KR100762962B1 - 게놈정보 및 인실리코 분석을 이용한 배양배지의 제조방법 - Google Patents

게놈정보 및 인실리코 분석을 이용한 배양배지의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 게놈정보 및 인실리코 분석을 이용한 배양배지의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈정보를 이용하여 대사회로를 구축하고, 상기 구축된 대사회로로부터 대사산물 중 하나를 제거하여 인실리코(in silco) 시뮬레이션을 이용한 대사흐름 분석을 수행함으로써 최소 합성 배양배지 성분을 선별한 후, 실제 배양을 통해 최종 배양배지를 결정하는 최소 합성 배양배지의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 배양배지의 제조방법은 종래 배양배지 제조방법에 비하여 체계적이고 정확하면서도, 제조에 소요되는 시간, 노력 및 비용을 획기적으로 줄일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 배양배지는 숙신산 생성 미생물 성장 및 숙신산을 생산하는데 유용하다. 따라서, 게놈 정보를 바탕으로 만들어진 대사회로를 이용하여 다양한 목적 대사산물 생산을 위한 각종 미생물의 배양배지 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
배양배지, 대사산물, 대사흐름, 맨하이미아

Description

게놈정보 및 인실리코 분석을 이용한 배양배지의 제조방법{Method for Preparing Culture Media Using Genome Information and In Silico Analysis}
도 1은 본 발명에 따른 배양배지의 제조방법의 과정을 도시한 것이다.
도 2는 결실된 아미노산 합성 대사회로도이다 (도2a: 메티오닌; 도2b: 시스테인).
도 3은 결실된 비타민 합성 대사회로도이다 (도3a: 니코틴산; 도3b: 판토테네이트; 도3c: 피리독신; 도3d: 티아민).
도 4는 본 발명의 배양배지에서 배양한 맨하이미아 균주의 성장 그래프이다.
도 5는 본 발명의 배양배지에서 배양한 맨하이미아 균주의 숙신산 생산 그래프이다.
본 발명은 게놈정보 및 인실리코 분석을 이용한 배양배지의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈정보를 이용하여 대사회로를 구축하고, 상기 구축된 대사회로로부터 대사산물 중 하나를 제거하여 인실리코(in silco) 시뮬레이션을 이용한 대사흐름 분석을 수행함으로써 최소 합성 배양배지 성분을 선별한 후, 실제 배양을 통해 최종 배양배지를 결정하는 최소 합성 배양배지의 제조방법에 관한 것이다.
진핵세포 또는 원핵세포를 특수한 환경에서 배양하기 위해서는 여러 가지 영양분이 필요하다. 이러한 영양분의 요구도는 동물, 식물, 곤충 및 미생물의 종류에 따라서, 또는 배양 세포조직이나 기관의 종류에 따라 크게 다르기 때문에 배양에 필요한 배지 조성은 각각 다르다. 진핵세포 또는 원핵세포 배양의 경우에는 영양소, 호르몬, 성장인자 및 혈청 등이 적당히 배합된 배지가 필요하기 때문에, 일반적으로 배양하는 세포나 세포주의 것과 동일한 조직 추출액에 무기염류, 아미노산 및 비타민 등을 첨가하여 사용하고 있다.
혈청의 경우에는, 비록 혈청을 첨가하지 않고 인위적으로 알고 있는 구성성분을 배지에 첨가하여 배양하는 무혈청 배양법이 Sato 등에 의해서 확립되었으나 (Rizzino et al., PNAS, 75:1844, 1978), 최종 배양배지에는 여전히 화학적으로 구성성분을 알지 못하는 조직 추출액이 함유되어 있었다. 그러나, 조직 추출액에는 알려지지 않은 유해한 성분들이 존재할 수 있으며, 이러한 성분들은 세포나 세포주의 생장을 저해할 수 있다. 특히, 치료용 세포나 세포주 배양의 경우에는 환자에게 치명적인 위험을 미칠 가능성이 있으며, 생물의약품 생산의 경우에는 생산성 저해를 초래할 뿐 아니라 분리 및 정제 비용이 증가한다. 따라서, 동물, 식물 및 곤충 세포나 세포주의 배양을 통한 치료용 목적이나 생물의약품 생산의 경우, 사용상의 안전성 확보 및 세포나 세포주 내 배양배지 구성성분의 정확한 역할을 규명하기 위해서는 화학적으로 모든 구성성분을 알고 있는 배양배지의 개발이 필요하다.
미생물 배양의 경우에도 화학적으로 성분이 명확하게 규명되지 않은 펩톤 (peptone), 효모 추출물 (yeast extract), 옥수수 추출물 (corn steep liquor), 맥아 추출물, 육즙 및 혈청 등을 함유한 복합 배양배지 (complex medium)나 이들이 일부 포함된 유사 복합 배양배지 (semi-defined medium)를 주로 이용하여 왔다. 상기 성분들은 제조 일시, 제조원 및 제조 원료에 따라 함유한 조성 성분이 일정하지 않고, 일반적으로는 화학적으로 성분이 명확히 규명된 합성 배양배지 (synthetic medium, defined) 제조에 사용되는 화학물질보다 대부분 가격이 비싸다는 단점이 있다. 또한, 상기의 성분들을 함유한 복합 배양배지의 사용은 미생물 배양을 통한 일관된 품질의 제품 생산을 보장할 수 없으며, 복합 배양배지에 존재하는 알려지지 않은 성분들로 인하여 생산물의 분리 및 정제비용 증가를 초래한다. 이 중 일부 성분들은 세포의 성장 및 특정 대사산물의 생산을 저해하는 것으로 알려져 있다 (Zhang et al., App . Microbiol . Biotechnol., 51:407, 1997). 특히, 복합 배양배지의 알려지지 않은 구성 성분들은 정확한 세포 대사특성의 이해를 어렵게 함으로써, 대사 공학적 기술을 이용한 우수한 균주의 개발을 제한하고 있다.
이에 최근, 상기한 구성성분이 명확히 규명되지 않은 성분들을 함유한 복합 배양배지의 사용에 따른 여러 단점들을 극복하기 위하여 화학적으로 성분이 명확히 규명된 합성 배양배지의 개발을 위한 많은 연구가 진행되어 왔으며, 실제 미생물 발효를 통한 젖산이나 외래 다당류 (exopolysaccharide)의 생산에 합성 배양배지가 사용되고 있다 (Cocaign-Bousquet et al., J. Appl. Bacteriol., 79:108, 1995; Grobben et al., Appl . Environ . Microbiol., 64:1333, 2003).
현재까지 합성 배양배지 개발은 제한 배양배지에 세포 성장을 위하여 필요한 모든 영양 성분들을 포함하는 배양배지를 조성한 후, 각각의 성분들을 하나씩 순차적으로 제거하여 이들의 세포 성장에 영향을 미치는 성분들을 밝혀내는 단일삭제법 (single omission technique)을 사용하여 왔다 (Zhang et al., App. Microbiol. Biotechnol., 51:407, 1997). 하지만 이는 많은 시간, 노력 및 연구비용을 필요로하는 시행착오 (trial and error method)적인 방법이다. 따라서, 이를 보완하기 위하여, 다양한 통계학적인 방법들이 개발되어 세포 배양에 필요한 구성성분을 확인하는 기술들이 사용되고 있으나, 이들 방법 역시 시행착오적인 방법에 바탕을 두고 있으며, 성공 확률 또한 매우 낮다는 단점을 가지고 있다.
현재까지 통계학적인 방법으로 개발되어 적용되고 있는 기술로는 Plackett-Burman experimental design, fractional factorial experimental design, central composite experimental design 및 response surface technique 등이 있다 (Dasu et al., J. Microbiol . Biotechnol., 12:355, 2002; Dasu et al., J. Microbiol . Biotechnol ., 12:360, 2002; Mantha et al., Bioprocess Eng ., 19:285, 1998).
2003년 휴먼 게놈 프로젝트가 완료되어 인간 게놈 지도가 완성된 것을 비롯하여, 최근까지 300 여종 이상의 생물종에 대한 전체 게놈 서열이 밝혀졌다. 또한, 현재 수많은 생물종에 대한 게놈 서열을 밝히는 작업이 진행 중이며, 또한 밝혀진 게놈 정보를 바탕으로 세포의 대사 회로를 구축하는 연구가 활발히 진행 중이다 (Ng et al., PNAS, 97:12176, 2000; Ruepp et al., Nature, 407:466, 2000; Nierman et al., PNAS, 98:4136, 2001; Perna et al., Nature, 409:529, 2001; Adams et al., Science, 287:2185, 2000).
한편, 숙신산 (HOOCCH2CH2COOH)은 고기능성 기초 화학물질로서 중요한 화학물질의 전구체로부터 식료품 및 의약품에 이르기까지 산업적인 용도가 매우 다양하다 (Zeikus et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 51:545, 1999). 특히 최근 주요한 생분해성 고분자인 폴리아마이드 (polyamides) (Willke et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol., 66:131, 2004) 및 폴리부틸렌 숙시네이트 (polybutylene succinate) (Ajinomoto, Environ. Rep. 21, 2003)의 원료물질로서 숙신산의 사용 가능성이 증명됨에 따라 그 수요가 급격히 증대할 것으로 예상되고 있다.
숙신산은 화학적 합성 및 전통적인 발효에 의하여 생산할 수 있다. 식품 및 의약품 등 특수한 용도로 사용되는 소량의 숙신산만이 고전적인 미생물 발효법에 의하여 생산되고 있다. 하지만, 현재 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 액화 프로판 가스 (LPG) 혹은 원유에서 유래한 n-부탄 (butane)으로부터 합성되고 있으며, 상기의 화학적 숙신산 합성법은 다량의 유해성 폐기물, 폐용액 및 폐가스를 배출한다는 문제점이 있다. 특히 화석원료를 기초물질로서 사용한다는 한계를 가지고 있으며, 최근의 급격한 원유 가격의 상승은 숙신산 가격의 증가를 초래하고 있다.
아울러, 환경친화적인 공정에 대한 인류의 인식과 더불어 상기에서 기술한 화학적 숙신산 합성공정에 따른 문제점들을 해결하기 위하여 경제적이며 친환경적인 숙신산 생산 공정의 개발을 위한 연구가 많은 연구자들에 의해 수행되어 왔다. 이에, 최근 미생물을 이용하여 재생 가능한 원료로부터 숙신산을 발효하는 방법이 새로운 숙신산 생산 공정으로서 주목받고 있다.
발효법에 의한 숙신산 생산 연구는 발효공정 개발, 분리 및 정제공정 개발, 값싼 기질 및 우수한 균주 개발 등으로 나눌 수 있다. 현재 사용되는 주요 균주로는 재조합 대장균 (recombinant E. coli), Anaerobiospirillum 및 루멘 박테리아 (ruminal bacteria: Actinobacillus, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas 및 Succinivibrio 등)로 나눌 수 있다.
미국 시카고 대학 연구팀은 젖산 (lactic acid) 및 개미산 (formic acid) 생산에 관여하는 유전자들 (ldh, pfl)을 제거한 대장균 변이균주인 NZN111을 제조하였으며, 상기 균주에 포도당 전달시스템 유전자 (ptsG)를 조작한 변이균주인 AFP111 (ATCC No. 202021)을 제조하여 숙신산 생산 증가를 시도하였다 (미국특허 5,770,435). 또한, 본 발명자들은 숙신산 생산에 관여하는 말릭 유전자 (sfcA)를 NZN111 균주에 증폭함으로써 상기 균주에서 축적되는 피루브산 (pyruvic acid)을 효과적으로 제거함과 동시에 숙신산 생산을 증대하였다 (Hong et al., Biotechnol . Bioeng., 74:89, 2001). 또한, 미국 조지아 대학 연구팀은 Rhizobium etli 균주의 피루빈산 카를복실화 유전자 (pyc)를 AFP111 균주에 발현시킨 균주 (AFP111/pTrc99A-pyc)를 제조하여, 숙신산의 생산성 증가를 시도하였다 (Vemuri et al., J. Ind . Microbiol . Biotechnol ., 28:325, 2001). 특히, 최근에는 미국 라이스 대학 연구팀에 의하여, 글리콜리시스 (Glycolysis), 트라이카보실릭산 (TCA) 사이클 및 글리옥실레이트 (Glyoxylate) 경로에 관여하는 유전자를 조작한 대장균 변 이 균주들을 제조하여, 호기성 조건에서 숙신산 생산을 유도하였다 (Lin et al., Metabol . Eng ., 7:116, 2005; Lin et al., Biotechnol . Bioeng ., 90:775, 2005).
독일 사냥개의 식도 및 배설물에서 동정된 Anaerobiospirillum succiniciproducens 균주는 절대 협기성 조건에서 다량의 숙신산을 생산하는 능력을 가지고 있다 (Davis et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 26:498, 1976; Samuelov et al., Appl. Environ. Microbiol., 57:3013, 1991). 이에, 본 발명자들은 상기 균주를 이용하여 다양한 종류의 탄소원, 질소원 및 가스 성분들(CO2/H2)에 대한 숙신산 생산에 대한 연구를 수행하였다 (Lee et al., Enzyme Microbial Technol., 24:549, 1999; Lee et al., Biotechnol . Bioeng ., 72:41, 2001). 또한, Michigan Biotechnology Institute(MBI) International 연구 그룹은 상기 균주를 이용하여 숙신산 생산과 이의 정제공정을 개발하였다 (미국특허 5,521,075; 미국특허 5,168,055; 미국특허 5,143,834).
루멘 박테리아 중에서는 Actinobacillus 및 맨하이미아 균주에 대하여 상대적으로 많은 연구가 진행되고 있다. MBI 연구그룹은 Actinobacillus succinogenes 130Z 균주 (ATCC No. 55618) 및 상기 균주의 나트륨 모너플루오르아세테이트 저항성 변이 균주들을 개발하였으며, 이들을 고농도의 숙신산 생산공정에 이용하였다 (미국특허 5,504,004; 미국특허 5,573,931). 최근에는 상기 130Z 균주를 고분자 물질에 부착한 반응기를 제조하여 반복적인 회분식 배양을 통한 숙신산 생산 증대를 시도하였다 (Urbance et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 65:664, 2004). 본 발명자들은 고효율 숙신산 생산 균주인 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E를 한우로부터 동정하여 (Lee et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 58:663, 2002; KCTC0769BP, Korean Collection for Type Cultures), 이것의 2,314,078 base pairs로 이루어진 전체 게놈 최근에 서열을 발표하였다 (Hong et al ., Nature Biotechnol., 22:1275, 2004).
특히, 본 발명의 출원인은 상기 균주에서 젖산 탈수소화효소 유전자 (ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소 유전자 (pfl)를 결실시킨 Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP)를 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 LPK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자 (pta)와 아세트산 키나제 유전자 (ackA)를 결실시킨 변이균주인 Mannheimia sp. LPK7을 제조한 다음, 이를 혐기적 조건에서 배양하여 고수율로 숙신산을 생산한 바 있다 (WO 05/052135 A1). 상기에서 기술한 균주들을 이용한 숙신산 생산 공정은 화학적으로 성분이 명확하게 규명되지 않은 펩톤, 효모 추출 및 옥수수 추출 등을 포함한 복합 배양배지를 이용하여 왔다.
앞서 언급한 바와 같이, 복합 배양배지는 조성 성분이 일정하지 않으며, 합성 배양배지 제조에 사용되어지는 화학물질보다 가격이 비싸다는 단점을 가지고 있다. 또한 복합 배양배지의 사용은 세포 배양에 의한 일관된 품질의 제품 생산을 보장할 수 없으며, 복합 배양배지에 존재하는 알려지지 않은 성분들로 인하여 세포 배양 생산물의 분리 및 정제비용 증가를 초래한다. 이 중 일부 성분들은 세포의 성장 및 특정 대사산물의 생산을 저해할 뿐만 아니라, 복합 배양배지의 알려지지 않은 탄소원이나 질소원은 정확한 세포 대사특성의 이해를 어렵게 함으로써, 대사 공 학적 기술을 이용한 우수한 균주의 개발을 제한하고 있다.
이에, 단일삭제법을 이용하여 주요한 숙신산 생산 균주로 알려진 Actinobacillus succinogen의 합성 배양배지 개발 및 이를 이용한 균주의 배양에 관하여 최근에 보고된 바가 있다 (McKinlay et al., Appl. Environ. Microbiol., 71:6651, 2005). 상기의 합성 배양배지의 개발은, 상기 균주에 대한 전체적인 게놈 정보를 이용할 수 없으므로 기존에 발표된 타 균주의 합성 배양배지 정보를 이용함으로써 이루어졌다. 즉, 메탄 생성균주의 배양에 사용된 10 종류의 비타민을 함유한 비타민 혼합액을 비타민 영양 성분으로 사용하였으며, Haemophilus influenzae 균주의 배양에 사용된 12 종류의 아미노산을 함유한 아미노산 혼합액을 아미노산 영양 성분으로 사용하였다. 최종적으로, 상기의 아미노산 혼합액으로부터 각각의 아미노산을 제거함으로써 3 종류의 아미노산과 상기에서 기술한 10 종류의 비타민 혼합액을 함유한 합성 배양배지를 제조하였다. 하지만, 이는 기존의 단일삭제법을 이용한 하나의 예시일 뿐이다. 특히 상기의 배양배지는 12 종류의 아미노산과 10 종류의 비타민을 함유한 배양배지에서 얻은 50% 정도의 세포 성장속도를 보였다. 보다 최근에는, 단일삭제법을 이용하여 Lactobacillus plantarum 균주의 성장에 필요한 영양 성분들을 규명하였으며, 이를 게놈 정보를 이용한 대사 회로의 구축을 위한 기본 자료로 사용하였다 (Teusink et al., Appl. Environ. Microbiol., 71:7253, 2005). 그러나, 생물종의 게놈 정보로부터 세포나 세포주 성장에 필요한 영양 성분의 규명 및 이를 이용한 배양배지 개발에 대한 시도는 현재까지 이루어지지 못하고 있다.
따라서, 많은 시간, 노력 및 연구비용을 요구하는 기존의 단일삭제법이나 통계학적인 기법을 대체할 수 있는 보다 체계적이고 정확하며, 또한 연구비용을 획기적으로 줄일 수 있는 효과적인 새로운 원핵세포 또는 진핵세포 배양배지의 개발방법이 절실히 요구되고 있다. 이를 위해서는 확보한 생물종의 게놈 정보를 기초로 한 균주의 전체 대사 회로 구축이 선행되어야 하고, 상기에서 구축된 전체 대사 회로를 바탕으로, 진핵세포 또는 원핵세포의 성장 및 목적 대사산물 생산을 위하여 외부에서 반드시 공급되어야 하는 영양 성분들을 파악하여 이를 이용한 최소 및 최적 합성 배양배지의 제조가 필요하다. 특히 현재까지는 상기에서 기술한 게놈 정보를 이용한 전체 대사 회로를 바탕으로 진핵세포 또는 원핵세포의 배양배지 개발이 시도된 적이 없었다.
또한, 아미노산은 알라닌(alanine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민산(glutamic acid), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine) 및 루신(leucine)과 같은 아미노산 및 아스코빈산(ascorbic acid)과 같은 비타민이 주요 배양배지의 성분으로서 그 사용범위가 확대되고 있으나 아직 진핵세포 또는 원핵세포의 성장 및 목적 대사산물의 생산에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바 없었다.
이에, 본 발명자들은 보다 효율적인 진핵세포 또는 원핵세포 배양배지를 제조하기 위하여 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E 균주의 알려진 전체 게놈 정보를 바탕으로 만들어진 대사 회로를 이용하여, 세포 성장 및 목적 대사산물인 숙신산 생산에 필요한 영양 성분들을 규명하였으며, 이를 이용하여 화학적으로 성분이 명확히 규명된 최소 및 최적 합성 배양배지를 개발하고, 목적 대사산물을 합 성하는 배양배지의 기능을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈정보를 이용하여 대사회로를 구축하고, 상기 구축된 대사회로로부터 대사산물 중 하나를 제거하고 인실리코(in silco) 시뮬레이션을 이용하여 대사흐름 분석을 수행한 후 실제 배양을 통해 결하는 최소 합성 배양배지의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 숙신산 생산 맨하이미아 배양배지의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 배양배지를 이용한 숙신산의 생산방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 대상 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈 정보를 이용하여 대사회로를 구축하는 단계; (b) 상기 구축된 대사회로로부터 대사산물 중 하나를 제거하고, 인실리코(in silco) 시뮬레이션을 이용하여 대사 흐름 분석을 수행하는 단계; (c) 상기 인실리코 시뮬레이션 결과 목적 함수값이 0인 경우(여기서, 상기 목적함수는 상기 진핵세포 또는 원핵세포가 요구하는 구성성분을 어느 하나라도 생성하지 못하면 그 값을 0으로 함), 상기 제거된 대사산물을 최소 합성 배양배지 성분으로 결정하고, 목적 함수값이 0이 아니면 (b)단계로 회귀하는 단계; (d) 상기 대사산물을 스스로 합성하는 다른 생물종과의 비교를 통해 결실된 효소 및 해당 대사 반응식을 조사하여 해당 반응식이 존재하는 경우, 해당 대사산물을 외부에서 공급하지 않고도 내부적으로 생성 및 사용 가능한지 확인하는 단계; (e) 상기 (b) 내지 (d) 단계를 반복하여 결정된 최소 합성 배양배지 성분들을 인실리코 최소 합성 배양배지로 결정하는 단계; 및 (f) 상기 결정된 인실리코 최소 합성 배양배지에 상기 진핵세포 또는 원핵세포를 실제 배양한 다음, 최종 배양배지를 결정하는 단계를 포함하는 게놈정보 및 인실리코(in silico) 분석을 이용한 배양배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 숙신산 생성능을 가지는 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈정보를 이용하여 대사회로를 구축하는 단계; (b) 상기 구축된 대사회로로부터 대사산물 중 하나를 제거하고, 인실리코(in silico) 시뮬레이션을 이용하여 대사 흐름 분석을 수행하는 단계; (c) 상기 인실리코 시뮬레이션 결과 목적 함수값이 0인 경우(여기서, 상기 목적함수는 상기 진핵세포 또는 원핵세포가 요구하는 구성성분을 어느 하나라도 생성하지 못하면 그 값을 0으로 함), 상기 제거된 대사산물을 최소 합성 배양배지 성분으로 결정하고, 목적 함수값이 0이 아니면 (b)단계로 회귀하는 단계; (d) 상기 대사산물을 스스로 합성하는 다른 생물종과의 비교를 통해 결실된 효소 및 해당 대사 반응식을 조사하여 해당 반응식이 존재하는 경우, 해당 대사산물을 외부에서 공급하지 않고도 내부적으로 생성 및 사용 가능한지 확인하는 단계; (e) 상기 (b) 내지 (d) 단계를 반복하여 결정된 최소 합성 배양배지 성분들을 인실리코 최소 합성 배양배지로 결정하는 단계; 및 (f) 상기 결정된 인실리코 최소 합성 배양배지에 상기 숙신산 생성능을 가지는 진핵세포 또는 원핵세포를 실제 배양한 다음, 최종 배양배지를 결정하는 단계를 포함하는 게놈정보 및 인실리코 분석을 이용한 숙신산 생산용 배양배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (f)단계는 상기 인실리코(in silico) 최소 합성 배양배지에 특정 영양성분을 하나씩 추가하여 실제 배양함으로써 상기 진핵세포 또는 원핵세포의 최소 영양요구성을 확인한 다음 최종 배양배지를 결정하는 단계인 것을 특징으로 하고, 상기 (f)단계 다음에 상기 진핵세포 또는 원핵세포의 성장에 필수적이지는 않으나 성장을 촉진하는 성분을 상기 배지에 추가하여 최종 배양배지를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (b)단계의 인실리코 시뮬레이션은 포도당 또는 그 외의 탄소원을 포함하는 조건에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (a)단계의 숙신산 생성능을 가지는 원핵세포는 맨하이미아(Mannheimia) 속인 것을 특징으로 하고, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스(Mannheimia succiniciproduces MBEL55E: KCTC 0769BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (b)단계의 대사산물은 아미노산 또는 비타민인 것을 특징으로 하고, 상기 아미노산은 메티오닌(methionine) 또는 시스테인(cysteine)인 것을 특징으로 하며, 상기 비타민은 니코틴산(nicotinic acid), 판토테네이트(pantothenate), 피리독신(pyridoxine) 및 티아민(thiaimine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 성장을 촉진하는 성분은 아미노산, 비타민 및 핵산 으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 상기 아미노산은 알라닌(alanine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민산(glutamic acid), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트레오닌(threonine) 및 트립토판(tryptophane)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상이며, 상기 비타민은 아스코빈산(ascorbic acid), 바이오틴(biotin) 및 폴산(folic acid)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 상기 핵산은 우라실(uracil) 및 크산틴(xanthine)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 포도당 또는 포도당 이외의 탄소원, 메티오닌(methionine) 또는 시스테인(cysteine), 니코틴산(nicotinic acid), 판토테네이트(pantothenate), 피리독신(pyridoxine) 및 티아민(thiaimine)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비타민 및 핵산을 함유하는 숙신산 생산용 배양배지를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 숙신산 생산용 배양배지를 이용하여 숙신산 생성능을 가지는 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 전체 혹은 대사회로 구성이 가능할 정도의 일부 게놈 정보가 밝혀진 진핵세포 또는 원핵세포의 배양배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양배지의 개발방법은 숙신산 생산 미생물인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니고, 전체 또는 일부의 게놈 정보가 알려진 모든 생물종인 것을 특징으로 할 수 있다. 모든 생물종은 각각의 특이적인 게놈 정보를 가지고 있으며, 이를 이용하여 전체 대사 회로를 구성할 수 있다 (Forster et al., Genome Research, 13:244, 2003; Ma et al., Bioinformatics, 19:270, 2003; Becker et al., BMC Microbiol., 5:8, 2005). 또한 이를 이용하여 진핵세포 또는 원핵세포 성장 및 특정 대사산물의 생산에 필요한 영양성분을 예측하여 배양배지를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 전체 혹은 대사회로 구성이 가능할 정도로 밝혀진 일부 게놈 정보를 이용한 대사 회로를 바탕으로 진핵세포 또는 원핵세포 성장 및 목적 대사산물 생산에 필요한 최소 영양성분들을 선택한 다음, 이를 이용한 최소 합성 배양배지를 제조한 후, 필수적이지는 않으나 성장을 촉진하는 성분을 추가하여 진핵세포 또는 원핵세포 배양 및 목적 대사산물 생산을 위한 최적의 합성 배양배지를 제조하는 방법을 제공한다. 진핵세포 또는 원핵세포의 배양 및 목적 대사산물의 수득 과정은 통상적으로 알려진 배양방법, 대사산물의 분리 및 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 숙신산 생산 미생물인 맨하이미아 속 미생물만을 예시하였으나, 게놈 정보가 전체 혹은 대사회로 구성이 가능할 정도로 밝혀진 모든 종류의 진핵세포 또는 원핵세포에 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
본 발명에 있어서, 최소 합성 배양배지에 첨가되는 2개 아미노산과 4개 비타민은 진핵세포 또는 원핵세포 성장에 주요한 성분이다. 또한 상기 성분들을 포함한 최적 합성 배양배지에 첨가되는 10개 아미노산, 3개 비타민 및 2개 핵산은 일반적으로, 모든 진핵세포 및 원핵세포에 있어서 성장을 촉진시키는 효과가 있고, 주요배지 성분으로 그 사용이 확대되고 있으나, 상기 성분들에 국한되는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어서, 배양배지에 함유되는 아미노산, 비타민 및 핵산의 농도는 표 5 및 6에 기술된 농도가 가장 적합하나, 아미노산의 경우 0.1 ∼ 1.0 g/l, 비타민의 경우 0.001 ∼ 0.01 g/l, 핵산의 경우 0.005 ∼ 0.05 g/l로 함유하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 맨하이미아 대사회로의 구축 및 인실리코 분석
1) 대사 회로 구축
본 발명에서는 맨하이미아의 합성 배양배지를 개발하기 위하여 새로운 대사 회로를 구축하였다. 맨하이미아의 전체 게놈 정보에 근거하여 유전자 부위를 추정하고 각 유전자의 기능을 부여한 후 대사 관련 회로를 구성하는 방법을 사용하였으며, 이로부터 현재 세포의 대사 상태를 묘사하였다.
2) 인실리코 시뮬레이션을 이용한 대사 흐름 분석
맨하이미아의 성장 및 숙신산 생산을 위한 합성 배양배지 구성 성분을 예측하기 위하여, 상기 구축한 맨하이미아의 전체 대사 회로를 바탕으로 대사흐름 분석방법을 사용하였다.
모든 대사산물, 대사경로 및 경로에서의 화학양론 매트릭스 (stoichiometric matrix) (Sij T , j번째 반응에서 i번째 대사산물의 시간에 따른 화학양론 계수)가 알려져 있다면, 대사흐름 벡터 (vj , j 경로의 대사흐름)를 계산할 수 있는데, 시간에 따른 대사산물 농도 X의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다.
또한 시간에 따른 X의 변화량이 일정한, 즉 준정상상태 가정 하에서, 아래의 식으로 정의될 수 있다.
STv = dX/dt = 0
(여기서, STv는 시간에 따른 대사산물의 변화량, X는 대사산물의 농도 및 t는 시간임.)
이 때, 특정 대사반응의 흐름값은 특정범위로 한정될 수 있는 등의 여러 물리 화학적 제한식과 특정 목적함수를 이용하는 선형 계획법 (linear programming)을 이용하여 최적 대사흐름분포를 구하는 것이 가능하고, 아래와 같이 계산할 수 있다.
minimize/maximize : Z = ∑civi
이 때, STv= 0 이고, αmin ,i≤vi≤αmax ,i로 가정한다.
여기서, ci는 가중치이고, vi는 대사흐름이다. 일반적으로 균체 구성성분 최대화, 대사산물 생산 최대화 및 부산물 생산 최소화 등이 목적함수로 사용되고 있다. αmin,i 및αmax ,i 은 각 대사흐름이 가질 수 있는 제한값으로서, 각 대사흐름이 허용하는 최소값과 최대값을 지정할 수 있다. 특히 균체 구성성분 최대화의 경우 실제 세포가 나타내는 생리현상과 가장 유사하다고 보고된 바 있다 (Ibarra, R.U., Edwards, J.S., and Palsson, B.Ø., 2002).
상기 대사흐름 분석방법을 이용하여 실시예 2에서 최소 합성 배양배지를 결정하였다. 상기 대사흐름 분석은 MetaFluxNet 프로그램을 이용하여 실시하였다 (Lee et al., Bioinformatics, 19:2144, 2003).
실시예 2: 인실리코 분석을 이용한 최소 합성 배양배지의 성분 결정
맨하이미아의 전체 대사 회로로부터 가능한 대사산물 섭취를 하나씩 제거한 상태에서 대사흐름 분석을 수행하여 균체 구성성분을 생성하는데 문제가 없는지를 확인하였다. 이 때, 탄소원은 포도당을 기본으로 포함시켰으며, 대사산물 섭취를 제거하기 위한 방법으로써 해당 대사산물의 섭취 속도 (uptake rate)를 0으로 설정하였다. 또한 대사흐름 분석을 위한 목적함수는 균체 구성성분을 사용하였다. 만약 다른 탄소원에서의 합성 배양배지를 예측하는 경우 해당 탄소원을 기본적으로 포함시킨 상태에서 대사흐름 분석을 수행하였다.
해당 대사산물을 제거하였을 때 균체가 요구하는 구성성분을 어느 하나라도 생성하지 못하여 대사흐름 분석결과로서 목적함수 값이 0 이 되는 경우 맨하이미아의 대사 회로로부터 예측된 최소 합성 배양배지 후보로 정하였다. 이는 후보 성분 물질들의 합성이 가능하여, 세포 성장이 가능한지의 여부를 확인하는 것이다. 이에 따라, 대사흐름 분석을 통하여 해당 성분물질이 생산되는 경우 배양배지를 통하여 공급할 필요가 없다고 판단하였고, 반대로 대사흐름 분석을 통하여 특정 성분물질의 결핍 시 균체의 구성성분을 생성하지 못한다면 배양배지로부터 반드시 공급되어야 하는 성분물질로 판단하였다.
또한, 해당 대사산물을 생성하지 못하는 이유를 찾기 위해 다른 생물종들, 즉 해당 대사산물을 스스로 합성하여 사용하는 생물종과의 비교 및 분석을 통해 결실된 효소 및 해당 대사 반응식을 찾고, 해당 반응식이 존재하는 경우 해당 대사산물을 외부에서 공급하지 않고 내부적으로 충분이 생성이 가능하여 이의 사용여부를 확인하여 최종적인 인실리코 (in silico) 최소 합성 배양배지를 결정하였다.
다음으로, 해당 인실리코 최소 합성 배양배지를 기본으로 사용하여 실제 배양을 수행하였다. 실제 세포는 비타민, 아미노산, 핵산 등 모든 성분들을 필요로 하고, 세포에 따라서 스스로 합성하거나, 합성할 수 있는 능력이 없을 경우에는 외부에서 공급받아 사용하게 된다. 실험에서는, 특정 성분 물질에 대한 해당 대사 네트워크가 존재하여도 세포의 조절기작에 의해 필요로 하는 수준 이상으로 해당 합성 유전자가 발현되지 않아 배양배지를 통해서 공급되어야 세포의 성장이 촉진되는 경우가 존재하므로, 이와 같은 경우를 위하여, 인실리코 최소 합성 배양배지에 특정 영양 성분물질들을 하나씩 추가함으로써 최종적으로 실제 배양실험을 통하여 해당 균주의 최소 영양요구성을 확인하였다.
또한, 최소 합성 배양배지를 결정한 후, 이를 기준으로 균주의 성장에 필수적이지는 않지만 성장을 촉진하는 성분을 찾아 최적화된 합성 배양배지를 결정하였다. 이는 상기에서 기술한 인실리코 최소 합성 배양배지에 특정 영양 성분물질들을 하나씩 추가함으로써 얻은 결과를 이용하였다. 이와 같이 대사흐름을 통하여 합성 배양배지를 위한 후보 성분물질을 찾는 방법은 단순히 후보 성분 물질 근방의 대사회로가 존재하는 가를 찾는 방법과는 달리 직관적으로 드러나지 않는 결실된 대사회로에 의한 영향까지 고려할 수 있다는 장점이 있다.
1) 아미노산
맨하이미아 대사 회로의 경우 아래 표 1에 기재된 아미노산 성분들의 합성경로 중 일부가 결손되어 이들 해당 성분 물질들을 합성하기 위한 대사흐름이 불가능함을 알 수 있다. 따라서 표 1에 기재된 성분 물질들을 최소 합성 배양배지에 반드시 첨가하여야 한다.
Figure 112006031786713-pat00001
그러나, 아미노산 합성 대사 회로가 존재하여도 세포의 조절기작에 의해 필요로 하는 수준 이상으로 해당 유전자가 발현되지 않아 배지를 통해서 섭취하여 세포의 성장이 촉진되는 경우가 존재할 수 있으므로, 실제 실험을 통하여 최적의 세포 성장을 위한 해당 아미노산 영양성분들의 요구성을 확인하는 것이 필요하였다.
이에 따라, 맨하이미아 대사회로부터 결실된 효소 및 대사 반응식을 조사한 결과, 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, Methionine의 경우 homoserine O-succinyltransferase (E. C. 2.3.1.46), Cysteine의 경우 3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase/ adenylyl-sulfate kinase (E. C. 3.1.3.7/E. C. 2.7.1.25)가 결실되어 있음을 확인하였다.
2) 비타민
비타민의 경우 nicotinic acid, pantothenate, pyridoxine 및 thiamine의 생합성 경로가 존재하지 않으므로 상기의 성분들을 대사흐름을 통하여 합성할 수 없음을 확인하였다. 따라서 표 2에 기재된 성분 물질들을 합성 배양배지에 반드시 첨가하였다.
Figure 112006031786713-pat00002
이에 따라, 맨하이미아 대사회로부터 결실된 효소 및 대사 반응식을 조사한 결과, 도 3a 내지 3d에 나타난 바와 같이, 결실된 효소에 의하여 상기 표2에 기재된 해당 대사산물을 외부에서 필요로 한다는 것을 알 수 있었다.
3) 핵산
핵산의 경우 모든 생합성 경로가 존재함을 확인하였으며 세포 성장을 위하여 배양배지로부터 반드시 공급되어야만 하는 필요한 성분은 없는 것으로 나타났다. 그러나, 핵산 합성 대사 회로가 존재하여도 세포의 조절기작에 의해 필요로 하는 수준 이상으로 해당 유전자가 발현되지 않아 배지를 통해서 섭취하여 세포의 성장이 촉진되는 경우가 존재할 수 있으므로 실제 실험을 통하여 최적의 세포 성장을 위한 해당 핵산 영양성분들의 요구성 확인하는 것은 필요하다.
실시예 3: 본 발명에 따른 배양배지의 제조
1) 액체 배양배지 조성
실시예 1 및 2에서 게놈 정보를 이용한 전체 대사 회로를 바탕으로 획득한 세포 성장 및 영양 성분물질들에 관한 정보를 이용하여, 필요한 성분 물질들을 예측하였다. 또한, 실제 실험을 통하여 맨하이미아 성장 및 숙신산 생산을 위하여 요구되어지는 영양성분들을 확인하였다. 이를 바탕으로 최소 및 최적 합성 배양배지를 개발하였다. 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E 균주의 배양에 사용된 제한 배양배지, 복합 배양배지, 최소 합성 배양배지 그리고 최적 합성 배양배지 성분들의 조성은 표 3, 4, 5 및 6과 같다.
최소 합성 배양배지의 조성은 상기에서 구축한 대사 회로를 분석하여 세포가 자체적으로 생산할 수 없는 2개의 아미노산과 4개의 비타민을 1차적으로 선정하여, 이를 제한 배양배지에 첨가하여 제조하였다. 또한, 최소 합성 배양배지에서 상기에서 기술한 각각의 성분들을 제거한 배양배지에서 세포의 성장 및 숙신산 생산이 없음을 확인함으로써 완성하였다.
최적 합성 배양배지는 최소 합성 배양배지에 18개의 아미노산, 10개의 비타민 및 6개의 핵산을 하나씩 첨가한 후 세포를 배양하여, 최소 합성 배양배지보다 세포성장이나 숙신산 생산이 향상된 15개의 성분들을 2차적으로 선정하여 제조하였다.
제한 배양배지, 복합 배양배지, 최소 합성 배양배지 및 최적 합성 배양배지는 다음과 같이 제조하였다.
Figure 112006031786713-pat00003
Figure 112006031786713-pat00004
3차 증류수에 상기 표 3 및 4의 조성과 농도를 갖는 제한 배양배지 및 복합 배양배지 영양 성분들을 각각 첨가하여 녹였다. 상기 배양배지의 pH는 5N NaOH 용액을 사용하여 7로 조정하였다. 준비된 상기 배양배지를 유리 삼각 플라스크에 넣고 10분 동안 이산화탄소 (CO2) 가스를 플라스크 내로 주입한 후 마개를 이용하여 밀봉하였다. 이산화탄소 가스가 주입 된 상기 제한 배양배지 및 복합 배양배지를 가압 및 고온 멸균 (121℃, 15분)하고, 이를 상온으로 식힌 후 배양배지로 사용하였다. 상기 복합 배양배지에 첨가된 효모 추출물(yeast extract)은 Becton, Dickinson and Company (Sparks, MD, USA)에서 제조 및 판매되는 BactoTM Yeast Extract를 사용하였다.
Figure 112006031786713-pat00005
Figure 112006031786713-pat00006
최소 및 최적 합성 배양배지는 상기 표 5와 6의 조성과 농도를 갖는 아미노산, 비타민 및 핵산 혼합액을 제한 배양배지에 첨가하여 제조하였다. 상기 배양배지의 pH는 5N NaOH 용액을 사용하여 7로 조정하였다. 합성 배양배지 제조에 사용된 혼합용액은 아미노산 농축액으로부터 각각 1ml씩, 비타민 농축액으로부터 각각 0.5ml씩, 핵산 농축액으로부터 각각 0.5ml씩 첨가하여 만들었으며, 상기 혼합용액은 세공의 크기가 0.2 ㎛인 멸균 필터를 이용하여 제균 후 사용하였다.
실시예 4: 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E 균주의 배양 및 숙신산 농도 분석
1) 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E 균주의 배양
상기 균주의 배양은 시험관 튜브 배양, 플라스크 배양 및 발효기 배양으로 나뉘어져 있다. 시험관 튜브 배양은 80 ml 부피의 혐기성 균주 배양 시험관 튜브에 상기 배양배지 20 ml을 옮긴 후, -70°C 이하에서 보관된 맨하이미아 균주 1 ml을 시험관 튜브에 접종함으로써 이루어졌다. 상기 -70°C 이하에서 보관된 맨하이미아 균주의 경우, 복합 배양배지에서 배양되었다. 따라서 복합 배양배지 성분으로 사용되는 효모 추출 성분이 잔류하고 있으므로, 상기 효모 추출 성분을 균주로부터 제거하기 위하여 최초 접종 시 세척작업을 수행하였다. 세척작업은 원심분리기를 이용하여 5,000 rpm, 4℃에서 5 분간 접종액을 원심분리하여 상등액을 버린 후 해당 배양배지를 이용하여 세척하였다. 세척작업은 3회 실시하였다. 접종된 시험관 튜브는 이산화탄소 가스가 주입된 후, 39℃ 배양기에서 광학밀도(OD600) 1.5에 이를때까지 배양하였다. 세포의 새로운 해당 배양배지에 대한 적응력을 향상시키고 활성을 촉진하기 위하여 10회의 계대 배양을 실시하였다. 상기 배양액을 30% (w/v) 글리세롤 (glycerol) 용액과 1:1 (v/v)로 혼합하여 -70°C 이하에서 보관 후, 추후 실험에서 접종 균주로 사용하였다.
상기의 접종 균주를 시험관 튜브에서 광학밀도 (OD600) 1.0까지 배양한 배양액 2.5ml을 250ml 배양배지를 함유한 500ml 플라스크에 접종함으로써 플라스크 배양을 실시하였다. 상기의 플라스크 배양은 시험관 튜브 배양의 조건과 동일하게 하였다.
발효기 배양은 2.5 liter 배양배지를 함유한 6.6 liter Bioflo 3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)를 이용하여 실시하였다. 플라스크 배양액 250ml을 접종 균주로 사용하였으며, 발효기내 배양액의 pH는 암모니아 용액을 이용하여 6.5로 자동 조절하였다. 1.25 l/min의 이산화탄소를 연속적으로 공급함으로써 발효기내 혐기성 조건을 유지할 뿐 아니라 세포 성장 및 숙신산 생산에 필요한 이산화탄소를 제공하였다. 발효기 내 임펠러 (impeller) 회전속도를 250 rpm으로 고정하여 배양액의 완전한 혼합상태를 유도하였다.
2) 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E 균주에 따른 숙신산 농도 분석
발효기로부터 배양액 20ml씩 채취하여 분석에 이용하였다. 분광광도계(Spectrophotometer / Pharmacia Biotech, Cambridge, England)를 이용하여 광학밀도를 측정함으로써 맨하이미아 균주의 성장 정도를 측정하였다. 광학밀도 측정은 분광광도계 600nm의 파장 (wavelength)에서 수행하였다.
소모된 포도당, 생산된 숙신산 및 각종 유기산들의 농도는, HPLC(High performance liquid chromatography / Hitachi Co., Tokyo, Japan with an Aminex HPX-87H column)을 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 샘플은 12,000 rpm으로 6 분 동안 원심분리한 후, 이의 상등액을 세공의 크기가 0.2 ㎛인 멸균 필터를 이용하여 세포를 제거한 후 획득하였다.
실시예 5: 본 발명에 따른 합성 배양배지의 효과
제조된 합성 배양배지의 효과를 확인하기 위하여, 상기의 복합 배양배지, 제한 배양배지, 최소 합성 배양배지 및 최적 합성 배양배지에서 맨하이미아 균주를 실시예 4와 같이 배양한 결과, 도 4 및 5에서 나타난 바와 같이 제한 배양배지에서 배양된 균주의 경우에는 세포 성장 및 숙신산 생산이 관찰되지 않았다.
그러나, 본 발명에 따른 최소 및 최적 합성 배양배지에서 배양된 균주들의 경우, 세포의 성장이 확인되었다. 특히, 최적 합성 배양배지에서 배양된 균주의 경우, 일반적으로 사용되는 복합 배양배지에서 배양된 균주보다 최종 세포농도가 51% 더 높았으며, 최종 숙신산 농도 역시 13% 높음을 알 수 있었다. 특히, 숙신산 생산성은 최적 합성 배양배지에서 복합 배양배지보다 55% 높은 값을 보였다. 이는 최적 합성 배양배지의 사용이 균주의 성장 및 숙신산 생산을 촉진함을 나타내는 것이다.
Figure 112006031786713-pat00007
이러한 본 발명에 따른 최소 및 최적 합성 배양배지에서 효과는 상기 표 7에 나타난 결과를 통하여 더욱 뒷받침되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 인실리코 분석을 이용하여 전체 혹은 대사회로 구성이 가능할 정도의 일부 게놈 정보가 밝혀진 원핵세포 또는 진핵세포의 배양배지의 제조 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 배양배지의 제조방법은 종래 배양배지 제조방법에 비하여 체계적이고 정확하면서도, 제조에 소요되는 시간, 노력 및 비용을 획기적으로 줄일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 배양배지는 숙신산 생성 미생물 성장 및 숙신산을 생산하는데 유용하다. 따라서, 게놈 정보를 바탕으로 만들어진 대사회로를 이용하여 다양한 목적 대사산물 생산을 위한 각종 미생물의 배양배지 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

  1. 다음 단계를 포함하는 게놈정보 및 인실리코(in silico) 분석을 이용한 배양배지의 제조방법:
    (a) 대상 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈 정보를 이용하여 대사회로를 구축하는 단계;
    (b) 상기 구축된 대사회로로부터 대사산물 중 하나를 제거하고, 인실리코(in silco) 시뮬레이션을 이용하여 대사 흐름 분석을 수행하는 단계;
    (c) 상기 인실리코 시뮬레이션 결과 목적 함수값이 0인 경우(여기서, 상기 목적함수는 상기 진핵세포 또는 원핵세포가 요구하는 구성성분을 어느 하나라도 생성하지 못하면 그 값을 0으로 함), 상기 제거된 대사산물을 최소 합성 배양배지 성분으로 결정하고, 목적 함수값이 0이 아니면 (b)단계로 회귀하는 단계;
    (d) 상기 대사산물을 스스로 합성하는 다른 생물종과의 비교를 통해 결실된 효소 및 해당 대사 반응식을 조사하여 해당 반응식이 존재하는 경우, 해당 대사산물을 외부에서 공급하지 않고도 내부적으로 생성 및 사용 가능한지 확인하는 단계;
    (e) 상기 (b) 내지 (d) 단계를 반복하여 결정된 최소 합성 배양배지 성분들을 인실리코 최소 합성 배양배지로 결정하는 단계; 및
    (f) 상기 결정된 인실리코 최소 합성 배양배지에 상기 진핵세포 또는 원핵세포를 실제 배양한 다음, 최종 배양배지를 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (f)단계는 상기 인실리코 최소 합성 배양배지에 특정 영양성분을 하나씩 추가하여 실제 배양함으로써 상기 진핵세포 또는 원핵세포의 최소 영양요구성을 확인한 다음, 최종 배양배지를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (f)단계 다음에 상기 진핵세포 또는 원핵세포의 성장에 필수적이지는 않으나 성장을 촉진하는 성분을 상기 배지에 추가하여 최종 배양배지를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 인실리코 시뮬레이션은 포도당 또는 그 외의 탄소원을 포함하는 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 다음 단계를 포함하는 게놈정보 및 인실리코 분석을 이용한 숙신산 생산용 배양배지의 제조방법:
    (a) 숙신산 생성능을 가지는 진핵세포 또는 원핵세포의 게놈정보를 이용하여 대사회로를 구축하는 단계;
    (b) 상기 구축된 대사회로로부터 대사산물 중 하나를 제거하고, 인실리코(in silico) 시뮬레이션을 이용하여 대사 흐름 분석을 수행하는 단계;
    (c) 상기 인실리코 시뮬레이션 결과 목적 함수값이 0인 경우(여기서, 상기 목적함수는 상기 진핵세포 또는 원핵세포가 요구하는 구성성분을 어느 하나라도 생성하지 못하면 그 값을 0으로 함), 상기 제거된 대사산물을 최소 합성 배양배지 성분으로 결정하고, 목적 함수값이 0이 아니면 (b)단계로 회귀하는 단계;
    (d) 상기 대사산물을 스스로 합성하는 다른 생물종과의 비교를 통해 결실된 효소 및 해당 대사 반응식을 조사하여 해당 반응식이 존재하는 경우, 해당 대사산물을 외부에서 공급하지 않고도 내부적으로 생성 및 사용 가능한지 확인하는 단계;
    (e) 상기 (b) 내지 (d) 단계를 반복하여 결정된 최소 합성 배양배지 성분들을 인실리코 최소 합성 배양배지로 결정하는 단계; 및
    (f) 상기 결정된 인실리코 최소 합성 배양배지에 상기 숙신산 생성능을 가지는 진핵세포 또는 원핵세포를 실제 배양한 다음, 최종 배양배지를 결정하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (f)단계는 상기 인실리코(in silico) 최소 합성 배양배지에 특정 영양성분을 하나씩 추가하여 실제 배양함으로써 상기 진핵세포 또는 원핵세포의 최소 영양요구성을 확인한 다음, 최종 배양배지를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 (f)단계 다음에 상기 진핵세포 또는 원핵세포의 성장에 필수적이지는 않으나 성장을 촉진하는 성분을 상기 배지에 추가하여 최종 배양배지를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, (b)단계의 인실리코 시뮬레이션은 포도당 또는 그 외의 탄소원을 포함하는 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, (a)단계의 숙신산 생성능을 가지는 원핵세포는 맨하이미아(Mannheimia) 속인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 맨하이미아(Mannheimia) 속은 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스(Mannheimia succiniciproduces MBEL55E: KCTC 0769BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, (b) 단계의 대사산물은 아미노산 또는 비타민인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 아미노산은 메티오닌(methionine) 또는 시스테인(cysteine)인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 비타민은 니코틴산(nicotinic acid), 판토테네이트(pantothenate), 피리독신(pyridoxine) 및 티아민(thiaimine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 성장을 촉진하는 성분은 아미노산, 비타민 및 핵산으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아미노산은 알라닌(alanine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민산(glutamic acid), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트레오닌(threonine) 및 트립토판(tryptophane)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 비타민은 아스코빈산(ascorbic acid), 바이오틴(biotin) 및 폴산(folic acid)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 핵산은 우라실(uracil) 및 크산틴(xanthine)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 포도당 또는 포도당 이외의 탄소원, 메티오닌(methionine) 또는 시스테인(cysteine), 니코틴산(nicotinic acid), 판토테네이트(pantothenate), 피리독신(pyridoxine) 및 티아민(thiaimine)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비타민 및 핵산을 함유하는 숙신산 생산용 배양배지.
  19. 제18항의 숙신산 생산용 배양배지를 이용하여 숙신산 생성능을 가지는 균주 를 배양하고, 그 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법.
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