△pgi△gntR。
[實施例11]
<pIaz/B：：atoDAB△pgi△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIaz轉殖至實施例9所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB△pgi△gntR株。
[實施例12]
<B：：atoDAB△gnd株的製作>
為了選殖編碼磷酸葡萄糖酸脫氫酵素的基因(gnd)之鹼基 序列附近區域，而合成出cgccatatgaatggcgcggcggggccggtgg(序列編號34)、tggagctctgtttactcctgtcaggggg(序列編號35)、tggagctctctgatttaatcaacaataaaattg(序列編號36)、cgggatccaccaccataaccaaacgacgg(序列編號37)所表示的4種寡核苷酸引子。序列編號34的引子在5'端具有NdeI識別部位，序列編號35及序列編號36的引子在5'端具有SacI識別部位。另外，序列編號37的引子在5'端具有BamHI識別部位。
調製大腸桿菌B株的基因DNA(GenBank accession No.CP000819)，並以序列編號34與序列編號35的引子對進行PCR，而藉此增幅約1.0kb的DNA斷片(以下會有稱為gnd-L斷片的情形)。另外，以序列編號36與序列編號37的引子對進行PCR，而藉此增幅約1.0kb的DNA斷片(以下會有稱為gnd-R斷片的情形)。將該等DNA斷片以瓊脂糖電泳分離、回收，並分別將gnd-L斷片以NdeI及SacI切割，將gnd-R斷片以SacI及BamHI切割。將這2種切割斷片與溫度敏感性質體pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)之NdeI及BamHI切割物混合，以T4DNA連接酶反應後，轉殖至大腸桿菌DH5α勝任細胞(東洋紡績公司製)，得到在30℃生長於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板的轉殖體。由所得到的轉殖體回收質體，確認編碼gnd的基因的5'上游附近斷片與3'下游附近斷片這兩個斷片正確插入pTH18cs1，而定為pTHl8cs1-gnd。
將以如此的方式所得到的質體pTH18cs1-gnd轉殖至實施例1所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB株，於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基，並在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素與氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，得到而在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈在LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，分別使其生長於 LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進行PCR，藉此選出gnd基因缺損且可得到約2.0kbp斷片的增幅之菌株，將所得到的菌株命名為B：：atoDAB△gnd株。
此外，大腸桿菌B株可由美國菌種保存中心取得。
[實施例13]
<pIa/B：：atoDAB△gnd株的製作>
將實施例2所製作的質體pIa轉殖至實施例12所製作的大腸桿菌B：atoDAB△gnd株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIa/B：：atoDAB△gnd株。
[實施例14]
<pIaz/B：：atoDAB△gnd株的製作>
將實施例2所製作的質體pIaz轉殖至實施例12所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△gnd株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，而藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB△gnd。
[實施例15]
<B：：atoDAB△pgi△gnd株的製作>
將實施例12所製作的質體pTH18cs1-gnd轉殖至實施例5所製作的大腸桿菌B株、B：：atoDAB△pgi株，並於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基，在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素與氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈在LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，分別使其生長於LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進 行PCR，藉此選出gnd基因缺損且可得到約2.0kbp斷片的增幅之菌株，所得到的菌株命名為B：：atoDAB△pgi△gnd株。
[實施例16]
<pIa/B：：atoDAB△pgi△gnd株的製作>
將實施例2所製作的質體pIa轉殖至實施例15所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gnd株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIa/B：：atoDAB△pgi△gnd。
[實施例17]
<pIaz/B：：atoDAB△pgi，△gnd株的製作>
將實施例2所製作的質體pIaz轉殖至實施例15所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gnd株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB△pgi△gnd株。
[實施例18]
<B：：atoDAB△gnd△gntR株的製作>
將實施例6所製作的質體pTH18cs1-gntR轉殖至實施例12所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△gnd株勝任細胞，於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基，在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素與氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板、得到在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈在LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，分別使其生長於LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進行PCR，藉此選出gntR基因缺損且可得到約2.0kbp斷片的增幅之菌株，將所得到的菌株命名為B：：atoDAB△gnd△gntR株。
[實施例19]
<pIa/B：：atoDAB△gnd△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIa轉殖至實施例18所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△gnd△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIa/B：：atoDAB△gnd△gntR株。
[實施例20]
<pIaz/B：：atoDAB△gnd△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIaz轉殖至實施例18所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△gnd△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB△gnd△gntR株。
[實施例21]
<B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株的製作>
將實施例6所製作的質體pTH18cs1-gntR轉殖至實施例15所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gnd株勝任細胞，並於含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板在30℃培養一晚，而得到轉殖體。將所得到的轉殖體接種至含有氯黴素10μg/ml的LB液態培養基，在30℃培養一晚。接下來，將此培養液的一部分塗佈在含有康黴素與氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。將所得到的菌落以LB液態培養基在30℃培養24小時，進一步塗佈在LB洋菜平板，而得到在42℃生長的菌落。
由所出現的菌落中隨機撿選100個菌落，分別使其生長於LB洋菜平板與含有氯黴素10μg/ml的LB洋菜平板，並選擇氯黴素敏感性的純株。進一步由該等目標純株的染色體DNA進行PCR，藉此選出gntR基因缺損且可得到約2.0kbp斷片的增幅之菌株，將所得到的菌株命名為B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株。
[實施例22]
<pIa/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIa轉殖至實施例21所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIa/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株。
[實施例23]
<pIaz/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株的製作>
將實施例2所製作的質體pIaz轉殖至實施例21所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株。
[實施例24]
<pIa/B：：atoDAB株的製作>
將實施例2所製作的質體pIa轉殖至實施例1所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIa/B：：atoDAB株。
[實施例25]
<pIaz/B：：atoDAB△pgi株的製作>
將實施例2所製作的質體pIaz轉殖至實施例5所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB株△pgi勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pIaz/B：：atoDAB△pgi株。
[測試例1]
(異丙醇的生產)
在本實施例中，使用WO2009/008377號小冊子圖1所示的生產裝置進行異丙醇的生產。培養槽採用容積3升的玻璃製品，阱槽採用10L容積的聚丙烯製品。在阱槽中，以每槽9L的量注入作為阱液的水(阱水)，並且連結2臺使用。此外，在培養槽設置廢液管，以使因為糖或中和劑的進料而增加的培養液適當地排出培養槽外。
將異丙醇生產評估所使用的菌株一覧揭示於表3。
作為前培養，將各評估株接種至加入了含有安比西林50μg/mL的LB Broth，Miller培養液(Difco244620)50mL而容積為500mL的三角燒瓶，在培養溫度30℃、120rpm的攪拌下培養一晚。將前培養45mL移至加入了以下所示組成的培養基855g的容積3L培養槽(ABLE公司製培養裝置BMS-PI)以進行培養。培養是在大氣壓下、通氣量0.9L/min、攪拌速度550rpm、培養溫度30℃、pH7.0(以NH3水溶液作調整)進行。培養開始至8小時後之間，以10g/L/小時的流速添加50wt/wt%葡萄糖水溶液。然後以20g/L/小時的流速適當地添加50wt/wt%之葡萄糖水溶液，使葡萄糖盡量不殘存在培養槽內。培養開始至72小時，將菌體培養液取樣數次，藉由離心操作將菌體除去後，以HPLC依據既定方法測定所得到的培養上清液中及阱水中的異丙醇及丙酮的累積量。此外，測定值為培養後之培養液與2臺阱槽中的合計值。將結果揭示於表4。
<培養基組成>
玉米浸液(日本食品化工製)：20g/L
Fe2SO4‧7H2O：0.1g/L
K2HPO4：2g/L
KH2PO4：2g/L
MgSO4‧7H2O：2g/L
(NH4)2SO4：2g/L
Adekanol LG126(ADEKA股份有限公司)0.1g/L
(剩餘部分：水)
評估的結果，陰性對照組(pla/B：：atoDAB)的異丙醇產量為48.7g/L/72h，破壞gntR的菌株(pla/B：：atoDAB△gntR)的產量為57.3g/L/72h。因此，比較破壞gntR與陰性對照組，可知生產力提升為約1.2倍。
另外，破壞gntR與pgi且強化zwf表現的菌株(pIaz/B：：atoDAB△pgi△gntR)的產量為70.2g/L/72h，與陰性對照組作比較，生產力為約1.4倍。由此可知，相較於僅破壞gntR，在破壞gntR與pgi兩者且強化zwf表現的情況生產力會進一步提升。
另一方面，在僅破壞pgi的情況(plaaa/B△pgi)完全無法生產異丙醇，在只強化zwf的情況(pIaz/B：：atoDAB)，產量為39.4g/L/72h，生產力並未增加甚至還降低。
在破壞gntR並且使zwf增強表現的情況(pIaz/B：：atoDAB△gntR)、破壞pgi且使zwf增強表現的情況(pIaz/B：：atoDAB△pgi)及破壞pgi與gntR兩者的情況(pIa/B：：atoDAB△pgi△gntR)，產量分別為33.3g/L/72h、41.1g/L/72h、9.6g/L/72h，異丙醇的生產力並未增加甚至還降低。
因此，在破壞gntR並加上進行其他因子的破壞或增強表現的情況，在pIaz/B：：atoDAB△pgi△gntR株所觀察到的生產力改善效果，認為可在將gntR與pgi兩者破壞且使zwf增強表現時得到。
另外，在對觀察到生產力提升的pIaz/B：：atoDAB△pgi△gntR株進一步實施gnd破壞的情況，亦即在破壞pgi、gntR與gnd且使zwf增強表現的情況(pIaz/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR)，異丙醇產量成為75.6g/L/72h，而表現出高於pIaz/B：：atoDAB△pgi△gntR株的高生產力。
另一方面，在僅破壞gnd的情況，異丙醇產量為45.5g/L/72h而低於陰性對照組，僅破壞gnd並未觀察到異丙醇生產力改善的效果。另外，破壞gntR與gnd的情況(pIa/B：：atoDAB△gnd△gntR)、破壞pgi與gnd的情況(pIa/B：：atoDAB△pgi△gnd)及破壞pgi、gntR與gnd的情況(pIa/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR)的產量分別為28.6g/L/72h、2.6g/L/72h、0.8g/L/72h，在該等菌株中，異丙醇的生產力並未增加甚至還降低。再者，在破壞gnd且使zwf增強表現的情況(pIaz/B：：atoDAB△gnd)、破壞gntR與gnd且使zwf增強表現的情況(pIaz/B：：atoDAB△gnd△gntR)及破壞pgi與gnd且使zwf增強表現的情況(pIaz/B：：atoDAB△pgi△gnd)，異丙醇的生產力皆並未增加甚至還降低(生產力分別為40.7g/L/72h、33.9g/L/72h、34.9g/L/72h)。
因此，在pIaz/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株所觀察到的生產力改善效果，認為僅可在同時破壞gntR、pgi與gnd且使zwf增強表現時得到。
另外，所得到的丙酮在精製之後，可使用作為異丙醇生產的原料。
(丙酮之製造)
[實施例26]
<異丙醇、丙酮的取出>
對於上述pIaz/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株(實施例23)的培養評估時的阱水作GC分析的結果，可知含有丙酮1.2g/L、異丙醇4.3g/L。由上述含有異丙醇及丙酮的水溶液(培養開始72小時後的阱水)，藉由蒸餾而使異丙醇及丙酮高濃度化而取出。
具體而言，起先將上述水溶液2L以流速500ml/h通液至填充陽離子交換樹脂(有機製，Amberlyst 31 WET)250ml的管柱，以除去殘存的氨等。將此處理液在常壓下蒸餾。取出沸點53~81.6℃的餾出物，以GC分析的結果，丙酮18.7質量%、異丙醇62.6質量%、不明成分為0.2質量%、其餘為水。將其使用作為下述脫氫反應的原料。
<脫氫觸媒ZnO：ZrO2(94：6)的調製>
在500ml附攪拌翼的圓底燒瓶中加入碳酸鈉15.94g(0.15mol)及水130ml，並使其溶解。在所得到的水溶液中花費1小時半滴入使硝酸鋅六水合物34.36g(0.11mol)及氧化二硝酸鋯二水合物1.30g(0.05mol)溶於150ml水而得的水溶液。以此狀態熟成5天之後，過濾並以水清洗乾淨。使所得到的白色物體在120℃乾燥2小時，並在400℃乾燥1小時，最後在600℃燒成2小時。以白色粉末的形式得到9.50g的複合氧化物觸媒ZnO：ZrO2(94：6)。
<丙酮的生產>
在直徑1cm、長度40cm的SUS製反應器中填充前述複合 氧化物觸媒ZnO：ZrO2(94：6)1.0g(以20MPa壓縮成型後，分級成250~500μm)，在350℃、10ml/min的氮氣流下以1.50g/hr的比例流通上述蒸餾液(丙酮18.7質量%、異丙醇62.6質量%、不明成分0.2質量%、其餘為水)。將反應器的出口冷卻，並收集反應液與反應氣體。以氣相層析對反應開始5小時後的生成物作分析的結果，如表5所示般，以高濃度生產出丙酮。此外，表5中「IPA」表示異丙醇(以下相同)。
[實施例27]
除了將反應溫度定為400℃以外，係以與實施例26同樣方式進行。將結果揭示於表5。如表5所示般以高濃度生產出丙酮。
[實施例28]
<脫氫觸媒ZnO：ZrO2(88：12)的調製>
在500ml附攪拌翼的圓底燒瓶中加入碳酸鈉15.94g(0.15mol)及水130ml，使其溶解。在所得到的水溶液中，花費1小時半滴入使硝酸鋅六水合物32.86g(0.11mol)及氧化二硝酸鋯二水合物2.66g(0.10mol)溶於150ml水而得的水溶液。以此狀態熟成5天之後，過濾並以水清洗乾淨。使所得到的白色物體在120℃乾燥2小時，並在400℃乾燥1小時，最後在600℃燒成2小時。以白色粉末的形式得到9.94g的複合氧化物觸媒ZnO：ZrO2(88：12)。
<丙酮的生產>
在直徑1cm、長度40cm的SUS製反應器中填充前述複合氧化物觸媒ZnO：ZrO2(88：12)1.0g(以20MPa壓縮成型後，分級成250~500μm)，在350℃、10ml/min的氮氣流下，以1.50g/hr的比例流通上述蒸餾液(丙酮18.7質量%、異丙醇62.6質量%、不明成分0.2質量%、其餘為水)。將反應器的出口冷卻，並收集反應液與反應氣體。以氣相層析對反應開始5小時後的生成物作分析的結果，如表5所示般，以高濃度生產出丙酮。
[實施例29]
除了將反應溫度定為400℃以外，係以與實施例28同樣方式進行。將結果揭示於表5。如表5所示般，以高濃度生產出丙酮。
(異丙醇生產大腸菌所含的基因的密碼子改變)
改變本發明之異丙醇生產大腸菌所含的異丙醇脫氫酵素基因與乙醯醋酸脫氫酵素基因的密碼子序列，並如以下所示的方式確認異丙醇及丙酮的生產力。
[實施例30]
<質體pI*a*z的製作>
梭菌屬細菌之乙醯醋酸去羧酶基因(adc)係記載於GenBank accession number M55392；異丙醇脫氫酵素基因(IPAdh)係記載於GenBank accession number AF157307。
為了使上述基因群表現所需要的啟動子之鹼基序列，可使用GenBank accession number X02662之鹼基序列資料之中，397-440所記載來自大腸桿菌的甘油醛3-磷酸脫氫酵素(以下會有稱為GAPDH的情形)之啟動子序列。
為了取得GAPDH啟動子，將大腸桿菌MG1655株的基因DNA使用於樣板，藉由cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(序列編號38)、及cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(序列編號39)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素NdeI、SphI切割，而得到相當於約110bp的GAPDH啟動子之DNA片段。將所得到的DNA片段與質體pBR322(GenBank accession number J01749)以限制酵素NdeI及SphI切割，將所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細 胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落，以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，由所得到的菌體回收質體pBRgapP。
為了取得密碼子改變的異丙醇脫氫酵素基因(IPAdh*)，以Clostridium beijerinckii NRRL B-593之異丙醇脫氫酵素基因的胺基酸序列為基礎設計密碼子改變後的異丙醇脫氫酵素基因，並藉由DNA合成製作以下的DNA片段(序列編號40)。將序列記載如下。
將所製作的DNA片段使用於樣板，藉由acatgcatgcatgaaaggttttgcaatgctg(序列編號41)、及acgcgtcgacttataatataactactgctttaa(序列編號42)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素SphI、SalI切割，而得到約1.1kbp的密碼子改變丙醇脫氫酵素片段。將所得到的DNA片段與將質體pUC119以限制酵素SphI及SalI切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，由所得到的菌體回收質體，確認密碼子改變後的IPAdh*已正確插入，將此質體命名為pUC-I*。
含有將質體pUC-I*以限制酵素SphI及EcoRI切割所得到的IPAdh*的片段與將質體pBRgapP以限制酵素SphI及EcoRI切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，由所得到的菌體回收質體，確認密碼子改變後的IPAdh*已正確插入，將此質體命名為pGAP-I*。
為了取得密碼子改變後的乙醯醋酸去羧酶基因(adc*)，以Clostridium acetobutylicum ATCC824之乙醯醋酸去羧酶基因的胺基酸序列為基礎設計密碼子改變後的乙醯醋酸去羧酶基因，藉由DNA合成而製作出以下的DNA片段(序列編號43)。將序列記載如下。
將所製作的DNA片段使用於樣板，藉由acgcgtcgacgctggttggtggaacatatgctgaaagatgaagtgatta(序列編號44)、及gctctagattacttgagataatcgtatatga(序列編號45)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以限制酵素SalI、XbaI切割，而得到約700bp的密碼子改變後的乙醯醋酸去羧酶片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pGAP-I*以限制酵素SalI及XbaI切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落以含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，由所得到的菌體回收質體，確認adc*已正確插入， 將此質體命名為pI*a*。
為了取得葡萄糖6磷酸-1-脫氫酵素基因(zwf)，將大腸桿菌B株的基因DNA(GenBank accession No.CP000819)使用於樣板，使用gctctagacggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(序列編號46)、及cgggatccttactcaaactcattccaggaacgac(序列編號47)以PCR法增幅，並將所得到的DNA片段以限制酵素BamHI、XbaI切割，而得到約1500bp的葡萄糖6磷酸1-脫氫酵素片段。將所得到的DNA片段與將先前製作的質體pI*a*以限制酵素XbaI及BamHI切割所得到的片段混合，並使用連接酶結合之後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。將所得到的菌落於含有安比西林50μg/mL的LB液態培養基在37℃培養一晚，由所得到的菌體回收質體pI*a*z。
[實施例31]
<pI*a*/B：：atoDAB△gntR株的製作>
將實施例30所製作的質體pI*a*轉殖至實施例6所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pI*a*/B：：atoDAB△gntR株。
[實施例32]
<pI*a*z/B：：atoDAB△pgi△gntR株的製作>
將實施例30所製作的質體pIa*轉殖至實施例9所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pI*a*z/B：：atoDAB△pgi△gntR。
[實施例33]
<pI*a*z/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株的製作>
將實施例30所製作的質體pI*a*z轉殖至實施例21所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株勝任細胞，並以含有 安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pI*a*z/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株。
[實施例34]
<pI*a*/B：：atoDAB株的製作>
將實施例30所製作的質體pI*a*轉殖至實施例1所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pI*a*/B：：atoDAB株。
[測試例2]
(異丙醇的生產)
與上述[測試例1]同樣方式進行異丙醇的生產評估。將評估所使用菌株的一覧揭示於表6。另外，將評估結果揭示於表7。
將表7的結果與表4的結果作比較，由其結果可知若改變異丙醇脫氫酵素基因與乙醯醋酸脫氫酵素基因的密碼子，則異丙醇的生產力會大幅提升。
[實施例35]
(由蔗糖生產異丙醇)
在pI*a*z/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株進一步導入用以使蔗糖分解的酵素轉化酶基因(cscA)，而由蔗糖進行異丙醇發酵生產。進一步由所得到的發酵液製造丙酮或丙烯。
<pI*a*z-cscA/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株的製作>
大腸桿菌O157株的基因DNA中全部的鹼基序列已為周知(GenBank accession number AE005174)，亦有文獻報告出編碼大腸桿菌O157株的轉化酶的基因(以下會有簡記為cscA的情形)的鹼基序列。亦即cscA係記載於GenBank accession number AE005174所記載的大腸桿菌O157株基因序列的3274383~3275816。
為了取得cscA，將大腸桿菌O157株的基因DNA使用於樣板，藉由gctggtggaacatatgacgcaatctcgattgcatg(序列編號48)、及ttaacccagttgccagagtgc(序列編號49)以PCR法增幅，將所得到的DNA片段以T4多核苷酸激酶使末端磷酸化，而得到約1470bp的cscA片段。將此DNA片段與將實施例30所製作的pI*a*z以限制酵素BamHI切割之後，以T4DNA聚合酶製成平端(flush end)並進一步以鹼性磷酸酶使末端脫磷酸化的產物混合，並使用連接酶結合後，轉殖至大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡績股份有限公司DNA-903)，而得到生長於含有安比西林50μg/mL的LB洋菜平板的轉殖體。由所得到的菌體回收質體，將確認葡萄糖6磷酸-1-脫氫酵素基因(zwf)的3'端與cscA的5'端連結，並且cscA已正確插入的質體命名為pI*a*z-cscA。
此外，大腸桿菌O157的基因可由標準物質及計量技術研究所取得。
將所製作的質體pI*a*z-cscA轉殖至實施例21所製作的大腸桿菌、B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株勝任細胞，並以含有安比西林50μg/mL的LB Broth,Miller洋菜平板在37℃培養一晚，藉此得到大腸桿菌pI*a*z-cscA/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株。
[測試例3]
(異丙醇及丙酮的製造)
除了使用大腸桿菌pI*a*z-cscA/B：：atoDAB△pgi△gnd△gntR株以外，係以與上述[測試例1]同樣的方式進行異丙醇及丙酮的製造。但是培養基使用40wt/wt%蔗糖水溶液以代替50wt/wt%葡萄糖水溶液而進行。其結果，在培養第72小時產生82.0g/L的異丙醇與23.7g/L的丙酮。對於第1臺的阱水作HPLC分析的結果，可知含有丙酮0.14質量%，異丙醇為0.55質量%。
(異丙醇、丙酮的取出)
由上述含有異丙醇及丙酮的阱水，藉由蒸餾使異丙醇及丙酮高濃度化而取出。
具體而言，起先將上述水溶液9L以流速500ml/h通液至填充陽離子交換樹脂(有機製，Amberlyst 31 WET)250ml的管柱，以除去殘存的氨等。將此處理液在常壓下蒸餾。取出沸點53℃~81.6℃的餾出物，以GC分析的結果，丙酮19.1質量%、異丙醇60.5質量%、不明成分為0.5質量%、其餘為水。將其使用作為以下的實施例36~實施例39的脫氫反應、及實施例40之丙烯生產之原料。
[實施例36]
(丙酮的製造)
<脫氫觸媒ZnO：ZrO2(94：6)的調製>
在500ml附攪拌翼的圓底燒瓶中加入碳酸鈉15.94g(0.15mol)及水130ml，使其溶解。在所得到的水溶液中，花費1小時半滴入使硝酸鋅六水合物34.36g(0.11mol)及氧化二硝酸鋯二水合物1.30g(0.05mol)溶於150ml水而得的水溶液。以此狀態熟成5天之後，過濾並以水清洗乾淨。使所得到的白色物體在120℃乾燥2小時，並在400℃乾燥1小時，最後在600℃燒成2小時。以白色粉末的形式得到9.50g的複合氧化物觸媒ZnO：ZrO2(94：6)。
<丙酮的生產>
在直徑1cm、長度40cm的SUS製反應器中填充前述複合氧化物觸媒ZnO：ZrO2(94：6)1.0g(以20MPa壓縮成型後，分 級成250~500μm)，在350℃、10ml/min的氮氣流下，以1.50g/hr的比例流通上述蒸餾液(丙酮19.1質量%、異丙醇60.5質量%、不明成分0.5質量%、其餘為水)。將反應器的出口冷卻，並收集反應液與反應氣體。以氣相層析對反應開始5小時後的生成物作分析的結果，如表8所示般，即使在使用含有大量的水以及來自生物的雜質的丙酮與異丙醇的情況，仍然以高濃度生產出丙酮。此外，表8中「IPA」表示異丙醇(以下相同)。
[實施例37]
除了將反應溫度定為400℃以外，係以實施例36同樣方式進行。將結果揭示於表8。如表8所示般以高濃度生產出丙酮。
[實施例38]
<脫氫觸媒ZnO：ZrO2(88：12)之調製>
在500ml附攪拌翼的圓底燒瓶中加入碳酸鈉15.94g(0.15mol)及水130ml，並使其溶解。在所得到的水溶液中，花費1小時半滴入使硝酸鋅六水合物32.86g(0.11mol)及氧化二硝酸鋯二水合物2.66g(0.10mol)溶於150ml水而得的水溶液。以此狀態熟成5天之後，過濾並以水清洗乾淨。使所得到的白色物體在120℃乾燥2小時，並在400℃乾燥1小時，最後在600℃燒成2小時。以白色粉末的形式得到9.94g的複合氧化物觸媒ZnO：ZrO2(88：12)。
<丙酮的生產>
在直徑1cm、長度40cm的SUS製反應器中填充前述複合氧化物觸媒ZnO：ZrO2(88：12)1.0g(以20MPa壓縮成型後，分級成250~500μm)，在350℃、10ml/min的氮氣流下，以1.50g/hr的比例流通上述蒸餾液(丙酮19.1質量%、異丙醇60.5質量%、不明成分0.5質量%、其餘為水)。將反應器的出口冷卻，並收集反應液與反應氣體。以氣相層析對反應開始5小時後的生成物作分析的結果，如表8所示般，以高濃度生產出丙酮。
[實施例39]
除了將反應溫度定為400℃以外，係以與實施例38同樣方 式進行。將結果揭示於表8。如表8所示般，以高濃度生產出丙酮。
[實施例40]
(丙烯的製造)
以由實施例35之測試例3所記載的培養液所得到的蒸餾液作為原料，並使用設置有高壓用進料泵、高壓用氫氣質量流量計、高壓用氮氣質量流量計、電爐、具有觸媒填充部分的反應器、背壓閥的固定床反應裝置，進行下向流式的加壓液相流通反應。
在內徑1cm的SUS316製反應器中，首先由反應器的出口側填充1.0g的銅-鋅觸媒(SudChemie公司製，製品名ShiftMax210、元素質量%Cu 32~35%、Zn 35~40%、Al 6~7%)粉末(分級成250~500μ)以作為上游側的觸媒層。裝填用於將觸媒層分離的石英棉之後，填充1.0g的β-沸石(觸媒化成公司製，以20MPa壓縮成型後，分級成250~500μ)作為下游側的觸媒層。
以氫氣加壓至2.5Mpa後，由反應器入口側在20ml/分的氫氣流下，在180℃由反應器入口側以0.60g/Hr流通上述蒸餾液(丙酮19.1質量%、異丙醇60.5質量%、不明成分0.5質量%、其餘為水)。在反應器出口與背壓閥的中間，藉由高壓氮氣質量流量計以200ml/分導入氮氣。在背壓閥正後方的管線設置氣液分離管，並分別對於採取到的氣體成分、液體成分作GC分析而定量生成物。反應結果如表9所示般，可知即使在使用含有大量的水以及來自生物的雜質的丙酮與異丙醇的情況，仍然以 高轉化率產生丙烯。此外，表9中「DIPE」表示二異丙基醚。
2010年8月12日所申請的日本專利申請第2010-181150號的揭示及2011年3月7日所申請的日本專利申請第2011-049531號全部揭示因為參照而收編於本說明書中。
本說明書所記載全部的文獻、專利申請、以及技術規格係被援用而收編於本說明書中，其與因為參照而收編的各文獻、專利申請及技術規格被具體且逐條記載的情況為相同程度。
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<213> 拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
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<213> 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
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Claims (13)

  1. 一種異丙醇生產大腸菌，其轉錄抑制因子GntR活性被去活化，而且具備：異丙醇生產系統；及伴隨該GntR活性的去活化以維持或強化異丙醇生產能力之酵素活性表現模式的輔酶群；該輔酶的酵素活性表現模式係選自：(1)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性、葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性及磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性的野生型的維持、(2)葡萄糖-6-磷酸異構脢(Pgi)活性的去活化與葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性的強化、(3)葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)活性的去活化與葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性的強化與磷酸葡萄糖酸脫氫酵素(Gnd)活性的去活化。
  2. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中，該葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)活性係來自埃希氏菌屬細菌來源的葡萄糖-6-磷酸-1-脫氫酵素(Zwf)編碼的基因。
  3. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中，該異丙醇生產系統係藉由乙醯醋酸去羧酶、異丙醇脫氫酵素、CoA轉移酶及硫解酶之各酵素基因所構築。
  4. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中，該異丙醇生產系統係藉由該乙醯醋酸去羧酶、異丙醇脫氫酵素、CoA轉移酶及硫解酶之各酵素基因所構築，且各酵素基因各自獨立而來自選自梭菌屬細菌、桿菌屬細菌及埃希氏菌屬細菌所構成之群中至少1種原核生物。
  5. 如申請專利範圍第3項之異丙醇生產大腸菌，其中，該乙醯醋酸去羧酶活性係來自丙酮丁醇梭菌來源的酵素編碼之基因；前述異丙醇脫氫酵素活性係來自拜氏梭菌來源的酵素編碼之基因；該CoA轉移酶活性及硫解酶活性係來自大腸桿菌來源的各酵素編碼之基因。
  6. 如申請專利範圍第3項之異丙醇生產大腸菌，其中，該異丙醇脫氫酵素及該乙醯醋酸去羧酶之至少一個活性係來自作為基因改造體所導入的基因。
  7. 如申請專利範圍第6項之異丙醇生產大腸菌，其中，該異丙醇脫氫酵素之基因改造體係序列編號40所表示之鹼基序列，該乙醯醋酸去羧酶之基因改造體係序列編號43所表示之鹼基序列。
  8. 如申請專利範圍第3項之異丙醇生產大腸菌，其中，更於蔗糖非PTS基因群之內至少具有蔗糖水解酵素基因。
  9. 一種異丙醇生產方法，包含使用如申請專利範圍第1至8項中任一項之異丙醇生產大腸菌，而由來自植物的原料生產異丙醇。
  10. 一種丙酮生產方法，包含使用如申請專利範圍第1至8項中任一項之異丙醇生產大腸菌，而由來自植物的原料得到異丙醇；及使所得到的異丙醇與作為觸媒的複合氧化物接觸，而該複合氧化物含有氧化鋅及含第4族元素至少1種之氧化物，且係以共沉澱法所調製。
  11. 一種丙烯之製造方法，包含使異丙醇在反應溫度50~300℃的範圍與作為觸媒的固體酸物質及含Cu的氫化觸媒接觸，該異丙醇係使用如申請專利範圍第1至8項中任一項之異丙醇生產大腸菌而由來自植物的原料所得到，且含有丙酮。
  12. 如申請專利範圍第11項之丙烯之製造方法，其中，該含Cu的氫化觸媒更含有第6族、第12族、及第13族之中至少一種元素的觸媒。
  13. 如申請專利範圍第11項之丙烯之製造方法，其中，該固體酸物質係沸石。
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