BRPI0510921B1 - Succinic acid production bacteria and process for producing succinic acid - Google Patents

Description

BACTÉRIA PRODUTORA DE ÁCIDO SUCCÍNICO E PROCESSO PARA PRODUZIR ÁCIDO SUCCÍNICO Área Técnica A presente invenção refere-se à indústria de fermentação e a um processo para produzir ácido succinico eficienteraente por meio de um método de fermentação usando uma bactéria corineforme. Técnica Antecedente Para a produção por fermentação de não-aminoácidos orgânicos, inclusive ácido succinico, geralmente são usadas bactérias anaeróbicas como as pertencentes ao gênero Anaerobíospirillum ou Actínobacillus (Documento-patente 1 ou 2 e Documento Não-Pa tente 1). O uso de bactérias anaeróbicas aumenta o rendimento dos produtos, ao mesmo tempo em que as referidas bactérias requerem muitos nutrientes para sua proliferação e, portanto, há necessidade de se acrescentar ao meio uma grande quantidade de fontes orgânicas de nitrogênio, tal como milhocina (CSL - Corn Steep Liquor). A adição de quantidades abundantes de fontes orgânicas de nitrogênio não somente leva a um aumento do custo do meio, mas leva também a um aumento do custo da purificação para isolar o produto, o que não é econômico.

Além disso, é conhecido um método que consiste em cultivar bactérias aeróbicas como a bactéria corineforme sob condição aeróbica para que as células bacterianas proliferem e, então, coletar e lavar as células para usá-las como bactérias em repouso para produzir ácido succinico sem aeraçâo com oxigênio (Documentos-Patentes 3 e 4) . Esse método é econômico porque as células bacterianas podem crescer suficientemente em um meio simples, ao qual se acrescenta uma pequena quantidade de nitrogênio orgânico para a proliferação de células bacterianas; porém, esse método ainda precisa ser melhorado em termos da quantidade de ácido succínico que é gerada, da sua concentração e da sua taxa de produção por célula bacteriana, bem como em termos de simplificação do processo de produção, e semelhantes.

Além do mais, quando bactérias aeróbicas como as bactérias corineformes são cultivadas em condições em que o oxigênio é limitado, ácidos orgânicos além da substância desejada, como ácido lático e ácido acético, se acumulam em excesso como produtos secundários, resultando em repressão do crescimento das células bacterianas e uma significativa diminuição da produtividade da fermentação. Além disso, são necessárias quantidades excessivas de contra-íons para neutralizar os ácidos orgânicos gerados como produtos secundários, o que resulta em um método não econômico. Para resolver esses problemas, a redução do lactato gerado como produto secundário tem sido realizada usando-se uma bactéria corineforme com atividade de lactato deidrogenase reduzida (Documento-Patente 5).

Entretanto, mesmo que seja usada a bactéria corineforme com atividade de lactato deidrogenase reduzida mencionada acima, uma grande quantidade de ácido acético é gerada como produto secundário. Como ura meio para resolver o problema da redução de ácido acético em um meio de cultura, são conhecidos: um método para aumentar a expressão de um gene assimilador do ácido acético (aceP) em uma bactéria pertencente ao gênero Escheríchía (Documento-Patente 6); um método para aumentar a expressão de um gene que codifica a proteína ACE em uma bactéria pertencente ao gênero Escheríchía (Documento-Patente 7), e métodos semelhantes. Os referidos métodos se destinam a reduzir a geração de ácido acético como um produto secundário por meio da assimilação ativa do ácido acético liberado em um meio de cultura. Ao mesmo tempo, como métodos para reprimir a geração do ácido acético como produto secundário suprimindo-se a biossíntese do ácido acétíco em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia, é conhecido um método para produzir ácido succínico usando Escherichia coli, no qual a fosfoacetiltransferase e a lactato deidrogenase são deficientes (Documento-Patente 8) .

Como enzimas responsáveis pela assimilação do ácido acético em bactérias corineformes foram relatadas a acetato quinase e a fosfotransacetilase (Documento Não-Patente 2). Por outro lado, presume-se que não apenas as enzimas citadas acima, mas também uma pluralidade de enzimas como piruvato oxidase (Documento-Patente 9), acilfosfatase, aldeído deidrogenase e acet.il-CoA hidrolase sejam responsáveis pela geração de ácido acético, mas não ficou esclarecida uma enzima especifica que contribua para a síntese do ácido acético. Portanto, não se conhece um método para produzir ácido succínico usando uma linhagem de uma bactéria corineforme que tenha uma atividade reduzida de enzima biossintética de ácido acético. A piruvato oxidase é uma enzima que produz ácido acético a partir de ácido pirúvico e água (EC1.2.2.2), e são conhecidos: um método para produzir um L-aminoácido usando-se enterobactérias nas quais a piruvato oxidase é deficiente (Documento-Patente 10) um método para produzir ácido D-pantotênico usando-se enterobactérias nas quais a piruvato oxidase é deficiente (Documento-Patente 11), e um método para produzir ácido D-pantotênico usando-se uma bactéria corineforme na qual a piruvato oxidase é deficiente (Documento-Patente 12).

Uma sequência genética da piruvato oxidase de Corynebacterium glutamicum foi identificada, e conhece-se um método para produzir um L-aminoácido usando-se uma bactéria corineforme que é modificada de tal modo que a expressão de um gene de piruvato oxidase é diminuída (Documento-Patente 13). No entanto, não se conhece a contribuição da piruvato oxidase para o sistema biossintético do ácido succínico em uma bactéria corineforme, e nenhum relato foi publicado sobre a análise da expressão do gene da piruvato oxidase sob condições anaeróbicas.

Documento-Patente 1: Patente US No. 5.143.833 Documento-Patenie 2: Patente ÍJS No. 5.504.004 Documento-Patente 3: JP11-113588A Documento-Patente 4: JP11-196888A Documento-Patente 5: JP11-206385A Documento-Patente 6: JP06-14781A Documento-Patente 7: JP07-67683A Documento-Patente 8: WO 99/06532 Documento-Patente 9: EP1096013A Documento-Patente 10: WO 02/36797 Documento-Patente 11: WO 02/072855 Documento-Patente 12: WO 02/29020 Documento-Patente 13: EP1108790A

Documento Não-Patente 1: International Journal of Systemtic Bacteriology, vol.49, p 207-216, 1999 Documento Não-Patente 2: Microbiology. 1999, Fev; 145(Pt2):503-13 Descrição da Invenção Um objetivo da presente invenção é fornecer uma bactéria corineforme capaz de produzir eficientemente o ácido succínico.

Os inventores da presente invenção estudaram intensamente para a solução dos problemas mencionados acima e, como resultado, descobriram que a geração de ácido acético como um produto secundário é reduzida e que o ácido succínico é produzido eficientemente em uma bactéria corineforme diminuindo-se a atividade da piruvato oxidase, tendo assim realizado essa invenção.

Isto é, a presente invenção é como segue: (1) (Jma bactéria coríneforme que tem capacidade para produzir ácido succíníco, sendo que a referida bactéria foi modificada de modo que a atividade da piruvato oxidase é diminuída. (2) A bactéria coríneforme de acordo com (1), sendo que a piruvato oxidase é uma proteína conforme descrição em (A) ou (B) seguinte: (A) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; ou (B) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, inclusive substituição, supressão, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos, e tendo atividade de piruvato oxidase. (3) A bactéria coríneforme de acordo com (1) ou (2), em que a atividade de piruvato oxidase foi diminuída por ruptura de um gene de piruvato oxidase em um cromossomo. (4) A bactéria coríneforme de acordo com (3), em que o gene de piruvato oxidase é um DNA conforme descrição em (a) ou (b) seguinte: (a) um DNA consistindo de uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos números 996 a 2732 em SEQ ID NO: 48; ou (b) um DNA que se hibridize com uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos números 996 a 2732 em SEQ ID NO: 48 ou uma sonda que possa ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeos sob condições rigorosas, e que codifique uma proteína que tenha atividade de piruvato oxidase. (5) A bactéria coríneforme de acordo com qualquer um de (1) a (4), que foi adicionalmente modificada de modo que as atividades de uma ou mais dentre a fosfotransacetilase, acetato quínase e acetil-CoA hidrolase foram diminuídas. (6) A bactéria coríneforme de acordo com qualquer um de (1) a (5), sendo que a referida bactéria foi adícíonalmente modificada de modo que a atividade de lactato deídrogenase foi diminuída. (7) A bactéria corineforme de acordo com qualquer um de (1) a (6), sendo que a referida bactéria foi adicionalmente modificada de modo que a atividade de piruvato carboxilase foi aumentada. (8) Um método para produzir ácido succínico que consiste em: permitir que a bactéria corineforme de acordo com qualquer um de (1) a (7), ou um produto tratado da mesma, aja sobre uma matéria prima orgânica em um líquido de reação contendo íon carbonato, íon bicarbonato, ou dióxido de carbono, para produzir e acumular ácido succínico no líquido de reação; e coletar o ácido succínico do líquido de reação. (9) 0 método de produção de acordo com (8), no qual se permite que a bactéria ou o produto tratado da mesma aja sobre a matéria prima orgânica sob condições anaeróbicas. (10) Um método para produzir um polímero contendo ácido succínico, consistindo dos estágios de produzir ácido succínico pelo método de acordo com (8) ou (9) e polímerízar o ácido succínico obtido.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBS3. A Figura 2 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBS4S. A Figura 3 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pAldh56-l. A Figura 4 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBS4S::ΔροχΒ. A Figura 5 é um gráfico que mostra a proporção do ácido acético como um produto secundário na linhagem com ooxB rompido e na linhagem de controle. A Figura 6 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBS5T::Aack. A Figura 7 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBSST::tpta-ack. A Figura 8 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBSST::ApoxB. A Figura 9 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBS4S::Aach. A Figura 10 mostra os procedimentos para construção do plasmídeo pBSST::Aacp Descrição das Incorporações Preferenciais Doravante no presente documento incorporações da presente invenção serão descritas detalhadamente. <1> Bactéria corínefome a ser usada na presente invenção Na presente invenção, o termo "bactéria corineforme" inclui uma bactéria que havia sido classificada como gênero Brevihacteri ura, mas agora é classificada como gênero Corynebacteríum (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)), e inclui também uma bactéria pertencente ao gênero Brevibacterium, que é proximamente .relacionada com a Corynebacterium. Exemplos das referidas bactérias corineformes incluem as seguintes.

Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolytícum Corynebacterium ca 11unae Corynebacterium giutamicum Corynebacterium lílíum Corynebacterium melasseco1 a Corynebacterium thermoamínogenes Corynebacterium herculis Brevihacteri um di var:i.ca tum Brevibacterium flavum Brevihacterium ímmariophilum Brevihacteríum lactofermentum Brevíbacteríum roseuw.

Brevibacteríum saccharolytícum Brevíbacteríum thiogenitalis Corynebacterium ammoníagenes Brevíbacteríum álbum Brevibacteríum seiinum Microbacte r í um. a mm o n í aph i 1 um Na presente invenção, o termo "capacidade para produzir ácido succínico" significa uma capacidade de acumular ácido succínico em um meio quando se cultiva a bactéria corineforme da presente invenção. A capacidade de produzir ácido succínico pode ser uma característica inerente a uma bactéria corineforme, ou uma característica conferida pelo cultivo.

Para conferir a capacidade de produzir ácido succínico pelo cultivo, podem ser aplicados métodos que têm sido empregados no cultivo de bactérias corineformes, que incluem a aquisição de linhagens mutantes quanto à regulagem metabólica, a criação de uma linhagem recombinanie tendo uma enzima biossintétíca para uma substância desejada aumentada, e semelhantes (Mino Acid Fermentatíon, Japan Scientific Societies Press, primeira edição publicada em 30 de maio de 1986, p77-100) . Nesses métodos, podem ser conferidas uma, ou duas, ou três, ou mais características, tais como mutações na regulagem metabólica e aumento de enzimas biossintéticas para uma substância desejada. O provimento de propriedades como mutações na regulagem metabólica e aumento de enzimas biossintéticas pode ser combinado. Um exemplo de enzima produtora de ácido succínico inclui a piruvato carboxilase conforme descrição abaixo.

Exemplos específicos especialmente preferenciais de uma bactéria corineforme que tem capacidade de produzir ácido succínico incluem a linhagem MJ233áldh da Brevíbacterium flavum com atividade de lactato deidrogenase diminuída (JP11-206385A) ; a linhagem MJ2.33/pPCPYC da Brevíbacterium flavum com atividade de píruvato carboxilasê ou fosfoenol piruvato carboxilasê aumentada (WO 01/27258 e JP11-196887A); a Brevíbacterium fiavam MJ-233 (FERM BP-1497); a Brevíbacterium flavum MJ-233 (FERM PB-1498); a Brevíbacterium ammoniagenes ATCC6872; a Corynebacterium glutamicum ATCC31831, e a Brevíbacterium lactofermentum ATCC13869. Como atualmente a Brevíbacterium flavum pode ser classificada como Corynebacterium glüt:am.ícum (Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. e Schleifer, K.H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260), a referida linhagem MJ-233 da Brevíbacterium flavum e sua linhagem mutante MJ-233 AB-41 são definidas como sendo as mesmas linhagens que a linhagem MJ-233 da Corynebacterium. glutamicum e a linhagem MJ233 AB-41 da Corynebacterium. glutamicum, respectivamente. <2> Construção da bactéria corineforme da presente invenção A bactéria corineforme da presente invenção é uma bactéria corineforme que tem a capacidade mencionada acima de produzir ácido succínico e que foi modificada de tal modo que a atividade de piruvato oxidase foi diminuída.

No cultivo da bactéria corineforme da presente invenção, não há preferência no que diz respeito a qual é realizada primeiro, se é a provisão da capacidade para produzir ácido succínico cu a modificação para diminuir a atividade piruvato oxidase (EC 1.2.2.2). 0 termo "atividade de piruvato oxidase" refere-se a uma atividade para catalisar uma reação para gerar ácido acético a partir de ácido pirúvico e água. O termo "modificada de tal modo que a atividade de piruvato oxidase é diminuída" significa que a atividade de piruvato oxidase é diminuída em comparação com. uma atividade específica de uma linhagem não modificada; por exemplo, uma bactéria corineforme do tipo selvagem. A atividade de piruvato oxídase é preferivelmente reduzida a 50% ou menos por célula bacteriana, mais preferivelmente 30% ou menos, ainda mais preferivelmente 101 ou menos por célula bacteriana, em comparação com uma linhagem não modificada. Aqui, exemplos de uma bactéria corineforme do tipo selvagem a ser usada como controle incluem Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869 {linhagem do tipo selvagem) e linhagem Aldh de Brevibacteríum lactofermentum (linhagem não modificada), A atividade de piruvato oxídase pode ser determinada de acordo com o método de Chang Y. e outros (Chang Y. e Cronan J. E. JR, J. Bacteriol. 151,1279 (1982)).

Exemplos de piruvato oxídase tendo a atividade mencionada acima incluem uma proteína que tem uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:49. Além disso, desde que a proteína tenha uma atividade de piruvato oxídase, pode ser uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO; 49 incluindo substituição, supressão, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos. Aqui, por exemplo, o termo "vários" significa de 2 a 20, preferivelmente de 2 a 10, mais preferivelmente de 2 a 5. A expressão "modificada de tal modo que a atividade de piruvato oxídase é diminuída" inclui diminuição do número de moléculas de piruvato oxídase por célula, diminuição da atividade de piruvato oxídase por molécula, e semelhantes. Especificamente, isso é realizado rompendo-se um gene que codifica a piruvato oxídase em um cromossomo, modífícando-se uma seqüência reguladora da expressão, tal como um promotor, seqüência de Shine-Dalgarno (SD), ou semelhante. Exemplos de gene da piruvato oxídase em um cromossomo incluem um DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos números 996 a 2732 de SEQ ID NO; 48. Também pode ser um DNA que se bibridize com a seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos números 996 a 2732 de SEQ ID NO: 48 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqiiência de nucleotídeos sob condições rigorosas, desde que codifique uma proteína que tenha atividade de piruvato oxidase. 0 termo "condições rigorosas" refere-se a condições em que se forma o assim-chamado híbrido especifico e não se forma o híbrido não-específico. É difícil definir claramente as condições por meio de valores numéricos, mas exemplos das mesmas incluem condições que consistem em lavar uma vez, preferivelmente duas vezes ou três vezes em uma concentração de sal correspondente a 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,11 SDS a 60°C. O gene de piruvato oxidase (doravante aqui denominado gene de poxB) pode ser obtido, por exemplo, por clonagem realizada sintetizando-se oligonucleotídeos sintéticos com base em uma seqiiência de Corynebacterium glutamícum registrada no GenBank (uma linhagem complementar de 2776766-2778505 de No. de Acesso GenBank NC 0033450), e realizando-se PCR usando um cromossomo de Corynebacterium glutamícum como template. Além disso, também pode ser usada uma seqüência de uma bactéria corineforme como a Brevibacterium lactofermentum com uma seqüência de nucleotídeos determinada pelo recente projeto genoma. O DNA cromossômíco pode ser preparado a partir de uma bactéria como doadora de DNA, por exemplo, pelo método de Saito e Miura (H.Saito e K. Míura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619(1963), Experimental Manual for Biotechnology, publicado pela Sociedade de Biotecnologia, Japão, p97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992) ou semelhantes. O gene de poxB preparado dessa maneira, ou uma parte do mesmo, pode ser usado para ruptura de gene. Um gene a ser usado para ruptura de gene só precisa ter homología suficiente para causar uma recombinaçâo homóloga com um gene de poxB a ser rompido em um cromossomo de uma bactéria corineforme (por exemplo, um gene tendo a sequência de nucleotídeos de nucleotídeos números 996-2732 na SEQ ID NO:48),e assim o referido gene homólogo também pode ser usado. Aqui, a homologia suficiente para causar recombinação homóloga é preferivelmente de não menos do que 70%, mais preferivelmente nao menos do que 80% e ainda mais preferivelmente não menos do que 90%. Além disso, DNAs capazes de hibridizar-se com o gene mencionado acima sob condições rigorosas pode causar recombinação homóloga, O termo "condições rigorosas" refere-se a condições em que se forma um assim-chamado híbrido especifico e não se forma um híbrido nâo-específico. É difícil definir claramente as condições por meio de valores numéricos, mas os exemplos das mesmas incluem condições que consistem em lavar uma vez, preferivelmente duas vezes ou três vezes em concentrações de sal correspondentes a 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,11 SDS a 60°C.

Por exemplo, usando-se o gene mencionado acima, prepara-se uma forma suprimida do gene de poxB, que é modificado de modo a não produzir piruvato oxidase que normalmente funciona suprimindo-se uma seqüência parcial do gene de poxB, e transforma-se uma bactéria corineforme com um DNA contendo o gene para causar recombinação entre a forma suprimida do gene e o gene em um cromossomo, para, desse modo, romper o gene de poxB em um cromossomo. A referida ruptura do gene por substituição do gene usando recombinação homóloga já foi estabelecida, e exemplos da mesma incluem um método que usa um DNA linear e um método que usa um piasmideo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente US No. 6.303.383, ou JP05-007491A). Além disso, a acima citada ruptura do gene por meio de substituição do gene usando recombinação homóloga também pode ser realizada usando-se um piasmideo que não tem nenhuma capacidade de replicação em um hospedeiro.

Por exemplo, um gene de poxB em um cromossomo de um hospedeiro pode ser substituído por uma forma suprimida de gene de poxB de acordo com os procedimentos seguintes. Primeiramente, prepara-se um plasmídeo para recombinação inserindo-se uma origem de replicação sensível à temperatura, a forma suprimida do gene de poxB, o gene de SacB que codifica o levansucrase e um gene marcador resistente a urna droga como o cIoran.fen.icol.

Aqui, o gene de sacB que codifica o levansucrase é um gene que é usado para selecionar com eficiência uma linhagem em que uma porção do vetor foi extirpada de um cromossomo (Schafer, A. e outros, Gene 145 (1994) 69-73) . Isto é, quando o levansucrase é expresso em uma bactéria corineforme, o levan gerado por assimilação de sacarose age letalmente sobre a bactéria e assim a bactéria não pode crescer. Portanto, se uma linhagem bacteriana na qual um vetor carregando levansucrase permanece no cromossomo for cultivada em uma placa contendo sacarose, ela não pode crescer. 0 resultado é que apenas uma linhagem bacteriana da qual tiver sido extirpado o vetor pode ser selecionada na placa contendo sacarose.

Os genes que têm as seguintes sequências podem ser usados como um gene de sacB ou gene homólogo do mesmo.

Bacillus subtílis: sacB Número de Acesso GenBank X0273Q (SEQ ID NO:41) Bacillus amyloliquefaciens: sacB Número de Acesso GenBank X52988 Zymomonas mobilis: sacB Número de Acesso GenBank L33402 Bacillus stearothermophilus: surB Número de Acesso GenBank U34874 Lactobacíllus sanfranciscensis: frfA Número de Acesso Genbank AJ508391 Acetobacter xylínus: IsxA Número de Acesso GenBank ABO 3 4152 Gluconacetobacter diazotrophicus: IsdA Número de Acesso GenBank L417 32 Uma bactéria corineforme é transformada com o plasmideo recombinante citado acima. A transformação pode ser realizada de acordo com um método de transformação que foi relatado anterionnente. Exemplos de métodos incluem um método para aumentar a permeabilidade de um DNA tratando as células de uma bactéria recipiente com cloreto de cálcio, conforme relatado com referência a Escherichia colí K-12 (Mandei, M. e Higa, A.J, J. Mol. Biol., 53,159 (1970)) e um método para preparar células competentes usando células proliferatívas para introdução de DNA, conforme relatado com referência a Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Alternativamente, como foi relatado com referência a Bacillus subtilis, actinomicetes e leveduras, também pode ser aplicado um método para introduzir um DNA recombinante em células de uma bactéria recipiente de DNA (Chang, S. e Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 158, 111(1979)); Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75 1929 (1978)). Além disso, uma bactéria corineforme pode ser transformada pelo método de pulso elétrico (Sugímoto e outros, JP02-207791A).

Exemplos de um plasmideo sensível à temperatura para uma bactéria corineforme incluem p48K e pSFKT2 (JP2000-262288Ά) e pHSC4 (Patente Francesa No. 2667875 (1992) e JP05-7491A). Esses plasmídeos podem ser replicados autonomamente em uma bactéria corineforme a pelo menos 25°C, mas não são autonomamente replicáveis a 37 °C. Escherichia coli AJ12571 com pHSC4 foi depositada com Número de Acesso FERM P-11763 no National Institute of Bíoscience and Human Technology (Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana), Agency of Industrial Science and Technology (Agência da Ciência e Tecnologia Industrial), Ministry of International Trade and Industry (Ministério do Comércio e Industria Internacional), (atualmente International Patent Organism Depositary -Órgão Depositário de Patentes Internacionais), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada) (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibarakí, 305-5466, Japão) , em 11 de outubro de 1990 e, então, foi transferida para um depósito internacional de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste em 26 de agosto de 1991, com o Número de Acesso FERM BP-3524. üm transformante obtido conforme descrição acima é cultivado a uma temperatura na qual a origem de replicação sensível à temperatura não funciona (25°C) para, dessa maneira, obter-se uma linhagem na qual o plasmídeo foi introduzido. A .linhagem em que foi introduzido o plasmídeo é cultivada a uma temperatura elevada para extirpar o plasmídeo sensível à temperatura, e a linhagem bacteriana é aplicada sobre uma placa contendo um antibiótico. O plasmídeo sensível à temperatura não pode se replicar a uma temperatura elevada. Portanto, uma linhagem bacteriana da qual tenha sido extirpado o plasmídeo não pode crescer em uma placa contendo um antibiótico, mas uma linhagem bacteriana em que ocorreu a recombinaçâo entre o gene de poxB no plasmídeo e o gene de poxB em um cromossomo aparece com uma frequência muito baixa.

Na linhagem obtida pela introdução do DNA recombinante em um cromossomo conforme descrição acima, ocorre a recombinaçâo com uma seqüência do gene de poxB que está originalmente presente em um. cromossomo, e dois genes de fusão do gene de poxB croinossômico e a forma suprimida de gene de poxB são inseridos em um cromossomo de modo que outras porções do DNA recombinante (parte de vetor, origem da replicação sensível à temperatura e marcador resistente a drogas) estejam presentes entre os genes de fusão.

Então, com a finalidade de deixar apenas a forma suprimida do gene de poxB em um DNA cromossômico, o gene é eliminado juntamente com a porção do vetor (a origem da replicação sensível á temperatura e marcador resistente a drogas) do cromossomo. Esse procedimento causa uma situação em que o gene de poxB normal permanece no DNA cromossômico e a forma suprimida do gene de poxB é extirpada ou, ao contrário, uma situação em que o gene de poxB normal é extirpado e a forma suprimida de gene de poxB permanece no DNA cromossômico. Em ambos os casos, quando o cultivo é realizado a uma temperatura que permite que uma origem de replicação sensível à temperatura funcione, o DNA clivado é mantido em uma célula como um plasmideo. Em seguida, quando o cultivo é realizado a uma temperatura que não permite que uma origem de replicação sensível à temperatura funcione, o gene de poxB no plasmideo é eliminado da célula juntamente com o plasmideo. Então, uma linhagem na qual a forma suprimida de gene de poxB permanece no cromossomo é selecionada por PCR, hibridização Southern ou semelhante, para, dessa maneira, produzir uma linhagem na qual o gene de poxB é rompido.

No caso de se usar um plasmideo que não tem nenhuma replicabilidade em uma bactéria coríneforme em vez do plasmideo sensível à temperatura mencionado acima, a ruptura do gene também pode ser realizada de uma maneira semelhante. 0 plasmideo que não tem qualquer replicabilidade em uma bactéria coríneforme é preferivelmente um plasmideo que tem replicabilidade em Escherichia coli, e os exemplos do mesmo incluem pHSG299{Takara Bio Inc.) e pHSG399 (Takara Bío Inc.).

Ao mesmo tempo, os exemplos de um método para diminuir uma atividade de piruvato oxidase incluem não apenas o método de engenharia genética citado acima, mas também um método que consiste em tratar uma bactéria corineforme com irradiação ultravioleta ou com um agente mutagênico de uso geral para mutação, como N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina (NTG) e ácido nitroso, e selecionar uma linhagem bacteriana que tenha atividade de piruvato oxidase diminuída.

Na presente invenção, é mais eficaz usar uma linhagem de bactéria modificada de tal modo que uma atividade de lactato deídrogenase (doravante aqui denominada LDH) seja diminuída, além da atividade de piruvato oxidase mencionada acima. A atividade de lactato deídrogenase significa uma atividade para catalisar uma reação para gerar ácido lático reduzindo-se o ácido pirúvico usando NADI-I como uma coenzima. A frase "a atividade de lactato deídrogenase é diminuída" significa que a atividade de LDH é diminuída em comparação com uma linhagem com LDH não modificada. A atividade de LDH é diminuída em relação a uma linhagem com LDH não modificada ou uma linhagem do tipo selvagem, e é preferivelmente diminuída para 50¾ ou menos, mais preferivelmente 30¾ ou menos, e mais preferivelmente ainda 10¾ ou menos por célula bacteriana. A atividade de LDH também pode ser completarnente eliminada. A atividade de LDH diminuída pode ser confirmada determinando-se a atividade de LDH pelo método de L. Kanarek e outros (L. Kanarek e R.L. Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)). A bactéria corineforme da presente invenção pode ser obtida preparando-se uma bactéria corineforme tendo atividade de LDH diminuída e modificando-se a mesma de modo que a atividade de piruvato oxidase seja diminuída. Entretanto, não há preferência quanto à ordem para realizar a modificação para diminuir a atividade de LDH e a modificação para diminuir a atividade de piruvato oxidase.

Como gene de Idh pode ser usado, por exemplo, um gene tendo a sequência de SEQ ID NO: 43 e a ruptura do gene pode ser realizada de uma maneira semelhante à usada no caso do gene de poxB mencionado acima.

Na presente invenção, é mais eficaz usar uma linhagem bacteriana modificada de modo que a atividade de qualquer uma dentre a fosfotransacetiiase (doravante aqui denominada PTA), a acetato quinase (doravante aqui denominada ACK), e a acetil-CoA bidrolase (ACH) seja diminuída, além da diminuição da atividade de piruvato oxidase. Também é eficaz usar uma linhagem bacteriana modificada de modo que as atividades de duas ou mais das enzimas seja diminuída e é especialmente eficaz usar uma linhagem bacteriana modificada de modo que todas as atividades sejam diminuídas. Também é eficaz usar uma linhagem bacteriana adicionalmente deficiente em acilfosfatase.

Na presente invenção, atividade de fosfotransacetiiase (PTA) significa uma atividade para catalisar uma reação para gerar acet.il fosfato transferindo fosfato para acetil CoA. A acetato quinase (ACK) significa uma atividade para catalisar uma reação para gerar ácido acético a partir de acetil fosfato e ADP. A atividade de acetil-CoA hidrolase (ACH) significa uma atividade para catalisar uma reação para gerar ácido acético a partir de acetil-CoA e água. A atividade de acilfosfatase (ACP) significa uma atividade para catalisar uma reação para gerar ácido fosfórico e ácido acético, ou ácido carboxílico e ácido fosfórico a partir de acetil fosfato. A diminuição dessas atividades pode ser realizada pela ruptura dos genes que codificam as enzimas mencionadas acima, ou pela modificação de uma seqüência reguladora de expressão, tal como um promotor e seqüência Shine-Dalgarno (SD) dos genes que codificara as enzimas. A ruptura de gene pode ser realizada da mesma maneira que o método acima para ruptura do gene de poxB.

Como genes que codificam as enzimas podem ser usados, por exemplo, os seguintes genes de Corynebacteríum glutamicum registrados no GenBank: Gene de pta (fosfoacetiltransferase): NCgl2657 de No. de Acesso GenBank NC 0033450 (uma linhagem complementar de nucleotídeos números 2936506-2937891 de NC_003450) (os números de nucleotídeos 956-1942 em SEQ ID NO: 45) .

Gene de ack (acetato quinase) : NCgl2656 de No. de Acesso GenBank NC_003450 (uma linhagem complementar de nucleotídeos números 2935313-2936506 em NC 003450) (os números de nucleotídeos 1945-3135 em SEQ ID NO: 45).

Gene de acb (acetil-CoA hidrolase): NCgl2480 de No. de Acesso GenBank NC 003450 (uma linhagem complementar de nucleotídeos números 272937 6-2730884 de NC_0033450 (SEQ ID NO:50).

Gene de acp (acilfosfatase): NCgll987 de No. de acesso GENEBANK NC_003450 (uma linhagem complementar de nucleotídeos números 2183107-2183391 de NC 003450 (SEQ ID NO:52). A frase "a atividade de fosfotransacetilase (doravante aqui mencionada como PTA) é diminuída" significa que a atividade de PTA é diminuída em comparação com uma linhagem não modificada quanto a PTA. A atividade de PTA é menor do que a de uma linhagem não modificada no que se refere à PTA ou uma linhagem do tipo selvagem, e é preferivelmente reduzida a 50% ou menos por célula bacteriana, mais 30% ou menos e mais preferivelmente ainda, 10% ou menos por célula bacteriana. A atividade de PTA também pode ser completamente eliminada. A atividade de PTA diminuída pode ser confirmada determinando-se a atividade de PTA por um método de Klotzsch e outros. (Klotzsch H.R., Meth Enzymol. 12, 381-386 (1969)). Uma bactéria corineforme tendo as atividades de POXB e PTA diminuídas pode ser obtida construindo-se uma bactéria corineforme tendo atividade de POXB diminuída e modificando-a de modo a diminuir a atividade de PTA. Entretanto, não há preferência quanto à ordem para a realização da modificação para diminuir a atividade de PTA e a modificação para diminuir a atividade de POXB. A expressão "a atividade de acetato quinase (doravante aqui denominada ACK) é diminuída" significa que a atividade de ACK é diminuída em comparação com uma linhagem do tipo selvagem ou uma linhagem com ACK não modificada. A atividade de ACK é menor do que a de uma linhagem, com ACK não modificada ou uma linhagem do tipo selvagem e preferivelmente é diminuída para 50% ou menos por célula bacteriana, mais preferivelmente 30% ou menos, e mais preferivelmente ainda 10% ou menos por célula bacteriana em comparação com uma .linhagem com ACK não modificada. A atividade de ACK também pode ser completamente eliminada. A atividade de ACK diminuída pode ser confirmada determinando-se a atividade de ACK por um método de Ramponi e outros (Ramponi G., Meth. Enzymol. 42, 409-426 (1975)). Uma bactéria corineforme tendo as atividade de POXB e ACK diminuídas pode ser obtida construíndo-se uma bactéria corineforme com atividade de POXB diminuída e modificando-a de modo a diminuir a atividade de ACK. Entretanto, não há preferência quanto à ordem para a realização da modificação para diminuir a atividade de ACK e a modificação para diminuir a atividade de POXB.

A frase "a atividade de acetil-CoA (doravante aqui denominada ACH) é diminuída" significa que a atividade é inferior à de uma linhagem com ACH não modificada ou uma linhagem do tipo selvagem, e a atividade é preferivelmente diminuída para 50% ou menos, mais preferivelmente 30% ou menos e, mais preferivelmente ainda, 10% ou menos por célula bacteriana, em comparação com uma linhagem de ACH não modificada. A atividade de ACH também pode ser completamente eliminada. A atividade de ACH diminuída pode ser confirmada determinando-se a atividade de ACH pelo método de Gergely, J. e outros (Gergely, J., Hele, P. e Ramkrishnan, C. V. (1952) J. Bioi. Chem. 198 p323-334) . Uma bactéria corineforme tendo atividades de ACH e POXB diminuídas pode ser obtida construindo-se uma bactéria corineforme tendo atividade de ACH diminuída e modificando-a de modo que a atividade de POBX seja diminuída. Entretanto, não há preferência quanto à ordem em que são realizadas a modificação para diminuir a atividade de POXB e a modificação para diminuir a atividade de ACH. Λ frase "a atividade de acilfosfatase (doravante aqui denominada ACP) é diminuída" significa que a atividade é diminuída em comparação com uma linhagem do tipo selvagem ou uma linhagem com ACH não modificada. A atividade de ACP é inferior à de uma linhagem do tipo selvagem ou uma linhagem com ACP não modificada e é preferivelmente diminuída para 50% ou menos por célula bacteriana, mais desejavelmente para 10% ou menos por célula bacteriana, em comparação com uma linhagem de ACP não modificada. A atividade de ACP também pode ser completamente eliminada. A atividade de ACP diminuída pode ser confirmada determinando-se a atividade de ACP pelo mesmo método usado para atividade de ACK )Ramponi G., Meth. Enzymol. 42, 409-426 (1975)). Uma bactéria corineforme tendo atividades de POXB e ACP diminuídas pode ser obtida construindo-se uma bactéria corineforme tendo atividade de POXB diminuída e modificando-a de modo que a atividade de ACP seja diminuída. Entretanto, não há preferência quanto à ordem em que são realizadas a modificação para diminuir a atividade de ACP e a modificação para diminuir a atividade de POXB.

Ao mesmo tempo,na presente invenção, pode-se usar uma bactéria modificada de modo que a atividade de piruvato carboxilase (doravante aqui denominada PC) é aumentada, além da diminuição da atividade de POXB. A frase "a atividade de piruvato carboxilase é aumentada" significa que a atividade de PC é aumentada em comparação com a de uma linhagem do tipo selvagem ou de uma linhagem não modificada, tal como uma linhagem genitora. A atividade de PC pode ser determinada pelo método de Peters-Wendisch, P.G e outros. (Peters-Wendisch, P. G. e outros. MícTobíology 143, 1095-1103 (1997)).

Como um gene de PC que codifica uma proteína PC a ser usada no método da presente invenção, pode ser empregado um gene cuja seqüêncía de nucleotídeos tenha sido determinada, ou um gene obtido isolando-se um fragmento dc DNA que codifique uma proteína com atividade de PC a partir de um cromossomo de microorganismos, animais, plantas ou semelhantes, de acordo com o método descrito abaixo e determinando-se sua seqüêncía de nucleotídeos. Além disso, após a determinação da seqüêncía de nucleotídeos, pode-se usar um gene sintetizado com base na seqüêncía. Por exemplo, pode-se usar um gene de piruvato carboxilase de Corynebacterium glutamícum ATCC13032 (Gene No. de Acesso GenBank NCgl0659: SEQ ID NO:60). Além do mais, também podem ser usados genes de PC derivados dos seguintes organismos Humano [Bíochem. Biophys. Res. Comm., 202, 1009-1014, (1994)] Camundongo [Proc. Natl. Ãcad. Sei. USA, 90, 1766-1779, (1993)] Rato [GENE, 165, 331-332, (1995)] Levedura; Saccharomyces cerevisíae [Mol. Gen. Genet., 229, 307-315, (1991)] Schizosaccharomyces pombe [No. de Acesso DDBJ: D78170] Bacillus stearothermophilus [GENE, 191, 47-50, (1997)] Rhízobíum etli [J. Bacteriol.,178, 5960-5970, (1996)] Um fragmento de DNA contendo um gene de PC pode ser expresso inserindo-se o fragmento de DNA em um plasmideo de expressão adequado, tal como pUCH8 (Takara Bio Inc.), e introduzindo-o em um microorganismo hospedeiro adequado, tal como Escheríchía coli JM109 (Takara Bio Inc.). 0 produto expresso do gene de PC, que é a piruvato carboxilase, pode ser confirmado determinando-se a atividade de PC pelo método conhecido descrito acima no transformante e, então, comparando-se a atividade de PC determinada com a atividade de PC de uma solução de enzima crua extraída de uma linhagem não-transformante. 0 fragmento de DNA contendo o gene de PC é inserido em um plasmideo adequado, tal como um vetor plasmideo contendo pelo menos um gene responsável pela função de replicação do plasmideo em bactérias corineformes; dessa maneira, pode-se obter um plasmideo recombinante capaz de uma alta expressão de PC em bactérias corineformes. Aqui, no plasmideo recombinante, um promotor para expressão do gene de PC pode ser um promotor de bactérias corineformes. No entanto, ele não se limita ao referido promotor e qualquer promotor pode ser usado, desde que tenha uma seqüência de nucleotídeos capaz de iniciar a transcrição do gene de PC.

Os vetores plasmídeos nos quais o gene de PC pode ser introduzido não são limitados, desde que contenham pelo menos um gene responsável pela função de replicação nas bactérias corineformes. Os seus exemplos específicos incluem: plasmideo pCRY30 descrito em JP03-210184A; plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KX, sendo cada um descrito em JP02-72876A e Patente US No. 5.185.262; plasmídeos pCRY2 e PCRY3, cada um descrito em JP01-191686A; pAM330 descrito em JP58-67679A; pHMl519 descrito em JP58-77895A; pAJ655, pAJGll, e pAJ1844, cada um descrito em JP58-192900A; pCGl descrito em JP57-134500A; pCG2 descrito em JP58-35197A, e pCGG4 e pCGll, cada um descrito em JP57-183799A.

Dentre esses, os vetores plasmídeos usados no sistema hospedeiro-vetor para bactérias corineformes são preferivelmente os que têm um gene responsável pela função de replicação do plasmídeo em bactérias corineformes e um gene responsável pela função de estabilização do plasmídeo em bactérias corineformes. Por exemplo, os plasmídeos pCRY30, pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE e pCRY3KX podem ser usados preferencialmente.

Bactérias corineformes tendo expressão acentuada do gene de PC podem ser obtidas transformando-se uma bactéria corineforme, por exemplo Brevibacterium lactofermentum, linhagem 2256 (ATCC1.3869) com um vetor recombinante preparado inscríndo-sc o gene dc PC em um sítio apropriado de um vetor plasmídeo que se~ja replicável em bactérias corineformes aeróbicas conforme descrição acima. A transformação pode ser conduzida, por exemplo, por meio do método de pulso elétrico (Res. Microbíol,, Vol.144, p. 181— 185, 1993). A atividade de PC também pode ser aumentada acentuando-se a expressão do gene pela introdução, substituição, ampliação ou semelhante do gene de PC em um cromossomo por um método conhecido de recombinação homóloga. Rompendo-se o gene de poxB em uma linhagem com alta expressão do gene de PC, pode-se obter uma linhagem bacteriana com atividade de PC aumentada e atividade de piruvato oxidase diminuída. Não há preferência quanto à ordem em que se realizam as modificações para diminuir a atividade de piruvato oxidase e aumentar a atividade de PC.

Além do mais, na presente invenção, uma bactéria que for modificada de modo que as atividades de piruvato oxidase, ACH, PTA e ACK foram diminuídas e adicionalmente modificada de modo que a atividade de LDH foi diminuída e a atividade de PC foi aumentada será usada de modo especialmente eficaz para a produção de uma substância, especialmente para produção de ácido succínico. <3> Produção de ácido succ.inico usando a bactéria da presente invenção 0 ácido succínico pode ser produzido eficientemente pelo cultivo da bactéria corineforme assim obtida em um meio para produzir e acumular ácido succínico no meio e coletar ácido succínico do meio.

Com referência ao uso da bactéria mencionada acima em uma reação para produzir ácido succínico, a bactéria submetida à cultura em meio sólido inclinado tal como um meio de agar pode ser usada diretamente para a reação, mas pode-se usar preferivelmente uma bactéria obtida cultivando-se previamente a bactéria mencionada acima em um meio liquido (cultura semeada). 0 ácido succínico pode ser produzido permitindo-se que a bactéria obtida na cultura semeada reaja com um material orgânico enquanto a bactéria prolifera em um meio contendo a matéria prima orgânica. Além disso, o ácido succínico também pode ser produzido colhendo-se células bacterianas que proliferaram e, então, reagindo as células bacterianas com uma matéria prima orgânica em um líquido de reação contendo a matéria prima orgânica. Além disso, para fins de usar uma bactéria corineforme aeróbica no método da presente invenção, é preferível usar a bactéria corineforme para a reação após cultivar a bactéria sob condição aeróbica normal. 0 meio a ser usado para cultura pode ser qualquer meio usado normalmente para a cultura de microorganismos. Por exemplo, podem-se usar meios convencionais que podem ser preparados acrescentando-se fontes de nutrientes naturais como extrato de carne, extrato de levedura e peptona a uma composição feita de sais inorgânicos como sulfato de amônio, fosfato de potássio e sulfato de magnésio. No caso de colheita e uso das células bacterianas depois da cultura, as células bacterianas são colhidas por centrifugação, separação de membrana ou semelhante e, então, são usadas para a reação.

Na presente invenção, um produto tratado de células bacterianas também pode ser usado. Por exemplo, os produtos tratados de células bacterianas incluem células bacterianas imobilizadas que são imobilizadas em acrilamido, carrageenan ou semelhante, células bacterianas rompidas, o sobrenadante da centrifugação das mesmas, ou frações obtidas pela purificação parcial do sobrenadante com um tratamento com sulfato de amônio ou semelhante. A matéria prima orgânica a ser usada no método de produção da presente invenção não é particularmente limitada, desde que seja uma fonte de carbono que possa ser assimilada pelo microorganismo descrito no presente para produzir ácido succinico. Em geral, usa-se um carboidrato fermentável, inclusive um carboidrato como galactose, lactose, glicose, frutose, glicerol, sacarina, sacarose, amido e celulose; um poliálcool como glicerina, manitol, xilitol e ribitol. Entre todos esses, são preferíveis a glicose, frutose e glicerol e a glicose é especialmente preferível.

Além disso, também pode ser usado um líquido de amido sacarifiçado, melado ou semelhante, que contenha qualquer um dos carboidratos fermentáveis mencionados acima. Qualquer um daqueles carboidratos fermentáveis pode ser usado isoladamente ou em combinação. A concentração na qual a matéria prima orgânica mencionada acima é usada não é particularmente limitada, mas é vantajoso aumentar a concentração o máximo possível dentro do intervalo que não inibe a produção de ácido succinico. A reação geralmente é realizada na presença da matéria prima orgânica no intervalo de 5 a 301 (peso/volume), preferivelmente de 10 a 20% (p/v), A matéria prima orgânica pode ser adicionalmente acrescentada de acordo com a diminuição da matéria prima orgânica citada acima, à medida que a reação progride. 0 líquido de reação que contém a matéria prima orgânica não é partículamente limitado. 0 líquido de reação a ser usado pode ser água, tampão, meio ou semelhante, mas o meio é o mais preferível. 0 líquido de reação é preferivelmente um liquido que contenha uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e semelhantes. Aqui, a fonte de nitrogênio não é particularmente limitada, desde que possa ser assimilada pelo microorganismo descrito no presente para produzir ácido succínico. Exemplos específicos de fonte de nitrogênio incluem vários compostos de nitrogênio orgânico e inorgânico, tais como sais de amônio, nitrato, uréia, hidrolisado de soja, hidrolisado de caseína, peptona, extrato de levedura, extrato de carne e milhocina. Os exemplos de sais inorgânicos incluem vários tipos de saís de ácido fosfórico, sais de ácido sulfúrico, e sais metálicos de magnésio, potássio, manganês, ferro, zinco e semelhantes. Além disso podem ser acrescentados, se necessário, componentes que promovam o crescimento de células bacterianas, inclusive: vitaminas como a biotina, ácido pantotênico, inositol e ácido nicotínico; nucleotídeos, e aminoácidos. Mais ainda, é preferível que uma quantidade adequada de um agente anti-espuma disponível no mercado seja acrescentada ao líquido de reação para impedir a formação de espuma na hora da reação. 0 pH do líquido de reação pode ser ajustado com o acréscimo de carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, ou semelhante. 0 pH para a reação geralmente é de 5 a 10, preferivelmente de 6 a 9,5, portanto o pH da solução de reação é ajustado dentro do intervalo mencionado acima com um material alcalino, carbonato, uréia ou semelhante durante a reação, se isso for necessário.

Preferivelmente, o meio contém íon carbonato, ion bicarbonato ou gás de ácido carbônico (dióxido de carbono). 0 íon carbonato ou íon bicarbonato é fornecido por carbonato de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio ou bicarbonato de potássio, que também podem ser usados como agente neutralizador. No entanto, se necessário, o íon carbonato ou ion bicarbonato também podem ser fornecidos por ácido carbônico ou ácido bícarbônico, ou sais dos mesmos, ou gás de ácido carbônico. Exemplos específicos dos sais de ácido carbônico ou ácido bícarbônico incluem o carbonato de magnésio, carbonato de amônio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de amônio, bicarbonato de sódio e bicarbonato de potássio. Além disso, o íon carbonato ou íon bicarbonato é acrescentado em uma concentração de 0,001 a 5M, preferivelmente de 0,1 a 3 M e, mais preferivelmente, de 1 a 2 M. Quando o meio contém gás de ácido carbônico, a quantidade de gás de ácido carbônico a ser contida é de 50 mg a 25 g, preferivelmente de 100 mg a 15 g e, mais preferivelmente, de 150 irtg a 10 g por litro do líquido. A temperatura ótima em que a bactéria a ser usada na .reação cresce fica geralmente no intervalo de 25°C -a 35°C. Por outro lado, a temperatura na hora da reação geralmente fica no intervalo de 25°C a 40 °C, preferivelmente no intervalo de 30°C a 37°C. A quantidade de células j bacterianas a serem usadas na reação não é particularmente limitado, mas a quantidade é ajustada dentro do intervalo de 1 a 700 g/1, preferivelmente de 10 a 500 g/1, e mais preferivelmente de 20 a 400 g/1. 0 período de tempo da reação é preferivelmente de 1 a 168 horas, mais ) preferivelmente de 3 a'72 horas.

Para a cultura da bactéria, é necessário fornecer oxigênio por aeração e agitação. Por outro lado, a reação para produzir ácido succínico pode ser realizada com aeração e agitação, ou pode ser realizada em condição anaeróbica, sem aeração e sem suprimento de oxigênio. Aqui, o termo "condição anaeróbica" significa que a reação é conduzida enquanto se mantém baixo o oxigênio dissolvido no liquido. Nesse caso, é preferível conduzir a reação com um nível de oxigênio dissolvido de 0 a 2 ppm , preferivelmente de 0 a 1 ppm e, mais preferivelmente, de 0 a 0,5 ppm. Com essa finalidade, pode-se usar um método em que um recipiente é hermeticamente fechado para que a reação seja realizada sem aeração; um método em que um gás inerte como gás nitrogênio é fornecido para a realização da reação; um método em que a reação é realizada com aeração com um gás inerte contendo gás de ácido carbônico, e métodos semelhantes. O ácido succíníco acumulado no líquido de reação (solução de cultura) pode ser isolado do líquido de reação e purificado de acordo com um procedimento convencional. Especificamente, o ácido succíníco pode ser isolado e purificado removendo-se materiais sólidos, inclusive células bacterianas, através de centrifugação, filtração ou semelhantes, e dessalgando-se a solução com uma resina trocadora de íons ou semelhante, seguido por cristalização ou cromatografia de coluna da solução.

Na presente invenção, após a produção de ácido succíníco pelo método da presente invenção conforme i descrição acima, realiza-se uma reação de polimerizaçâo usando o ácido succíníco obtido como matéria prima para produzir um polímero contendo ácido succíníco. O polímero contendo ácido succíníco pode ser um homopolímero ou um copolímero cora outras matérias primas em forma de polímero. ) Nos últimos anos, os produtos industriais que respeitam o ambiente vêm aumentando e os polímeros preparados com matérias primas de origem vegetal têm atraído a atenção. 0 ácido succíníco a ser produzido na presente invenção pode ser processado em polímeros como políéster e poliamida e então usado. Exemplos específicos de polímeros contendo ácido succínico incluem um poliéster contendo ácido succínico obtido por meio da polimerização entre um diol, tal como butanodiol ou etileno glicol e ácido succínico e uma poliamida contendo ácido succínico obtida por meio da polimerização entre uma diamína como hexametilenodiamina e ácido succínico.

Além. disso, o ácido succínico ou uma composição contendo ácido succínico que pode ser obtida pelo método de produção da presente invenção podem ser usados como aditivos alimentares, produtos farmacêuticos, cosméticos e semelhantes.

Exemplos Doravante a presente invenção será descrita com maiores detalhes por meio de exemplos.

Exemplo 1 <1> Construção de um vetor cie rompimento carregando um gene de_ sacB J_A)_ Construção_ do pBS3 0 gene de sacB foi obtido por PCR usando-se um DNA cromossômico de Bacillus subtilis como lemplate e SEQ ID NOS: 1 e 2 como primeis. A PCR foi conduzida usando-se LA Taq (Takara Bio Inc.), de modo que foi realizado um ciclo de retenção térmica a 94°C por 5 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 49°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 2 minutos foi repetido 25 vezes. 0 produto da PCR assim obtido foi purificado por um procedimento convencional e então foi digerido com BglII e BamHI, e em seguida as extremidades ) foram aparadas. 0 fragmento foi inserido em um sítio de pHSG299 que havia sido digerido com Avall e cujas extremidades haviam sido aparadas. Células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e as células transformadas foram aplicadas era um meio LB contendo 25 pg/ml de canamicina (doravante abreviada como Km), seguido por cultura da noite para o dia. Subsequentemente, as colônias que apareceram foram colhidas e as colônias simples foram isoladas e desse modo foram obtidos transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo em que um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBS3. A Figura 1 mostra os procedimentos para a construção do pBS3, (B)_Construção dojoBS4S 0 sítio Smal na seqüência do gene de resistência à canamicina presente no pBS3 foi rompido por substituição de nucleotídeo mediada por PCR cruzada, sem causar nenhuma substituição de aminoácído para obter um plasmídeo. Prímeiramente, foi realizada PCR usando-se o pBS3 como um template e DNAs sintéticos de SEQ ID Nos: 3 e 4 como primers, e desse modo o produto ampliado da região N-termínal do gene de resistência à canamicina foi obtido. Por outro lado, para se obter o produto ampliado da região i C-terminal do gene de resistência à Km, foi realizada a PCR usando-se o pBS3 como template e DNAs sintéticos de SEQ ID Nos: 5 e 6 como primers. A PCR foi conduzida usando-se Polimerase de DNA Pyrobest (Takara Bio Inc.), de modo que foi realizado um ciclo de retenção térmica a 98°C por 5 ) minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 98°C por 10 segundos, com recozimento a 57°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 1 minuto foi repetido 25 vezes, rendendo dessa maneira um produto de PCR de interesse. As SEQ ID Nos: 4 e 5 são parcialmente complementares entre si ] e o sítio Smal na seqüência é rompido por substituição de nucleotídeo sem causar nenhuma substituição de aminoácído. Em seguida, para se obter um fragmento de um gene resistente à canamicina mutante em que o sítio Smal seja rompido, os produtos genéticos das regiões N-terminal e C- terminal do gene de resistência à canamicina mencionado acima foram misturados em uma concentração aproximadamente equimolar, e a PCR foi realizada usando-se a mistura dos produtos genéticos como templates e DNAs sintéticos de SEQ

I ID NOS: 3 e 6 como primers, produzindo assim o produto ampliado de um gene de resistência à Km introduzido por mutação. A PCR foi conduzida usando-se Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bío Inc.) de tal modo que foi realizado um cicio de retenção térmica a 98°C por 5 minutos e então um ciclo de desnaturação a 98 °C por 10 segundos, recozimento a 57°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 1,5 minuto foi repetido 25 vezes, rendendo assim um produto de PCR de interesse. 0 produto da PCR foi purificado por um procedimento convencional e então foi digerido com BanII, seguido de inserção no sítio BanII do pBS3 mencionado acima. Células competentes de Escherichía coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e as células transformadas foram aplicadas em um meio LB contendo 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura da noite para o dia. Subsequentemente as colônias que apareceram foram colhidas, e as colônias simples foram isoladas, sendo desse modo obtidos transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo no qual um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBS4S. A Figura 2 mostra os procedimentos para construção do pBS4S.

Exemplo 2 CConstrução de linhagem_com gene de ldh rompido> (A) Clonagem de um fragmento pararomper o gene de lactato deidrogenase Um fragmento de um gene de lactato deidrogenase (doravante abreviado como gene de ldh) derivado da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum cuja ORF foi suprimida foi obtido por PCR cruzada usando-se como primers DNAs sintéticos projetados -com base na seqüência de nucleotídeos (Ncgl12810, No. de Acesso no Banco de Dados GenBank NC_003450) do gene de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (No. de Acesso do Banco de Dados GenBank NC_Q03450), que já foi descrito. Isto é, a PCR foi conduzida por um procedimento convencional, usando-se um DNA crortiossômico da linhagem 2256 de Brevibacteríum lactofementum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID Nos: 7 e 8 como primers, e dessa maneira foi obtido o produto ampliado da região N-terminal do gene de ldh. Por outro lado, para se obter o produto ampliado da região C-terminal do gene de ldh, foi realizada PCR por um procedimento convencional usando-se um DNA genômico de Brevibacteríum lactofementum 2256 como template e DNAs sintéticos de SEQ 1D Nos: 9 e 10 como primers. As SEQ ID Nos: 8 e 9 são complementares uma à outra e têm estruturas para suprimir todas as seqüências de ORE do ldh. A linhagem 2256 de Brevibacteríum lactofementum está disponível através da American Type Culture Collection (ATCC) (Endereço: ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América).

Em seguida, para se obter um fragmento do gene de ldh cuja seqüência interna é suprimida, os acima citados produtos genéticos das regiões N-terminal e C-terminal do ldh foram misturados em uma concentração aproximadamente equimolar e realizou-se PCR por um procedimento convencional, usando-se a mistura de produtos genéticos como templates e DNAs sintéticos de SEQ ID Nos: 11 e 12 como primers, produzindo desse modo o produto ampliado do gene de ldh introduzido por mutação. O produto de PCR obtido dessa maneira foi purificado por um procedimento convencional e então foi digerido com Sall, seguido por inserção no sítio Sall do p]3S4S mencionado acima. Células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e as células transformadas foram aplicadas em um meio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 μς/ιηΐ de X-Gal e 25 pg/rril de Km, seguido por cultura da noite para o dia. Subseqüentemente, as colônias brancas que apareceram foram colhidas e as colônias simples foram isoladas, obtendo-se assim transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo no qual um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado phldh56-l. A Figura 3 mostra os procedimentos para a construção do plasmídeo. (B) Preparação de linhagem com ldh rompido 0 pAldh56-l obtido em (A) acima não contém uma região que possibilite a replicação autônoma em uma célula de uma bactéria corineforme. Portanto, quando uma bactéria corineforme é transformada com esse plasmídeo, uma linhagem em que o plasmídeo é integrado em um cromossomo por recombinação homóloga aparece com uma freqüência muito baixa como transformante. A linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum foi transformada usando-se uma alta concentração do plasmídeo pAldh56-l pelo método de pulso elétrico, e as células transformadas foram aplicadas em meio CM-Dex (5 g/L de glicose, 10 g/L de polípeptona, 10 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de KH2P04, 0,4 g/L de MgS04.7H20, 0,01 g/L de FeS047H20, 0,01 g/L de MnS047H20, 3 g/L de uréia, 1,2 g/L de hidrolisado de soja, pH 7,5 (KOH)) contendo 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Uma linhagem que cresceu nesse meio contém o gene de resistência à canamicina e o gene de sacB, que são derivados do plasmídeo no genoma, como resultado da recombinação homóloga entre o fragmento de gene de ldh no plasmídeo e o gene de ldh em um genoma da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum.

Em seguida, o recombinante cruzado simples foi cultivado a 31°C da noite para o dia em meio CM-Dex líquido não contendo canamicína e, após diluição adequada, foi aplicado em meio Dex-SlO contendo 101 de sacarose (100 g/L de sacarose, 10 g/L de polipeptona, 10 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,4 g/L de MgSCV/LLO, 0,01 g/L de FeSCqlfhO, 0,01 g/L de MnSChTKbO, 3 g/L de uréia, 1,2 g/L de hidrolisado de soja, 10 pg/L de biotina, pH 7,5 (KOH)) não contendo canamicína, seguido por cultura a 31,5DC por cerca de 30 horas. Como resultado, foram obtidas cerca"de 50 linhagens, que foram consideradas como tendo se tornado insensíveis à sacarose devido à eliminação do gene de sacB pela segunda recombínação homóloga.

As linhagens assim obtidas incluem: uma linhagem em que 0 gene de Idh foi substituído pelo tipo mutante derivado de pAldh56~l, e uma linhagem em que 0 gene de ldh reverteu ao tipo selvagem. Pode-se verificar facilmente se 0 gene de ldh é do tipo mutante ou do tipo selvagem, submetendo-se diretamente as linhagens bacterianas obtidas por cultura em meio de agar Dex-SIQ à PCR e detectando-se seu gene de ldh. Na análise PCR realizada usando-se prímers (SEQ ID NOS: 7 e 10) para ampliar 0 gene de ldh, uma linhagem que produziu um produto de PCR de tamanho menor do que 0 do produto obtido pela PCR realizada usando-se um DNA croraossômico da linhagem 2256 como template foi definida como uma linhagem de ldh rompido e usada nos experimentos abaixo. Como resultado da análise das linhagens insensíveis à sacarose pelo método mencionado acima, uma linhagem carregando apenas 0 gene do tipo mutante foi selecionada e denominada linhagem 2256A(ldb). Além disso, a linhagem foi usada como linhagem genítora para modificação nos exemplos seguintes Exemplo 3 <Construção de linhagem com gene de piruvato oxidase rompido> (A) Clonagem de um fragmento para romper 0 gene de piruvato oxidase Um fragmento de um gene de piruvato oxídase (doravante abreviado como gene de poxB) da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum cuja ORF foi suprimida foi obtido por PCR cruzada usando-se como primers DNAs sintéticos projetados com base na seqüência de nucleotídeos do gene de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NCgl2521 de Número de Acesso ao Banco de Dados GenBank NC_003450), que já foi descrito. Isto é, a PCR foi conduzida usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 29 e 30 como primers, obtendo-se dessa maneira um produto ampliado da região N-term.inal do gene de poxB.

Por outro lado, para se obter o produto ampliado da região C-terminal do gene de poxB, foi realizada PCR usando-se um DNA genômico de Brevibacterium lactofermentum 2256 como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 31 e 32 como primers. SEQ ID NOS: 30 e 31 são complementares entre si. A PCR foi conduzida usando-se KOD-plus (TOYOBO) de tal modo que um ciclo de retenção térmica a 94°C por 2 minutos foi realizado e então, um ciclo de desnaturação a 94 °C por 10. segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 40 segundos foi repetido 30 vezes, para as regiões N-terminal e C-terminal. Em seguida, para se obter um fragmento do gene de poxB cuja seqüência interna é suprimida, os produtos ampliados acima mencionados das regiões N-terminal e C-terminal do poxB foram misturados em uma concentração aproximadamente equimolar e a PCR foi conduzida usando-se a mistura dos produtos genéticos como templ.at.es e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 33 e 34 como primers, produzindo assim o produto ampliado de um gene de poxB introduzido por mutação. A PCR foi realizada usando-se KOD-plus(TOYOBO) de modo que foi realizado um ciclo de retenção térmica de 94°C por 2 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 70 segundos foi repetido 30 vezes, produzindo assim um produto ampliado do gene de poxB de interesse introduzido por mutação. O produto de PCR obtido dessa maneira foi purificado por um procedimento convencional e, então, foi digerido com Xbal, seguido por inserção no sítio Xbal do pBS4S construído no Exemplo 1 (B) acima. Células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e as células transformadas foram aplicadas em um meio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura da noite para o dia. Subseqüentemente, as colônias brancas que apareceram foram colhidas, e as colônias simples foram isoladas, e desse modo foram obtidos transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo no qual um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBS4S::ΔροχΒ. A Figura 4 mostra os procedimentos para a construção do pBS4S::ΔροχΒ. (B) Preparação de linhagem com poxB rompido O pBS4S::ΔροχΒ obtido em (A) acima não contém uma região que possibilite a replicaçâo autônoma em uma célula de uma bactéria corineforme. Portanto, quando uma bactéria corineforme é transformada com o plasmídeo, a linhagem em que o plasmídeo é integrado em um cromossomo por recombínação homóloga aparece com uma freqüência muito baixa como um transformante. A linhagem 2256A(ldh) preparada no Exemplo 2fo.i transformada usando-se uma alta concentração do plasmídeo pBS4S::ΔροχΒ pelo método de pulso elétrico e, então, foi aplicada em meio CM-Dex contendo 25 μρ/ιηΐ de canamicina, seguido por cultura a 31,50C por cerca de 30 horas. A linhagem que cresceu no meio contém um gene resistente à canamicina e um gene de sacB, que são derivados do plasmídeo no genoma, como resultado de recombinaçâo homóloga entre o fragmento de gene poxB no plasmídeo e o gene poxB em um genoma da linhagem 22 56Δ(ldh) de Brevibacteríum lactof ementam.

Em seguida, o recombinante cruzado simples foi cultivado a 31,5°C da noite para o dia em meio liquido CM-Dex não contendo canamicina e então, após diluição adequada, foi aplicado em meio Dex-SlO contendo 10% de sacarose e não contendo canamicina, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas.

Como resultado, foram obtidas cerca de 30 linhagens que foram consideradas como tendo se tornado insensíveis à sacarose devido à eliminação do gene de sacB pela segunda recombinaçâo homóloga.

As linhagens assim obtidas incluem: uma linhagem em que o gene de poxB foi substituído pelo tipo mutante derivado de pBS4S:: ΔροχΒ, e uma linhagem em que o gene de poxB reverteu ao tipo selvagem, lí possível verificar facilmente se o gene de poxB é do tipo mutante ou do tipo selvagem submetendo-se a linhagem bacteriana obtida por cultura em meio de agar Dex-SlO diretamente à PCR e detectando-se o gene de poxB. A análise do gene de poxB usando prímers (SEQ ID NOS: 29 e 32) para ampliação por PCR deve resultar em um fragmento de DNA de 2,4 kb para o tipo selvagem, e um fragmento de DNA de 1,2 kb para o tipo mutante que tem a região suprimida. Como resultado da análise da linhagem insensível à sacarose pelo método mencionado acima, uma linhagem que carrega apenas o gene do tipo mutante foi selecionada e denominada 2.256Δ (ldh,poxB) . Neste documento, a linhagem também é chamada de linhagem com poxB rompido.

Exemplo 4 <Produção de ácido succínico pela linhagem com poxB rompido A) Avaliação da cultura da linhagem com poxB rompido A linhagem 2256Δ(ldh) e a linhagem 2256A(ldh, poxB) foram usadas para cultura para a produção de ácido succínico conforme descrição abaixo. As células bacterianas da linhagem 2 2 5 6Δ(ldh) e da linhagem 2256A(ldh, poxB) obtidas por cultivo em um meio CM-Dex em placa foram inoculadas em 3 ml de um meio de cultura semeada (20 g/L de glicose, 4g/L de uréia, 14 g/L de (NH4)2S04, 0,5 g/L de KH2P04, 0,5 g/L de K2iIP04, 0,5 g/L de MgS04 7H20, 0, 02 g/L de FeS04 7H20, 0,02 g/L de MnS04 7H20, 200 gg/L de biotina, 200 pg/L de VBiHCl., 1 g/L de extrato de levedura, e 1 g/L de ácido casamino: sem ajuste de pl-l; foi adicionada glicose depois de ser esterilizada independentemente). A cultura foi realizada com agitação em um tubo de teste a 31,5°C por cerca de 16 horas sob condição aeróbica.μΔ Depois disso, foram acrescentados ao tubo 3 ml de um meio principal A (100 g/L de glicose, 15 g/L de (sulfeto de sódio e 71,4 g/L de MgC03) . Para impedir aeração, a cultura para produção do ácido succínico foi realizada com o tubo hermeticamente fechado com uma tampa de silicone. A cultura foi realizada com agitação a 31,5°C por cerca de 48 horas e foi terminada antes que o açúcar contido no meio se esgotasse.

Após a conclusão da cultura, as quantidades acumuladas de ácido succínico e do produto secundário ácido acético no meio foram analisadas por cromatografia liquida depois que o meio havia sido adequadamente diluído. Foi usada uma coluna obtida conectando-se duas peças de Shím-pack. SCR-102H (Shimadzu) em série e a amostra foi eluída a 40°C usando-se 5 mM de ácido p-tolueno sulfôníco. O eluenfe foi neutralizado usando-se 20 mM de solução aquosa Bis-Tris contendo 5 mM de ácido p-tolueno sulfôníco e 100 μΜ de EDTA. O ácido succínico e o ácido acético foram medidos determinando-se a condutividade elétrica por meio de CDD- 10AD (Shimadzu). Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 1 e na Figura 5.

No caso da linhagem 2256Δ (ldh, poxB), a produção de ácido succínico foi igual à da linhagem genitora 2256Δ(ldh) , mas a proporção de ácido acético era relação ao ácido succínico foi de cerca de um terço para dois terços da linhagem 2256A(ldh, poxB). Esses resultados indicaram que eliminar ou diminuir a atividade de poxB é eficaz para reduzir o ácido acético sob condições anaeróbicas.

Tabela 1. Produção de _ácido succínico, ácido acético e ácido pirúvico pela linhagem com poxB rompido Exemplo 5 <Construção de linhagem com poxB, pta, ack rompidos e linhagem com poxB, pta, ach rompidos> (5-1) <Construção de linhagem com gene de acetato quinase rompído> (A) Clonagem de um fragmento para romper gene de acetato quinase Um fragmento de um gene de acetato quinase (doravante abreviado como ack) derivado da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum cuja ORF foi suprimida foi obtido por PCR cruzada usando-se como primers DNAs sintéticos projetados com base na seqüência de nucleotídeos do gene de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NCgl 2656 de No. de Acesso do Banco de Dados GenBank NC_003450; SEQ ID NO: 45), que já foi descrito). Isto é, a PCR foi conduzida usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID Nos: 13 e 14 como prímers, e dessa maneira foi obtido o produto ampliado da região N-terminal do gene de ack. Por outro lado, para se obter o produto ampliado da região C-terminal do gene de ack, foi realizada PCR usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID Nos: 15 e 16 como primers. As SEQ ID Nos: 14 e 15 são parcialmente complementares entre si. A PCR foi realizada usando-se KOD-plus (TOYOBO) de modo que um ciclo de retenção térmica a 94 °C por 2 minutos foi realizado e, então, para a região N-terminal, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 30 segundos e, para a região C-terminal, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68 °C por 2 minutos foram repetidos 30 vezes, respectivamente.

Em seguida, para se obter um fragmento do gene de ack em que sua seqüência interna é suprimida, os acima citados produtos genéticos das regiões N-terminal e C-terminal de ack foram misturados em uma concentração aproximadamente equimoiar, e a PCR foi realizada usando-se a mistura dos produtos genéticos como templates e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 17 e 18 como primers para, dessa maneira, produzir o produto ampliado de um gene de ack introduzido por mutação. A PCR foi realizada usando-se KOD-plus (TOYOBO) de tal modo que foi realizado um ciclo de retenção térmica a 94°C por 2 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos, e alongamento a 68°C por 2,5 minutos foi repetido 30 vezes, produzindo desse modo um produto ampliado do gene de ack de interesse introduzido por mutação. O produto da PCR obtido foi purificado por um procedimento convencional e, então, foi digerido com Xbal, seguido por inserção no sítio Xbal do pBSST construído no exemplo 1 (C) mencionado acima. Células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e aplicadas em um meio LB contendo 100 μΜ de TPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 μς/ιηΐ de canamicina, seguida por cultura da noite para o dia. Subseqüentemente, as colônias brancas que apareceram foram colhidas e as colônias simples foram isoladas e, desse modo, foram obtidos transformantes. Os plasmídeos foram ) extraídos dos transformantes e um plasmídeo no qual um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBS5T::Aack. A Figura 6 mostra os procedimentos para a construção do pBS5T::Aack. (B) Preparação de linhagem com ack rompido ) A origem de replicação para as bactérias corineformes no pBS5T:;Aack obtido em (A) acima é sensível à temperatura. Isto é, o plasmídeo é autonomamente replicável em uma célula de uma bactéria corineforme a 25°C, mas não é autonomamente replicável a 31,5°C (ou 34°C). A linhagem 225 6Δ(ldh) de Brevíbacterium lactofermentum foi transformada usando-se o plasmideo pelo método de pulso elétrico, e aplicada em um meio CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura a 25°C por 2 noites. As colônias que apareceram foram isoladas para, desse modo, produzir transformantes. Os transformantes contêm o plasmideo. Os transformantes foram cultivados a 34°C da noite para o dia em um meio liquido CM-Dex não contendo canamicina e então, após diluição adequada, foram aplicados em um meio líquido CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura a 34°C por cerca de 30 horas. A linhagem que cresceu no meio contém o gene de resistência à canamicina e um gene de sacB, que derivam do plasmideo no genoma, como resultado de recombinaçâo homóloga entre o fragmento de gene de ack. no plasmideo e o gene de ack no genoma da linhagem 2256A(ldh) de Brevíbacterium lactofermentum.

Em seguida, o recombinante cruzado simples foi cultivado a 31,5°C da noite para o dia em meio líquido CM-Dex não contendo canamicina e, após diluição adequada, foi aplicado em meio Dex-SlO contendo 10% de sacarose e não contendo canamicina, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Como resultado, foram obtidas cerca de 50 linhagens, que foram consideradas como tendo se tornado > insensíveis à sacarose devido à eliminação do gene de sacB pela segunda recombinaçâo homóloga.

As linhagens obtidas dessa maneira incluem: uma linhagem na qual o gene de ack foi substituído pelo tipo mutante derivado de pBS5T::Aack, e uma linhagem na qual o ) gene de ack reverteu ao tipo selvagem. É possível verificar facilmente se o gene de ack é do tipo mutante ou do tipo selvagem, submetendo-se diretamente à PCR uma linhagem bacteriana obtida através de cultura em um meio de agar Dex-SlO e detectando-se o gene de ack. A análise do gene de ack usando prímers (SEQ ID NOS: 13 e 16) para ampliação de PCR deve resultar em um fragmento de DNA de 3,7 kb para o tipo selvagem e um fragmento de DNA de 2,5 kb para o tipo mutante tendo uma região suprimida. Como resultado da análise da linhagem insensível à sacarose pelo método citado acima, uma linhagem carregando apenas o gene do tipo mutante foi selecionada e denominada 2256Δ(ldh, ack) . (5-2) <Construção de linhagem com gene de acetato quinase e gene de fosfotransacetilase rompidos> (A) Clonagem de fragmentos para romper gene de acetato quinajqe e_ gene de_ fosfotransacetilase As ORFs do gene de acetato quinase (ack) e gene de fosfotransacetilase (doravante denominado pia) da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum têm uma estrutura de operon, e ambas as ORFs podem se tornar deficientes simultaneamente. Esses fragmentos de genes foram obtidos por PCR cruzada usando como prímers DNAs sintéticos projetados com base nas seqüências de nucleotideos dos genes de Corynebacteriim glutamicum ATCC13032 (NCgl2656 e 2657 do No. de Acesso ao Banco de Dados GenBank NCJ303450; SEQ ID NO; 45), que já foram descritos. Isto é, a PCR foi conduzida usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template, e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 19 e 20 como prímers, produzindo desse modo um produto ampliado da região N-terminal do gene de pta. Por outro lado, para produzir um produto ampliado da região C-terminal do gene de ack, foi realizada PCR usando um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como templa te, e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 21 e 16 como prímers. As SEQ ID NOS: 20 e 21 são parcialmente complementares entre si. A PCR foi realizada usando-se KOD-plus (TOYOBO) de modo que um ciclo de retenção térmica a 94°C por 2 minutos foi realizado e, então, para a região N-terminal, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 30 segundos e, para a região C-terminal, um ciclo de desnaluração a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 2 minutos foram repetidos 30 vezes, respectivamente.

Em seguida, para se obter um fragmento do gene de pta-ack era que uma sequência interna em pta e ack é suprimida, os produtos genéticos das acima citadas região N-te.rminal de pta e região C-terminal de ack foram misturados em uma concentração aproximadamente equimolar, e a PCR foi realizada usando-se a mistura como templates e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 22 e 18 como prímers para, dessa maneira, produzir o produto ampliado de um gene de pta-ack introduzido por mutação. A PCR foi .realizada usando-se KOD-plus (TOYOBO) de tal modo que foi realizado um ciclo de retenção térmica a 94°C por 2 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos, e alongamento a 68°C por 2,5 minutos foi repetido 30 vezes, produzindo desse modo um produto ampliado do gene de pta-ack de interesse introduzido por mutação. O produto da PCR obtido dessa maneira foi purificado por um procedimento convencional e, então, foi digerido com Xbal, seguido por inserção no sítio Xbal do pBSST. Células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e aplicadas em um meio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 pg/ml. de X-Gal e 2.5 pg/ml de canamicina, seguida por cultura da noite para o dia. Subseqüenlemenie, as colônias brancas que apareceram foram colhidas e as colônias simples foram isoladas e, desse modo, foram obtidos transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo no qual um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBSST::Apta-ack. A Figura 7 mostra os procedimentos para a construção do pBS5T::Apta-ack. (B) Preparação de linhagem com pta-ack rompido A origem de replicação para as bactérias corineformes no pBS5T::Apta-ack obtido em (A) acima é sensível à temperatura. Isto é, o plasmídeo é autonomamente replicável em uma célula de uma bactéria corineforme a 25°C, mas não é autonomamente replicável. a 31,5°C (ou 34°C) . A linhagem 225 6Δ(ldh) de Brevibacteríum lactofermentum foi transformada usando-se o plasmídeo, pelo método de pulso elétrico e aplicada em um meio CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamícina, seguido por cultura a 25°C por 2 noites. As colônias que apareceram foram isoladas, produzindo desse modo transformantes. Os transformantes têm o plasmídeo. Os transformantes foram cultivados a 34°C da noite para o dia em um meio líquido CM-Dex não contendo canamícina e então, após diluição adequada, foram aplicados em um meio líquido CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamícina, seguido por cultura a 34°C por cerca de 30 horas. A linhagem que cresceu no meio contém o gene de resistência à canamícina e o gene de sacB, os quais são derivados do plasmídeo no genoma, como resultado de recombinaçao homóloga entre o fragmento de gene de pta-ack no plasmídeo e o gene de pta-ack em um genoma da linhagem 2256A(ldh) de Brevibacteríum lactofermentum.

Em seguida, o recombinante cruzado simples foi cultivado a 31,5°C da noite para o dia em meio líquido CM-Dex não contendo canamícina e, após diluição adequada, foi aplicado em meio Dex-SlO contendo 10¾ de sacarose e não contendo canamícina, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Como resultado, foram obtidas cerca de 50 linhagens, que foram consideradas como tendo se tornado insensíveis à sacarose devido à eliminação do gene de sacB pela segunda recombinaçao homóloga.

As linhagens obtidas dessa maneira incluem: uma linhagem na qual os genes de pta e ack foram substituídos pelo tipo mutante derivado de pBS5T::Apta-ack, e uma linhagem na qual os genes de pta e ack reverteram ao tipo selvagem. É possível verificar facilmente se o gene de pta-ack é do tipo mutante ou do tipo selvagem, submetendo-se diretamente à PCR uma linhagem bacleriana obtida através de cultura em um meio de agar Dex-SlO e detectando-se os genes de pta e ack. A análise do gene de pta-ack usando prímers (SEQ ID NOS: 19 e 16) para ampliação de PCR deve resultar em um fragmento de DNA de 5,0 kb para o tipo selvagem e um fragmento de DNA de 2,7 kb para o tipo mutante tendo uma região suprimida.

Como resultado da análise das linhagens insensíveis à sacarose pelo método citado acima, uma linhagem carregando apenas o gene do tipo mutante foi selecionada e denominada 2256A(ldh, pta, ack). (5-3) <Construção d_e_1 inhagem com gene de acetato quinase, gene de fosfotran saceti1ase e gene de piruvato oxidase rompidosí (A) Clonagem de um_fragmen_to_ para romper o gene de piruvato oxidase Um fragmento de gene de piruvato oxidase (doravante abreviado para poxB) da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum cuja ORF foi suprimida foi obtido por PCR cruzada usando-se como prímers DNAs sintéticos projetados com base na seqüência de nucleotídeos do gene de Corynebacterium çlutamicum ATCC13032 (NCgl2521 do No. de Acesso no Banco de Dados GenBank NC_003450, SEQ ID NO:48), que já foi descrito. Isto é, a PCR foi realizada usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 23 e 24 como prímers, obtendo-se desse modo um produto ampliado da região N-terminal do gene de poxB.

Por outro lado, para se obter o produto ampliado da região C-terminal do gene de poxB, a PCR foi realizada usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 25 e 26 como prímers. As SEQ ID NOS: 2.4 e 25 são complementares entre si. A PCR foi conduzida usando-se KOD-plus (TOYOBO) de tal modo que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 94 °C por 2 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68 °C por 40 segundos foi repetido 30 vezes para ambas as regiões N-termmal e C-terminal. Em seguida, para se obter um fragmento do gene de poxB cuja sequência interna é suprimida, os acima citados produtos genéticos das regiões N-terminal e C-terminal do poxB foram misturados em uma concentração aproximadamente equimolar e a PCR foi conduzida usando-se a mistura como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 27 e 28 como prímers, produzindo, desse modo, o produto ampliado de um gene de poxB introduzido por mutação. A PCR foi conduzida usando-se KOD-plus (TOYOBO) de tal modo que foi realizado um ciclo de retenção térmica a 94°C por 2 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 70 segundos foi repetido 30 vezes, produzindo, dessa forma, um produto ampliado do gene de poxB de interesse introduzido por mutação. O produto de PCR assim obtido foi purificado por um procedimento convencional e, então, digerido com Xbal, seguido por inserção no sitio Xbal do pBS5T construído no Exemplo 1 (C) mencionado acima. Células competentes de Escherichía coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e aplicadas em um meio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal, e 25 pg/ml de canamicína, seguido por cultura da noite para o dia. Subseqüentemente, as colônias brancas que apareceram foram colhidas e as colônias simples foram isoladas e, desse modo, foram obtidos transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo no qual um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBS5T::ΔροχΒ. A Figura 8 mostra os procedimentos para a construção do pBS5T::ΔροχΒ. (B) Preparação de J. 1n hagem com poxB rompido A origem de replicação para as bactérias corineformes no pBS5T::ApoxB obtido no Exemplo 5 (A) mencionado acima é sensível à temperatura. Isto é, o plasmídeo é autonomamente replicável em uma célula de uma bactéria corineforme a 25°C, mas não é autonomamente replicável a 31,5°C (ou 34°C). A linhagem 2256A(ldh, pta, ack) de Brevibacteríum lactofermentum foi transformada usando-se o plasmídeo, pelo método de pulso elétrico, e então foi aplicada em um meio CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura a 25 °C por 2 noites. As colônias que apareceram foram isoladas, desse modo produzindo transformantes. Os transformantes devem ter o plasmídeo.

Os transformantes foram cultivados a 34°C da noite para o dia em um meio liquido CM-Dex não contendo canamicina e, após diluição adequada, foram aplicados em um meio líquido CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura a 34 °C por cerca de 30 horas. Na linhagem que cresceu no meio, o gene de resistência à canamicina e o gene de sacB, os quais são derivados do plasmídeo, são inseridos no genoma, como resultado de recombinação homóloga entre o fragmento de gene de poxB no plasmídeo e o gene de poxB no genoma da linhagem 2256Δ(ldh, pta, ack) de Brevibacteríum lactofermentum.

Em seguida, o recombinante cruzado' simples foi cultivado a 31,5°C da noite para o dia em meio líquido CM-Dex não contendo canamicina e, após diluição adequada, foi aplicado em meio Dex-SlO contendo 10% de sacarose e não contendo canamicína, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Como resultado, foram obtidas cerca de 50 linhagens, que foram consideradas como tendo se tornado insensíveis à sacarose devido à eliminação do gene de sacB pela segunda recombinação homóloga.

As linhagens assim obtidas incluem: uma linhagem em que o gene de poxB fo.i substituído pelo tipo mutante derivado de pBS5T: :ΔροχΒ, e uma linhagem em que o gene de poxB reverteu ao tipo selvagem. Pode-se verificar facilmente se o gene de poxB é do tipo mutante ou do tipo selvagem, submetendo-se uma linhagem bacteriana obtida através de cultura em um meio de agar Dex-SlO diretamente à PCR e detectando-se o gene de poxB. Analisando-se o gene de poxB usando primers (SEQ ID NOs: 23 e 26) para ampliação por PCR, um fragmento de DMA de 2,4 kg para o tipo selvagem e um fragmento de DNA de 1,2 kb para o tipo mutante tendo a região suprimida podem ser detectados Como resultado da análise da linhagem .insensível à sacarose pelo método mencionado acima, uma linhagem carregando apenas o gene do tipo mutante foi selecionada e denominada 2256A(ldh, pta, ack, poxB). A linhagem também é chamada, no presente documento, linhagem com pta, ack, poxB rompidos. (5-4)CConstrução de linhagem com genes de poxB, pta, ack, ach rompidos> (A) Clonagem de um Jrragmento para .romper o gene de acetil- CoA hidrolase Um fragmento de gene de acetil-CoA hidrolase (doravante aqui abreviado como ach) da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum cuja ORF foi suprimida foi obtido por PCR cruzada usando-se como primers DNAs sintéticos projetados com base na seqüência de nucleotídeos do gene de Corynebacterium glutamícum ATCC13032 (NCgl 2480 de No. de Acesso ao Banco de Dados GenBank NC_003450; SEQ ID NO:50), que já foi descrito. Isto é, a PCR foi realizada usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 35 e 36 como primers, obtendo-se desse modo um produto ampliado da região C-terminal do gene de ach. Por outro lado, para se obter o produto ampliado da região N-terminal do gene de ach, a PCR foi realizada usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 37 e 38 como primers. As SEQ ID NOS: 36 e 37 são complementares entre si. A PCR foi conduzida usando-se KOD-plus (TOYOBO) de tal modo que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 94 °C por 2 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimervto a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 50 segundos foi repetido 30 vezes para a região N-terminal e região C-terminal, Em seguida, para se obter um fragmento do gene de ach em que uma seqüência interna é suprimida, os acima citados produtos genéticos das regiões N-terminal e C-terminal do ach foram misturados em uma concentração aproximadamente equimolar, e realizou-se PCR usando a mistura como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 39 e 40 como primers, produzindo assim o produto ampliado de um gene de ach introduzido por mutação. A PCR foi realizada usando-se KOD-plus(TOYOBO) de tal modo que foi realizado um cicio de retenção térmica a 94°C por 2 minutos e, então um ciclo de desnaturação a 94 °C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 90 segundos foi repetido 30 vezes, produzindo dessa maneira um produto ampliado do gene de ach de interesse introduzido por mutação. O produto de PCR obtido desse modo foi purificado por um procedimento convencional e digerido com Xbal, seguido de inserção no sítio Xbal do pBS4S construído no Exemplo 1 (B) mencionado acima. Células competentes de Escherichia colí JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e foram aplicadas em um meio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal, e 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura da noite para o dia. Subseqüentemente, as colônias brancas que apareceram foram colhidas e as colônias simples foram isoladas, e desse modo foram obtidos transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo em que um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBS4S::Aach. A Figura 9 mostra os procedimentos para construção do pBS4S::Aach. (B) Preparação de linhagem com ach rompido 0 pBS4S::ãach obtido em (A) acima não inclui uma região que possibilite a replícação autônoma em uma célula de uma bactéria corineforme, portanto quando uma bactéria corineforme é transformada com o plasmídeo, uma linhagem na qual o plasmídeo é integrado em um cromossomo por recombinaçâo homóloga aparece com uma freqüência muito baixa como um transformante. A linhagem 2256é(ldh, pta, ack, poxB), e a linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum foram transformadas usando-se uma alta concentração do plasmídeo pBS4S::hach pelo método de pulso elétrico e aplicadas em um meio CM-Dex contendo 25 μς/πιΐ de canamicina, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Nas linhagens que cresceram no meio, um gene de resistência à canamicina e um gene de sacB derivados do plasmídeo são inseridos no genoma como um resultado de recombinaçâo homóloga entre o fragmento de gene de ach no plasmídeo e o gene de ach num genoma de cada uma das linhagens 2256Δ(ldh), 2256Δ(ldh, pta, ack), 2256h(ldh, pta, ack, poxB) e 2256Δ (ldh, pta, ack, poxB, acp) de Brevíbacterium lactofermentum.

Em seguida o recombinante cruzado simples foi cultivado a 31,5°C da noite para o dia em meio CM-Dex líquido não contendo canamicina e, após diluição adequada, foi aplicado em meio Dex-SlO contendo 10¾ de sacarose e não contendo canamicina, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Como resultado, foram obtidas cerca de 50 linhagens, que foram consideradas como tendo se tornado insensíveis à sacarose devido à eliminação do gene de sacB pela segunda recombinação homóloga.

As linhagens assim obtidas incluem: uma linhagem na qual o gene de ach foi substituído pelo tipo mutante derivado do pBS4S: :Aach, e uma linhagem na qual o gene de ach reverteu ao tipo selvagem. Pode-se verificar facilmente se o gene de ach é do tipo mutante ou do tipo selvagem, submetendo-se uma linhagem bacteriana obtida através de cultura em um meio de agar Dex-SlO diretamente à PCR e detectando-se o gene de ach. A análise do gene de ach usando primers (SEQ ID NOS: 35 e 38) para ampliação por PCR deve resultar em um fragmento de DNA de 2,9 kb para o tipo selvagem e um fragmento de DNA de 1,4 kb para o tipo mutante que tem a região suprimida. Como resultado da análise da linhagem insensível à sacarose pelo método citado acima, uma linhagem carregando apenas o gene do tipo mutante foi selecionada e a linhagem obtida a partir de 2256A(ldh, pta, ack, poxB) foi denominada linhagem 2256Δ(ldh, pta, ack, poxB, acp). A linhagem também é chamada aqui de uma linhagem com ach, pta, ack e poxB rompidos.

Exemplo 6 cConstrução de linhagem com _g_en_e de acilfosfatase rompido> (A) Clonagem de um fragmento para romper o gene de acilfosfatase Um fragmento de um gene de acilfosfatase (doravante aqui denominado acp) da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum cuja ORF foi suprimida foi obtido por PCR cruzada usando-se como primers DNAs sintéticos projetados com base em uma seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 52), que foi obtida como uma seqüência que tem alta homología com o gene de acp de Mycobacterium tubérculos a partir de uma procura em uma seqüência da linhagem ATCC13869 de Brevibacterium lactofermentum conforme identificação por análise genômica. Isto é, foi realizada PCR usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID Nos: 54 e 55 como primers, e desse modo um produto ampliado da região Oterminal do gene de acp foi obtido. Por outro lado, para se obter o produto ampliado da região N-terminal do gene de acp, foi realizada PCR usando-se um DNA genômico da linhagem 2256 de Brevibacterium lactofermentum como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 56 e 57 como primers. SEQ ID NOS: 55 e 56 são complementares entre si. A PCR foi conduzida usando-se KOD-plus (TOYOBO) de tal modo que um ciclo de retenção térmica a 94°C por 2 minutos foi realizado e então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 35 segundos foi repetido 30 vezes, para as regiões N-terminal e C-terminal. Em seguida, para se obter um fragmento do gene de acp com supressão de uma seqüência interna, os produtos ampliados mencionados acima das regiões N-terminal e C-terminal do acp foram misturados em uma concentração aproximadamente equímolar e a PCR foi conduzida usando-se a mistura como template e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 58 e 59 como primers, produzindo assim o produto ampliado de um gene de poxB introduzido por mutação. A PCR foi realizada usando-se KOD-plus(TOYOBO) de modo que foi realizado um ciclo de retenção térmica de 94°C por 2 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 68°C por 60 segundos foi repetido 30 vezes, produzindo assim um produto ampliado do gene de acp de interesse introduzido por mutação. 0 produto de PCR obtido dessa maneira foi purificado por um procedimento convencional e, então, foi digerido com Xbal, seguido por inserção no sitio Xbal do pBS5T construído no Exemplo 1 (C) mencionado acima. Células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) foram usadas para transformação com esse DNA e aplicadas em ura meio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 μρ/πιΐ de canamicina, seguido por cultura da noite para o dia. Subsequentemente, as colônias brancas que apareceram foram colhidas, e as colônias simples foram isoladas, e desse modo foram obtidos transfonnantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um plasmídeo no qual um produto de PCR de interesse foi inserido foi denominado pBS5T::ãacp. A Figura 10 mostra os procedimentos para a construção do pBS5T::Aacp. (B)_Preparação de linhagem com acp rompido O pBS5T::Aacp obtido em (A) mencionado acima não inclui uma região que possibilite a replicação autônoma em uma célula de uma bactéria corínefome, assim, quando uma bactéria corineforme é transformada com o plasmídeo, unia linhagem na qual o plasmídeo é integrado em um cromossomo por recombinaçao homóloga aparece com uma freqüência muito baixa como um transformante. A linhagem 2256ã(ldh, pta, ack, poxB) de Brevibacterium lactofermentam foi transformada usando-se uma alta concentração do plasmídeo pBS5T::Aacp pelo método de pulso elétrico e aplicada em meio CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamicina, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Na linhagem que cresceu no meio, o gene resistente à canamicina e o gene de sacB derivados do plasmídeo são inseridos no genoma, como resultado de recombinaçao homóloga entre o fragmento de gene de acp no plasmídeo e o gene de acp em um genoma da linhagem 2 2 5 6Δ(Idh, pta, ack, poxB) de Brevibacterium lactofermentam.

Em seguida, o recombinante cruzado simples foi cultivado a 31,5°C da noite para o dia em meio liquido CM-Dex não contendo canamicína e, após diluição adequada, foi aplicado em meio Dex-SlO contendo 10% de sacarose e não contendo canamicína, seguido por cultura a 31,5°C por cerca de 30 horas. Como resultado, foram obtidas cerca de 50 linhagens que foram consideradas como tendo se tornado insensíveis à sacarose devido à eliminação do gene de sacB pela segunda recombinaçâo homóloga.

As linhagens assim obtidas incluem: uma linhagem em que o gene de acp foi substituído pelo tipo mutante derivado de pBS5T::ãacp,e uma linhagem em que o gene de acp reverteu ao tipo selvagem. É possível verificar facilmente se o gene de acp é do tipo mutante ou do tipo selvagem, submetendo-se a linhagem bacteriana obtida por cultura em meio de agar Dex-SlO diretamente à PCR e detectando-se o gene de acp. A análise do gene de acp usando prímers (SEQ ID NOS: 54 e 57) para ampliação por PCR deve resultar em um fragmento de DNA de 1,3 kb para o tipo selvagem, e um fragmento de DNA de 1,0 kb para o tipo mutante que tem a região suprimida. Como resultado da análise da linhagem insensível à sacarose pelo método mencionado acima, uma linhagem que carrega apenas o gene do tipo mutante foi selecionada e denominada linhagem 2256A(ldh,pta, ack, poxB, acp) .

Exemplo 7 (7-1) Avaliação de cultura da 1inhagem com ach, pta, ack, poxB rompidos e linhagem com pta, ack, poxB rompidos A linhagem 2256Δ(Idh), a linhagem 2256Δ(ldh, pta-ack, poxB),e a linhagem 2256Δ(ldh, pta-ack, poxB, ach) de Brevíbacterium lactofermentum foram usadas em cultura para a produção de ácido succínico conforme descrição acima. As células bacterianas da linhagem 2256Δ (ldti), linhagem 2256ã(ldh, pta-ack, poxB) e a linhagem 2256A(ldh, pta-ack, poxB, ach) obtidas por cultura em um meio Cm-Dex em placa foram inoculadas em 3 ml do meio B de cultura semeada.

(lOg/L de glicose, 2,5 g/L de (NH4) 2SO4, 0,5 g/L de ΚΗ2Ρ0<ι, 0,25 g/L de MgSCd, 7H20, 2 g/L de uréia, 0,01 g/L de FeSO^ 7H20, 0,01 g/L de MnSCg 7H20, 50 ^ig/L de biotina, 100 μg/L de VB1-HC1, 15 mg/L de ácido protocatecuico, 0,02 mg/L de CaCl2, com pH 7,0 (KOH) ) . A cultura foi realizada com agitação em um tubo de teste a 31,5°C por cerca de 15 horas sob condição aeróbica.

Depois disso, 3 ml de um meio B principal (70g/L de glicose, 5 g/L de (NlhhSCg, 2 g/L de KH2P04, 3 g/L de uréia, 0,01 g/L de FeSCg 7H20, 0,01 g/L de MnSCg 7H20, 200 μg/L de biotina, 200 μg/L de VB1-HC1, 40 g/L de MOPS, e 50 g/L de MgC03, com pH 6,8 (NaOH)) foram acrescentados no tubo. Para impedir a aeração, a cultura para produção de ácido succínico foi conduzida com. 0 tubo hermeticamente fechado com uma tampa de silicone. A cultura foi realizada com agitação a 31,5°C por cerca de 24 horas e foi terminada antes que 0 açúcar contido no meio se esgotasse. Após a conclusão da cultura, as quantidades de ácido succínico e do produto secundário ácido acético acumuladas no meio foram analisadas por cromatografia líquida depois que 0 meio havia sido adequadamente diluído. Foi usada uma coluna obtida conectando-se duas peças de Shim-pack SCR-102H (Shimadzu) em série e a amostra foi eluída a 40°C usando-se 5 mM de ácido p-tolueno sulfônico. O eluente foi neutralizado usando-se 20 mM de solução aquosa Bis-Tris contendo 5 mM de ácido p-tolueno sulfônico e 100 μΜ de EDTA. 0 ácido succínico e 0 ácido acético foram medidos deterrainando-se a -condutividade elétrica por meio de CDD-10AD (Shimadzu). Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 2. O ácido acético na linhagem 2256Δ(ldh, pta-ack, poxB) foi drasticamente diminuído em comparação com a linhagem controle 2256Aldh, e o ácido acético na linhagem 2256Δ(ldh, pta, ack, ach, poxB) foi reduzido ainda mais, isto é, foi reduzido em cerca de 4 0¾ em comparação com a linhagem 2256A(ldh, pta, ack, poxB). Esses resultados revelaram que eliminar ou diminuir todas ou qualquer uma das atividades de poxB, pta-ack e ach simultaneamente é eficaz para a redução do ácido acético.

Tabela 2. Produção de ácido succínico e ácido acético na linhagem em que ACH, PTA, ACK E POXB foram rompidas em combinação Rendimento Ácido Linhagens OD620(x51) Açúcar do Ácido Acético Consumido Succínico (/ácido (g/L) (%) succínico I) 2256hldh Õ",Ü2~ ÃFTs 57,3 1^9 2256A(ldh, pta,ack, ach) 0,347 39,0 58,4 6,1 2256Δ(ldh, pta, ack, poxB, ach,} 0,372 39,8 56,1 3,6 (7-2) Avaliação de cultura da linhagem com pta, ack, poxB e acp rompidos A linhagem 2256A(ldh), a linhagem 2256Δ(ldh, pta, ack, poxB), e a linhagem 2256A(ldh, pta-ack, poxB e acp) de Brevibacterium lactofermentum foram usadas em cultura para produzir ácido succínico como segue. As células bacterianas da linhagem 2256Δ(ldh), linhagem 2256Δ(ldh, pta, ack, poxB) e linhagem 2256A(ldh, pta-ack, poxB. acp) obtidas por cultura em um meio Cm-Dex em placa foram inoculadas em 3 ml do meio B de cultura semeada mencionado acima. A cultura foi realizada com agitação em um tubo de teste a 31,5°C por cerca de 15 horas sob condição aeróbica.

Depois disso, 3 ml do meio B principal citado acima foram acrescentados no tubo. Para impedir a aeração, a cultura para produção de ácido succínico foi conduzida com o tubo hermeticamente fechado com uma tampa de silicone. A cultura foi realizada com agitação a 31,5°C por cerca de 24 horas e foi terminada antes que o açúcar contido no meio se esgotasse.

Após a conclusão da cultura, as quantidades de ácido succinico e do produto secundário ácido acético acumuladas no meio foram analisadas por cromatografia liquida depois que o líquido de cultura havia sido adequadamente diluído.

Foi usada uma coluna obtida conectando-se duas peças de Shim-pack SCR-102H (Shimadzu) em série e a amostra foi eluída a 40°C usando-se 5 mM de ácido p-tolueno sulfônico. 0 eluente foi neutralizado usando-se 20 mM de solução aquosa Bis-Tris contendo 5 mM de ácido p-tolueno sulfônico e 100 μΜ de EDTA. 0 ácido succinico e o produto secundário, ácido acético, foram medidos determinando-se a condutividade elétrica por meio de CDD-10AD (Shimadzu). Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. Produção de ácido succínico e ácido acético na linhagem em que pta, ack, poxB e acp foram rompidas em combinação Rendimento Ácido Linhagens OD62Qnm(x51) Açúcar do Ácido Acético Consumido Succinico (/ácido (g/L) (%) succinico I) 2256Aldh 0,333 4579 4972 UM 2256Λ (ldh, pta,ack, poxB) 0,307 40,7 45,2 8,9 2256Δ (ldh, pta, ack, poxB, acp,) 0,341 44,3 46,0 8,8 Como resultado, a proporção de ácido acético em relação ao ácido succinico diminuiu ligeiramente pela redução ou eliminação de todas as atividades de PTA, ACK e POXB, mesmo quando a atividade de ACH não foi reduzida ou eliminada conforme (C) mencionado acima. Por outro lado, a redução ou eliminação da atividade de ACP teve pouca influência sobre a produção de ácido acético e ácido succíni.co .

Aplicabilidade Industrial A presente invenção é útil para a produção fermentativa de ácido succíníco. 0 ácido succínico é útil como matéria prima para polímeros biodegradáveis, produtos alimentícios, medicamentos, cosméticos e semelhantes.

REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1, Método para a produção de ácido succínico, caracterizado por compreender as etapas de; permitir que uma bactéria corineforme com uma capacidade de produção· de ácido succínico ou um seu produto tratado atue sobre uma matéria-prima orgânica num líquido de reação contendo íon carbonato, íon bicarbonato ou dióxido de carbono para produzir e acumular ácido succínico no liquido de reação; e recolher o· ácido succínico a partir do líquido de reação, onde a dita bactéria foi modificada de modo que uma atividade de piruvato oxídase é diminuída por ruptura de um gene de piruvato oxidase num cromossoma e a dita bactéria corineforme é a Corynebacterium glutamícum ou Brevibacterium lactofermentum.

2, Método de acordo· com a reivindicação 1, caracterizado por: a piruvato oxídase ser uma proteína consistindo de um amino ácido da sequência de 5EQ ID NO: 49.

3, Método de acordo· com a reivindicação 1, caracterizado por; o dito gene da piruvato oxidase ser um DMA consistindo da sequência de nucleótidos de números 996-2732 na SEQ ID NO: 48.

4, Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: a dita bactéria ser ainda modificada de modo que as atividades de uma ou mais fosfotransacetilase, acetato-quinase e acetil-CoA-hidrolase serem diminuídas por ruptura de um gene codificando uma ou mais de fosfotransacetilase, acetato-quinase e acetil-CoA hidrolase.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 a 4, caracterizado por: a dita bactéria ter sido ainda modificada de modo que uma atividade de lactato desidrogenase fosse diminuída pela ruptura de um gene de lactato^ desidrogenase num cromossoma,

6. Método de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado por: a dita bactéria ter sido ainda modificada de modo que uma atividade de píruvato carboxilase fosse aumentada por transformação com um vector compreendendo um gene que codifica piruvato carboxilase.

7. Método de acordo cora a reivindicação 1 a 6, caracterizado por: a dita bactéria ou o seu produto tratado poder atuar sobre a matéria-prima orgânica sob condições anaeròbicas

8. Método para produzir um polímero contendo ácido succinico, caracterizado por: além de compreender as etapas de produção de ácido succinico pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, realizar a etapa final de polimerizaçâo do ácido succinico obtido.