ES2464159T3 - Microorganismo modificado por ingeniería genética novedoso que produce ácido homosuccínico y método para preparar ácido succínico usando el mismo - Google Patents

Microorganismo modificado por ingeniería genética novedoso que produce ácido homosuccínico y método para preparar ácido succínico usando el mismo Download PDF

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Abstract

Mutante bacteriano que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA ) , un yen de fosfotransacetilasa (p ta) y un yen de acetato cinasa (a ckA) at mismo tiempo que comprende un yen de piruvato formiato-liasa mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir sólo acido succinico a una alta concentración al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia , el genero A ctinoba cillus y el genero A na erobiospirillum.

Description

Microorganismo modificado por ingenieria genetica novedoso que produce acid° homosuccinico y metodo para preparar acid° succinico usando el mismo
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un mutante bacteriano del rumen que produce acid° homosuccinico y a un metodo para preparar acid° homosuccinico usando el mismo, y mas particularmente a un mutante bacteriano del rumen que produce acid° succinico a alta concentraci6n at mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, que se obtiene alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA), sin
alterar un gen que codifica para piruvato formiato liasa (pt1) , asi como a un metodo para preparar acidos succinicos usando el mismo.
T6cnica anterior
El acid° succinico (HOOCCH2CH2COOH), un acid° dicarboxilico que consiste en 4 carbonos, es un acid° organic° que tiene muchas utilidades, que se usa ampliamente como precursor de medicamentos, alimentos, cosmeticos y
productos quimicos de otras industrias (Zeikus etal. , Appl. Microbiol. Biotechnol, 51:545, 1999; Song etal.,Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006). Particularmente, se espera que aumente drasticamente la demanda de acid° succinico como fuente principal de macromolecules biodegradables, con el Ultimo aumento brusco de los precios del petradeo (VVillke et al. , Appl. Microbiol. Biotechnol, 66:131, 2004).
Puede producirse acido succinico mediante sintesis quinnica y fernnentacion. Sin embargo, la mayor parte del acid°
succinico para uso industrial se produce actualmente a traves de metodos de sintesis quimica usando n-butano y acetileno derivados del petroleo como material de particle por companies quimicas chinas, companies quimicas japonesas y grandes companies quimicas tales como BASF, DuPont, BP chemical etc., pero solo una pequena cantidad de acid° succinico para uso especial tal como medicamentos, etc. se produce mediante el metodo de fermentaci6n microbiana tradicional. Los metodos de sintesis quimica mencionados anteriormente tienen el problema de liberar grandes cantidades de desechos peligrosos, efluentes y gas de desecho (por ejemplo, CO, etc.) generados durante el proceso de producciOn de acid° succinico. Particularmente, se usan como material basic° combustibles fOsiles que tiene una alta posibilidad de agotarse y por tanto hay una necesidad urgente de desarrollar un metodo para preparar acidos succinicos reemplazando los combustibles fOsiles por combustibles alternativos tales como recursos renovables.
Para superar estos problemas provocados por el proceso de sintesis quimica para preparar acid° succinico, muchos investigadores han realizado de manera intensive y amplia estudios sobre la producci6n de acidos succinicos mediante fermentacion microbiana usando diversos recursos renovables. Los microorganismos que se han usado en la producci6n de acid° succinico varian, pero pueden clasificarse generalmente en Escherichia coli recombinante y bacterias del rumen (Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio, etc.)
(Song etal. , Enzyme Microbial Technol, 39:352, 2006).
Entre los estudios sobre la produccion de acidos succinicos usando E. coli recombinante, hubo un intento de aumentar la producci6n de acid° succinico preparando un mutante AFP111 (n.° de la ATCC 202021) obtenido a traves de un metodo en el que se manipula el gen de transporte de glucose (ptsG) mientras que se eliminan los genes (Idhypfl)que estan implicados en la produccion de acid° lactic° y acid° fOrmico en E. coli,por el equipo de
investigaciOn de la Universidad de Chicago (patente estadounidense n.° 5.770.435).
Los presentes inventores han amplificado un gen de enzima malice (sfcA) implicado en la produccion de acid° succinico, en E. coli recombinante, cepa NZN111, de la que se eliminan los genes Idh y pfl, para suprimir el acid° pirOvico acumulado en el proceso de fermentaciOn de la cepa NZN111, aumentando asi la produccion de acid° succinico (Hong et al. , Biotechnol. Bioeng., 74:89, 2001). Tambien, un equipo de investigadores dirigidos por la Universidad de Georgia ha construido una cepa AFP111/pTrc99A-pyc que expresa un gen de piruvato carboxilasa (pyc)en la cepa AFP111, y entonces usaron esta cepa en la producciOn de acid° succinico (Vemuri etal.,J. Ind. MicrobioL Biotechnol, 28:325, 2001). Recientemente, para inducir la producciOn de acido succinico en condiciones anaerobias, un equipo de investigadores dirigidos por la Universidad de Rice notificaron que habian construido
cepas de E. coli recombinante manipulando genes implicados en rutas de glicolisis, ciclo de TCA y glioxilato (Lin et a/., Eng., 7:1 16,2005; Lin etal., Biotechnol. Bioeng., 90:775, 2005).
Una cepa de Actinobacillus, una cepa de Anaerobiospirillum y una cepa de Mannheimia, que son una clase de bacterias del rumen, se sabe que son excelentes en la produccion de acid° succinico, de modo que se han realizado activamente estudios sobre las cepas. Un equipo de investigadores dirigidos por el Institut° Biotecnologico de
Michigan (MBI) en America descubriO Actinobacillus succinogenes cepa 130Z (n.° de la ATCC 55618) para desarrollar un metodo para producir acid° succinico, y construy6 diversas cepas mutantes de Actinobaci us usando mutagenesis quimica tradicional para su uso en el desarrollo de un procedimiento para
succinogenes, producir y purificar acid° succinico (patents estadounidense n.° 5.521.075; patente estadounidense n.° 5.168.055; patente estadounidense n.° 5.143.834).
Sin embargo, el procedimiento de produccion de acid° succinico usando fermentaciOn microbiana, desarrollado hasta ahora, tiene una productividad muy baja de menos de 2 g/l/h, y especialmente incurre en un gran coste para separar y purificar el acido succinico porque se produce acid° succinico junto con grandes cantidades de diversos acidos organicos y etanol como subproductos en algun grado durante la fermentaci6n. Aunque los resultados
5 mencionados anteriormente mostraron un efecto de disminucion de acid° lactic°, acid° formic°, acid° acetic° y etanol como subproductos en algunas cepas recombinantes, no mostraron una eliminacion complete de los mismos. Ademas, en otras cepas mutantes recombinantes, habia algunos casos en los que las tasas de crecimiento de las mismas se han vuelto tan bajas que la productividad de acid° succinico global no aument6. Por tanto, hay una demanda urgente de desarrollar una cepa productora de acid° succinico novedosa, que tenga una alta productividad
deacid° succinico y evite la producci6n de subproductos (Hong etal., Biotechnol. Lett., 22:871, 2000).
Para desarrollar una cepa productora de acid° succinico novedosa para satisfacer las demandas anteriores, debe tener prioridad el aislamiento de una cepa que tenga una excelente productividad de acid° succinico, la complecion de la secuencia genomica de la misma, la comprension de las caracteristicas metabOlicas de la misma y el establecimiento de una tecnica de manipulacion genetica requerida para la construccion de una cepa recombinante. 15 Hasta ahora, en el caso de bacterias del rumen que tienen alta productividad de acid° succinico, se complete) la secuencia genOmica complete de la cepa M. succiniciproducens MBEL 55E, pero las de bacterias del rumen tales como Actinobacillus, Anaerobiospirillum etc. a& no se han notificado. Aunque se ha notificado un intento de tratar
de producir acidos succinicos amplificando el gen de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (pckA)de A.succinogenesyA. succiniciproducens en E. coil (Kim et al. , Appl. Environ. Microbiol., 70:1238, 2004; Laivenieks et al. , Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997), no se ha intentado tratar de desarrollar una cepa de produce& de acid° succinico recombinante basandose en la secuencia genomica.
Los presentes inventores han notificado que aislaron M. succiniciproducens MBEL 55E (KCTC0769BP) produciendo acid° succinico con alta eficacia a partir de ganado nativo coreano, y completaron la secuencia genornica y caracterizaron las propiedades metabolicas de la cepa (Hong et al. , Nature Biotechnol, 22: 1275, 2004). Ademas, los 25 presentes inventores han construido un mutante bacteriano, M. succiniciproducens LPK (KCTC10558BP) alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldha) y un gen que codifica para piruvato formiato-liasa (0) en M. succiniciproducens MBEL 55E que es una clase de bacteria del rumen para inhibir la producci6n de acidos lacticos y acidos formicos. Ademas de eso, las presentes invenciones han construido un mutante M. succiniciproducens LPK7 (KCTC1062BP) alterando un gen de fosfotransacetilasa (pta)y un gen de acetato cinasa (ackA)en la cepa mutante,
M. succiniciproducens LPK para inhibir la produce& de acid° acetic°, para cultivar los mutantes bacterianos en condiciones anaerobias (documento WO 05/052135 Al; Lee et al. , Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006), aumentando por tanto el acid° succinico. Sin embargo, en el caso de tales cepas mutantes, aunque pudo suprimirse la produce& de subproductos, acid° f6rmico y acid° acetic° en algOn grado, se acumulaban una gran cantidad de acidos pirOvicos como subproducto durante la fermentacion, sobre todo, la tasa de crecimiento de la cepa se ha
35 vuelto tan baja en comparaci6n con una cepa silvestre que no podia lograrse una excelente productividad de acid° succinico.
Mientras tanto, se notific6 que un gen de piruvato formiato-liasa (0) participa en la conversion de acid° pirOvico en acetil coenzima A (acetil-CoA), afectando asi al crecimiento celular y la redistribuci6n de acid° pirOvico (Wolfe, Microbial. Mol. Biol. Rev., 69:12, 2005).
El documento W02007/030830 da a conocer determinados metodos y organismos para la produce& de succinato acoplada al crecimiento.
Por consiguiente, los presentes inventores han hecho esfuerzos extensos para construir un microorganismo mutante que pueda producir acidos homosuccinicos a un alto rendimiento minimizando la disminucion en la tasa de crecimiento microbiano e inhibiendo completamente la formaci6n de diversos subproductos incluyendo acidos 45 pirOvicos y para desarrollar a metodo de fermented& del mismo, y como resultado, han construido un mutante
bacteriano M.succiniciproducensPALK (KCTC10973BP) alterando un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) ,un gen de fosfotransacetilasa (pta)y un gen de acetato cinasa (ackA) sin alterar un gen de piruvato formiato-liasa (0)en M. succiniciproducens MBEL55E que es una clase de bacteria del rumen, y entonces fermentaron la cepa mutante en
condiciones anaerobias usando glucose y glicerol
como fuentes de carbon°, y confirmaron que la cepa mutante puede producir acid° homosuccinico casi a un alto rendimiento, completando de ese modo la presente invencion.
Sumario de la invencion
Por tanto, es un objeto de la presente invencion proporcionar un microorganismo mutante que tiene alta tasa de
crecimiento y productividad de acid° succinico y produce solo acid° succinico a un alto rendimiento al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos durante el periodo de fermented& anaerobia.
objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo para producir acid° homosuccinico sin la
55 Otro acumulacion de otros subproductos, cultivando el microorganismo mutante usando glucose y glicerol como fuentes de carbono en condiciones anaerobias.
Un aspecto de la invencion se refiere a un mutante bacteriano que carece de un gen de lactato deshidrogenasa
(IdhA) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) al mismo tiempo que comprende un
gen de piruvato formiato-liasa (pfl) , mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir sOlo acid° succinico a una alta concentraci6n al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero
Actinobacillus y el genero Anaerobiospifillum.
Un aspect° adicional de la invenciOn se refiere a un metodo para producir acido succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano anterior en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.
Un aspect° adicional de la invencion se refiere a un mutante bacteriano Mannheimia succiniciptoducens PALK
(KCTC10973BP), que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) al mismo tiempo que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) , mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir acido succinico a alta concentraciOn al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
Un aspect° adicional de la invencion se refiere a un metodo para producir el mutante bacteriano segOn la reivindicacion 1, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) alterando
el gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) en el genoma de una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospiifllum, usando recombinaci6n hornologa; y
(b) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando el gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y el gen que codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma del mutante
bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) usando recombinaci6n homologa.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para preparar acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) en condiciones anaerobias; y recuperar acido succinico del caldo de cultivo.
La presente solicitud tambien da a conocer un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en un microorganismo que produce acid° succinico al mismo tiempo que solo se mantiene un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) en el
microorganismo que produce acid° succinico, que tiene la propiedad de producir solo acid° succinico a alta concentraci6n al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
Adernas, la presente solicitud da a conocer un mutante bacteriano del rumen Mannhimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldha) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en M. succiniciproducens al mismo tiempo que se mantiene un gen de piruvato
formiato-liasa (pfl) en M. succiniciproducens, que tiene la propiedad de producir acid° succinico a alta concentracien al nnismo tiempo que produce poco o nada de otos acidos organicos en condiciones anaerobias.
Adicionalmente, la presente solicitud da a conocer un metodo para producir un microorganismo mutante, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) obtener un mutante bacteriano del rumen que carece del gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldha) alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) del genoma de la bacteria del rumen productora de acido succinico usando recombinaciOn homologa; y (b) obtener un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) , del genoma del mutante bacteriano
del rumen que carece del gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , mediante recombinaci6n homOloga.
Adernas, la presente solicitud da a conocer un nnetodo para producir acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar los mutantes bacterianos del rumen en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.
mas a partir de las siguientes descripciones detalladas y reivindicaciones adjuntas.
Otras caracteristicas y realizaciones de la presente invencion se aclararan
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquematico que muestra la ruta de produce& de acid° succinico en el microorganismo
mutante segOn la presente invencion.
La figura 2 muestra un procedimiento de construcci6n de un vector de reemplazamiento para alterar IdhA (pMLKOsacB) mediante recombinaciOn hornologa.
La figura 3 muestra un procedimiento de construcci6n de un mutante bacteriano (M. succiniciproducens LK) alterando el gen IdhA en Mannheimia succiniciproducens MBEL55E mediante recombinaciOn hornologa.
La figura 4 muestra un procedimiento de construcci6n de un vector de reemplazamiento para alterar pta y ackA (pPTA-sacB) mediante recombinaci6n homologa.
5 Lafigura 5 muestra un procedimiento de construcci6n de un mutante bacteriano (M. succiniciproducens PALK) alterando los genes IdhAypta-ackAen M.succiniciproducensLK mediante recombined& homOloga.
La figura 6 es una fotografia de electroforesis que muestra la alteraciOn de pta-ackAen M.succiniciproducensPALK,
en la que M representa un marcador de 1 kb; los carriles 1-6 representan fragmentos de PCR (1,1 kb) usando los
cebadores PAU1 y SP1; los carriles A-F representan fragmentos de PCR (1,5 kb) usando los cebadores SP2 y
10 PAD2.
La figura 7 muestra las caracteristicas de cultivo de M. succiniciproducens PALK de la invencion en condiciones anaerobias saturadas con CO2.
Descripcion detallada de la invencion y realizaciones preferidas
Un aspecto de la invencion se refiere a un mutante bacteriano que carece de un gen de lactato deshidrogenasa
15 (IdhA) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) al mismo tiempo que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) , mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir sOlo acid° succinico a una concentraciOn alta al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genera Mannheimia, el genera Actinobacillus y el genera Anaerobiospirillum.
20 Una descripcion adicional se refiere a un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) ,un gen de fosfotransacetilasa (pta)y un gen de acetato cinasa (ackA)en un microorganismo que produce acid° succinico al mismo tiempo que solo se mantiene un gen de piruvato formiato-liasa (0) en el
microorganismo que produce acid° succinico, que tiene la propiedad de producir solo acid° succinico a una alta concentracion al mismo tiempo produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
25 Enla presente invenciOn, el microorganismo productor de acid° succinico se refiere a un microorganismo que puede producir una gran cantidad excesiva de acid° succinico en compared& con la producci6n de etanol u otros acidos organicos, que puede usarse para uso industrial en la producci& de acid° succinico mediante fermentacion.
Los microorganismos productores de acid° succinico tipicos incluyen bacterias del rumen. A partir de informaci6n genetica parcial (ARNr 16s), analisis enzimatico y resultados de fermented& de Actinobacillus succinogenes,
30 Anaerobiospirillum succiniciproducens que son una clase de bacterias del rumen y diversas bacterias del rumen que
se sabe que producen acid° succinico hasta ahora, se encontr6 que la principal ruta de biosintesis para la producci6n de acid° succinico a partir de una fuente de carbono en bacterias del rumen es casi identica a la ruta de biosintesis para la producciOn de acido succinico en Mannheimia sp. que es una clase de bacteria del rumen (table 1; Van der Wert etal., Arch Microbial., 167:332, 1997; Laivenieks etal., Appl Environ. Microbial., 63:2273, 1997; 35 Samuelov et al. , App. Environ. Microbial., 65:2260, 1999; Kim et al. , Appl Environ. Microbial., 70:1238, 2004). Especialmente todas las bacterias del rumen que estan implicadas en la producci6n de acid° succinico convierten fosfoenolpiruvato y piruvato, compuestos C3 en oxalacetato y malato, compuestos C4 usando enzima fijadora de CO2 con la produccion de acid° sucdnico, produciendo asi acid° succinico. Ademas, las bacterias del rumen producen acid° acetic°, acid° fermico y acid° lactic° coma subproductos de fermentacien en condiciones
40 anaerobias, lo que sugiere par tanto que todas las bacterias del rumen incluyendo Mannheimia sp. tienen la misma ruta para la biosintesis de acid° succinico.
Table 1
Bacterias del rumen productoras de acid° succinico
Cepa Referencias Cytophagasuccinicans Andersonetal.,J.Bacteriol.,81:130,1961 Fibrobactersuccinogens Wood etal.,J.Cereal.Sc .,19:65,1994 Ruminococcusflavefaciens lannottietal.,Appl.Environ.Microbial.,43:136,1973 Succinimonasamylolytica Bryant,Bacterial .Rev.,23:125, 1959 Succinivibriodextrinisolvens Bryant,Bacteriol.Rev.,23:125,1959 Actinobacillussuccinogenes Gluttereta/., Int.J.Syst.Bacterial.,49:207,1999
Mannheimiasucciniciproducens Hongetal.,NatureBiotechnol.,22:1275,2004
45 Enla presente invencion, se construyo un microorganism° mutante productor de acid° succinico con una alta tasa de crecimiento, que puede producir acid° succinico a una alta concentracion al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos, manipulando el genoma de bacterias del rumen que son un microorganismo
productor de acid° succinico. En otras palabras, se alteraron un gen de lactato deshidrogenasa (ldha) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en el ADN genornico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP), construyendo de ese modo un mutante bacteriano M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) que muestra una alta tasa de crecimiento y produce acid° succinico a una alta concentracion al mismo tiempo
produce poco o nada de otros acidos organicos.
En la presente invencion, para la alteracion de cada gen, se us6 un metodo de sustitucion de los genes mediante recombinacion homologa para inactivar, pero puede usarse cualquier metodo sin limitaciones siempre que sea un metodo de manipulacion genetica en el que el gen correspondiente pueda modificarse o eliminarse, de manera que no se genere una enzima codificada por el gen correspondiente.
Enla presente invencion, las bacterias del rumen se seleccionan del grupo que consiste en Mannheimia sp., Actinobacillus sp. y Anaerobiospirillumsp.
En la presente invenciOn, el microorganismo mutante es preferiblemente una cepa de fermentaci6n homogenea quo produce solo acid° succinico al mismo tiempo quo forma poco o nada de otros acidos organicos como subproductos, las cantidades de otros acidos organicos producidos son preferiblemente inferiores al 1% en peso basandose en la
cantidad de acid° succinico producido, y los otros acidos organicos son preferiblemente uno cualquiera o mas acidos organicos seleccionados del grupo quo consiste en acid° lactic°, acid° acetic°, acid° formic° y acid° pirOvico.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), quo carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un
gen de acetato cinasa (ackA) al mismo tiempo que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pf/), mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir acid° succinico a una alta concentracion al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
Una descripciOn adicional se refiere a un mutante bacteriano del rumen M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), quo carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un
gen de acetato cinasa (ackA) en M. succiniciproducens al mismo tiempo quo se mantiene un gen de piruvato formiato-liasa (ptl) on M. succiniciproducens, quo tiene la propiedad de producir acid° succinico a una alta concentraciOn al mismo tiempo quo se produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
El mutante bacteriano M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), que se construy6 alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldha) , un gen quo codifica para piruvato formiato-liasa (0), un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen quo codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma de Mannheimia sp., se uso para comparar la productividad de acid° succinico y tasa de crecimiento de M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) segCin la presente invenciOn con las de mutantes bacterianos tradicionales. En el presente documento, el =tante bacteriano M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) tiene una alteracion adicional de un gen quo codifica para piruvato formiato-liasa (ptl) en la cepa mutante M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)
segOn la presente invencion (documento W02005/052135; Lee etal.,Appl. Environ. Microbiol. 72:1939,2006).
M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) segun la presente invenciOn tiene una alta productividad de acid° succinico y produce poco o nada de subproductos tales como acid° lactic°, acid° acetic°, acid° fOrmico y acid° pirOvico, mostrando por tanto excelentes propiedades en comparacion con M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) silvestre para la produccion de acid° succinico y el mutante bacteriano previamente construido M.
succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), y puede producir acid° succinico a altos rendimientos debido a la alta tasa de crecimiento del mismo, alta productividad de acid° succinico y produccion de acid° homosuccinico evitando la acumulacion de acid° pirOvico,
en comparaciOn con el mutante bacteriano previamente construido M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP).
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para producir el mutante bacteriano segCin la reivindicacion 1, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) alterando el gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) en el genoma de una bacteria que se selecciona del grupo
quo consiste en el genero Mannheimia, el *ler° Actinobacillus y el Wier° Anaerobiospirillum, usando recombinacion homologa; y
obtener un mutante bacteriano quo carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen quo codifica para acetato cinasa (ackA) alterando el gen quo codifica para fosfotransacetilasa (pta) y el gen quo codifica para acetato cinasa (ackA)
(b)
en el genoma del mutante bacteriano quo carece de un gen quo codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) usando recombinacion homOloga.
Todavia otra descripci6n se refiere a un metodo para construir un microorganismo mutante, comprendiendo el
metodo las etapas de: (a) obtener un mutante bacteriano del rumen quo carece de un gen quo codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) alterando un gen quo codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) en el genoma de bacterias del rumen productoras de acid° succInico usando recombinaci6n hornologa; y (b) obtener un mutante bacteriano del
rumen que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma del mutante bacteriano del rumen que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) mediante recombinacion homologa.
Enla presente invencion, la recombinacion homologa de la etapa (a) se Ileva a cabo preferiblemente usando un vector de intercambio genetic° que contiene un IdhA alterado, y la recombinaci6n homologa de la etapa (b) se Ileva a cabo preferiblemente usando un vector de intercambio genetic° que contiene un pta-ackA alterado.
En la presente invencion, el vector de intercambio genetic° que contiene un IdhA alterado es preferiblemente pMLKO-sacB, y el vector de intercambio genetic° que contiene un pta-ackA alterado es preferiblemente pMPKOsacB.
La presente invencion tambien proporciona un metodo para producir acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el microorganismo mutante mencionado anteriormente en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.
En la presente invencion, para el cultivo, se usa preferiblemente glucosa o glicerol como fuente de carbono, y las
cantidades de otros acidos organicos producidos como subproductos son preferiblemente inferiores al 1% en peso basandose en la cantidad de acid° succinico producido.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para preparar acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.
Aimotra descripciOn se refiere a un metodo para preparar acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano del rumen en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.
El cultivo del microorganismo mutante productor de acid° succinico segiin la presente invencion y el procedimiento de recuperaci6n del acid° succinico pueden Ilevarse a cabo mediante los metodos de cultivo conocidos en el proceso de fermentacion convencional y metodos para separar y purificar acid° succinico.
Enla presente invencion, para el cultivo, se usa preferiblemente glucosa o glicerol como fuente de carbono, y las cantidades de otros acidos organicos producidos como subproductos son preferiblemente inferiores al 1% en peso basandose en la cantidad de acid° succinico producido.
Ejemplos
La presente invencion se describira a continuaci6n en el presente documento con mas detalles mediante ejemplos. Sin embargo, resultara obvio para un expert° en la tecnica que estos ejemplos se facilitan sOlo para fines ilustrativos, y la presente invencion no se limita a o por los ejemplos.
Particularmente, los siguientes ejemplos ilustran sOlo Mannheimia sp. que es un microorganismo productor de acid° succinico como celula huesped para delecionar los genes segun la presente invencion. Sin embargo, resulta obvio para un expert° en la tecnica que puede obtenerse un microorganismo mutante que produce acid° homosuccinico
incluso cuando se usan otras clases de microorganismos productores de acid° succinico.
Eiemplo 1: ConstrucciOn del vector de alteracion de IdhA (pMLKO-sacB)
Para alterar el gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) en el genoma de un microorganismo productor de acid° succinico mediante recombinaciOn hornologa, se construy6 un vector de intercambio genic° de la siguiente manera. En primer lugar, se sometio el ADN genomico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), como molde, a
PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 a continuaci6n y, entonces, se corto el fragmento de PCR obtenido que contenia la regi6n 1 homOloga a IdhA(L1) con Sac!yPstlyse introdujo en el vector pUC18 (New England Biolabs, Inc., EE.UU.), construyendo de ese modo pUC18-L1.
SEQ ID NO: 1: 5'-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG
SEQ ID NO: 2: 5'-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA
Ademas, se sometio el ADN gen6mico de M. succiniciproducensMBEL55E (KCTC 0769BP), como molde, a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 a continuacion y, entonces, se corto el fragment° de PCR obtenido que contenia la region 2 hornologa a IdhA (L2) con Pstl y Hindl I l y se introdujo en el
pUC18-L1, construyendo de ese modo pUC18-L1-L2.
SEQ ID NO: 3: 5'-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC
5'-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG
SEQID NO: 4:
Para insertar el gen resistente a kanamicina como marcador de selecciOn en el pUC18-L1-L2, se coda el vector pUC4K (Pharmacia, Alemania) con Ps/I , y se fusiono el gen resistente a kanamicina resultante con pUC18-L1-L2 cortado con Ps/I , construyendo de ese modo pUC18-L1-KmR-L2. Se insert6 un ligador expuesto en SEQ ID NO: 5 en el pUC18-L1-KmR-L2 cortado con Sad, produciendo de ese modo un nuevo sitio de corte de Xbal .
5 SEQID NO: 5: 5'-TCTAGAAGCT
Para insertar el gen sacB en el pUC18-L1-KmR-L2 en el que se ha insertado el sitio de cone de Xbal , se Veva a cabo PCR en pKmobsacB (Schafer etal.,Gene, 145:69, 1994) como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 6 y 7. Entonces se collo el fragmento de PCR resultante que contenia el gen sacB con Xbal , y se inserto en el nuevo sitio de enzima de restricciOn Xbal de pUC18-L1-KmR-L2 en el que se ha inserted° el sitio de carte de Xbal
anterior, construyendo de ese modo pMLKO-sacB, un vector de intercambio para alterar el gen IdhA (figura 2).
SEQ ID NO: 6: 5'-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG
SEQ ID NO: 7: 5'-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC
Ejemplo 2: Construccion de la cepa LK de M. succinicioroducens
Se construy6 una cepa mutante alterando el gen IdhA en el genoma de M. succiniciproducens MBEL55E 15 (KCTC0769BP) usando pMLKO-sacB construido en el ejemplo 1 como vector de intercambio genetic° para alterar el gen IdhA (figura3).
En otras palabras, se sembro en placa M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) en media de agar LBglucosa que contenia 10 g/I de glucosa, y se cultivO a 37°C durante 36 horas. Se inoculo la colonia formada en 10 ml de media liquido de LB-glucosa, y se cultivo durante 12 horas. Se inoculo un 1% del caldo de cultivo, que se habia
hecho crecer suficientemente, en 100 ml de media liquido de LB-glucosa, y se cultivo en una incubadora con agitacion a 200 rpm y 37°C.
Cuando el caldo de cultivo alcanzO una D0600 de aproximadamente 0,3-0,4 tras 4-5 horas, se centrifug6 a 4°C y
4.500 rpm durante 20 minutos para recoger las celulas. Entonces, se resuspendieron las celulas en 200 ml de disolucion de glicerol al 10% a 4°C. Se centrifuge) la suspensi6n a 4°C y 5.500 rpm durante 20 minutos, y se
25 recogieron las celulas. Tras resuspender y recoger en la mitad de la disolucion de glicerol anterior dos veces de la misma manera que los procedimientos descritos anteriormente, se suspendieron las celulas en glicerol a una razor) en volumen de 1:1, para obtener un concentrado celular.
Se mezclo el concentrado celular asi obtenido con el vector de intercambio genetic° pMLKO-sacB construido en el ejemplo 1, y entonces se introdujo pMLKO-sacB en la M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) cultivada
mediante electroporacion en condiciones de 1,8 kV, 25 1.1F y 200 ohmios. Se ariadio 1 ml de media liquid° de LBglucosa a la cepa con pMLKO-sacB introducido, y se cultivo previamente en una incubadora con agitacion a 37°C y 200 rpm durante una hora. Se sembr6 en placa el caldo de cultivo en media solid° de LB-glucosa que contenia el
antibiOtico kanamicina (concentracian final de 25 1.1g/m1) y se cultivo a 37°C durante 48 horas o mas. Para seleccionar una colonia en la que solo se produjo doble sobrecruzamiento, se sembraron en estrias las colonias 35 formadas en media sOlido de LB-sacarosa que contenia kanamicina (2514/m1) y sacarosa 100 g/I. Tras 24 horas, se sembraron en estrias de nuevo las colonias formadas en el mismo media.
Se cultivaron las colonias (mutantes) formadas en el media en media liquid° de LB-glucosa que contenia un antibi6tico, y se aisle) ADN gen6mico de la cepa cultivada mediante el metodo descrito en Rochelle et al. (Rochelle et FEMS Microbial. Lett., 100:59, 1992). Se Ilevo a cabo PCR usando el ADN genomico del mutante aislado coma molde, y se sometio a electroforesis el product° de PCR para confirmar la alteraciOn del gen IdhA en el ADN
genomico.
Para confirmar la alteracion del gen IdhA, se Ilevaron a cabo PCR dos veces de las siguientes maneras. En primer lugar, se sometio a PCR el ADN genomico mutante coma molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
45 SEQID NO: 8: 5'-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC (KM 1)
SEQ ID NO: 9: 5'-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC (LU1)
Entonces, se someti6 a PCR el ADN gen6mico mutante coma molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.
SEQ ID NO: 10: 5'-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG (KM2)
SEQID NO: II: 5'-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC (LD2)
Se sometieron los fragmentos de PCR obtenidos en las dos PCR a electroforesis en gel para confirmar la alteracion de IdhA par su tamatio. Se confirmaron los fragmentos de PCR del ADN genOmico que tenian IdhA alterado
mediante el hecho de que el producto que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 8 (KM1) y SEQ ID NO: 9 (LU1) tiene un tamafio de 1,5 kb, y al mismo tiempo el product° que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 10 (KM2) y SEQ ID NO: 11 (LU2) tiene un tame° de 1,7 kb. La posici6n de cada cebador se muestra en la figura 3.
5 Se construy6 la cepa mutante M. succiniciproducens LK alterando el gen IdhA en el genoma de M. succiniciproducens MBEL55E segOn el metodo anterior.
Ejemplo 3: ConstrucciOn del vector de intercambio genic° (pPTA-sacB) para la alteracion de DtayackA
Para alterar pta y ackA en el genoma de la cepa LK de M. succiniciproducens mediante recombinaci6n homologa, se construy6 un vector de intercambio genetic° de la siguiente manera. Se someti6 un vector pKmobsacB que contiene
el gen sacB, como molde, a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13. Se corto el producto de sacB resultante con Pstl y BamHI y se inserto en pUC19 (Stratagene Cloning Systems. EE.UU.), construyendo de ese modo pUC19-sacB (figura 4).
SEQ ID NO: 12: 5'-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG
SEQ ID NO: 13: 5'-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC
15 Mientras tanto, se sometio el ADN gen6mico de M. succiniciproducens LK como molde a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, y se corto el fragmento de PCR resultante que contenia la region 1 homologa 1 a pta-ackA con Xbal y BamHI . Adernas, se sometio el ADN gen6mico de M. succiniciproducens LK como molde a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, y se cork) el fragmento de PCR resultante que contenia la regi6n 2 homologa a pta-ackAcon XbalySad .Entonces, se insertaron estos
fragmentos en el sitio BamHI y Sadl de pUC19, construyendo de ese modo pUC19-PTAl2.
SEQ ID NO: 14: 5'-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC
SEQ ID NO: 15: 5'-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG
SEQ ID NO: 16: 5'-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCA
TGTTTCC
25 SEQID NO: 17: 5'-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC
Para insertar el gen resistente a espectinornicina (GenBank X02588; SpR) como marcador selectivo en pUC19- PTAl2, se sometio a PCR el plasmido pIC156 (Steinmetz et al. , Gene, 142:79, 1994) que contiene el gen resistente a espectinomicina (GenBank X02588), como molde, usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, y se corto el fragmento de PCR resultante que contenia el gen SpRcon EcoRV y se introdujo en el pUC19
PTAl2, construyendo de ese modo pUC19-PTA1S2 que tiene el gen resistente a espectinomicina. Se corto el pUC19-PTA1S2 construido con Sadl y BamHI y se introdujo en el pUC19-SacB construido anteriormente, construyendo de ese modo un vector de intercambio (pPTA-sacB) para la alteracion de pta y ackA (figura 4).
SEQ ID NO: 18: 5'-GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC
SEQ ID NO: 19: 5'-CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC
35 Eiemplo 4: Construcci6n de la cepa PALK de M. succiniciproducens
Se construyo una cepa mutante alterando el gen pta y ackA en el genoma de M. succiniciproducens LK usando pPTA-sacB, un vector de intercambio para la alteracion del gen de fosfotransacetilasa (pta) y el gen de acetato cinasa (ackA) construido en ejemplo 3 (figura 4).
En otras paiabras, se sembro en placa M. succiniciproducens LK construida en el ejemplo 2 en medio de agar LB
glucosa que contenia 10 g/I de glucosa, y se cultivo a 37°C durante 36 horas. Se inoculo la colonia formada en 10 ml de medio liquido de LB-glucosa, y se cultivo durante 12 horas. Se inoculo un 1% del caldo de cultivo, que se habia hecho crecer suficientemente, en 100 ml de medio liquid° de LB-glucosa, y se cultivo en una incubadora con agitacion a 200 rpm y 37°C.
Se recogio el concentrado celular del caldo de cultivo resultante de la misma manera que se describio en el ejemplo
45 2. Se mezclo el concentrado celular recogido con el vector de intercambio genetic° pPTA-sacB construido en el ejemplo 3, y entonces se introdujo pPTA-sacB en la M. succiniciproducens LK mediante electroporacion en condiciones de 2,5 kV, 50 1.1F y 200 ohmios. Se afiadieron 800 ml de medio liquid° de LB-glucosa a la cepa con pPTA-sacB introducido, y se cultivo previamente en un termostato a 37°C durante una hora y media. Para inducir un doble sobrecruzamiento, se sembro en placa el caldo de cultivo en medio solid° de TSB-sacarosa (medio solid° de
caldo de soja triptica (Becton, Dickinson and Company) que contiene 100 g/I de sacarosa) que contenia el antibiotic°
espectinomicina (concentraciOn final de 50 pig/m1) y se cultivo a 37°C durante 48 horas o mas. Para seleccionar una
colonia en la que solo se produjo doble sobrecruzamiento, se sembraron en estrias las colonias formadas en medio de TSB-sacarosa que contenia espectinomicina 50 1.1g/m1 y medio de agar TSB que contenia ampicilina 50 tg/ml, respectivamente, y se cultivaron a 37°C durante 12 horas. Entonces, se seleccionaron las colonias que se formaron en el medio de TSB-sacarosa que contenia espectinomicina 50 gig/m1 pero que no se formaron en el medio de TSB
5 que contenia ampicilina 50 tg/ml, y se sembraron en estrias de nuevo en el medio de TSB-sacarosa que contenia espectinomicina 50 jtg/ml. Se seleccionaron las colonias formadas en el presente documento de nuevo usando el medio que contenia espectinomicina y el medio que contenia ampicilina, y entonces se seleccionaron en Ultima instancia las colonias que mostraban los resultados requeridos. Se amplificO el ADN gen6mico del mutante aislado como molde mediante PCR y se sometio a electroforesis el producto de PCR para confirmar la alteracion de pta10 ackA.
Para confirmar la alteracion de pta-ackA, se Ilevaron a cabo PCR dos veces de la siguiente manera. En primer lugar, se sometio a PCR el ADN genomico mutante como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21. Entonces, se sometiO a PCR el ADN gen6mico mutante como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23.
15 SEQID NO: 20: 5'-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC (SP1)
SEQ ID NO: 21: 5'-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC (PAU1)
SEQ ID NO: 22:
5'-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG (SP2)
SEQ ID NO: 23:
20 5'-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG (PAD2)
Se sometieron los productos obtenidos en las dos PCR a electroforesis en gel para confirmar la alteraciOn de ptaackA por su tamano (figura 6). Se confirmo la alteraciOn de pta-ackA por el hecho de que el producto que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 (cebador SP1 y cebador PAU1) tiene un tamafio de 1,1 kb, y al mismo tiempo el product° que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 22
25 y SEQ ID NO: 23 (cebador SP2 y cebador PAD2) tiene un tamafio de 1,5 kb. La posici6n de cada cebador se muestra en la figura 5.
La cepa mutante construida mediante la alteraciOn de pta-ackA del genoma de M. succiniciproducens LK como el metodo descrito anteriormente, es decir, una cepa mutante que resultaba de la alteracion de IdhA, pta y ackA del genoma de M. succiniciproducens, se denomino "M. succiniciproducens PALK" y se deposit6 con el nt:Imero de
30 registro "KCTC10973BP" el 26 de julio de 2006 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC; 52, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon-si, Reptiblica de Corea), Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, que es una autoridad depositaria internacional.
Ejemplo 5: Producci6n de acid° homosuccinico usando M. succiniciproducens PALK
Se sembrO en placa M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) construida en el ejemplo 4 en 10 ml de medio de 35 composicion que contenia 5 g/I de glucosa, y se cultivo en condiciones anaerobias a 39°C durante 8 horas, y entonces se cambio de nuevo a 250 ml de medio de composicion que contenia 5 g/I de glucosa y se cultivo a 39°C. En este momento, se &ladle) espectinomicina 50 pg/ml al medio como antibiotic°. Se inocularon 250 ml del caldo de cultivo de M. succiniciproducens PALK en el biorreactor que contenia 2,25 I de medio de composiciOn (1 g/I de NaCI, 2 g/I de (NH4)2HPO4, 0,02 g/I de CaC12.2H20, 0,2 g/I de MgC12-6H20, 8,709 g/I de K2HPO4, 0,5 g/I de cisteina, 0,5 g/I 40 de metionina, 0,5 g/I de alanina, 0,5 g/I de asparagina, 0,5 g/I de acid° aspartico, 0,5 g/I de prolina, 0,5 g/I de serina, 0,005 g/I de acid° nicotinic°, 0,005 g/I de Ca-pantotenato, 0,005 g/I de piridoxina.HCI, 0,005 g/I de tiamina, 0,005 g/I de acid° ascorbic° y 0,005 g/I de biotina), y se Hew:, a cabo la fermentacion en condiciones de una primera concentraci6n de glucosa de 18,2 g/I (100 mM), una primera concentracion de glicerol de 9,2 g/I (100 mM) a 39°C. Durante la fermentacion, se ajusto el pH del cultivo a 6,5 usando agua amoniacal, y se afiadio espectinomicina
45 50jig/m1 al medio como antibiOtico. Para producir acid° succinico a una alta concentraci6n, siempre que la glucosa se agotaba completamente, se ajusto la concentraci6n de glucosa del caldo de cultivo a aproximadamente 18,2 g/I (100 mM) afiadiendo disolucion de glucosa concentrada.
Se fermentaron M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) y la cepa mutante productora de acid° succinico
M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) para producir acid° succinico de la misma manera que se describio 50 anteriormente.
Se midi6 la concentracion de celulas en el caldo de cultivo con un espectrofotometro, y entonces se calculo usando la absorcion de luz medida previamente del espectrofotometro y la prueba de verificacion para peso de celulas secadas. Durante la fermentaci6n, se recogieron muestras del biorreactor regularmente. Se centrifugaron las muestras recogidas a 13.000 rpm durante 10 minutos, y entonces se usaron los sobrenadantes para analizar las 55 concentraciones de acidos organicos, glucosa, y glicerol usando cromatografia de liquidos de alta resolucion.
Como resultado, cuando se compare) M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) de la presente invenciOn con M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) y M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), mostra una productividad mas alta de acid° succinico al mismo tiempo que producia poco o nada de otros acidos organicos como subproductos que M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) y M. succiniciproducens LPK7
5 (KCTC10626BP) tal como se muestra en la figura 7 y la tabla 2. Aunque se detectaron 0,45 g/I de acid° acetic° y 0,24 g/I de acid° pit-Civic°, resulta obvio para un expert° en la tecnica que estas cantidades son las cantidades minimas de acidos organicos producidos por una cepa para crecer y pueden ignorarse porque se produjeron en cantidades de menos del 1% en peso en comparaci6n con el acid° succinico producido.
Tabla 2
10 Productividad de acid° succinico de M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)
Cepa
MBEL55E LPK7 PALK
(KCTC0769BP) (KCTC1 0626BP) (KCTC1 0973BP)
Concentraci on final de aci d° succini co (g/l )
1 0, 49 1 3, 40 45, 79
Consumo de gl ucosa (g/1 )
22, 50 1 9, 98 53, 00
Rendi mi ento
de aci d° succi ni co (g de aci d° 0, 47 0, 67 0, 86
succi ni co/g de gl ucosa)
Tasa de aumento de aci d° succini co en comparaci on
- 42, 55 82, 98
con lacepasilvestre (MBEL55E) (%) Concentracionfinaldeacid°acetic° (g/l) 4,96 0,53 0,45 Concentracionfinaldeacid° lactic°(g/l) 3,47 0,27 0,00 Concentraci6nfinaldeacid°pit-Civic° (g/I) 0,00 2,47 0,24 Tasadecrecimientoespecificocelular(1/h) 0,81 0,30 0,69
Aplicabilidad industrial
Tat como se describi6 y proporcion6 anteriormente en detalle, la presente invencion proporciona el microorganismo mutante productor de acid° succinico que tiene una alta tasa de crecimiento, que produce acid° succinico a una alta concentracion al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos durante el cultivo en condiciones
15 anaerobias, y el metodo para producir acid° succinico usando el mismo. El microorganismo mutante de la invencion tiene la capacidad de tener una alta tasa de crecimiento y productividad de acid° succinico al mismo tiempo que produce poco o nada de acidos organicos, en comparacion con las cepas anteriores que producen acid° succinico. Por tanto, el microorganismo mutante de la invencion es ON para producir acid° succinico para uso industrial.
<110> Institut° de Ciencia y Tecnologia de Corea
20 <120> Microorganismo modificado por ingenieria genetica novedoso que produce acid° homosuccinico y metodo para preparar acid° succinico usando el mismo
<130> PP-80304
<150> KR10-2006-0071666
<151> 25 <160>23
<170> Kopatentln 1.71
<210> 1 <211>30
<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 1 cagtgaagga gctccgtaac gcatccgccg 30
35 <210>2
<211>30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 5 <223> cebador
<400> 2 ctttatcgaa tctgcaggcg gtttccaaaa
<210> 3
<211> 30 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 3
15 gtactgtaaa ctgcagcttt catagttagc <210>4 <211>30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> cebador <400>4 gccgaaagtc aagcttgccg tcgtttagtg <210>5
25 <211>10
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sitio xbal
30 <400> 5 tctagaagct <210>6 <211>29
<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 6
gctctagacc ttctatcgcc ttcttgacg <210>7 <211>29
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 7 10 gctctagagg ctacaaaatc acgggcgtc
<210> 8
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> cebador
<400> 8 gacgtttccc gttgaatatg gc
<210> 9 20 <211>24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
25 <400> 9 cattgaggcg tattatcagg aaac
<210> 10
<211> 23
<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 10 gcagtttcat ttgatgctcg atg
35 <210>11 <211>24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400>11 5 cctcttacga tgacgcatct ttcc
<210> 12
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> cebador
<400> 12 agcggatccc cttctatcgc cttcttgacg
<210> 13 15 <211>30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
20 <400> 13 gtcctgcagg gctacaaaat cacgggcgtc
<210> 14
<211> 32
<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 14 gctctagata tccgcagtat cactttctgc gc
30 <210> 15 <211>30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 35 <223> cebador
<400> 15 tccgcagtcg gatccgggtt aaccgcacag
<210> 16
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> cebador
<400> 16
ggggagctcg ctaacttagc ttctaaaggc catgtttcc
<210> 17
10
<211>32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
15
<400> 17
gctctagata tccgggtcaa tatcgccgca ac
<210> 18
<211>30
<212> ADN
20
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 18
gaattcgagc tcgcccgggg atcgatcctc
25
<210> 19
<211>36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
30
<223> cebador
<400> 19
cccgggccga caggctttga agcatgcaaa tgtcac
<210>20
<211>36
35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> cebador
<400> 20 cctgcaggca tgcaagcttg ggctgcaggt cgactc <210>21
5 <211>35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
10 <400> 21 gctgccaaac aaccgaaaat accgcaataa acggc <210>22 <211>43
<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 22 gcatgtaact ttactggata tagctagaaa aggcatcggg gag
20 <210> 23 <211>34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> cebador
<400> 23 gcaacgcgag ggtcaatacc gaaggatttc gccg

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Mutante bacteriano que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un yen de fosfotransacetilasa (pta) y un yen de acetato cinasa (ackA) at mismo tiempo que comprende un yen de piruvato formiato-liasa mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir sOlo acid° succinico a una alta concentraciOn al
    mismotiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum.
  2. 2. Mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, en el que el mutante bacteriano es una cepa de fermentaci6n
    homogenea que produce solo acid° succinico al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos como subproductos.
  3. 3.
    Mutante bacteriano segOn la reivindicaciOn 1, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acid° succinico producido.
  4. 4.
    Mutante bacteriano segOn la reivindicacion 1, en el que los otros acidos organicos son uno cualquiera o
    masacidos organicos seleccionados del grupo que consiste en acid° lactic°, acid° acetic°, acid° f6rmico y acid° pirOvico.
  5. 5. Mutante bacteriano Mannheimia succinicipnoducens PALK (KCTC10973BP), que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un yen de fosfotransacetilasa (pta) y un yen de acetato cinasa (ackA), al mismo tiempo que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (ptT) , mutante bacteriano que tiene la
    propiedad de producir acid° succinico a una alta concentracion al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
  6. 6. Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicaciOn 1, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA)
    alterandoel gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) en el genoma de una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el *len) Actinobacillus y el genero Anaerobiospitillum, usando recombinaci6n hornologa; y
    (b) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un yen que codifica para acetato cinasa (ackA)
    alterandoel yen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y el yen que codifica para acetato cinasa (ackA) en
    el genoma del mutante bacteriano que carece de un yen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) usando recombinaci6n homOloga.
  7. 7. Metodo para producir el mutante bacteriano segOn la reivindicacion 6, en el que la recombinaci6n hornologa de la etapa (a) se realiza usando un vector de intercambio genetic° que contiene un IdhA alterado.
  8. 8.
    Metodo para producir el mutante bacteriano segOn la reivindicacion 6, en el que la recombinaci6n homologa de la etapa (b) se realiza usando un vector de intercambio genetic° que contiene un pta-ackA alterado.
  9. 9. Metodo para producir el mutante bacteriano segOn la reivindicaciOn 7, en el que el vector de intercambio genetic° que contiene un IdhA alterado es pMLKO-sacB.
  10. 10.
    Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicaciOn 8, en el que el vector de intercambio genetic° que contiene un pta-ackA alterado es pMPKO-sacB.
  11. 11. Metodo para producir acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante
    bacteriano segOn una reivindicacion cualquiera entre las reivindicaciones 1 a 4 en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.
    como fuentede carbono para el cultivo.
  12. 12.
    Metodo para producir acid° succinico segOn la reivindicacion 11, en el que se usa glucosa o glicerol
  13. 13.
    Metodo para preparar acid° succinico segOn la reivindicaciOn 11, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acid° succlnico producido.
  14. 14.
    Metodo para preparar acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante
    bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.
    como
  15. 15. Metodo para preparar acid° succinico segOn la reivindicacion 14, en el que se usa glucosa o glicerol
    fuente de carbono para el cultivo.
  16. 16. Metodo para preparar acid° succinico segun la reivindicacion 14, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succinico producido.
    'ilacosa
    FIG. 1
    Glue( a-)-P
    1. 13 iOflRL,
    Fostecnolpiruvato
    Acido lactic°
    AA
    Oxal
    Piruvato oactBAG Acid() formico. C°2 112 ONE
    alato
    AcctiiCoA
    Furnaralo freifrid:
    Acido aca A Etanol
    cid() succi nic(
    FIG. 2
    pUC18 (vim
    Sad Ori (ió 1 hoinOloga a kilh1 ) , pUC1 84.1 (lch)
    (region 2
    iPsti moioga a /Au) AR
    1
    Pal Psi! Kindill El S
    Cow, crsiiin dc Saden es1 sill.) A.M./ . onelliante SEV ID O. 5
    X64,1 coca Alxit
    JEndIfl
    12 LI
    FIG. 3
    pMLKO-sacE3
    17'.111tb)
    RegieIn 2 .1116lop a klit. .1
    Regi4n I .homologa a
    MR
    Croinosoina tie fannireimio snecinivipro u(ors M1111,551: (sihesir
    licgik.11 I' homMoga a ki/r4
    Rcgiqin 2 hortiologa a 11I f
    • a-
    S;fthrixn=aniclutft intlisickast ritedi4,1 tclisooftaikat
    Sobre,rivanlicano Joble eft ft 'oho
    Cm4114454)11):i 414:
    /
    s444-4:4#11(.vnlihiCa,ns
    tt4:$.14in 2' 1a4m6144444 a /AA Kcition I ' honiologa a 14//4,4
    LK
    FIG. 4
    On BconHI 1,1,c,..gion 1 homologa rh l-aciA)
    pUC19
    (RigOn 2 homillogaa p1ts-thi.4) EcoRV
    pUC19-PTAl2
    PA2 PA1
    pUC19-PTA1S2!
    Rcgion I hointiloga a pra.ackA ftc:ii; km 2 hostOloga pia-ack,4
    FIG. 5
    pPTA-sacE3
    RegiOn 2 ho-mtiloga a pro-ock,l Region. I homologa apla.aciA
    Cronin:Anna de Aucciniciproducens LK
    Region 2 htmOkg t pli,ck.t ReJi6aI' lunnologa a pra-ack I
    enizainiento dnble en medic) de sacarasa"Sp
    SeleeciAn resisterne a Sp, .scasible a Ap
    'Region 2' hoinologa a 1,1(4-irekA SpR (Trornosoina de
    Reg ion I' hot nolaga a pia-ockA
    YfIceitlicipror
    .herens
    PALK
    6
    OOP
    . A
    C 1).! • XI
    FIG, 7
    50 40. 30
    Glucosa Gliceral Acid° succirmco Acidolactic° --tt-Acido formico—*-Acido acitico Acido pirtwico
  17. 2.0
    10
    0 0,00
    5.00 10,00 15,00 Tiempo 20,00 • 25,00
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