CN103068968A

CN103068968A - 通过破坏gntR而提高了生产能力的异丙醇生产细菌

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Publication number: CN103068968A
Application number: CN2011800389870A
Authority: CN
Inventors: 天野仰; 白井智量; 高桥均; 平野淳一郎; 松本佳子; 竹林望; 和田光史; 清水浩; 古泽力; 平泽敬
Original assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2011-08-11
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-08-11
Also published as: TW201245442A; EP2604683B1; JP5674789B2; CA2808044A1; EP2604683A1; EP2604683A4; TWI531649B; BR112013003336B1; US9267156B2; ES2668457T3; SG187768A1; CN103068968B; US20130211170A1; JPWO2012020833A1; WO2012020833A1; BR112013003336A2; WO2012020833A9

Abstract

本发明提供一种异丙醇生产大肠杆菌，其转录抑制因子GntR的活性被失活，并且所述异丙醇生产大肠杆菌具有异丙醇生产系统，优选还具有酶活性表达模式为维持或强化伴有该GntG活性失活的异丙醇生产性能的辅酶群；一种异丙醇生产方法，其中包括使用上述异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料生产异丙醇；一种丙酮生产方法，其中包括使复合氧化物与由上述生产方法得到的异丙醇接触，所述复合氧化物是含有氧化锌及元素周期表第4族的至少一种氧化物、且通过共沉淀法制备出的复合氧化物；和一种丙烯的制造方法，其中包括使作为催化剂的固体酸物质及含有铜的氢化催化剂与由上述生产方法得到的异丙醇及丙酮接触。

Description

通过破坏gntR而提高了生产能力的异丙醇生产细菌

技术领域

本发明涉及异丙醇生产细菌及使用其的异丙醇生产方法。

背景技术

丙烯是聚丙烯等合成树脂或石油化学制品的重要的基础原料，被广泛应用于汽车用缓冲器或食品容器、膜、医疗设备等。

因为由植物来源原料制造出的异丙醇可经脱水工序转化为丙烯，所以有希望作为碳中和的丙烯的原料。另外，丙酮也能够作为溶剂、塑料的原料被广泛应用。根据京都议定书，所有发达国家被赋予于2008年至2012年间使二氧化碳排放量与1990年相比削减5％的义务，在这种情况下，碳中和的丙烯由于其广泛适用性而对地球环境极其重要。

将植物来源原料同化来生产异丙醇的细菌是已知的。例如，国际公开2009/008377号中公开了为了以葡萄糖为原料生产异丙醇而经修饰的细菌，其中指出异丙醇的选择性高因而具有作为工业生产用生物催化剂优异的性质。

异丙醇制造大肠杆菌中，由于异丙醇的原料是葡萄糖，所以由于糖酵解及分解代谢而得到的大量化合物均可能成为副产物。另一方面，由于上述化合物有时是为了使大肠杆菌生长繁殖而必需的物质，所以不能完全抑制上述副反应所消耗的葡萄糖的量。因此，为了使副产物最小化且提升异丙醇的生产量，进行了多种研究。

例如，国际公开2009/008377号说明书中，公开了一种异丙醇生产细菌，该异丙醇生产细菌导入有乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶的各基因、可由植物来源原料生成异丙醇。其中指出该异丙醇生产细菌的能力记载为：生产速度0.6g/L/hr，蓄积量28.4g/L。

国际公开2009/049274号及Appl.Environ.Biotechnol.，73(24)，pp.7814-7818，(2007)中，公开了一种导入有乙酰CoA酰基转移酶、乙酰乙酰CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶及仲醇脱氢酶的各基因的、制造异丙醇的大肠杆菌。其中指出上述细菌的能力为：生产速度0.4g/L/hr，收率43.5％，蓄积量4.9g/L。

国际公开2009/028582号中，公开了一种导入有乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、乙酰CoA：乙酸酯CoA-转移酶及乙酰CoA酰基转移酶的各基因的、制造异丙醇的大肠杆菌。其中指出该细菌的能力为：蓄积量9.7g/L。

Appl.Microbiol.Biotechnol.，77(6)，pp.1219-1224，(2008)中公开了一种导入有硫解酶、CoA-转移酶、乙酰乙酸酯脱羧酶、伯醇-仲醇脱氢酶的各基因的、制造异丙醇的大肠杆菌。其中指出上述细菌的能力为：生产速度0.6g/L/hr，收率51％，蓄积量13.6g/L。

国际公开2009/103026号中，公开了一种导入有乙酰乙酸脱羧酶、乙酰CoA：乙酸酯CoA-转移酶及乙酰CoA酰基转移酶及异丙醇脱氢酶的各基因的、可制造异丙醇的大肠杆菌。其中指出该细菌的能力可期待为：收率50％，生产速度0.4g/L/hr，最终生产量14g/L。

国际公开2009/247217号中，公开了一种导入有乙酰乙酸酯脱羧酶、CoA转移酶、硫解酶及2-丙醇脱氢酶的各基因的、可制造异丙醇的大肠杆菌。其中指出该细菌的能力为：最终生产量2g/L。

在此，异丙醇脱氢酶、仲醇脱氢酶、伯醇-仲醇脱氢酶及2-丙醇脱氢酶是名称不同但催化相同反应的酶，CoA转移酶、乙酰乙酰CoA转移酶、乙酰CoA：乙酸酯CoA-转移酶及CoA-转移酶是名称不同但催化相同反应的酶。另外，乙酰乙酸脱羧酶和乙酰乙酸酯脱羧酶是名称不同但催化相同反应的酶，硫解酶和乙酰CoA酰基转移酶也是名称不同但催化相同反应的酶。因此，上述文献中的异丙醇生产大肠杆菌虽生产能力各有不同，但为了制造异丙醇而进行利用的酶是与国际公开2009/008377号说明书所记载的、乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶这4种酶相同的酶，在为了提高生产能力或收率等情况下，一直以来研究上述4种酶。

日本特开平5-260979号中记载了在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)中破坏该大肠杆菌具有的GntR基因时，D-核糖的生产能力提高。

另外，作为将异丙醇转化为丙酮的方法，日本特开平7-53433号及日本特开平11-335315号中使用铜类催化剂作为通过对异丙醇进行脱氢来制造丙酮的固体催化剂。另外，英国专利第665376号中使用将氧化锌微粒和氧化锆微粒物理混合而成的催化剂。已知通常情况下在使用微生物生产物质时会包含进杂质。基于此点考虑，由于上述技术均不是使用了微生物的制造方法，所以上述技术中均未记载将含有杂质的异丙醇作为原料使用。

丙酮可通过氢化容易地转化为异丙醇，已经提供出一种通过进一步对该异丙醇进行脱水反应形成丙烯、然后使其与苯反应得到枯烯的工艺。即，通过利用两阶段的反应将丙酮转化为丙烯从而将其作为枯烯法的原料再利用的工艺(例如，参见日本特开平2-174737号公报)。

在如上所述的再利用中，在工业上，需要实用地确立由丙酮高选择性地制造丙烯的方法。另外，还已知在Cu(25％)-氧化锌(35％)-氧化铝(40％)催化剂的存在下、在400℃下进行丙酮的氢化反应得到丙烯的方法(例如，参见东德专利DD84378号公报)。但是，该方法中，尽管反应温度为高达400℃的高温，但丙酮转化率仍较低，为89％。而且，该方法中，由于丙烯被氢化而生成丙烷的副反应，因而丙烯选择性也不高，为89％。

发明内容

然而，可生产异丙醇的上述大肠杆菌均难以说具有充分的生产能力，提高异丙醇生产大肠杆菌中异丙醇的生产能力是应解决的重大课题。另外，还期求提供有效地利用得到的异丙醇的方法。

本发明的目的在于提供大幅提高异丙醇的生产能力的大肠杆菌、使用了该大肠杆菌的异丙醇生产方法及丙酮生产方法，进一步提供由使用该大肠杆菌得到的含有丙酮的异丙醇生产丙烯的方法。

本发明是鉴于上述情况完成的，本发明的异丙醇生产大肠杆菌、异丙醇生产方法及丙酮生产方法如下所述。

〔1〕一种异丙醇生产大肠杆菌，其转录抑制因子GntR的活性被失活，并且所述异丙醇生产大肠杆菌具有异丙醇生产系统和辅酶群，所述辅酶群的酶活性模式为维持或强化伴有该GntR活性失活的异丙醇生产性能。

〔2〕如[1]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述辅酶群的酶活性模式选自如下酶活性模式：

(1)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性、葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性及磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)活性的野生型的维持；

(2)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性的失活、和葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性的强化；

(3)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性的失活、葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性的强化、和磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)活性的失活。

〔3〕如[2]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性来自编码埃希氏杆菌属细菌来源的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)的基因。

〔4〕如[1]～[3]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇生产系统是由乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶各酶的基因构建而成的。

〔5〕如[1]～[4]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇生产系统是由上述乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶各酶的基因构建而成的，并且，各酶基因各自独立地来自选自梭状芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏杆菌属细菌中的至少一种原核生物。

〔6〕如[4]或[5]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述乙酰乙酸脱羧酶活性来自编码丙酮丁醇梭菌来源的酶的基因，上述异丙醇脱氢酶活性来自编码拜氏梭菌来源的酶的基因，上述CoA转移酶活性及硫解酶活性来自编码大肠杆菌来源的各酶的基因。

〔7〕如[4]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇脱氢酶及上述乙酰乙酸脱羧酶的至少一种的活性来自作为基因修饰体导入的基因。

〔8〕如[7]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇脱氢酶的基因修饰体为序列号40表示的碱基序列，上述乙酰乙酸脱羧酶的基因修饰体为序列号43表示的碱基序列。

〔9〕如[4]～[8]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，至少还具有蔗糖非PTS基因簇中的蔗糖水解酶基因。

〔10〕一种异丙醇生产方法，包括：

使用[1]～[9]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，由植物来源原料生产异丙醇。

〔11〕一种丙酮生产方法，包括：

使用[1]～[9]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，由植物来源原料得到异丙醇；及

使作为催化剂的复合氧化物与得到的异丙醇接触，所述复合氧化物包含氧化锌和含有第4族元素的至少一种氧化物，且通过共沉淀法制备得到。

〔12〕一种丙烯的制造方法，包括：

在反应温度50～300℃的范围内，使作为催化剂的固体酸物质及含有铜的氢化催化剂与异丙醇接触，所述异丙醇使用[1]～[9]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料得到、且含有丙酮。

〔13〕如[12]所述的丙烯的制造方法，其中，上述含有铜的氢化催化剂为进一步包含第6族、第12族、及第13族中至少一种元素的催化剂。

〔14〕如[12]或[13]所述的丙烯的制造方法，其中，上述固体酸物质是沸石。

通过本发明，可提供可高效地生产异丙醇的大肠杆菌、使用了该大肠杆菌的异丙醇生产方法及丙酮生产方法，进而可提供由使用该大肠杆菌得到的含有丙酮的异丙醇、生产丙烯的方法。

具体实施方式

本发明的异丙醇生产大肠杆菌是如下异丙醇生产大肠杆菌：其中，转录抑制因子GntR的活性被失活，并且所述异丙醇生产大肠杆菌具有异丙醇生产系统和辅酶群，所述辅酶群的酶活性模式维持或强化伴有该GntR活性失活的异丙醇生产性能。

本发明的异丙醇生产大肠杆菌中，GntR活性被失活，并且具有上述规定的酶活性模式的辅酶群，因而，可高效地生产异丙醇。

即，本发明为了提高异丙醇的生产能力而进行了多种研究，结果发现，通过使葡糖酸代谢的负调控因子即GntR的活性失活，该大肠杆菌产生的产物即异丙醇的生产能力提高。

另外，这时发现，存在对由于GntR活性的失活而提高的异丙醇生产性能有影响的酶。通过这些酶活性模式，由于GntR的活性的失活而提高的异丙醇生产性能得到维持或强化。

本发明中的“辅酶群”是指，影响上述异丙醇生产性能的一种或两种以上的酶。另外，辅酶群的各自的酶活性被失活、活化或强化，本发明中的“辅酶群的酶活性模式”是指，仅通过使GntR的活性失活而得到提高的异丙醇生产量可维持或增加的各酶的酶活性模式，包括一种或两种以上的酶的组合。

上述辅酶群也可以是除了具有异丙醇生产系统且使GntR活性失活之外、仅由天然酶(本发明中，只要没有特别说明，“酶”也包括单独存在时不表现酶活性的“因子”)构成的酶群。

上述异丙醇生产大肠杆菌例如包括：具有发挥规定的异丙醇生产性能的异丙醇生产系统且利用基因重组技术使GntR失活，除此之外未进行任何人为改变的异丙醇生产大肠杆菌；及具有赋予了为了提高异丙醇生产性能的修饰的异丙醇生产系统且利用基因重组技术使GntR失活，除此之外未进行任何人为改变的异丙醇生产大肠杆菌。

作为辅酶群的酶活性模式，可优选举出如下模式：

其中，从异丙醇生产性能的观点考虑，更优选上述(3)的辅酶群的酶活性模式。

需要说明的是，本发明涉及的辅酶群及其酶活性模式并不限定于此，只要是包括GntR的活性的失活、可增加异丙醇生产大肠杆菌中的异丙醇生产量的辅酶群及其酶活性模式，均包含在本发明中。另外，辅酶群并非必须由多种酶构成，也可由一种酶构成。

需要说明的是，本发明中的“失活”是指如下状态：当将失活前的在大肠杆菌中的活性作为100时，利用现有的所有测定体系所测定出的该因子或酶的活性均为失活前的1/10以下。

本发明中的术语“利用基因重组技术”包括通过针对本来的基因的碱基序列进行其他DNA的插入、或基因某些部分的置换、缺失或它们的组合、而发生碱基序列上的改变的所有情形。例如，也可以是发生突变的情形。

本发明中，因子或酶的活性被失活的大肠杆菌是指，通过由菌体外向菌体内的任何方法而使本来活性受到损害的细菌。上述细菌例如可通过破坏编码该蛋白质或酶的基因(基因破坏)来制作。

作为本发明中的基因破坏，可举出为了不能发挥某种基因的功能而向该基因的碱基序列引入变异、插入其他DNA、及使基因的某部分缺失。基因破坏的结果，例如为该基因变得不能转录为mRNA，结构基因变得不能被翻译。或者，由于转录的mRNA不完整因而翻译出的结构蛋白的氨基酸序列中发生变异或缺失而变得不能发挥本来的功能。

就基因破坏株的制备而言，只要是可得到不表达该酶或蛋白质的破坏株的方法，任何方法均可使用。就基因破坏的方法而言，报道了多种方法(自然育种、添加诱变剂、照射紫外线、照射放射线、随机突变、转座子、部位特异性基因破坏)，但从可仅破坏某特定基因的方面考虑，优选基于同源重组的基因破坏。利用同源重组的方法在J.Bacteriol.，161，1219-1221(1985)、J.Bacteriol.，177，1511-1519(1995)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，97，6640-6645(2000)中有记载，本领域技术人员按照上述方法及其应用可容易地实施。

本发明中的“活性”的“强化”是指广义的、强化前的异丙醇生产大肠杆菌中的各种酶活性在强化后得到提高。

作为强化的方法，只要是异丙醇生产大肠杆菌具有的各种酶的活性得到提高，就没有特别限制，可举出利用从菌体外导入的酶基因所进行的强化、利用菌体内的酶基因的表达增强所进行的强化、及上述方法的组合。

作为利用从菌体外导入的酶基因所进行的强化，具体而言，可举出将编码比宿主来源的酶活性更高的酶的基因从宿主细菌的菌体外导入到菌体内，从而追加基于导入的酶基因的酶活性或者使该酶活性置换宿主本来具有的酶活性，进而使宿主来源的酶基因或来自菌体外的酶基因的数目增加为2以上，或它们的组合。

作为利用菌体内的酶基因的表达增强所进行的强化，具体而言，可举出将增强酶基因的表达的碱基序列从宿主细菌的菌体外导入到菌体内，将宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子置换为其他启动子，从而强化酶基因的表达，以及它们的组合。

本发明中“宿主”是指如下大肠杆菌，所述大肠杆菌将一个以上的基因从菌体外导入，结果形成本发明的异丙醇生产大肠杆菌。

以下，对本发明进行说明。

本发明中的GntR是指，对参与经由恩杜糖解(Entner-Doudoroff)途径的葡糖酸代谢的操纵子进行负调控的转录因子；是指抑制负责葡糖酸的摄取和代谢的两个基因簇(GntI和GntII)的作用的GntR转录抑制因子的总称。

本发明中的葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号5.3.1.9、催化从D-葡萄糖-6-磷酸生成D-果糖-6-磷酸的反应的酶的总称。

本发明中的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.49、催化从D-葡萄糖-6-磷酸生成D-葡萄糖酸-1，5-内酯-6-磷酸的反应的酶的总称。

作为上述酶，例如，可举出嗜放射异常球菌(Deinococcusradiophilus)等异常球菌属(Deinococcus)菌、黑曲霉(Aspergillusniger)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)等曲霉属(Aspergillus)菌、汉式醋杆菌(Acetobacter hansenii)等醋酸杆菌属(Acetobacter)菌、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)等热袍菌属(Thermotoga)菌、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)等隐球菌属(Cryptococcus)菌、盘基网柄茵(Dictyostelium discoideum)等盘基网柄菌属(Dictyostelium)菌、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等假单胞菌属(Pseudomonas)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌属(Saccharomyces)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等芽孢杆菌属(Bacillus)菌、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏杆菌属(Escherichia)菌来源的酶。

作为本发明中使用的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码硫解酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列而合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例示具有嗜放射异常球菌等异常球菌属菌、黑曲霉、棘孢曲霉等曲霉属菌、汉式醋杆菌等醋酸杆菌属菌、海栖热袍菌等热袍菌属菌、新型隐球菌等隐球菌属菌、盘基网柄菌等盘基网柄茵属菌、荧光假单胞菌、绿脓假单胞菌等假单胞菌属、酿酒酵母等酵母菌属、巨大芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌、大肠杆菌等埃希氏杆菌属菌来源的基因的碱基序列的DNA。作为更优选的DNA，可举出具有异常球菌属菌、曲霉属菌、醋酸杆菌属菌、热袍菌属菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属菌、埃希氏杆菌属等原核生物来源的基因的碱基序列的DNA，特别优选具有大肠杆菌来源的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.44、催化从6-磷酸-D-葡糖酸生成D-核酮糖-5-磷酸和CO₂的反应的酶的总称。

本发明中的异丙醇生产大肠杆菌是具有异丙醇生产系统的大肠杆菌，是指利用基因重组技术进行导入或修饰过的具有异丙醇生产能力的大肠杆菌。上述异丙醇生产系统只要是使作为对象的大肠杆菌生产异丙醇的系统，就可以是任意系统。

可优选举出参与异丙醇生产的酶活性的强化。对于本发明中的异丙醇生产大肠杆菌来说，进一步优选从菌体外赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及上述的硫解酶活性这4种酶活性或在菌体内使这4种酶表达增强、或上述两者。

本发明中的硫解酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.3.1.9、催化从乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA的反应的酶的总称。

作为上述酶，例如，可举出丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏杆菌属细菌、盐杆菌种(Halobacterium sp.)细菌、生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)等动胶菌属细菌、根瘤菌种(Rhizobium sp.)细菌、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌属细菌、热带假丝酵母(Candida tropicalis)等假丝酵母菌属细菌、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)等链霉菌属细菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等肠球菌属细菌来源的酶。

作为本发明中使用的硫解酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码硫解酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例示具有丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等梭状芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏杆菌属细菌、盐杆菌种细菌、生枝动胶菌等动胶菌属细菌、根瘤菌种细菌、大豆慢生根瘤菌等慢生根瘤菌属细菌、热带假丝酵母等假丝酵母菌属细菌、新月柄杆菌等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌等链霉菌属细菌、粪肠球菌等肠球菌属细菌来源的基因的碱基序列的DNA。作为更优选的基因，可举出具有梭状芽孢杆菌属细菌或埃希氏杆菌属细菌等原核生物来源的基因的碱基序列的DNA，特别优选为具有丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌来源的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的乙酰乙酸脱羧酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号4.1.1.4、催化从乙酰乙酸生成丙酮的反应的酶的总称。

作为上述酶，例如，可举出丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽孢杆菌属细菌、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)等芽孢杆菌属细菌来源的酶。

作为导入到本发明的宿主细菌中的乙酰乙酸脱羧酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码乙酰乙酸脱羧酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例示具有梭状芽孢杆菌属细菌或芽孢杆菌属细菌来源的基因的碱基序列的DNA，例如可例示具有丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢杆菌来源的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有丙酮丁醇梭菌来源的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的异丙醇脱氢酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.80、催化从丙酮生成异丙醇的反应的酶的总称。

作为上述酶，例如，可举出拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽孢杆菌属细菌来源的酶。

作为导入至本发明的宿主细菌中的异丙醇脱氢酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码异丙醇脱氢酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可举出具有梭状芽孢杆菌属细菌来源的基因的碱基序列的DNA，例如为具有拜氏梭菌来源的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的CoA转移酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.8.3.8、催化从乙酰乙酰CoA生成乙酰乙酸的反应的酶的总称。

作为上述酶，例如，可举出丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beiierinckii)等梭状芽孢杆菌属细菌、肠道罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)等罗斯氏菌属细菌、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)等Faecalibacterium属细菌、粪球菌(Coprococcus)属细菌、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)等锥虫、大肠杆菌(Escherichia coli：大肠杆菌)等埃希氏杆菌属细菌来源的酶。

作为本发明中使用的CoA转移酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码CoA转移酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例示具有丙酮丁醇梭菌等梭状芽孢杆菌属细菌、肠道罗斯氏菌等罗斯氏菌属细菌、普拉梭菌等Faecalibacterium属细菌、粪球菌属细菌、布氏锥虫等锥虫、大肠杆菌等埃希氏杆菌属细菌来源的基因的碱基序列的DNA。作为更优选的DNA，可举出具有梭状芽孢杆菌属细菌或埃希氏杆菌属细菌来源的基因的碱基序列的DNA，特别优选具有丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌来源的基因的碱基序列的DNA。

对于上述4种酶来说，从酶活性的观点考虑，优选分别为选自梭状芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏杆菌属细菌中的至少1种细菌来源的酶，其中，更优选乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶为梭状芽孢杆菌属细菌来源，CoA转移酶活性及硫解酶活性为埃希氏杆菌属细菌来源。

其中，对于本发明涉及的4种酶来说，从酶活性的观点考虑，优选分别为丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大肠杆菌中任一种来源的酶，更优选乙酰乙酸脱羧酶为丙酮丁醇梭菌来源的酶，CoA转移酶及硫解酶分别为丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌来源的酶，异丙醇脱氢酶为拜氏梭茵来源的酶，对于上述4种酶来说，从酶活性的观点考虑，特别优选乙酰乙酸脱羧酶活性为丙酮丁醇梭菌来源，上述异丙醇脱氢酶活性为拜氏梭菌来源，CoA转移酶活性及硫解酶活性为大肠杆菌来源。

本发明中的上述酶的活性可以从菌体外向菌体内导入，或者通过将宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性强化或置换为其他启动子而使酶基因强表达。

酶活性的导入例如可以通过使用基因重组技术使编码酶的基因从宿主细菌的菌体外导入到菌体内来进行。此时，被导入的酶基因对宿主细胞来说为同种或不同种均可。在从菌体外向菌体内导入基因时所必要的基因组DNA的制备，DNA的切断及连接，转化，PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)，用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法，可通过本领域技术人员公知的常规方法来进行。上述方法记载在Sambrook，J.，et al.，”Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，(1989)等中。

本发明中酶活性经强化的大肠杆菌是指，通过任意方法将该酶活性强化而得到的大肠杆菌。上述大肠杆菌例如可使用如下方法制成：使用与上述相同的基因重组技术，使用质粒将编码该酶及蛋白质的基因从菌体外导入至菌体内；或通过将宿主大肠杆菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性强化或置换为其他启动子来使酶基因强表达等方法。

本发明中的基因的启动子只要是可控制上述任一基因的表达的启动子即可，优选是恒常地在微生物内发挥功能的强力的、并且即使在葡萄糖存在下表达也不易受到抑制的启动子，具体而言，可举出甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子和丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。

本发明中的启动子是指与具有Sigma因子的RNA聚合酶结合的、起始转录的部位。例如，大肠杆菌来源的GAPDH启动子记载于GenBank登录号X02662的碱基序列信息中的碱基编号397-440。

大肠杆菌来源的CoA转移酶基因(atoD及atoA)和硫解酶基因(atoB)以atoD、atoA、atoB的顺序在大肠杆菌基因组上形成操纵子(Journal of Baceteriology Vol.169pp 42-52Lauren Sallus Jenkins等)，因此，通过修饰atoD的启动子，可同时控制CoA转移酶基因和硫解酶基因的表达。

由此，CoA转移酶活性及硫解酶活性通过宿主大肠杆菌的基因组基因得到时，从获得充分的异丙醇生产能力的观点考虑，优选通过将负责两种酶基因的表达的启动子置换为其他启动子等，而增强两种酶基因的表达。作为用于增强CoA转移酶活性及硫解酶活性的表达的启动子，可举出前述的大肠杆菌来源的GAPDH启动子等。

本发明中，作为具有异丙醇生产系统的异丙醇生产大肠杆菌的例子，可例示WO2009/008377号中记载的pIPA/B株或pIaaa/B株。另外，该大肠杆菌包括如下株：在参与异丙醇生产的酶中，CoA转移酶活性和硫解酶活性的增强是通过强化该大肠杆菌的基因组上的各基因的表达来进行的，异丙醇脱氢酶活性和乙酰乙酸脱羧酶活性的增强通过用质粒强化各基因的表达进行(有时称为pIa/B::atoDAB株)。

本发明中，从更有效地提高异丙醇生产能力的观点考虑，优选具有失活的GntR活性。进一步优选在具有失活的GntR活性的同时、还具有失活的葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性和强化的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性，最优选具有失活的GntR活性、失活的葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性、失活的磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)活性和强化的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性。通过为上述组合，与除此之外的各因子或酶的组合相比，可以令人惊异地提高异丙醇生产能力。

作为本发明中的异丙醇生产大肠杆菌的优选方式，是使上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株的GntR活性失活的株。

作为更优选的方式，是使上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株的GntR活性和葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性失活、使葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性强化的株。

作为特别优选的方式，是使上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株的GntR活性和葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性和磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)活性失活、使葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性强化的株。

进而，对本发明中的异丙醇生产大肠杆菌而言，可向其中导入编码蔗糖同化酶的基因簇。由此，可由蔗糖生产异丙醇。

作为编码蔗糖同化酶的基因，包括编码参与微生物的蔗糖同化路径中PTS系统和非PTS系统的酶群的基因。

具体而言，作为编码参与蔗糖PTS的酶群的基因，可举出编码ScrA(进行蔗糖的摄取)、ScrY(进行蔗糖的磷酸化)、ScrB(在微生物内部进行蔗糖的分解)、ScrR(控制编码ScrA、ScrY、ScrB的基因的表达)、ScrK(进行果糖的磷酸化)的基因。

另外，具体而言，编码参与蔗糖非PTS的酶群的蔗糖非PTS基因簇，为由编码CscB(蔗糖透过酶：进行蔗糖的摄取)、CscA(蔗糖水解酶：在微生物内部进行蔗糖的分解)、CscK(果糖激酶：进行果糖的磷酸化)、CscR(阻抑蛋白：控制编码CscB、CscA、及CscK的基因的表达)的基因构成的基因簇。

作为向本发明中的异丙醇生产大肠杆菌导入的蔗糖同化酶基因，其中可举出编码参与非PTS系统的酶群的基因，其中，可举出至少包含CscA的一种以上的酶的组合的基因。例如，可举出仅cscA、cscA及cscK的组合、cscA及cscB的组合、cscA及cscR的组合、cscA、cscR及cscK的组合、cscA、cscR及cscB的组合等。其中，从高效地生产异丙醇的观点考虑，也可选择仅导入编码CscA的基因。

作为上述蔗糖水解酶(转化酶、CscA)的基因，可利用具有由具有该酶的生物得到的编码蔗糖水解酶(转化酶、CscA)的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可举出具有欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏杆菌属菌(Escherichia)来源的基因的碱基序列的DNA，例如可举出具有大肠杆菌O157株来源的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有大肠杆菌O157株来源的基因的碱基序列的DNA。另外，优选在cscA中添加用于使cscA移动至菌体的外周胞质的信号序列。

作为上述阻抑蛋白(CscR)的基因，可利用具有由具有该酶的生物得到的编码阻抑蛋白(CscR)的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可举出具有欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏杆菌属菌(Escherichia)来源的基因的碱基序列的DNA，例如可举出具有大肠杆菌O157株来源基因的碱基序列的DNA。特别优选具有大肠杆菌O157株来源的基因的碱基序列的DNA。

作为上述果糖激酶(CscK)的基因，可利用具有由具有该酶的生物得到的编码果糖激酶(CscK)的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可举出具有欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属茵(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏杆菌属菌(Escherichia)来源的基因的碱基序列DNA，可举出例如具有大肠杆菌O157株来源的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有大肠杆菌O157株来源的基因的碱基序列的DNA。

作为上述蔗糖透过酶(CscB)的基因，可利用具有由具有该酶的生物得到的编码蔗糖透过酶(CscB)的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可举出具有欧文茵属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏杆菌属菌(Escherichia)来源的基因的碱基序列的DNA，可举出例如具有大肠杆菌O157株来源的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有大肠杆菌O157株来源的基因的碱基序列的DNA。

在本发明涉及的异丙醇生产大肠杆菌中，上述异丙醇生产系统涉及的各酶，优选上述异丙醇生产系统的酶中异丙醇脱氢酶及乙酰乙酸脱氢酶的至少一方的酶活性也可以来自以基因修饰体形式导入的导入基因。

本发明中“基因修饰体”包括所有向该酶基因的碱基序列施加缺失、置换、添加等修饰而得到的基因。具体而言，可举出在该酶基因的碱基序列中，仅向密码子施加更改、对于基于仅向该密码子施加更改得到的碱基序列而合成的氨基酸序列未更改的基因；仅向该酶基因的启动子区域施加更改、对于基于仅向该启动子区域施加更改得到的碱基序列而合成的氨基酸序列未更改的基因等。

修饰的酶基因可以是宿主本来的基因，也可以是来自其他种微生物的酶基因。

此外，可仅编码异丙醇脱氢酶的酶基因施加基因修饰或仅乙酰乙酸脱氢酶基因被基因修饰，也可两者同时被基因修饰。

作为基因修饰体，只要是对基因修饰的上述任一酶基因进行改变，结果向宿主赋予或强化对应的酶的酶活性，增强目标物质生产性能，也可以施加任意修饰。

基因修饰体优选为基于大肠杆菌的密码子使用频率修饰了使用密码子的修饰体基因。通过形成为上述基因修饰体，可提高异丙醇的生产能力。

本发明中“修饰使用密码子”是指，修饰在编码规定氨基酸序列的碱基序列上的对应各氨基酸的3碱基排列即密码子。本发明中“密码子修饰”是指，在不改变氨基酸序列的情况下仅修饰碱基序列。

作为上述异丙醇脱氢酶的基因修饰体，优选具有序列号40表示的碱基序列。另外，作为上述乙酰乙酸脱氢酶的基因修饰体，优选具有序列号43表示的碱基序列。通过使用这些基因修饰体，可分别优选地增强异丙醇脱氢酶及乙酰乙酸脱氢酶的各酶活性。

本发明中大肠杆菌是指，不论本来是否具有由植物来源原料生产异丙醇的能力、通过使用某种方法从而可具有由植物来源原料生产异丙醇的能力的大肠杆菌。

此处，作为上述的基因重组的对象的大肠杆菌，可以是不具有异丙醇生产性能的大肠杆菌，也可以是可进行上述各基因的导入及改变的任意的大肠杆菌。

更优选可以是预先赋予了异丙醇生产性能的大肠杆菌，由此可更高效地生产异丙醇。

作为上述异丙醇生产大肠杆菌，可举出例如WO2009/008377号说明书中记载的赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性、及硫解酶活性、可由植物来源原料生成异丙醇的异丙醇生成大肠杆菌等。

本发明的异丙醇生产方法是包括使用上述异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料生产异丙醇的步骤的方法，即，是包括使上述异丙醇生产大肠杆菌与植物来源原料接触、进行培养的步骤(以下称为培养工序)、和回收通过接触而得到的异丙醇的步骤(以下称为回收工序)的方法。

上述异丙醇生产方法中使用的植物来源原料只要是从植物得到的碳源、是植物来源原料，就没有特别限制。本发明中，植物来源原料是指根、茎、干、枝、叶、花、种子等器官、包含它们的植物体、及上述植物器官的分解产物，进而，在从植物体、植物器官、及它们的分解产物得到的碳源中，可在微生物培养时作为碳源利用的物质也包含在植物来源原料中。

上述植物来源原料中包含的碳源中，通常可举出淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类、及大量含有上述成分的草木质分解产物、纤维素水解物等、及它们的组合，进而，植物油来源的甘油或脂肪酸也可包含在本发明中的碳源中。

作为本发明中的植物来源原料的例子，可以优选举出谷物等农作物，玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等，及它们的组合，作为上述原料的使用形态，为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，也可以为仅是上述碳源的形态。

就培养工序中的异丙醇生产大肠杆菌与植物来源原料的接触而言，通常通过在含有植物来源原料的培养基中培养异丙醇生产大肠杆菌来进行。

植物来源原料与异丙醇生产大肠杆菌的接触密度根据异丙醇生产大肠杆菌的活性不同而不同，通常，作为培养基中的植物来源原料的浓度，以葡萄糖换算，可使初始的糖浓度相对于混合物的总质量为20质量％以下，从大肠杆菌的耐糖性的观点考虑，优选使初始的糖浓度为15质量％以下。其他各成分以通常添加的量向微生物的培养基中添加即可，没有特别限制。

另外，作为培养基中的异丙醇生产大肠杆菌的含量，根据大肠杆菌的种类及活性的不同而不同，通常使在培养开始时投入的预培养的菌液(OD660nm＝4～8)的量相对于培养液为0.1质量％至30质量％，从控制培养条件的观点考虑，可优选使其为1质量％～10质量％。

作为异丙醇生产大肠杆菌的培养中使用的培养基，只要是含有碳源、氮源、无机离子、及为了使微生物生产乳酸而需要的有机微量元素、核酸、维生素类等的通常使用的培养基，就没有特别限制。

在进行本发明的培养时，对培养条件没有特别限制，例如，在需氧条件下，可一边将pH和温度适当地控制在pH4～9、优选pH6～8、温度20℃～50℃、优选25℃～42℃的范围内，一边进行培养。

向上述混合物中通气体的通气量没有特别限制，当仅使用空气作为气体时，通常为0.02vvm～2.0vvm(vvm：通气容量〔mL〕/液容量〔mL〕/时间〔分钟〕)，从抑制对大肠杆菌的物理损伤的观点考虑，优选在0.1vvm～1.5vvm的条件下进行。

可使培养工序从培养开始持续至混合物中的植物来源原料被消耗、或至异丙醇生产大肠杆菌的活性消失。培养工序的期间随着混合物中的异丙醇生产大肠杆菌的数目及活性、以及植物来源原料的量的不同而不同，但通常为1小时以上、优选为4小时以上即可。另一方面，通过进行植物来源原料或异丙醇生产大肠杆菌的再投入，可使培养期间无限制地持续，但从处理效率的观点考虑，通常可使培养期间为5天以下，优选为72小时以下。其他条件可直接应用通常的培养中使用的条件。

作为将培养液中蓄积的异丙醇回收的方法，没有特别限制，例如可采用如下方法：在通过离心分离等从培养液中除去菌体后，用蒸馏或膜分离等通常的分离方法将异丙醇分离的方法。

需要说明的是，对于本发明的异丙醇的生产方法，在用于生产异丙醇的培养工序之前，也可包括预培养工序，所述预培养工序用于使使用的异丙醇生产大肠杆菌为适当的菌数或适度的活性状态。预培养工序只要是利用对应于异丙醇生产细菌的种类的通常使用的培养条件所进行的培养即可。

本发明的异丙醇的生产方法优选包括培养工序和回收工序，所述培养工序一边向含有上述异丙醇生产细菌及植物来源原料的混合物中供给气体、一边培养该异丙醇生产大肠杆菌，所述回收工序从混合物中分离并回收通过上述培养生成的异丙醇。

根据上述方法，一边向混合物中供给气体一边培养生产大肠杆菌(通气培养)。通过上述通气培养，生产的异丙醇被释放到混合物中，并且从混合物中蒸发，结果，可容易地从混合物中分离生成的异丙醇。另外，由于生成的异丙醇连续地从混合物中分离，因而可抑制混合物中异丙醇的浓度上升。由此，无需特别考虑异丙醇生产大肠杆菌对异丙醇的耐受性。

需要说明的是，本方法中的混合物只要是以通常用于大肠杆菌培养的基本培养基为主体即可。关于培养条件可直接适用上述事项。

在回收工序中，回收在培养工序中生成的、从混合物分离得到的异丙醇。作为上述回收方法，只要可以收集通过通常培养从混合物中蒸发的气体状或飞沫状的异丙醇即可。作为这样的方法，可以举出收纳到通常使用的密闭容器等收集构件中等，其中，从可以只将异丙醇高纯度地回收的观点考虑，优选为包括将用于捕集异丙醇的捕集液与从混合物中分离得到的异丙醇接触的方法。

本方法中，可以以将异丙醇溶解在捕集液或混合物中的方式进行回收。作为这样的回收方法，可举出例如国际公开2009/008377号说明书中记载的方法等。回收的异丙醇可使用HPLC等通常的检测方法进行确认。可根据需要对回收的异丙醇进行进一步精制。作为上述精制方法，可举出蒸馏等。

当回收的异丙醇为水溶液的状态时，该异丙醇的生产方法除了包括回收工序之外还可进一步包括脱水工序。异丙醇的脱水可通过常规方法进行。

作为在能以溶解在捕集液或混合物中的形态而回收的异丙醇的生产方法中能够使用的装置，可举出例如国际公开2009/008377号说明书的图1所示的生产装置。

在上述生产装置中，在收纳有含有异丙醇生产细菌和植物来源原料的培养基的培养槽上，连接有用于从装置外部注入气体的注入管，能够向培养基通气。

另外，在培养槽上通过连接管连接有捕获槽，所述捕获槽容纳有作为捕集液的捕获液(trap solution)。此时，向捕获槽移动的气体或液体与捕获液接触发生起泡。

由此，在培养槽中通过通气培养生成的异丙醇由于通气而蒸发，易于从培养基中分离，并且在捕获槽中被捕获液捕集。结果，能够以进一步精制的形态连续且简便地生产异丙醇。

通过本发明的异丙醇的生产方法，可高效地生产异丙醇，与不使用本发明的情况相比，使用同样的方法通常得到的生产量多。虽然随着生产方法的条件、使用的异丙醇生产大肠杆菌的状态的不同而不同，但可使生产能力为50～100g/L/72hr、优选55～80g/L/72hr。

如上所述，本发明的异丙醇生产大肠杆菌可高效地生产异丙醇，因而，例如当使用本发明的大肠杆菌催化剂进行异丙醇的制造时，培养72小时，可蓄积75g/L以上的异丙醇，可获得远高于以往的催化剂的生产能力。

另外，本发明的异丙醇生产大肠杆菌，也可同时生产作为异丙醇的前体的丙酮。优选在利用公知的方法将得到的丙酮精制后，通过使用公知的方法(例如专利第2786272号公报记载的方法)将丙酮转化为异丙醇。由此，可进一步提高从糖原料向异丙醇的转化效率。

本发明涉及的丙酮生产方法是包括如下步骤的丙酮生产方法：使用上述异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料得到异丙醇的步骤(以下称为异丙醇生产工序)；及使得到的异丙醇与作为催化剂的复合氧化物接触的步骤(以下称为丙酮生产工序)，所述复合氧化物包含氧化锌和含有第4族元素的至少一种氧化物、且是通过共沉淀法制备出的。

通过使使用上述异丙醇生产大肠杆菌得到的异丙醇与通过共沉淀法制备出的上述复合氧化物接触，从而发生脱氢反应，可由异丙醇生产丙酮。由此，可有效地利用使用上述异丙醇生产大肠杆菌生产出的异丙醇，可高效地进行物质生产。

关于异丙醇生产工序中使用的异丙醇生产大肠杆菌及植物来源原料、以及异丙醇生产的条件等，可直接适用关于异丙醇的生产的上述事项。

在丙酮生产工序中，将包含氧化锌和含有第4族元素的至少一种氧化物、且通过共沉淀法制备出的复合氧化物作为催化剂使用。

第4族元素是指元素周期表的第4族元素，可举出钛、锆及铪等。从可高选择性地生产丙酮方面考虑，优选为锆。

作为可用作催化剂的复合氧化物，可举出ZnO:ZrO₂、ZnO:TiO₂、CuO:ZnO:Al₂O₃等，从催化剂活性、及丙酮的选择性方面考虑，优选ZnO:ZrO₂。

对于氧化锌、与含有第4族元素的至少一种氧化物的比率，没有特别限制，从催化剂活性及丙酮选择性方面考虑，优选为50∶50～99∶1，更优选为65∶35～95∶5。氧化锌的比率为50以上时，可表现高催化剂活性，为99以下时，可表现更高的丙酮选择性，因而优选。

复合氧化物通过共沉淀法制备。由于可用作催化剂的复合氧化物通过共沉淀法制备，因而具有催化剂组成的均一性、催化剂制备的控制容易性等优点。

共沉淀法是作为制造多成分类的复合氧化物的方法通常使用的制备方法，通过向2种以上的金属盐的混合水溶液中加入碱水溶液等沉淀剂，可使其以固体形态均匀地沉淀。

作为具体的催化剂的制备方法，可通过如下方法制造：按照形成所期望的金属氧化物的组成的方式混合硝酸锌等水溶性的锌盐水溶液、和硝酸锆等水溶性的锆盐水溶液，将该水溶液滴加到碳酸钠等碱水溶液中、使其为碱性，从而以氢氧化物形式沉淀固体。过滤该生成的沉淀物，进行水洗、干燥，然后可通过煅烧进行制造。

此外，在实施本发明时，对使用的催化剂的量没有特别限制，例如，当使用固定床流动装置(fixed bed flow reactor)进行反应时，以原料(异丙醇)的单位时间供给量(质量)除以催化剂的质量而得到的值、即WHSV表示时，优选为0.01～200/h的范围，更优选为0.02～100/h的范围。

本发明中的脱氢反应可通过分批式或连续式等反应形式进行。在连续式的情况下，例如使原料在充填有催化剂的管状的反应器中流通，回收从反应器中产出的反应产物。

可以使进行脱氢反应时的反应温度通常为100℃～500℃、优选为150℃～450℃、进一步优选为200℃～400℃。丙酮与异丙醇、氢之间存在平衡关系，反应温度越高丙酮的平衡组成越高。因此，反应温度为100℃以上时，不大量残留异丙醇，是优选的。此外，为500℃以下时，不导致不期望的副反应的增加，是优选的。对反应压力没有特别限制，但其依赖于反应温度，优选使其为0.1MPa～1.0MPa。

在回收反应产物之后，根据需要，还可适当地追加进行精制等。对于丙酮的精制方法等，可适用在本领域内周知或公知的精制方法。

本发明涉及的丙烯生产方法包括如下步骤：使用上述异丙醇生产大肠杆菌从植物来源原料得到含有丙酮的异丙醇的步骤(以下称为异丙醇生产工序)；及在得到的含有丙酮的异丙醇中，在作为催化剂的含有铜的氢化催化剂及固体酸物质的存在下，在反应温度50～300℃的范围内，使丙酮与氢反应的步骤(以下称为催化反应工序)。需要说明的是，在说明书中，以下也将含有铜的氢化催化剂简称为“氢化催化剂”。

在上述丙烯生产方法中，对于利用上述异丙醇生产大肠杆菌得到的异丙醇，利用上述固体酸物质将异丙醇脱水而生成丙烯及水。

在上述催化反应工序中，将在异丙醇生产工序中得到的含有丙酮的异丙醇作为原料，使用含有铜的氢化催化剂及固体酸物质，在规定的条件下，使丙酮与氢反应。

作为在上述催化反应工序中使用的氢，可使用分子状的氢，也可使用来自在反应条件下产生氢的环己烷等烃的氢。氢在原理上相对于丙酮为等摩尔以上即可，从分离回收方面考虑，优选相对于丙酮为1～10倍摩尔、更优选为1～5倍摩尔即可。例如，将氢的每单位时间供给量相对于丙酮的每单位时间供给量设定在上述范围内即可。当想要将丙酮的转化率抑制在100％以下时，可通过将氢的量降低为相对于丙酮的量为1倍摩尔以下来处理。

上述催化反应工序中，供给的氢与丙酮的氧原子键合而形成水，可从反应器出口取出。此外，只要不进行预想之外的副反应，则实质上不会消耗为丙酮的当量以上的氢。

当向反应器供给氢气时，通常连续地供给，但并不特别限定于该方法。作为氢的供给方式，可以是间歇供给，所述间歇供给是在反应开始时供给氢气之后，在反应中停止供给，经过一定时间后，再次进行供给；在液相反应的情况下，也可以使氢气溶解在溶剂中来进行供给。

另外，就氢而言，可以将氢从反应器中取出进行再利用。作为上述的氢的再循环工序，例如有如下工序：在反应器后部利用气液分离器分离为反应液与反应气，通过分离膜等从反应气中分离氢气，将分离出的氢气再次供给至反应器的入口。在该再循环工序的情况下，可将与轻沸馏分一起从塔顶回收的氢气供给至反应器。供给的氢的压力通常与反应器的压力为同等程度，但可根据氢的供给方法进行适当改变。

在实施本发明时，也可向反应体系内供给相对于催化剂及起始物质(丙酮、异丙醇、及氢)为惰性的溶剂或气体，在稀释的状态下进行上述反应。

适用于上述催化反应工序的反应温度为50℃～300℃。小于50℃时，得不到充分的丙酮、或异丙醇的转化率，此外，超过300℃时，发生预想之外的副反应、丙烯的聚合等，不能维持充分的丙烯的选择性。从经济性的观点考虑，反应温度优选为150℃～250℃，更优选为150～200℃的范围。

当进行上述反应时，作为其他方法及条件，没有特别限制，例如，可采用如下所示那样的条件及方法。作为起始物质的丙酮、异丙醇与氢的接触、氢的供给方法为气液对流和气液合流中任一种均可，此外，作为液体及气体的方向，为液体下降-气体上升、液体上升-气体下降、液体气体上升、液体气体下降中任一种均可。此外，实施压力优选为0.1气压～500气压、更优选为0.5气压～100气压。

作为上述固体酸物质，为通常的固体酸，可举出沸石、二氧化硅、氧化铝、二氧化硅氧化铝、γ氧化铝、氧化钛、氧化锌、氧化锆等金属氧化物等。其中，从高催化剂活性、及高丙烯选择性方面考虑，优选沸石。

作为沸石，可根据被认为在上述反应中作为原料及中间体存在的异丙醇及目标丙烯的分子径选择合适的沸石。

尤其是，作为沸石，由于接近于异丙醇、丙烯的分子径，因而优选具有氧10～12元环的细孔的沸石。作为具有氧10～12元环的沸石，可举出镁碱沸石、片沸石、ZSM-5、ZSM-11、ZSM-12、NU-87、θ1、weinebeite、X型沸石、Y型沸石、USY型沸石、丝光沸石、脱铝丝光沸石、β-沸石、MCM-22、MCM-56等。其中优选β-沸石。

为了得到高活性，沸石中的硅与铝的组成比(硅/铝)优选在2/1～200/1的范围内，从活性及热稳定性方面考虑，特别优选在5/1～100/1的范围内。此外，也可使用将沸石骨架中所含的铝用Ga、Ti、Fe、Mn、B等铝以外的金属置换而得到的、所谓同型置换沸石。另外，作为沸石，也可使用用金属离子修饰自身而得到的沸石。

对固体酸物质的形状没有特别限制，为球状、圆柱状、挤出状、破碎状中任一种均可。另外，对其粒子大小也没有特别限制，通常可根据反应器的大小选择0.01mm～100mm范围的固体酸物质。固体酸物质可单独使用一种，也可使用两种以上。

作为上述含有铜的氢化催化剂，可举出以金属本身的形式含有Cu的氢化催化剂、以金属化合物的形式含有铜的氢化催化剂等。作为上述金属化合物，例如，可举出CuO、Cu₂O等金属氧化物；及CuCl₂等金属氯化物等。另外，还可使载体担载上述催化剂。

从得到更高的选择性、或更长的催化剂寿命方面考虑，上述含有铜的氢化催化剂优选进一步含有元素周期表第6族、第12族及第13族中至少一种元素。作为第6族，可优选举出Cr、Mo等；作为第12族，可优选举出Zn等；作为第13族，可优选举出Al、In等。作为上述氢化催化剂，可举出铜-铬、雷尼铜(Raney copper)、铜-锌等铜类的催化剂。

另外，还可向上述含有铜的氢化催化剂中添加PbSO₄、FeCl₂、SnCl₂等金属盐；K、Na等碱金属或碱金属盐；BaSO₄；等，由此，有时上述含有铜的氢化催化剂的活性、丙烯的选择性得到提高。作为上述金属盐、碱金属或碱金属盐向上述氢化催化剂中的添加量，没有特别限制，主要从选择性方面考虑，优选为0.01质量％～10.00质量％。

作为可在市场上得到的含有铜的氢化催化剂，可举出例如CuO-ZnO-Al₂O₃、CuO-Cr₂O₃-BaO等。

对于氢化催化剂的形状没有特别限制，为球状、圆柱状、挤出状、破碎状中任一种均可。另外，对其粒子大小也没有特别限制，通常可根据反应器的大小选择0.01mm～100mm范围的氢化催化剂。

本发明涉及的丙烯的制造方法中，可向充填有上述氢化催化剂及固体酸物质的反应器中，供给上述丙酮及氢，使丙酮与氢发生反应。对向反应器中充填的氢化催化剂及固体酸物质的总量(以下也称为“催化剂量”)没有特别限制，例如，当使用具有固定床反应器的固定床流动装置进行反应时，以作为起始物质的丙酮的单位时间供给量(质量)除以催化剂量(重量)而得到的值、即WHSV表示时，优选为0.1～200/h、更优选为0.2～100/h的范围。

对于固体酸物质与氢化催化剂的量比没有特别限制，固体酸物质∶氢化催化剂(质量比)通常优选为1∶0.01～1∶100、更优选为1∶0.05～1∶50。固体酸物质∶氢化催化剂的量比为1∶0.01以上时，倾向于得到充分的丙酮的转化率，此外，固体酸物质∶氢化催化剂的量比在1∶100以内时，倾向于脱水反应充分进行、丙烯的收率变得充分。

在上述反应经过一定时间之后，催化剂的活性有时降低，此时可利用公知的方法进行再生，恢复氢化催化剂及固体酸物质的活性。

本发明中，可使用固体酸物质和氢化催化剂这两种成分作为催化剂。另外，作为该催化剂的使用方法，没有特别限制，例如，可以使用以厘米大小的催化剂粒子水平将作为酸催化剂成分的固体酸物质和氢化催化剂物理混合而得到的物质；可以将两者微细化并混合后，重新成型为厘米大小的催化剂粒子；可以将固体酸物质作为载体，在其上担载氢化催化剂；可以将氢化催化剂作为载体，在其上担载固体酸物质。另外，也可以在不混合氢化催化剂和固体酸物质的情况下，分别使用它们。

尤其是，从可以以高活性及高选择性工业性地获得方面考虑，优选使用氢化催化剂、且使用β-沸石作为构成固体酸的沸石。例如，氢化催化剂也可以担载在沸石上。作为其制备方法，可举出如下方法：使Cu的硝酸盐等的水溶液浸渗沸石，进行煅烧的方法；为了使Cu可溶于有机溶剂中，而使被称为配体的有机分子与Cu键合而形成络合物，将该络合物添加到有机溶剂中来制备溶液，使该溶液浸渗沸石，进行煅烧的方法；进一步地，由于在真空下络合物中的某种物质发生气化，因而通过蒸镀等使其担载在沸石上的方法等。

另外，氢化催化剂也可担载在沸石以外的载体上。作为可担载氢化催化剂的载体，可举出二氧化硅、氧化铝、二氧化硅氧化铝、二氧化钛、氧化镁、二氧化硅氧化镁、氧化锆、氧化锌、碳(活性炭)、酸性白土、硅藻土等。其中，从更高活性及更高选择性方面考虑，优选选择二氧化硅、氧化铝、二氧化硅氧化铝、二氧化钛、氧化镁、二氧化硅氧化镁、氧化锆、氧化锌、碳(活性炭)中的至少一种。

作为本发明中使用的反应器，可举出固定床反应器、流化床反应器等，但从防止催化剂的磨耗、粉化这样的观点考虑，优选固定床反应器。

本发明中，对向反应器中充填氢化催化剂及固体酸物质的方法没有特别限制。当使用固定床反应器作为反应器时，氢化催化剂及固体酸物质的充填方法有时对反应效果有很大影响。如上所述，一般认为在本发明中逐步地发生氢化和脱水反应。因此，从高效地使用催化剂这样的意义上、进而从抑制不是目的副反应这样的意义上，向反应器中依次充填与反应的各阶段相应的适当的催化剂种类是优选的充填方法。

特别是在为了提高反应速度而提升氢压、反应温度的情况下，发生在低氢压、低反应温度时未发现的预想之外的副反应，这种变化在通常的化学反应中常见。在这种情况下，特别是催化剂的充填方法可能对反应效果有较大影响。

因此，可以向反应器中依次充填与反应的各阶段相应的适当的催化剂种类，也可以使氢化催化剂与固体酸物质的混合比倾斜地向反应器中充填。作为向反应器中充填氢化催化剂和固体酸物质的方法，例如可举出如下方法：(1)将氢化催化剂及固体酸物质混合，向反应器中填充的方法；(2)按照形成由氢化催化剂形成的层(上游侧，即入口侧)、和由固体酸物质形成的层(下游侧，即出口侧)的方式向反应器中充填的方法；(3)向反应器中充填担载有氢化催化剂的固体酸物质的方法；(4)按照形成由氢化催化剂形成的层(上游侧，即入口侧)、和由固体酸物质及氢化催化剂形成的层(下游侧，即出口侧)的方式向反应器中充填的方法；(5)按照形成由氢化催化剂形成的层(上游侧，即入口侧)、和由担载有氢化催化剂的固体酸物质形成的层(下游侧，即出口侧)的方式向反应器中充填的方法；(6)按照形成由氢化催化剂及固体酸物质形成的层(上游侧，即入口侧)、和由固体酸物质形成的层(下游侧，即出口侧)的方式向反应器中充填的方法；(7)按照形成由担载有氢化催化剂的固体酸物质形成的层(上游侧，即入口侧)、和由固体酸物质形成的层(下游侧，即出口侧)的方式向反应器中充填的方法。需要说明的是，上游侧表示反应器的入口侧，即起始物质通过反应的前半的层，下游侧表示反应器的出口侧，即，起始物质、中间体及反应产物等通过反应的后半的层。需要说明的是，起始物质是指丙酮及氢，当以气液对流方式向反应器供给丙酮及氢时，上述上游侧(入口侧)是指，丙酮通过反应的前半的层。

为了维持丙烯的生产量，可采取旋转支架(merry go round)方式，所述旋转支架方式中，将两个或三个反应器并列排列，在一个反应器内的催化剂再生期间，用剩余的一个或两个反应器实施反应。进而可采取如下方式：当反应器存在三个时，串联连接其他两个反应器，减少生产量的变动。另外，当通过流化床流通反应方式、移动床反应方式进行实施时，通过连续或断续地从反应器中除去一部分或全部催化剂并补充相当的成分，可维持一定的活性。

实施例

以下记载本发明的实施例，但本发明不受它们的限制。需要说明的是，只要没有特别说明，记载中的“％”是质量基准。

(异丙醇生产株的制备)

本实施例中使用的大肠杆菌株与质粒的一览表如表1及表2所示。

[表1]

[表2]

[实施例1]

<B::atoDAB株的制备>

大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全碱基序列是公知的(Genbank登录号(Genbank accession number)U00096)，也报道了编码大肠杆菌MG1655株的CoA转移酶α亚基的基因(以下有时简称为atoD)的碱基序列。即，atoD记载于GenBank登录号U00096中记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469～2322131。

作为为了使上述基因表达而需要的启动子的碱基序列，可使用GenBank登录号X02662的碱基序列信息中397-440记载的大肠杆菌来源的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子序列。为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利用PCR法由cgctcaattgcaatgattgacacgattccg(序列号1)、及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列号2)进行扩增，用限制性酶MfeI及EcoRI消化得到的DNA片段，从而得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段与通过将质粒pUC19(GenBank登录号X02514)用限制性酶EcoRI消化进而用碱性磷酸酶处理而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。得到的菌落中的10个分别在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，回收质粒，选出在用限制性内切酶EcoRI及KpnI进行消化时GAPDH启动子未被切除的质粒，进而确认DNA序列，将GAPDH启动子被正确地插入的的质粒作为pUCgapP。用限制性酶EcoRI及KpnI消化得到的pUCgapP。

进而，为了获得atoD，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利用PCR法由cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(序列号3)、及gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(序列号4)进行扩增，用限制性酶EcoRI及KpnI消化得到的DNA片段，从而得到约690bp的atoD片段。将该DNA片段与之前用限制性酶EcoRI及KpnI消化过的pUCgapP混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体回收质粒，确认atoD被正确插入，将该质粒命名为pGAPatoD。

需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可由美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection)获得。

如上所述，也报道了大肠杆菌MG1655株的基因组DNA中的atoD的碱基序列。使用基于大肠杆菌MG1655株的atoD的5’附近区域的基因信息制成的gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(序列号5)和tactgcagcgttccagcaccttatcaacc(序列号6)，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增了约1.1kbp的DNA片段。

另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的GAPDH启动子的序列信息制成的ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列号7)、和基于大肠杆菌MG1655株的atoD的序列信息制成的序列号4的引物，将之前制备的表达载体pGAPatoD作为模板进行PCR，得到包括GAPDH启动子和atoD的约790bp的DNA片段。

将如上所述得到的片段分别用限制性酶PstI和XbaI、XbaI和KpnI进行消化，将该片段与用PstI和KpnI消化温度敏感性质粒pTH18cs1(GenBank登录号AB019610)〔Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)〕而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至DH5α株，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。将该质粒转化至大肠杆菌B株(ATCC11303)中，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。将得到的培养菌体涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，在42℃下进行培养，得到菌落。将得到的菌落在不含抗生素的LB液体培养基中在30℃下进行2小时培养，涂布于不含抗生素的LB琼脂板上，得到在42℃下进行生长繁殖的菌落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在不含抗生素的LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，通过PCR从上述克隆的染色体DNA扩增含有GAPDH启动子和atoD的约790bp片段，选择atoD启动子区域被GAPDH启动子置换的株，将满足以上条件的克隆命名为大肠杆菌、B::atoDAB。

需要说明的是，大肠杆菌B株(ATCC 11303)可由作为细胞·微生物·基因库的美国标准生物品收藏中心获得。

[实施例2]

<质粒pIaz的制备>

梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶记载于GenBank登录号M55392，异丙醇脱氢酶记载于GenBank登录号AF157307。

作为为了使上述的基因簇表达而需要的启动子的碱基序列，可使用GenBank登录号X02662的碱基序列信息中397-440记载的大肠杆菌来源的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子序列。

为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利用PCR法由cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(序列号18)、及cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(序列号19)进行扩增，用限制性酶NdeI、SphI消化得到的DNA片段，从而得到约110bp对应于GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段与通过将质粒pBR322(GenBank登录号J01749)用限制性酶NdeI及SphI消化而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的茵体中回收质粒pBRgapP。

为了得到异丙醇脱氢酶基因，使用拜氏梭菌NRRL B-593的基因组DNA作为模板，利用PCR法由aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列号8)、及gcggatccttataatataactactgctttaattaagtc(序列号9)进行扩增，用限制性酶SphI、BamHI消化得到的DNA片段，从而得到约1.1kbp的异丙醇脱氢酶片段。将得到的DNA片段与通过将质粒pBRgapP用限制性酶SphI及BamHI消化得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认IPAdh被正确插入，将该质粒命名为pGAP-IPAdh。

为了得到乙酰乙酸脱羧酶基因，使用丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA作为模板，利用PCR法由caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(序列号10)、及ggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc(序列号11)进行扩增，用限制性酶BamHI、EcoRI消化得到的DNA片段，从而得到约700bp的乙酰乙酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段与通过将之前制成的质粒pGAP-IPAdh用限制性酶BamHI及EcoRI消化而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体回收质粒，确认adc被正确插入，将该质粒命名为pIa。

为了得到葡萄糖6磷酸-1-脱氢酶基因(zwf)，使用大肠杆菌B株的基因组DNA(GenBank登录号CP000819)作为模板，利用PCR法使用caggatcccggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(序列号12)、及cgtctagattactcaaactcattccaggaacgac(序列号13)进行扩增，用限制性酶BamHI、XbaI消化得到的DNA片段，从而得到约1500bp的葡萄糖6磷酸1-脱氢酶片段。将得到的DNA片段与通过将之前制成质粒pIa用限制性酶BamHI及XbaI消化而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，将得到的质粒作为pIaz。

将该质粒pIaz转化至实施例1中制备出的大肠杆菌B::atoDAB感受态细胞，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板上在37℃下培养一夜，由此得到大肠杆菌pIaz/B::atoDAB。

[实施例3]

<大肠杆菌B株Δpgi株的制备>

大肠杆菌MG 1655的基因组DNA的全碱基序列是公知的(GenBank登录号U00096)，也报道了编码大肠杆菌的磷酸葡萄糖异构酶(以下有时称为pgi)的基因的碱基序列(GenBank登录号X15196)。为了克隆编码pgi的基因(1，650bp)的碱基序列附近区域，合成caggaattcgctatatctggctctgcacg(序列号14)、cagtctagagcaatactcttctgattttgag(序列号15)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(序列号16)及gacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(序列号17)所示的4种寡核苷酸引物。序列号14的引物在5’末端侧具有EcoRI识别位点，序列号15及16的引物在5’末端侧具有XbaI识别位点，序列号17的引物在5’末端侧具有PstI识别位点。

制备大肠杆菌MG1655株(ATCC700926)的基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号14和序列号15的引物对，进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段(以下有时称为pgi-L片段)。另外，使用序列号16和序列号17的引物对，进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段(以下有时称为pgi-R片段)。将这些DNA片段在琼脂糖电泳中进行分离、回收，用EcoRI及XbaI消化pgi-L片段，用XbaI及PstI进行消化pgi-R片段。将该两种消化片段、与温度敏感性质粒pTH18cs 1(GenBank登录号AB019610)的EcoRI及PstI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺织公司制)，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了编码pgi的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段两片段被正确地插入到pTH18cs1中。将得到的质粒用XbaI消化后，利用T4DNA聚合酶进行平末端化处理。使用T4DNA连接酶将该DNA片段与下述DNA片段连接，所述DNA片段是用T4DNA聚合酶对用EcoRI消化pUC4K质粒(GenBank登录号X06404)(Pharmacia)而得到的卡那霉素耐性基因进行平末端化处理而得到的DNA片段。然后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到在含有10μg/ml氯霉素和50μg/mi卡那霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认卡那霉素耐性基因被正确地插入到编码pgi的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段之间，将其作为pTH18cs1-pgi。

将如上所述得到的质粒pTH18cs 1-pgi转化至大肠杆菌B株(ATCC 11303)，在含有10μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的茵落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上、和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出仅在含有卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于pgi基因被置换为卡那霉素耐性基因而为约3.3kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株pgi基因缺失株(以下有时简称为BΔpgi株)。

需要说明的是，大肠杆菌MG1655株及大肠杆菌B株可由美国标准生物品收藏中心获得。

[实施例4]

已报道了大肠杆菌的硫解酶及大肠杆菌的CoA转移酶的氨基酸序列和基因的碱基序列。即，编码硫解酶的基因记载于GenBank登录号U00096中记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2324131～2325315。此外，编码CoA转移酶的基因记载于上述大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469～2322781。并且，可通过使后述的梭状芽孢杆菌属细菌来源的乙酰乙酸脱羧酶基因、异丙醇脱氢酶基因表达而进行异丙醇的生产。

为了得到异丙醇脱氢酶基因，使用拜氏梭菌NRRL B-593的基因组DNA作为模板，由aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列号20)、及gcggatccggtaccttataatataactactgctttaattaagtc(序列号21)利用PCR法进行扩增，用限制性酶SphI、BamHI消化得到的DNA片段从而得到约1.1kbp的异丙醇脱氢酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶SphI及BamHI消化在实施例2中制备的质粒pBRgapP而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中，回收质粒pGAP-IPAdh。

为了得到大肠杆菌来源的硫解酶基因，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，由atggatccgctggtggaacatatgaaaaattgtgtcatcgtcag(序列号22)、及gcagaagcttgtctagattaattcaaccgttcaatcaccatc(序列号23)利用PCR法进行扩增，用限制性酶BamHI、HindIII消化得到的DNA片段从而得到约1.2kbp的硫解酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶BamHI及HindIII消化之前制成的质粒pGAP-IPAdh而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh-atoB。

为了得到大肠杆菌来源的CoA转移酶基因，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，由gctctagagctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(序列号24)、及tagcaagcttctactcgagttatttgctctcctgtgaaacg(序列号25)利用PCR法进行扩增，用限制性酶XbaI、HindIII消化得到的DNA片段从而得到约600bp的CoA转移酶α亚基片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶XbaI及HindIII消化之前制成的质粒pGAP-IPAdh-atoB而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD。

进而，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，由aagtctcgagctggtggaacatatggatgcgaaacaacgtattg(序列号26)、及ggccaagcttcataaatcaccccgttgc(序列号27)利用PCR法进行扩增，用限制性酶XhoI、HindIII消化得到的DNA片段从而得到约600bp的CoA转移酶β亚基片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶XhoI及HindIII消化之前制成的质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA。

为了得到乙酰乙酸脱羧酶基因，使用丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA作为模板，由caggtaccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(序列号28)、及gcggatccttacttaagataatcatatataacttcagc(序列号29)利用PCR法进行扩增，用限制性酶KpnI、BamHI消化得到的DNA片段从而得到约700bp的乙酰乙酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶KpnI及BamHI消化之前制成的质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh-Adc-atoB-atoD-atoA，将其作为pIaaa。

将该质粒pIaaa转化至在实施例3中制备出的大肠杆菌BΔpgi感受态细胞，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板上在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaaa/BΔpgi株。

[实施例5]

<B::atoDABΔpgi株的制备>

向在实施例1中制备的B::atoDAB中转化在实施例3中制备的pTH18cs1-pgi，在含有10μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布至含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而，涂布至含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的茵落。

从出现的茵落中随机选出100个菌落，分别使它们在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板、和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出仅在含有卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于pgi基因被置换为卡那霉素耐性基因而为约3.3kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、pgi基因缺失株(以下有时简称为B::atoDABΔpgi株)。

[实施例6]

<B::atoDABΔgntR株的制备>

大肠杆菌B株的基因组DNA的全碱基序列是公知的(GenBank登录号CP000819)、编码GntR的碱基序列记载于GenBank登录号CP000819中记载的大肠杆菌B株基因组序列的3509184～3510179。为了克隆编码GntR的碱基序列(gntR)的附近区域，合成ggaattcgggtcaattttcaccctctatc(序列号30)、gtgggccgtcctgaaggtacaaaagagatagattctc(序列号31)、ctcttttgtaccttcaggacggcccacaaatttgaag(序列号32)、ggaattcccagccccgcaaggccgatggc(序列号33)所示的四种寡核苷酸引物。序列号30及33的引物分别在5’末端侧具有EcoRI识别位点。

制备大肠杆菌B株的基因组DNA(GenBank登录号CP000819)，将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号30和序列号31的引物对，通过进行PCR而扩增了约1.0kb的DNA片段(以下有时称为gntR-L片段)。另外，使用序列号32和序列号33的引物对，通过进行PCR而扩增了约1.0kb的DNA片段(以下有时称为gntR-R片段)。将这些DNA片段在琼脂糖电泳中进行分离、回收，将gntR-L和gntR-R片段作为模板，使用序列号30和序列号33的引物对，通过进行PCR，由此扩增了约2.0kb的DNA片段(以下有时称为gntR-LR片段)。将该gntR-LR片段于琼脂糖电泳中进行分离、回收，用EcoRI消化，与温度敏感性质粒pTH18cs1(GenBank登录号AB019610)的EcoRI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应，然后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺织公司制)，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认gntLR片段被正确插入到pTH18cs1中，将该质粒作为pTH18cs1-gntR。

将如上所述得到的质粒pTH18cs1-gntR转化至在实施例1中制备的大肠杆菌、B::atoDAB株，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布至含有10μg/ml卡那霉素氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而，将其涂布至LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板、和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于gntR基因缺失而为约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、gntR基因缺失株(以下有时简称为B::atoDABΔgntR株)。

[实施例7]

<pGAP-Ia/B::atoDABΔgntR株的制成>

向在实施例6中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIa，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIa/B::atoDABΔgntR株。

[实施例8]

向在实施例6中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIaz，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaz/B::atoDABΔgntR株。

[实施例9]

<B::atoDABΔpgiΔgntR株的制备>

向在实施例5中制备的大肠杆菌B::atoDABΔpgi株中转化在实施例6中制备的质粒pTH18cs1-gntR，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布至含有10μg/ml卡那霉素氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而将其涂布至LB琼脂板，得到在42℃下生长繁殖的菌落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板、和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于gntR基因缺失而为约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失株(以下有时简称为B::atoDABΔpgiΔgntR株)。

需要说明的是，大肠杆菌MG1655株及大肠杆菌B株可由美国标准生物品收藏中心得到。

[实施例10]

向在实施例9中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIa，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR。

[实施例11]

向在实施例9中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIaz，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株。

[实施例12]

<B::atoDABΔgnd株的制备>

为了克隆编码磷酸葡糖酸脱氢酶的基因(gnd)的碱基序列附近区域，合成cgccatatgaatggcgcggcggggccggtgg(序列号34)、tggagctctgtttactcctgtcaggggg (序列号35)、tggagctctctgatttaatcaacaataaaattg (序列号36)、cgggatccaccaccataaccaaacgacgg(序列号37)所示的4种寡核苷酸引物。序列号34的引物在5’末端侧具有NdeI识别位点，序列号35及序列号36的引物在5’末端侧具有SacI识别位点。另外，序列号37的引物在5’末端侧具有BamHI识别位点。

制备大肠杆菌B株的基因组DNA(GenBank登录号CP000819)，使用序列号34和序列号35的引物对，通过进行PCR而扩增了约1.0kb的DNA片段(以下有时称为gnd-L片段)。另外，使用序列号36和序列号37的引物对，通过进行PCR而扩增了约1.0kb的DNA片段(以下有时称为gnd-R片段)。将这些DNA片段于琼脂糖电泳中进行分离、回收，用NdeI及SacI消化gnd-L片段，用SacI及BamHI消化gnd-R片段。将该两种消化片段、与温度敏感性质粒pTH18cs1(GenBank登录号AB019610)的NdeI及BamHI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺织公司制)，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认编码gnd的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的两条片段被正确地插入到pTH18cs1中，将其作为pTH18cs1-gnd。

将如上所述得到的质粒pTH18cs1-gnd转化至在实施例1中制备的大肠杆菌、B::atoDAB株，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布到含有10μg/ml卡那霉素氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的茵落在LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而涂布在LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选择氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于gntR基因缺失而为约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B::atoDABΔgnd株。

需要说明的是，大肠杆菌B株可由美国标准生物品收藏中心得到。

[实施例13]

向在实施例12中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgnd株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIa，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIa/B::atoDABΔgnd株。

[实施例14]

向在实施例12中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgnd株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIaz，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaz/B::atoDABΔgnd。

[实施例15]

<B::atoDABΔpgiΔgnd株的制备>

向在实施例5中制备的大肠杆菌B株、B::atoDABΔpgi株中转化在实施例12中制备的质粒pTH18cs1-gnd，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布到含有10μg/ml卡那霉素氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而涂布在LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选择氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于gntR基因缺失而为约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B::atoDABΔpgiΔgnd株。

[实施例16]

向在实施例15中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgnd株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIa，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd。

[实施例17]

向在实施例15中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgnd株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIaz，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaz/B::atoDABΔpgiΔgnd株。

[实施例18]

<B::atoDABΔgndΔgntR株的制备>

向在实施例12中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgnd株感受态细胞中转化在实施例6中制备的质粒pTH18cs1-gntR，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布到含有10μg/ml卡那霉素氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而涂布在LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选择氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于gntR基因缺失而为约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B::atoDABΔgndΔgntR株。

[实施例19]

向在实施例18中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgndΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIa，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIa/B::atoDABΔgndΔgntR株。

[实施例20]

向在实施例18中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgndΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIaz，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR株。

[实施例21]

<B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株的制备>

向在实施例15中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgnd株感受态细胞中转化在实施例6中制备的质粒pTH18cs1-gntR，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接下来，将该培养液的一部分涂布到含有10μg/ml卡那霉素氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下进行24小时培养，进而涂布在LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。

从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选择氯霉素敏感性的克隆。进而，选出如下株：利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增从而可得到由于gntR基因缺失而为约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株。

[实施例22]

向在实施例21中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIa，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株。

[实施例23]

向在实施例21中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIaz，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株。

[实施例24]

向在实施例1中制备的大肠杆菌、B::atoDAB株感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIa，在含有50μg/mL氨苄西林的LBBroth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIa/B::atoDAB株。

[实施例25]

向在实施例5中制备的大肠杆菌、B::atoDAB株Δpgi感受态细胞中转化在实施例2中制备的质粒pIaz，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pIaz/B::atoDABΔpgi株。

[试验例1]

(异丙醇的生产)

本实施例中，使用WO2009/008377号说明书图1所示的生产装置进行异丙醇的生产。培养槽使用容量为3升的玻璃制槽，捕获槽使用容量为10L的聚丙烯制的槽。以每槽9L的量向捕获槽中注入作为捕获液的水(捕获水)，将2台连接进行使用。需要说明的是，在培养槽上设置废液管，将由于糖或中和剂的流加而增量的培养液适当地排出至培养槽外。

用于异丙醇生产评价的株的一览如表3所示。

[表3]

IPA＝异丙醇

作为预培养，将各评价株接种于装有50mL含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的500mL容量锥形瓶中，以培养温度30℃、120rpm的转数搅拌培养一夜。将预培养物45mL移至装有855g如下所示组成的培养基的3L容量的培养槽(ABLE公司制培养装置BMS-PI)中，进行培养。培养在大气压下、通气量0.9L/min、搅拌速度550rpm、培养温度30℃、pH7.0(用NH₃水溶液调节)的条件下进行。从培养开始直至8小时后的期间，以10g/L/小时的流速添加50wt/wt％的葡萄糖水溶液。然后，以20g/L/小时的流速适当添加50wt/wt％的葡萄糖水溶液，使得培养槽内尽量无葡萄糖残留。从培养开始直至72小时，进行数次菌体培养液的取样，通过离心操作除去菌体，然后，通过HPLC按照常规方法测定得到的培养上清液中及捕获水中的异丙醇及丙酮的蓄积量。需要说明的是，测定值是培养后的培养液与2台捕获槽中的总计值。将结果示于表4。

<培养基组成>

玉米浆(日本食品化工制)：20g/L

Fe₂SO₄·7H₂O：0.1g/L

K₂HPO₄：2g/L

KH₂PO₄：2g/L

MgSO₄·7H₂O：2g/L

(NH₄)₂SO₄：2g/L

Adekanol LG126(株式会社ADEKA)0.1g/L

(剩余部分：水)

[表4]

在评价结果中，阴性对照(pla/B::atoDAB)的异丙醇生产量为48.7g/L/72h，破坏了gntR的株(pla/B::atoDABΔgntR)的生产量为57.3g/L/72h。由此可知，破坏gntR后，与阴性对照相比，生产能力提升至约1.2倍。

另外，破坏了gntR和pgi且强化了zwf的表达的株(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR)的生产量为70.2g/L/72h，与阴性对照相比，生产能力变为约1.4倍。由此可知，与仅破坏gntR时相比，破坏了gntR和pgi两者且强化了zwf的表达时的生产能力进一步提高。

另一方面，在仅破坏了pgi时(pIaaa/BΔpgi)，完全不生产异丙醇，在仅强化了zwf时(pIaz/B::atoDAB)，生产量为39.4g/L/72h，生产能力未增加，反而降低。

在破坏了gntR且使zwf强表达时(pIaz/B::atoDABΔgntR)、在破坏了pgi且使zwf强表达时(pIaz/B::atoDABΔpgi)、及在破坏了pgi和gntR两者时(pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR)，也为同样情况，生产量分别为33.3g/L/72h、41.1g/L/72h、9.6g/L/72h，异丙醇的生产能力没有增加，反而降低。

因此，在除了进行gntR的破坏还进行其他因子的破坏或强表达时，在pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株中可见的生产能力提高效果可以说是在破坏gntR和pgi两者且使zwf强表达时得到的。

另外，在对可见到生产能力的提高的pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株进一步实施gnd破坏时、即在破坏pgi、gntR和gnd且使zwf强表达时(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR)的异丙醇生产量为75.6g/L/72h，表现高于pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株的高生产能力。

另一方面，在仅破坏gnd时，异丙醇生产量低于阴性对照，为45.5g/L/72h，在仅破坏gnd时未见异丙醇生产能力提高的效果。另外，在破坏了gntR和gnd时(pIa/B::atoDABΔgndΔgntR)、在破坏了pgi和gnd时(pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd)、及在破坏了pgi、gntR和gnd时(pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR)的生产量分别为28.6g/L/72h、2.6g/L/72h、0.8g/L/72h，这些株的异丙醇生产能力未增加，反而下降。进而，在破坏了gnd且使zwf强表达时(pIaz/B::atoDABΔgnd)、在破坏了gntR和gnd且使zwf强表达时(pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR)及在破坏了pgi和gnd且使zwf强表达时(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgnd)，也为同样情况，异丙醇的生产能力未增加，反而降低(生产能力分别为40.7g/L/72h、33.9g/L/72h、34.9g/L/72h)。

因此，可以说在pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株中可见的生产能力提高的效果是仅在同时破坏gntR、pgi和gnd且使zwf强表达时得到的。

另外，可在将得到的丙酮精制后，将其作为异丙醇生产的原料使用。

(丙酮的制造)

[实施例26]

<异丙醇、丙酮的获取>

对上述pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株(实施例23)的培养评价时的捕获水进行GC分析，结果得知，含有丙酮1.2g/L、异丙醇4.3g/L。利用蒸馏由上述含有异丙醇及丙酮的水溶液(培养开始72小时后的捕获水)使得异丙醇及丙酮高浓度化并获取异丙醇及丙酮。

具体而言，最初，以500ml/h的流速使2L上述水溶液通过充填有250ml阳离子交换树脂(Organo制、AMBERLYST 31WET)的柱，除去残留的氨等。在常压下蒸馏该处理液。获取沸点53～81.6℃的馏分，对其进行GC分析，结果得知，丙酮为18.7质量％，异丙醇为62.6质量％，不明成分为0.2质量％，剩余部分为水。将其用作以下的脱氢反应的原料。

<脱氢催化剂ZnO∶ZrO₂(94∶6)的制备>

向500ml的带有搅拌叶片的圆底烧瓶中装入碳酸钠15.94g(0.15mol)及水130ml使其溶解。经1.5小时向得到的水溶液中滴加将硝酸锌六水合物34.36g(0.11mol)及二硝酸氧化锆二水合物1.30g(0.05mol)溶解在150ml的水中而得到的水溶液。在此状态下熟化5天，然后过滤，充分水洗。对得到的白色物进行120℃下2小时、400℃下1小时的干燥，最后进行600℃下2小时的煅烧。以白色粉末形式得到复合氧化物催化剂ZnO∶ZrO₂(94∶6)9.50g。

<丙酮的生产>

向直径1cm、长40cm的SUS制反应器中充填上述的复合氧化物催化剂ZnO∶ZrO₂(94∶6)1.0g(在20MPa下压缩成型后分级为250～500μm的复合氧化物催化剂)，在10ml/min的氮气流下、在350℃下以1.50g/hr的比例流通上述蒸馏液(丙酮18.7质量％、异丙醇62.6质量％、不明成分0.2质量％、剩余部分是水)。将反应器的出口冷却，捕集反应液和反应气。对反应开始5小时后的产物用气相色谱进行分析，结果如表5所示，以高浓度生成了丙酮。需要说明的是，表5中“IPA”表示异丙醇(以下相同)。

[实施例27]

除了使反应温度为400℃以外，与实施例26同样地进行。结果如表5所示。如表5所示，以高浓度生成了丙酮。

[实施例28]

<脱氢催化剂ZnO∶ZrO₂(88∶12)的制备>

向500ml的带有搅拌叶片的圆底烧瓶中装入碳酸钠15.94g(0.15mol)及水130ml使其溶解。经1.5小时向得到的水溶液中滴加将硝酸锌六水合物32.86g(0.11mol)及二硝酸氧化锆二水合物2.66g(0.10mol)溶解在150ml的水中而得到的水溶液。在此状态下熟化5天，然后过滤，充分水洗。对得到的白色物进行120℃下2小时、400℃下1小时的干燥，最后进行600℃下2小时的煅烧。以白色粉末形式得到复合氧化物催化剂ZnO∶ZrO₂(88∶12)9.94g。

<丙酮的生产>

向直径1cm、长40cm的SUS制反应器中充填上述的复合氧化物催化剂ZnO∶ZrO₂(88∶12)1.0g(在20MPa下压缩成型后分级为250～500μm的复合氧化物催化剂)，在10ml/min的氮气流下、在350℃下以1.50g/hr的比例流通上述蒸馏液(丙酮18.7质量％、异丙醇62.6质量％、不明成分0.2质量％、剩余部分是水)。将反应器的出口冷却，捕集反应液和反应气。对反应开始5小时后的产物用气相色谱进行分析，结果如表5所示，以高浓度生成了丙酮。

[实施例29]

除了使反应温度为400℃以外，与实施例28同样地进行。结果如表5所示。如表5所示，以高浓度生成了丙酮。

[表5]

(异丙醇生产大肠杆菌中含有的基因的密码子修饰)

改变本发明的异丙醇生产大肠杆菌中含有的异丙醇脱氢酶基因和乙酰乙酸脱氢酶基因的密码子序列，如下所示，确认了异丙醇及丙酮的生产能力。

[实施例30]

<质粒pI^*a^*z的制备>

梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因(adc)记载于GenBank登录号M55392、异丙醇脱氢酶基因(IPAdh)记载于GenBank登录号AF157307。

为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，由cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(序列号38)、及cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(序列号39)利用PCR法进行扩增，用限制性酶NdeI、SphI消化得到的DNA片段，从而得到约110bp的与GAPDH启动子相应的DNA片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶NdeI及SphI消化质粒pBR322(GenBank登录号J01749)而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pBRgapP。

为了得到经密码子修饰的异丙醇脱氢酶基因(IPAdh^*)，基于拜氏梭菌NRRL B-593的异丙醇脱氢酶基因的氨基酸序列，设计经密码子修饰的异丙醇脱氢酶基因，利用DNA合成制成以下的DNA片段(序列号40)。序列记述如下。

ATGAAAGGTTTTGCAATGCTGGGTATTAATAAGC

TGGGCTGGATCGAAAAAGAGCGCCCGGTTGCGGG

TTCGTATGATGCGATTGTGCGCCCACTGGCCGTA

TCTCCGTGTACCTCAGATATCCATACCGTTTTTG

AGGGAGCTCTTGGCGACCGCAAGAATATGATTTT

AGGGCATGAAGCGGTGGGTGAAGTTGTGGAGGTA

GGCAGTGAAGTGAAGGATTTCAAACCTGGTGACC

GTGTTATCGTCCCTTGCACAACCCCGGATTGGCG

GTCTTTGGAAGTTCAGGCTGGTTTTCAACAGCAC

TCAAACGGTATGCTCGCAGGATGGAAATTTTCCA

ACTTCAAGGATGGCGTCTTTGGTGAGTATTTTCA

TGTGAATGATGCGGATATGAATCTTGCGATTCTG

CCTAAAGACATGCCCCTGGAAAACGCTGTTATGA

TCACAGATATGATGACTACGGGCTTCCACGGAGC

CGAACTTGCAGATATTCAGATGGGTTCAAGTGTA

GTGGTCATTGGCATTGGCGCGGTTGGCCTGATGG

GGATAGCCGGTGCTAAATTACGTGGAGCAGGTCG

GATCATTGGCGTGGGGAGCCGCCCGATTTGTGTC

GAGGCTGCCAAATTTTACGGGGCCACCGACATTT

TGAATTATAAAAATGGTCATATCGTTGATCAAGT

CATGAAACTGACGAACGGAAAAGGCGTTGACCGC

GTGATTATGGCAGGCGGTGGTAGCGAAACACTGT

CCCAGGCCGTATCTATGGTCAAACCAGGCGGGAT

CATTTCGAATATAAATTATCATGGAAGTGGCGAT

GCGTTATTGATCCCGCGTGTGGAATGGGGGTGCG

GAATGGCTCACAAGACTATCAAAGGCGGTCTTTG

TCCCGGGGGACGTTTGAGAGCAGAGATGCTGCGA

GATATGGTAGTGTACAACCGTGTTGATCTCAGCA

AACTGGTCACGCATGTATATCATGGGTTCGATCA

CATCGAAGAAGCCCTGTTACTGATGAAAGACAAG

CCAAAAGACCTGATTAAAGCAGTAGTTATATTAT

AA

使用制成的DNA片段作为模板，由acatgcatgcatgaaaggttttgcaatgctg(序列号41)、及acgcgtcgacttataatataactactgctttaa(序列号42)利用PCR法进行扩增，用限制性酶SphI、SalI消化得到的DNA片段，从而得到约1.1kbp的密码子修饰异丙醇脱氢酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶SphI及SalI消化质粒pUC 119而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认经密码子修饰的IPAdh^*被正确地插入，将该质粒命名为pUC-I^*。

将通过用限制性酶SphI及EcoRI消化质粒pUC-I^*而得到的包含IPAdh^*的片段、与通过将质粒pBRgapP用限制性酶SphI及EcoRI消化而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50

μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认经密码子修饰的IPAdh^*被正确地插入，将该质粒命名为pGAP-I^*。

为了得到经密码子修饰的乙酰乙酸脱羧酶基因(adc^*)，基于丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰乙酸脱羧酶基因的氨基酸序列，设计经密码子修饰的乙酰乙酸脱羧酶基因，利用DNA合成制成以下的DNA片段(序列号43)。序列记述如下。

ATGCTGAAAGATGAAGTGATTAAACAGATTAGCA

CGCCATTAACTTCGCCTGCATTTCCGCGCGGTCC

GTATAAATTTCATAATCGTGAATATTTTAACATT

GTATACCGTACCGATATGGACGCCCTGCGTAAAG

TTGTGCCAGAGCCTCTGGAAATTGATGAGCCCTT

AGTCCGGTTCGAAATCATGGCAATGCATGATACG

AGTGGCCTGGGTTGCTATACAGAATCAGGTCAGG

CTATTCCCGTGAGCTTTAATGGTGTTAAGGGCGA

CTACCTTCACATGATGTATCTGGATAACGAGCCG

GCAATTGCCGTAGGTCGGGAATTAAGTGCATACC

CTAAAAAGCTCGGGTATCCAAAGCTGTTTGTGGA

TTCAGACACTCTGGTGGGCACGTTAGACTATGGA

AAACTGCGTGTTGCGACCGCGACAATGGGGTACA

AACATAAAGCCCTGGATGCTAATGAAGCAAAGGA

TCAAATTTGTCGCCCGAACTATATGTTGAAAATC

ATCCCCAATTATGACGGCTCCCCTCGCATATGCG

AGCTTATCAACGCGAAAATCACCGATGTTACCGT

ACATGAAGCTTGGACAGGACCGACTCGACTGCAG

TTATTCGATCACGCTATGGCGCCACTGAATGACT

TGCCGGTCAAAGAGATTGTTTCTAGCTCTCACAT

TCTTGCCGATATAATCTTGCCGCGCGCGGAAGTC

ATATACGATTATCTCAAGTAA

使用制成的DNA片段作为模板，由acgcgtcgacgctggttggtggaacatatgctgaaagatgaagtgatta(序列号44)、及gctctagattacttgagataatcgtatatga(序列号45)利用PCR法进行扩增，用限制性酶SalI、XbaI消化得到的DNA片段，从而得到约700bp的经密码子修饰的乙酰乙酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶SalI及XbaI消化之前制成的质粒pGAP-I^*而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体回收质粒，确认adc^*被正确插入，将该质粒命名为pI^*a^*。

为了得到葡萄糖6磷酸-1-脱氢酶基因(zwf)，使用大肠杆菌B株的基因组DNA(GenBank登录号CP000819)作为模板，使用gctctagacggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(序列号46)、及cgggatccttactcaaactcattccaggaacgac(序列号47)利用PCR法进行扩增，用限制性酶BamHI、XbaI消化得到的DNA片段，从而得到约1500bp的葡萄糖6磷酸1-脱氢酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶XbaI及BamHI消化之前制成的质粒pI^*a^*而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pI^*a^*z。

[实施例31]

<pI^*a^*/B::atoDABΔgntR株的制成>

向在实施例6中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔgntR株感受态细胞中转化在实施例30中制备的质粒pI^*a^*，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pI^*a^*/B::atoDABΔgntR株。

[实施例32]

<pI^*a^*z/B::atoDABΔpgiΔgntR株的制成>

向在实施例9中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgntR株感受态细胞中转化在实施例30中制备的质粒pIa^*，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pI^*a^*z/B::atoDABΔpgiΔgntR。

[实施例33]

<pI^*a^*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株的制备>

向在实施例21中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株感受态细胞中转化在实施例30中制备的质粒pI^*a^*z，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pI^*a^*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株。

[实施例34]

<pI^*a^*/B::atoDAB株的制备>

向在实施例1中制备的大肠杆菌、B::atoDAB株感受态细胞中转化在实施例30中制备的质粒pI^*a^*，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pI^*a^*/B::atoDAB株。

[试验例2]

(异丙醇的生产)

与上述[试验例1]同样地操作，进行异丙醇的生产评价。用于评价的株的一览如表6所示。另外，评价结果如表7所示。

[表6]

IPA＝异丙醇

[表7]

将表7的结果与表4的结果进行比较得知，对异丙醇脱氢酶基因和乙酰乙酸脱氢酶基因的密码子进行修饰后，异丙醇的生产能力大幅提升。

[实施例35]

(由蔗糖开始的异丙醇生产)

向pI^*a^*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株中进一步导入用于分解蔗糖的酶转化酶基因(cscA)，进行由蔗糖开始的异丙醇发酵生产。进而，由得到的发酵液制造丙酮或丙烯。

<pI^*a^*z-cscA/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株的制备>

大肠杆菌O157株的基因组DNA的全碱基序列是公知的(GenBank登录号AE005174)，也报道了编码大肠杆菌O157株的转化酶的基因(以下有时简称为cscA)的碱基序列。即，cscA记载于GenBank登录号AE005174中记载的大肠杆菌O157株基因组序列的3274383～3275816。

为了得到cscA，使用大肠杆菌O157株的基因组DNA作为模板，由gctggtggaacatatgacgcaatctcgattgcatg(序列号48)、及ttaacccagttgccagagtgc(序列号49)利用PCR法进行扩增，通过将得到的DNA片段用T4多核苷酸激酶进行末端磷酸化，从而得到约1470bp的cscA片段。将该DNA片段与通过将在实施例30中制成的pI^*a^*z用限制性酶BamHI消化后、用T4DNA聚合酶使其为平末端、进而用碱性磷酸酶将末端脱磷酸化而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体回收质粒，将确认了葡萄糖6磷酸-1-脱氢酶基因(zwf)的3’末端侧和cscA的5’末端侧连接起来、cscA被正确插入的质粒命名为pI^*a^*z-cscA。

需要说明的是，大肠杆菌O 157的基因组可由标准物质及计量技术研究所得到。

向在实施例21中制备的大肠杆菌、B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株感受态细胞中转化制备的质粒pI^*a^*z-cscA，在含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller琼脂板中在37℃下培养一夜，由此，得到大肠杆菌pI^*a^*z-cscA/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株。

[试验例3]

(异丙醇及丙酮的制造)

除了使用大肠杆菌pI^*a^*z-cscA/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株以外，与上述[试验例1]同样地操作，进行异丙醇及丙酮的制造。但是，培养基使用40wt/wt％蔗糖水溶液代替50wt/wt％葡萄糖水溶液进行。结果，在培养第72小时，生成82.0g/L的异丙醇和23.7g/L的丙酮。对第1台捕获水进行HPLC分析，结果得知，含有丙酮0.14质量％、异丙醇0.55质量％。

(异丙醇、丙酮的获取)

对上述含有异丙醇及丙酮的捕获水进行蒸馏，使异丙醇及丙酮高浓度化并从中获取异丙醇及丙酮。

具体而言，最初，以500ml/h的流速使9L上述水溶液通过充填有250ml阳离子交换树脂(Organo制、AMBERLYST 31WET)的柱，除去残留的氨等。在常压下蒸馏该处理液。获取沸点53℃～81.6℃的馏分，对其进行GC分析，结果得知，丙酮为19.1质量％，异丙醇为60.5质量％，不明成分为0.5质量％，剩余部分是水。将其用作以下的实施例36～实施例39的脱氢反应、及实施例40的丙烯生产的原料。

[实施例36]

(丙酮的制造)

<脱氢催化剂ZnO∶ZrO₂(94∶6)的制备>

<丙酮的生产>

向直径1cm、长40cm的SUS制反应器中充填上述的复合氧化物催化剂ZnO∶ZrO₂(94∶6)1.0g(在20MPa下压缩成型后分级为250～500μm的复合氧化物催化剂)，在10ml/min的氮气流下、在350℃下以1.50g/hr的比例流通上述蒸馏液(丙酮19.1质量％、异丙醇60.5质量％、不明成分0.5质量％、剩余部分是水)。将反应器的出口冷却，捕集反应液和反应气。对反应开始5小时后的产物用气相色谱进行分析，结果，如表8所示，即使在使用含有大量的水、及生物来源的杂质的丙酮和异丙醇时，也以高浓度生成了丙酮。需要说明的是，表8中“IPA”表示异丙醇(以下相同)。

[实施例37]

除了使反应温度为400℃以外，与实施例36同样地进行。结果如表8所示。如表8所示，以高浓度生成了丙酮。

[实施例38]

<脱氢催化剂ZnO∶ZrO₂(88∶12)的制备>

向500ml的带有搅拌叶片的圆底烧瓶中装入碳酸钠15.94g(0.15mol)及水130ml使其溶解。经1.5小时向得到的水溶液中滴加将硝酸锌六水合物32.86g(0.11mol)及二硝酸氧化锆二水合物2.66g(0.10mol)溶解在150ml的水中而得到的水溶液。在此状态下熟化5天，然后过滤，充分水洗。对得到的白色物进行120℃下2小时、400℃下1小时的干燥、最后进行600℃下2小时的煅烧。以白色粉末的形式得到复合氧化物催化剂ZnO∶ZrO₂(88∶12)9.94g。

<丙酮的生产>

向直径1cm、长40cm的SUS制反应器中充填上述的复合氧化物催化剂ZnO∶ZrO₂(88∶12)1.0g(在20MPa下压缩成型后分级为250～500μm的复合氧化物催化剂)，在10ml/min的氮气流下、在350℃下以1.50g/hr的比例流通上述蒸馏液(丙酮19.1质量％、异丙醇60.5质量％、不明成分0.5质量％、剩余部分是水)。将反应器的出口冷却，捕集反应液和反应气。对反应开始5小时后的产物用气相色谱进行分析，结果，如表8所示，以高浓度生成了丙酮。

[实施例39]

除了使反应温度为400℃以外，与实施例38同样地进行。结果如表8所示。如表8所示，以高浓度生成了丙酮。

[表8]

[实施例40]

(丙烯的制造)

将由实施例35的试验例3所记载的培养液得到的蒸馏液作为原料，使用设置有高压用加料泵、高压用氢质量流量计(mass flow)、高压用氮质量流量计、电炉、具有催化剂充填部分的反应器、背压阀的固定床反应装置，进行依赖于下流的加压液相流通反应。

首先，从反应器的出口侧，向内径1cm的SUS316制反应器中，充填1.0g铜-锌催化剂(SudChemie公司制、制品名ShiftMax210、元素质量％Cu 32～35％、Zn 35～40％、Al 6～7％)粉末(分级为250～500μ的粉末)作为上游侧的催化剂层。为了分离催化剂层，在装入石英棉后，充填1.0g β-沸石(催化剂化成公司制、在20MPa下压缩成型后分级为250～500μ的沸石)作为下游侧的催化剂层。

在用氢加压至2.5Mpa后，在从反应器入口侧开始的20ml/分钟的氢气流下、在180℃下、以0.60g/Hr从反应器入口侧流通上述蒸馏液(丙酮19.1质量％、异丙醇60.5质量％、不明成分0.5质量％、剩余部分是水)。在反应器出口与背压阀的中间通过高压氮质量流导入200ml/分钟的氮。在紧邻背压阀后的管线上设置气液分离管，对采集的气体成分、液体成分分别进行GC分析，定量产物。反应结果如表9所示，得知即使在使用含有大量的水、及生物来源的杂质的丙酮和异丙醇时，也以高转化率生成丙烯。需要说明的是，表9中“DIPE”表示二异丙醚。

[表9]

将2010年8月12日申请的日本专利申请第2010-181150号的公开内容及2011年3月7日申请的日本专利申请第2011-049531号的公开内容整体通过参照引入本说明书中。

本说明书中记载的所有文献、专利申请和技术标准通过参照援引至本说明书中，各个文献、专利申请和技术标准通过参照被引入的情况与具体且分别地记载的情况程度相同。

Claims

1.一种异丙醇生产大肠杆菌，其转录抑制因子GntR的活性被失活，并且所述异丙醇生产大肠杆菌具有异丙醇生产系统和辅酶群，所述辅酶群的酶活性表达模式为维持或强化伴有该GntR活性失活的异丙醇生产性能。

2.如权利要求1所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述辅酶群的酶活性表达模式选自如下酶活性表达模式：

3.如权利要求2所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性来自编码埃希氏杆菌属细菌来源的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)的基因。

4.如权利要求1～3中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇生产系统是由乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶的各酶基因构建而成的。

5.如权利要求1～4中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇生产系统是由上述乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶的各酶基因构建而成的，并且，各酶基因各自独立地来自选自梭状芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏杆菌属细菌中的至少1种原核生物。

6.如权利要求4或5所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述乙酰乙酸脱羧酶活性来自编码丙酮丁醇梭菌来源的酶的基因，上述异丙醇脱氢酶活性来自编码拜氏梭菌来源的酶的基因，上述CoA转移酶活性及硫解酶活性来自编码大肠杆菌来源的各酶的基因。

7.如权利要求4所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇脱氢酶及上述乙酰乙酸脱羧酶的至少一种的活性来自作为基因修饰体导入的基因。

8.如权利要求7所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇脱氢酶的基因修饰体为序列号40表示的碱基序列，上述乙酰乙酸脱羧酶的基因修饰体为序列号43表示的碱基序列。

9.如权利要求4～8中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，至少还具有蔗糖非PTS基因簇中的蔗糖水解酶基因。

10.一种异丙醇生产方法，包括：使用权利要求1～9中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，由植物来源原料生产异丙醇。

11.一种丙酮生产方法，包括：使用权利要求1～9中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，由植物来源原料得到异丙醇；及

使作为催化剂的复合氧化物与得到的异丙醇接触，所述复合氧化物包含氧化锌和含有第4族元素的至少一种氧化物、且通过共沉淀法制备得到。

12.一种丙烯的制造方法，包括：

在反应温度50～300℃的范围内，使作为催化剂的固体酸物质及含有铜的氢化催化剂与异丙醇接触，所述异丙醇是使用权利要求1～9中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料得到的、且含有丙酮。

13.如权利要求12所述的丙烯的制造方法，其中，上述含有铜的氢化催化剂为进一步包含第6族、第12族、及第13族中至少一种元素的催化剂。

14.如权利要求12或13所述的丙烯的制造方法，其中，上述固体酸物质是沸石。