BR112017000940B1 - Célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada, grampositiva anaeróbica facultativa, produtora de (s)-lático e pertencente a espécie geobacillus thermoglucosidans, bem como processo para produção de ácido (s)-lático enantiomérico puro - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma célula bacteriana termofílica engenheirada geneticamente que é anaeróbica facultativa e produzindo ácido (s)-lático compreendendo inativação ou supressão do gene endógeno metil glioxal sintase mgsa.

Description

[0001] A presente invenção refere-se à modificação de uma célula bacteriana termofílica para produção de ácido (S)-lático homolático ou enantiopuro, uma célula modificada geneticamente e um processo para produzir ácido (S)-lático enantiomérico puro.

[0002] Ácido lático e seus sais, conhecidos como lactatos, são produtos comercialmente viáveis úteis em vários campos incluindo medicina, polímeros biodegradáveis e processamento de alimento. Bactérias termofílicas, como Geobacillus, que são anaeróbicas facultativas parecem organismos ideais para a fabricação industrial de ácido lático. Elas são capazes de crescer em temperaturas entre 3775°C, com um ótimo em 55-65°C (Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446) e permitem fermentação industrial anaeróbica em temperaturas acima de 50°C. Esta alta temperatura tem várias vantagens quando fermentando em escala industrial: menos risco de infecções e assim maior pureza enantiomérica, reações mais rápidas, menores custos de resfriamento, etc. A natureza anaeróbica facultativa dos Geobacilli permite fermentação sob condições anaeróbicas, ou pelo menos sob uma baixa pressão parcial de oxigênio, que para escala industrial é desejável porque permite equipamento e processamento relativamente baratos. Além disso, os requisitos de nutrientes destas bactérias têm menos demandas do que aqueles de bactérias de ácido lático tais como espécies Lactobacillus que também permitem processos industriais relativamente baratos.

[0003] Espécies Geobacillus que são anaeróbicas facultativas são conhecidas produzirem ácido lático quando crescidas sob condições anaeróbicas, ou pelo menos sob uma baixa pressão parcial de oxigênio. Exemplos são G. caldotenax, G. caldoxylosilyticus, G. debilis, G. kaustophilus, G. pallidus, G. stearothermophilus, G. tepidimans, G. thermodenitrificans, G. thermoglucosidans, G. thermoleovorans, G. toebii, G. tropicalis.

[0004] G. termoglucosidans pode produzir ácido lático a partir de xilose, arabinose, glicose, frutose, sucrose e celobiose (Green et al., 2003, WO03/008601). Para aplicações industriais estoques de alimentação contendo sucrose, glicose, xilose, ou arabinose, ou suas misturas, são mais relevantes. A habilidade para utilizar simultaneamente glicose e xilose (Green et al., 2003, WO03/008601) é uma importante vantagem de G. thermoglucosidans quando usando açúcares fermentáveis derivados de estoques de alimentação lignocelulósicos.

[0005] Uma desvantagem das conhecidas espécies Geobacillus que é anaeróbica facultativa é o fato de que elas têm uma fermentação ácida mista, produzindo ácido lático, etanol, ácido acético, e ácido fórmico como principais produtos de fermentação. Neste pedido de patente o termo ácidos orgânicos também é pretendido incluir seus correspondentes sais.

[0006] Uma outra desvantagem é que maioria das espécies não produz ácido lático enantiomérico puro. Pureza quiral é um aspecto importante para a produção de polímeros de ácido poli lático. Por isso, é essencial produzir ácido (S)-lático enantio puro para aplicações comerciais. Entretanto, atualmente somente limitada informação é disponível sobre a pureza enantio do ácido lático produzido por espécies Geobacillus. É para ser entendido que outros termos para ácido (S)- lático são ácido L-lático ou ácido L(+)-lático. Neste pedido de patente estes termos são usados intercambiavelmente. Similarmente, os termos ácido (R)-lático, ácido D-lático e ácido D(-)-lático são usados intercambiavelmente.

[0007] Payton & Hartley mostram que G. stearothermophilus PSII tem um perfil de fermentação de ácido misto produzindo ácido (S)-lático, ácido acético, e etanol quando crescida sobre glicose em condições de frasco de agitação e pH não controlado (Payton & Hartley, 1985, FEMS Microbiol. Lett. 26:333-336). Pureza quiral não é mencionada. Posteriores estudos mostram que PSII e seus derivados são atípicas para G. steraothermophilus e parecem relacionadas mais de perto a G. caldotenax (Amartey et al., 1991, Biotechnol. Lett. 13:621-626; Green et al., 2001, WO 01/49865). O baixo rendimento torna esta linhagem imprópria para aplicação industrial.

[0008] Danner et al. mostram produção de ácido (S)-lático por G. stearothermophilus IFA6 e IFA9 a partir de sucrose e glicose (Danner et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72:895-903). Linhagem IFA6 produz significantes quantidades de subprodutos etanol, ácido acético e ácido fórmico a partir de glicose, enquanto a linhagem IFA9 não produz. Pureza quiral foi reportada entre 99,22 e 99,85% para IFA6 e 99,4% para IFA9, quando crescida sobre glicose (Danner et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72:895-903). Condições de cultura foram baseadas no uso de meio rico contendo extrato de levedura e peptona caseína, que não são desejáveis para produção industrial. Comparada à linhagem IFA6 linhagem IFA9 tem reduzida produtividade em maiores concentrações de produto, tornando a mesma menos apropriada para produção industrial. Em adição, linhagem IFA6 sofreu de um baixo rendimento, tornando-a também imprópria para produção industrial.

[0009] Rao & Satyanarayana mostram produção de ácido lático com G. thermoleovorans, mas não comenta sobre rendimento nem pureza quiral (Rao & Satyanarayana, 2009, Appl. Biochem. Biotechnol. 159:464-477).

[0010] Green et al. mostram produção de ácido (S)-lático com G. thermoglucosidans LN-9 com uma pureza quiral de 99,2% e um rendimento de 0,7 g/g em condições de frasco de agitação de pH não controlado (Green et al., 2003, WO 03/008601). O baixo rendimento a torna imprópria para aplicações industriais.

[0011] Atkinson et al. demonstram produção de ácido lático com G. thermoglucosidans NCIMB 11955 a partir de xilose ou glicose com significantes quantidades de etanol, ácido acético e ácido fórmico como subprodutos (Atkinson et al., 2006, WO 2006/117536). Rendimento sobre glicose foi de 0,64 g/g, que é muito baixo para aplicação industrial. Pureza quiral não foi mostrada.

[0012] Tang et al. demonstram produção de ácido (S)-lático com G. thermoglucosidans M10EXG. Sob condições microaeróbicas ácido lático foi o principal produto, com ácido acético, etanol, e ácido fórmico como subprodutos significantes. Sob condições anaeróbicas ácido fórmico foi o principal produto, com ácido lático, ácido acético, e etanol como principais subprodutos. Os rendimentos descritos são muito baixos para aplicação industrial. A pureza quiral do ácido (S)-lático foi reportada ser >99% (Tang et al., 2009, Biotechnol. Lett. 102:13771386).

[0013] G. thermoglucosidans é descrita como uma espécie Bacillus termofílica (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495; Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446; Coorevits et al., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485). G. thermoglucosidans foi anteriormente conhecida como Bacillus thermoglucosidasius (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495), que foi renomeada para G. thermoglucosidasius por Nazina et al. em 2001 (Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446), e mais tarde renomeada para G. thermoglucosidans por Coorevits et al. (Coorevits et al., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485). O tipo de linhagem foi isolado do solo (Suzuki et al., 1976, Appl. Environ. Microbiol. 31:807-812). Embora originalmente reportada como estritamente aeróbica, estudos posteriores reportaram crescimento anaeróbico facultativo e produção de ácido (S)-lático (Green et al., 2003, WO 03/008601; Fong et al., 2006, Extremophiles 10:363-372). Faixa de temperatura está entre 42 e 69oC, com um ótimo de 62oC (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487495). Modificação genética de G. thermoglucosidans para produção de etanol foi reportada (Green et al., 2001, WO 01/49865; Atkinson et al., 2008, WO08/038019). Isto inclui descrição das ferramentas genéticas para G. thermoglucosidans DSM 2542T e um processo para interromper o gene L-lactato desidrogenase (Idh) (Atkinson et al., 2006/WO2006/117536 e 2008, WO2008, 038019). Caminhos metabólicos e fluxos para células crescidas sobre xilose e glicose foram reportados para G. thermoglucosidans M10EXG (Tang et al. 2009, Biotechnol. Lett. 102: 1377-1386).

[0014] No laboratório foi observado que pureza quiral do ácido produzido por G. thermoglucosidans DSM 2542 pode variar, dependendo da composição de meio e/ou fonte de açúcar. Foi visto purezas quirais de ácido (S)-lático entre 89 e >99%. Entretanto, para flexibilidade em escolha de substrato e composição de meio existe uma necessidade de um derivado que produza ácido (S)-lático enantiopuro sob todas as condições industriais relevantes.

[0015] Pode ser concluído a partir do anterior que linhagens Geobacillus conhecidas têm uma fermentação ácida mista e não mostram produção de ácido lático enantiopuro e homolático.

[0016] Existe uma clara necessidade de se ser capaz de usar linhagens bacterianas (por exemplo, linhagens Geobacillus) para produção de ácido lático enantiopuro e homolático que tem atraentes características para aplicação industrial, tais como baixas necessidades de nutrientes, amplas capacidades de consumo de açúcar, a capacidade de produzir enzimas carboidrolíticas, alta taxa de crescimento, alta produtividade, resistência para tensão osmótica, e acessibilidade genética.

[0017] Um dos objetivos da presente invenção é produzir uma célula bacteriana termofílica que é anaeróbica facultativa e produz ácido (S)-lático através de fermentação homolática.

[0018] Um outro objetivo da presente invenção é produzir uma célula bacteriana termofílica que é anaeróbica facultativa e produz ácido (S)-lático enantiopuro.

[0019] Rendimento de ácido (S)-lático e pureza quiral na produção de ácido lático com espécies Geobacillus que são anaeróbicas facultativas podem variar dependendo da linhagem e as condições de cultura. Por isso, existe uma necessidade de uma Geobacillus aperfeiçoada que seja modificada para produzir ácido (S)-lático quiral puro em uma maneira homolática.

[0020] Existem várias opções que podem resultar em impureza quiral como descrito na literatura. Ácido (R)-lático pode ser formado a partir de piruvato através de atividade de uma D-lactato desidrogenase, ele pode ser formado de ácido (S)-lático através da atividade de uma lactato racemase, ou ele pode ser formado através de caminho metil glioxal.

[0021] Metil glioxal sintase (E.C. 4.2.99.11) catalisa a conversão de diidróxi acetona fosfato a metil glioxal e ortofosfato na primeira etapa do desvio metil glioxal. A seguir, metil glioxal pode ser convertido via dois caminhos diferentes a ácido (S)- ou (R)-lático. Por isso, o desvio metil glioxal pode ser uma fonte de contaminação quiral para produção de ambos, ácido (S)- e (R)-lático. Em Escherichia coli interrupção do gene mgsA codificando metil glioxal sintase aperfeiçoou a pureza quiral para produção de ambos, ácido (S)- e (R)-lático (Grabar et al., 2006, Biotechnol. Lett. 28:1527-1535). Em Gram-positivas pouco é conhecido sobre a atividade do caminho metil glioxal. No Bacillus subtilis mesofílico o gene mgsA é codificado em um óperon junto com genes codificando as primeiras duas enzimas em biossíntese bacilitiol (Gaballa et al., 2010, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 107:6482-6486; Helmann, 2011, Antioxidants & Redox signaling 15:123-133). Recentemente, Chandrangsu et al. demonstraram que bacilitiol está envolvido em detoxificação de metil glioxal (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91:706-715). O caminho metil glioxal dependente de bacilitiol utiliza glioxalase I (GlxA) e glioxalase II (FlxB) para converter metil glioxal a ácido (R)-lático (Chandrangsu et al., 2014). Em adição, metil glioxal pode ser convertido a ácido (R)-lático através de atividade de YdeA, YraA, e YfkM, homólogos previstos de glioxalase III (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91:706-715).

[0022] A partir de sequência de genoma de G. thermoglucosidans foi possível recuperar um gene D-lactato desidrogenase previsto, mas nenhum gene lactato racemase aparente. Para ambos caminhos para a conversão de metil glioxal a ácido (R)-lático, como caracterizado em B. subtilis (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91:706-715), homólogos mais próximos em G. thermoglucosidans têm identidade de sequência de aminoácidos muito baixa (46% para YwbC; 34% para TurT; nenhum homólogo encontrado para YdeA; 30% para YraA; e 35% para YfkM). Em contraste, MgsA de B. subtilis tem um homólogo de G. thermoglucosidans com 72% de identidade de sequência de aminoácidos. Baseado na informação de genoma pode-se esperar que a produção de ácido (R)-lático seja causada por atividade D-lactato desidrogenase, e não por uma lactato racemase ou através de caminho metil glioxal. Surpreendentemente, foi verificado ser capaz de abolir produção de (R)-lactato através de interrupção de gene mgsA, previsto codificar metil glioxal sintase.

[0023] Espécies Geobacillus que são anaeróbicas facultativas mostram fermentações ácidas mistas com ácido lático, etanol, ácido acético, e ácido fórmico como produtos principais. Interrupção de genes codificando enzimas essenciais em produção de subprodutos é uma abordagem comum para aperfeiçoar produção de um desejado produto. Entretanto, efeitos da interrupção de um específico gene podem ter diferentes efeitos colaterais dependendo do metabolismo total do hospedeiro. Mutações simples em Escherichia coli pflA, codificando piruvato - formiato liase ativando enzima, e adhE, codificando complexo álcool desidrogenase/acetaldeído-CoA bifuncional, resulta em aperfeiçoada produção de ácido lático com concomitante aumentada formação de subproduto piruvato, produção de etanol e ácido acético residual e rendimento de biomassa fortemente reduzido (pflA) ou aperfeiçoada produção com ácido acético como principal produto de fermentação (adhE) (Zhu & Shimizu, 2005, Metab. Eng. 7:104-115). Em várias linhagens de E. coli o lócus focA-pflAB foi interrompido para eliminar produção de ácido fórmico (Zhou et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:2237-2244; Liu et al., 2011, Appl. Biochem. Biotechnol. 164:162-169). A importância de focA, codificando uma proteína de canal formato, em acumulação de ácido lático no meio foi recentemente mostrada (Beyer et al., 2013, J. Bacteriol. 195:1428-1435), assim ela estará contribuindo para os fenótipos de linhagens de E. coli tendo supressões focA-pflAB. Nas algas verdes Chlamydomonas reinhardtii nocautes de genes codificando piruvato formiato liase e álcool desidrogenase aperfeiçoaram fermentação de ácido lático, mas também aumentaram concentrações de ácido acético e glicerol extracelulares (Catalanotti et al., 2012, Plant Cell 24:692-707).

[0024] Em G. thermoglucosidans os genes pflBA são orientados convergentemente para o gene adhE. Por razões práticas foi decidido interromper pflA, pflB, e adhE através de deleção de pflBA e parte de adhE em uma modificação. Surpreendentemente, foi verificar ser capaz de aproximadamente abolir formação de subprodutos etanol, ácido acético, e ácido fórmico sem impactar outros subprodutos e sem impactar desempenho de fermentação de ácido lático. Por exemplo, no presente pedido de patente onde formação de subproduto é aproximadamente abolida através de fermentação de uma célula geneticamente engenheirada como aqui descrita a quantidade em peso de subprodutos (como etanol, ácido acético, e ácido fórmico) com relação à quantidade total de ácido lático produzida é de não mais que 10% (peso/peso), e em particular não mais que 5%, 4%, 3% ou 2% (peso/peso). A quantidade de ácido lático e de subprodutos pode ser determinada através de processos conhecidos na técnica, por exemplo, através de derivação e análises através de cromatografia gás - líquido (GLC) ou cromatografia líquida de alta performance (HPLC).

[0025] Deficiência de esporulação é uma desejada propriedade para aplicação industrial de espécies Bacillus. De acordo com Diretriz 2009/41/EC do Parlamento Europeu e do Conselho de 6 de maio de 2009 sobre o uso contido de micro-organismos modificados geneticamente, usos contidos de micro-organismos modificados geneticamente devem ser classificados em relação ao risco que eles apresentam para saúde humana e o ambiente. Ter um fenótipo deficiente - esporulação para espécies Bacillus é visto como um meio para minimizar o risco de disseminação no ambiente. São conhecidos diferentes processos para obtenção de fenótipos deficientes em esporulação, incluindo seleção de derivados deficientes em esporulação espontâneos (Green et al., 2001, WO01/49865) ou interrupção direcionada do caminho de esporulação, por exemplo, através de interrupção de spo0A (Gonzy-Tréboul et al., 1992, J. Mol. Biol. 244:967-979; Atkinson et al., 2010, WO2010/052499) ou sigF (Fleming et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3775-3780; Wang et al., 2005, J. Appl. Microbiol. 98:761-767; Kovács et al., 2010, Appl. Environ. Microbiol. 76:4085-4088).

[0026] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção mostra uma célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada que é anaeróbica facultativa e produzindo (S)-lático compreendendo inativação ou supressão do gene metil glioxal sintase endógeno mgsA.

[0027] Genes endógenos são genes que estão presentes em um micro-organismo. Segue-se que uma bactéria como aqui descrita onde um gene é inativado ou suprimido requer que o gene esteja inerentemente presente na bactéria. Na ausência de uma indicação ao contrário, no presente pedido de patente qualquer referência a um gene significa um gene endógeno. Genes que são introduzidos em um microorganismo não são genes endógenos.

[0028] Em um outro aspecto é provida uma célula bacteriana geneticamente engenheirada que é anaeróbica facultativa, é homolática e produz ácido (S)-lático em uma forma enantiomérica pura.

[0029] Na presente invenção fermentação homolática é definida por produção de ácido lático a partir de fontes de hidrocarbonetos com a formação de não mais que 15% (peso/peso), preferivelmente não mais que 10% (peso/peso), e mais preferivelmente não mais que 5%, 4%, 3% ou 2% (peso/peso) de subprodutos tais como ácido fórmico, ácido acético e etanol. Esta porcentagem se refere ao peso total de subprodutos sobre o peso total de ácido lático (incluindo ácido (S)- lático e qualquer ácido (R)-lático que possa estar presente). A quantidade de ácido lático e etanol, ácido acético, e ácido fórmico pode ser determinada através de processos conhecidos na técnica, por exemplo, através de derivação e análise através de cromatografia de gás - líquido (GLC) ou cromatografia líquida de alta performance (HPLC).

[0030] Em várias modalidades, a quantidade formada de pelo menos um de ácido fórmico, etanol e ácido acético não é mais que 10% (peso/peso) baseada no peso total de ácido fórmico, etanol ou ácido acético sobre o peso total de ácido lático produzido, em particular não mais que 6%, 1%, 0,25% ou 0,1% (peso/peso). Em outras palavras, a quantidade de ácido fórmico formada na fermentação homolática pode ser, por exemplo, de não mais que 10% (peso/peso) e mais em particular não mais que 6%, 1%, 0,25% ou 0,1% (peso/peso) em relação à quantidade em peso total de ácido lático. Similarmente, a quantidade de etanol pode ser de não mais que 10%, 6%, 1%, 0,25% ou 0,1% (peso/peso) e a quantidade de ácido acético pode ser de não mais que 10%, 6%, 1%, 0,25% ou 0,1% (peso/peso).

[0031] No presente relatório descritivo mgsA se refere ao gene metil glioxal sintase a sequência do qual é provida em SEQ ID NO: 23 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é provida em SEQ ID NO: 24. As regiões de nucleotídeo flanqueando mgsA podem ser identificadas por iniciadores de PCR SEQ ID NOs: 11, 12, 15 e 16.

[0032] Em um outro aspecto a invenção se refere a uma célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada onde, em adição ao gene mgsA, também o gene piruvato - formiato liase A e/ou B endógeno é inativado ou suprimido.

[0033] Em uma modalidade preferida o gene piruvato - formiato liase é inativado através de inativação ou supressão do lócus piruvato - formiato liase/álcool desidrogenase pflBA-adhE. Alternativamente, o gene piruvato liase A e/ou B e o gene álcool desidrogenase adhE podem ser inativados ou suprimidos em etapas separadas. As regiões de nucleotídeos flanqueando pflBA-adhE podem ser identificadas por iniciadores de PCR de SEQ ID NOs: 19-21.

[0034] No presente relatório descritivo com pflBA é pretendido os genes piruvato - formiato liase A e B, codificando enzima ativante piruvato - formiato liase e piruvato formiato liase, respectivamente.

[0035] plfA se refere ao gene piruvato formiato liase A (codificando enzima ativante piruvato - formiato liase) a sequência do qual é provida em SEQ ID NO: 27 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácido codificada é provida em SEQ ID NO: 28. pflB se refere ao gene piruvato formiato liase B (codificando piruvato formiato liase) a sequência do qual é provida em SEQ ID NO: 25. A sequência de aminoácido codificada é provida em SEQ ID NO: 26. Na presente invenção adhE se refere ao gene álcool desidrogenase E, codificando complexo acetaldeído-CoA/álcool desidrogenase, a sequência do qual é provida em SEQ ID NO: 29 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é provida em SEQ ID NO: 30.

[0036] Ainda em uma outra modalidade de acordo com a presente invenção na célula geneticamente engenheirada também o gene fosfo transacetilase (pta) endógeno é inativado ou suprimido. A sequência de nucleotídeos de pta é provida em SEQ ID NO: 31 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de nucleotídeos de pta é provida em SEQ ID NO: 31 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos é provida em SEQ ID NO: 32. Inativação ou supressão de pta (que codifica fosfo transacetilase) ainda minimiza a restante produção de acetato associada à atividade pta endógena. A linhagem resultante (com pta inativado ou suprimido) é auxotrófica para ácido acético. Da mesma maneira, quando fermentando esta célula geneticamente engenheirada ácido acético tem de ser suplementado para o meio de crescimento.

[0037] Ainda em uma outra modalidade de acordo com a presente invenção a célula bacteriana termofílica engenheirada geneticamente em adição é feita deficiente em esporulação através de inativação ou supressão de um gene de esporulação endógeno.

[0038] Em uma outra modalidade o gene de esporulação inativado ou suprimido é sigF.

[0039] sigF se refere a um gene de esporulação a sequência de nucleotídeos do qual é provida em SEQ ID NO: 33 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é provida em SEQ ID NO: 34. As sequências de nucleotídeos flanqueando SigF podem ser identificadas por iniciadores de PCR SEQ ID N°s 3-6.

[0040] Em uma outra modalidade de acordo com a presente invenção ácido (S)-lático é produzido na célula de acordo com a invenção com uma pureza enantiomérica de pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, 99,5%, 99,8% ou 99,9%.

[0041] Ainda em uma outra modalidade da presente invenção na célula um ou mais dos genes mgsA, pflBA-adhE ou sigF são inativados ou suprimidos através de recombinação homóloga.

[0042] Ainda em uma outra modalidade a célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada de acordo com a presente invenção é uma célula bacteriana Gram positiva. Preferivelmente, a célula pertence ao gênero Bacillus.

[0043] Ainda em uma outra modalidade a célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada de acordo com a presente invenção é uma célula bacteriana gram positiva. Preferivelmente a célula pertence ao gênero Geobacillus.

[0044] Novamente em uma outra modalidade a célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada de acordo com a presente invenção é Geobacillus thermoglucosidans.

[0045] Um dos objetivos da presente invenção é produzir uma linhagem Geobacillus que seja anaeróbica facultativa e produza ácido (S)-lático através de fermentação homolática.

[0046] Pureza quiral é um aspecto importante para produção de polímeros de ácido poli lático. Por isso, é essencial produzir ácido (S)- lático enantiopuro para aplicações comerciais.

[0047] Assim, em um aspecto, a presente invenção mostra um processo para modificação genética de espécies Geobacillus moderadamente termofílicas que são anaeróbicas facultativas e homoláticas por meio de engenharia genética.

[0048] Em um outro aspecto a invenção provê um processo para produzir ácido lático enantiomérico puro. O processo compreende as etapas de: cultura de uma célula bacteriana termofílica de acordo com a presente invenção usando estoque de alimentação contendo carbono fermentável apropriado e isolando o ácido (S)-lático.

[0049] Em um aspecto a invenção provê um processo para produção de ácido lático enantiomérico puro onde o estoque de alimentação contendo carbono compreende xilose, glicose ou sucrose.

[0050] A temperatura da cultura está preferivelmente em uma temperatura de entre 50°C e 70°C, mais preferivelmente entre 55 e 65°C.

[0051] No contexto da invenção, inativação ou supressão de um gene pode ser modificação de um gene codificando um desejado polipeptídeo a ser produzido pela célula e/ou um gene codificando um polipeptídeo envolvido em produção de um metabólito primário ou secundário pela célula. Em princípio isto pode ser feito através de diminuição de níveis celulares da proteína codificada. Diminuição de níveis celulares pode ser efetuada, por exemplo, através de inativação alvejada do gene codificando a enzima de interesse. O gene pode ser removido em sua totalidade. Entretanto, como uma alternativa também a supressão de parte do gene pode resultar em uma redução da atividade da proteína codificada. Alternativamente, ou adicionalmente, sequências de nucleotídeos responsáveis pela regulação ou expressão dos genes tais como aperfeiçoadores promotores, sítios de iniciador traducional, e semelhantes podem ser modificados ou removidos. Uma outra maneira para influenciar a atividade da proteína de interesse pode ser a modificação de sinais de transporte, se necessário, ou a introdução de RNA antissenso.

[0052] Modificação cromossômica é preferida uma vez que modificação cromossômica assegurará uma distribuição estável da funcionalidade do gene sobre as células de progênie. Supressão de uma desejada funcionalidade no cromossoma pode ser feita com recombinação não homóloga assim como com recombinação homóloga. Recombinação homóloga é preferida, na medida em que ela abre a oportunidade para introduzir, para remover ou para simultaneamente introduzir e remover uma funcionalidade.

[0053] Quando recombinação homóloga é pretendida, o DNA transformante ainda contém uma sequência de DNA que é homóloga a uma sequência alvo genômica da específica célula a ser engenheirada. Aqueles versados entenderão que não são requeridos 100% de identidade para obtenção de recombinação homóloga. Uma porcentagem de identidade de 80%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, 98% ou 99% também será suficiente. Genericamente, a sequência de DNA de interesse a ser inserida no cromossoma por recombinação homóloga é flanqueada por sequências homólogas com um comprimento suficiente para permitir recombinação homóloga. Um tal comprimento pode ser pelo menos cerca de 200 bp, por exemplo, entre cerca de 200 e cerca de 1500 bp, preferivelmente entre cerca de 500 e cerca de 1000 bp.

[0054] Para o propósito da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos se refere à porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências. O grau de identidade é determinado usando o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Software para realização de análises BLAST é publicamente disponível através de National Center for Biotechnology Information (/www.ncbi.nlm.nih.gov/). As fixações default para parâmetros de algoritmo Blastp são limite esperado de 10, tamanho de palavra de 3, emparelhamentos Max em uma faixa de questão de 0, Matriz é BLOSUM62, Existência de Custos de Folga de 11 e Extensão de 1, Ajustes composicionais em ajuste de matriz de escore composicional Condicional.

[0055] Para o propósito da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de nucleotídeos se refere à porcentagem de nucleotídeos que são idênticos entre as duas sequências. O grau de identidade é determinado usando o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Software para realização de análises BLAST é publicamente disponível através de National Center for Biotechnology Information (/www.ncbi.nlm.nih.gov/). As fixações default para parâmetros de algoritmo Blastn são limite Esperado de 10, tamanho de palavra de 28, emparelhamentos Max em uma faixa de questão de 0, Escores de emparelhamento/desemparelhamento de 1, -2, Custos de Folga em Linear.

[0056] Como mencionado anteriormente, nenhuma das sequências identificando os genes acima em Geobacillus thermoglucosidans precisa ser 100% idêntica de modo a modificar o gene de interesse através de engenharia genética. Além disso, em células bacterianas termofílicas relacionadas de outras espécies genes podem se desviar destas sequências. Entretanto, fazendo uso do gene Geobacillus thermoglucosidans, sequências homólogas a estes genes e que têm a mesma funcionalidade podem ser facilmente identificadas por aqueles versados na técnica e correspondentes iniciadores podem ser preparados para realização de recombinação homóloga nestas linhagens. Assim, mesmo se desvios das sequências dos genes identificados acima existem em uma certa linhagem genes homólogos podem ser facilmente identificados. Sua sequência de nucleotídeos pode ser determinada usando tecnologia conhecida na técnica e se necessário um novo conjunto de iniciadores pode ser definido idêntico ou complementar para as sequências de gene flanqueando.

[0057] As células de acordo com a presente invenção podem ser preparadas usando tecnologias conhecidas na técnica. Em particulares processos para introdução de DNA em bactérias termofílicas através de eletroporação foram descritos por Van Kranenburg et al., 2007, WO2007/085433 e Cripps et al. 2009, Metab. Eng. 11:398-408.

[0058] Transformação destas espécies Bacillus por eletroporação pode ser obtida através de uma descarga de alta voltagem através de uma suspensão contendo uma espécie Bacillus moderadamente termofílica que é anaeróbica facultativa e homolática em um apropriado DNA transformante compreendendo a desejada funcionalidade e/ou sequências de DNA homólogas para sequências genômicas dos específicos Bacilli.

[0059] Ácido (S)-lático pode ser obtido através de fermentação de uma célula bacteriana termofílica engenheirada geneticamente como aqui descrita na presença de uma fonte de carboidrato (por exemplo, glicose e/ou xilose) através de processos conhecidos na técnica. Durante fermentação o ácido lático excretado pelos micro-organismos é genericamente neutralizado usando uma base, por exemplo, sais básicos de metais alcalinos ou alcalinoterrosos como hidróxidos, carbonatos e/ou hidrogeno carbonatos de sódio, potássio, magnésio, e/ou cálcio. Bases de magnésio, por exemplo, hidróxido de magnésio, carbonato de magnésio, e/ou hidrogeno carbonato de magnésio, são genericamente preferidos. Da mesma maneira, em vários aspectos a presente invenção se refere particularmente a um processo para produzir ácido (S)-lático enantiomérico puro, o dito processo compreendendo cultura de uma célula bacteriana termofílica como aqui descrita na presença de uma base de magnésio (por exemplo, selecionada de pelo menos um de hidróxido de magnésio, carbonato de magnésio, e hidrogeno carbonato de magnésio) usando apropriados estoques de alimentação contendo carbono fermentáveis e isolamento de ácido (S)-lático.

[0060] Após fermentação, o ácido (S)-lático (ou um seu sal) é separado do caldo de fermentação através de quaisquer das muitas técnicas convencionais conhecidas para separação de ácido lático e/ou lactato de soluções aquosas. Partículas de substrato ou microorganismos (a biomassa) podem ser removidos antes de separação para aperfeiçoar eficiência de separação. A dita separação pode ser conduzida por meio de centrifugação, filtração, floculação, flotação ou filtração com membrana. Isto é conhecido, por exemplo, de WO 01/38283 onde um processo contínuo para a preparação de ácido lático por meio de fermentação é descrito. Embora a discussão da fermentação neste relatório descritivo se refira genericamente a um processo de batelada, partes ou todo o inteiro processo pode ser realizado continuamente.

[0061] Após separação do ácido (S)-lático (ou um seu sal) do caldo de fermentação, o produto pode ser submetido a uma ou mais etapas de purificação tais como extração, destilação, cristalização, eletrodiálise, filtração, tratamento com carbono ativado, troca de íons, etc. As várias correntes residuais podem ser recicladas, opcionalmente após tratamento, para o vaso de fermentação ou para qualquer etapa de purificação realizada anteriormente.

Exemplos Materiais e processos Linhagens e plasmídeos Linhagens e plasmídeos usados neste estudo são listados na Tabelai.

[0062] Escherichia coli foi rotineiramente cultivada em caldo LB (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) a 37oC sob condições aeróbicas. Quando apropriado cloranfenicol e/ou ampicilina foram usados em concentrações de 20 mg/L e 100 mg/L, respectivamente.

[0063] G. thermoglucosidans foi crescida rotineiramente em meio TGP a 52°C, 55°C ou 60°C sob condições aeróbicas, a menos que de outro modo estabelecido. Meio TGP (Taylor et al., 2008, Plasmid 60:4552) conteve triptona 17 g/L, peptona de soja 3 g/L, NaCl 5 g/L, K2HPO4 2,5 g/L em pH 7,0, e adições pós-autoclave de 4 ml/L de glicerol e 4 g/L de piruvato de Na. Para placas TGP 10 g/L de ágar foram usados. Quando apropriado, o meio foi suplementado com cloranfenicol (8 μg/mL). Tabela 1. Linhagens e plasmídeos usados neste estudo

Técnicas de Manipulação de DNA

[0064] Técnicas padrões de manipulação de DNA foram realizadas como descritas por Sambrook and Russell (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

[0065] Construção de derivados pNW33N foi realizada em E. coli.

[0066] Isolamento de DNA de plasmídeo E. coli em larga escala a partir de 100 mL de cultura foi realizado usando o kit Jetstar 2.0 Plasmid Maxiporep (Genomed) seguindo as instruções do fabricante. Isolamento de DNA plasmídeo de E. coli em pequena escala a partir de 1 mL de cultura foi realizado usando o kit Nucleospin Plasmid Quick Pure (Macherey-Nagel) seguindo as instruções do fabricante.

[0067] Células competentes de E. coli foram preparadas usando cloreto de cálcio e transformadas por choque térmico como descrito por Sambrook and Russell (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

[0068] Reações PCR para propósitos de clonagem foram realizadas com Pwo polimerase de alta fidelidade (Roche) seguindo as instruções do fabricante.

[0069] Para análises de PCR-colônia, colônias foram retiradas com um palito de dentes e um pequeno material de células foi transferido para um tubo de reação de PCR. As células foram interrompidas através de incubação por 1 minuto em 1000 W em um forno de micro-ondas. Misturas de reação PCR de 50 microlitros ou 25 microlitros com rTaq polimerase (Amersham Biosciences) foram preparadas como recomendado pelo fabricante e adicionadas aos tubos de reação com as células interrompidas.

Eletroporação de G. thermoglucosidans

[0070] G. thermoglucosidans foi transformada por eletroporação, baseado no protocolo descrito por Cripps et al. (Cripps, et al., 2009, Metab. Eng. 11:398-408). G. thermoglucosidans foi crescida por toda noite a 55°C e 1 mL foi usado para inocular 50 mL de meio TGP preaquecido em um frasco cônico de 250 mL com defletores. Células foram incubadas a 60°C (180 rpm) até a OD600 ser ~1,0. O frasco foi resfriado sobre gelo por 10 minutos e as células foram pelotizadas por centrifugação (4°C). A seguir, as células foram lavadas quatro vezes com tampão de eletroporação resfriado em gelo (sorbitol 0,5 M, manitol 0,5 M, glicerol 10% (v/v). Os volumes das etapas de lavagem foram 50 mL, 25 mL, e 10 mL. A pelota final foi ressuspensa em 1,3 mL de tampão de eletroporação resfriado com gelo e alíquotas de 60 microlitros de células eletrocompetentes foram estocadas a -80°C ou usadas diretamente para eletroporação.

[0071] Uma alíquota de 60 microlitros de células eletrocompetentes (descongeladas) foi misturada com 1-2 μg de DNA plasmídeo e subsequentemente transferida para uma cubeta de eletroporação resfriada (largura de folga de 0,1 cm). As condições de eletroporação usando um eletroporador pulsador de gene Bio-Rad foram de 2,5 kV, 10 μF e 600 Q. Após eletroporação as células foram transferidas para 1 mL de TGP preaquecido (52°C) em um tubo plástico de 5 mL e recuperadas a 52°C, 180 rpm por duas horas. A suspensão de células recuperada foi pelotizada e todos 150 mL de sobrenadante foram descartados. A pelota foi novamente suspensa no sobrenadante restante. Volumes de 1/10 e 9/10 foram revestidos sobre placas TGP contendo 8 μg/L de cloranfenicol. As placas foram incubadas a 52°C por 24-48 horas. Colônias que apareceram sobre as placas foram transferidas para uma placa TGP nova contendo 8 μg/L de cloranfenicol e incubadas a 55°C por toda noite. Aquelas que cresceram foram testadas para a presença do plasmídeo através de PCR de colônia usando iniciadores 1 e 2 (Tabela 2).

Integração

[0072] O vetor lançador Geobacillus-E. coli pNW33n foi usado como vetor de integração em G. thermoglucosidans como descrito previamente (Cripps et al., 2009 Metab. Eng. 11:398-408). 20 mL de TGP contendo 8 μg/mL de cloranfenicol foram incubados com linhagens transformadas a partir de um estoque de glicerol. Após crescimento por toda a noite a 55°C, 180 rpm, apropriadas diluições foram revestidas sobre placas TGP contendo 8 μg/mL de cloranfenicol. Estas placas foram então incubadas a 68°C por 24 horas. Colônias simples foram riscadas para uma placa nova (incubada a 52°C) e uma PCR de colônia foi conduzida sobre estas colônias para identificar uma colônia com um cruzamento simples. As apropriadas combinações de iniciador foram usadas para identificar cruzamentos simples via o fragmento a montante ou a jusante (Tabela 2; combinações de iniciadores 655-170 e 656-571 para integração de pRM3; combinações de iniciadores754-170 e 991571 para integração de pRM12, respectivamente). A seguir, DNA cromossômica de colônias positivas foi isolado usando o Masterpure Gram Positive DNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies) e para confirmar os resultados da PCR de colônia, a PCR descrita acima foi repetida sobre o DNA cromossômico isolado. Um cruzamento simples via a região de flanco a montante e um cruzamento simples via a região de flanco a jusante foram selecionados para a segunda etapa de recombinação.

[0073] Para obter um cruzamento duplo, os integrantes primários foram subcultivados várias vezes em TGP sem cloranfenicol. Apropriadas diluições (10-4, 10-5, 10-6) foram revestidas sobre placas TGP. Colônias isoladas foram transferidas para uma placa TGP com e uma sem 8 μg/mL de cloranfenicol. Mutantes de cruzamento duplo são sensíveis a cloranfenicol. Análises de PCR usando as apropriadas combinações de iniciador (Tabela 2; combinações de iniciador 655-656 para ΔsigF, 754-991 para ΔmgsA, e 744-808 para ΔpflBA-ΔadhE) foram usadas para discriminar tipo selvagem de mutantes de supressão e para verificar a ausência do plasmídeo. Todas as modificações foram confirmadas por sequenciamento dos produtos de PCR. Tabela 2. Iniciadores usados neste estudo

Fermentação

[0074] Meio TMM foi modificado a partir de Fong et al. (Fong et al., 2006) e conteve por L: 60 g/L de glicose; 30 g/L de xilose; 8,37 g de MOPS, 0,23 g de K2HPO4; 0,51 g de NH4Cl; 0,50 g de NaCl; 1,47 g de Na2SO4; 0,08 g de NaHCO3; 0,25 g de KCl; 1,87 g de MgCl2.6H2O; 0,41 g de CaCl2.2H2O; 16,0 mg de MnCl2.4H2O; 1,0 mg de ZnSO4.7H2O; 2,0 mg de H3BO3; 0,1 mg de CuSO4.5H2O; 0,1 mg de Na2MoO4.2H2O; 1,0 mg de CoCl2.6H2O; 7,0 mg de FeSO4.7H2O; 0,1 mg de tiamina; 0,1 mg de riboflavina; 0,5 mg de ácido nicotínico; 0,1 mg de ácido pantotênico; 0,5 mg de piridoxamina, HCl; 0,5 mg de piridoxal, HCl; 0,1 mg de D- biotina; 0,1 mg de ácido fólico; 0,1 mg de ácido p-amino benzoico; 0,1 mg de cobalamina. O pH foi ajustado para pH 7,2. Glicose, xilose, metais e vitaminas foram esterilizados em filtro. Meio foi autoclavado. TMM1, TMM2.5, e TMM5 foram suplementados com 1 g/L, 2,5 g/L, e 5 g/L de extrato de levedura (Oxoid), respectivamente.

[0075] Meio STMM diferiu de meio TMM em concentrações de K2HPO4 (1,00 g/L), NH4Cl (2,50 g/L), NaCL (5,00 g/L), e CaCl2.2H2O (50 mg/L) e foi suplementado com D,L-metionina (68,5 mg/L) e betaína (0,14 g/L).

[0076] Uma pré-cultura de 1000 mL em TMM5 ou STMM5 foi usada para inocular (10% v/v) 400 mL TMM1 ou TMM2,5, ou STMM2,5 ou STMM5, respectivamente, em um fermentador Multifors 0,75 L (Infors) equipado com um condensador (resfriado com água corrente de torneira de aproximadamente 15°C). O pH foi controlado em pH 7,2 através de adição de KOH 2,5 M estéril, Mg(OH)2 75 g/L estéril, ou Ca(OH)2 75 g/L estéril. Temperatura foi de 60°C. Velocidade de agitador foi de 300 rpm.

[0077] Amostras foram retiradas da fermentação para medição de ácido (R)- e (S)-lático, e possíveis subprodutos. Amostras foram centrifugadas e debris restantes foram removidos por filtração usando um filtro Millex GP 0,22 μm (Millipore). Filtrado foi estocado a -21°C até ainda análises.

[0078] Açúcares foram medidos por HPLC usando uma coluna Thermo CarboPac AS-10 (Dionex). Ácidos orgânicos (ácido lático, ácido acético, ácido fórmico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido pirúvico) e etanol foram medidos usando uma derivação e cromatografia gás - líquido (GLC). (R)- e (S)-lactatos foram metilados para metil lactato e medidos através de análise de espaço superior sobre uma coluna quiral.

Exemplo 1 Produção de ácido lático enantio puro com G. thermoglucosidans

[0079] Plasmídeo de integração pRM3 foi construído para suprimir o gene sigF em G. thermoglucosidans. As regiões de flanco a montante e a jusante do gene sigF foram geradas por PCR usando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinações de iniciadores 653 e 654 (Tabela 2) para obter o fragmento a montante, e os iniciadores 651 e 652 (Tabela 2) para obter o fragmento a jusante. Primeiro, o fragmento a jusante foi clonado como fragmento Kpnl-Sall em pNW33n, digerido com as mesmas enzimas. A seguir, o fragmento a montante foi clonado como fragmento Sall-Hindlll nesta construção, digerida com as mesmas enzimas resultando em plasmídeo pRM3. Construção de pRM3 foi feita em E. coli TG90. A integridade da sequência pRM3 foi confirmada por sequenciamento de DNA.

[0080] Plasmídeo pRM3 foi eletroporado para G. thermoglucosidans DSM 2542. Uma colônia transformante simples foi selecionada e usada para obter mutantes de cruzamento simples como descrito em Materiais e Processos. Duas colônias foram selecionadas para ainda trabalho, uma com um cruzamento simples via a região de flanco a montante e uma com um cruzamento simples via a região de flanco a jusante.

[0081] Um mutante de cruzamento duplo foi obtido seguindo o procedimento descrito em Materiais e Processos. Sessenta colônias, obtidas após subcultura dos integrantes de cruzamento simples em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas de TGP com e sem cloranfenicol. Cinquenta colônias foram sensíveis a cloranfenicol. Doze colônias tiveram a desejada modificação e três reverteram para tipo selvagem. Uma colônia foi selecionada e designada G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF. A supressão foi confirmada por sequenciamento. Tabela 3. Fermentações com G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF sobre uma mistura de glicose/xylose

[0082] G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF foi avaliada em fermentação de pH controlado (KOH) usando TMM1 e TMM2,5. Fermentações foram analisadas. Os resultados são resumidos na Tabela 3. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF consumiu xilose e glicose simultaneamente. Pureza quiral do ácido (S)-lático produzido foi bem abaixo de expectativas para ácido lático quiral puro.

[0083] Plasmídeo pJS43 foi construído para deletar 267 pb do gene mgsA (423 pb) em G. thermoglucosidans. As regiões de flanco a montante e a jusante do gene mgsA foram geradas por PCR usando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinações de iniciadores 750 e 999 para obter o fragmento a jusante de mgsA, e os iniciadores 1000 a 753 para adquirir o fragmento mgsA a montante. Os dois produtos de PCR resultantes foram subsequentemente usados como molde em PCR de sobreposição usando combinação de iniciadores 750 e 753 para fundir os mesmos. O produto foi clonado como fragmento BamHI-Pstl em plasmídeo pNW33n digerido com BamHI e Pstl, resultando em plasmídeo pJS43.

[0084] Construção de pJS43 foi feita em E. coli TG90. Integridade da sequência de nucleotídeos de pJS43 foi confirmada por sequenciamento.

[0085] Plasmídeo pJS43 foi eletroporado para G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF. Uma colônia transformante simples foi selecionada e usada para obter mutantes de cruzamento simples como descrito em Materiais e Processos. Um integrante de cruzamento simples foi selecionado para ainda trabalho.

[0086] Um mutante de cruzamento duplo foi obtido seguindo o procedimento descrito em Materiais e Processos. Sessenta colônias obtidas após subcultura do integrante de cruzamento simples em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas de TGP com e sem cloranfenicol. Todas as colônias pareceram sensíveis a cloranfenicol. Vinte e cinco colônias foram analisadas. Quatro colônias tiveram a desejada modificação e vinte e uma reverteram para tipo selvagem. Uma colônia foi selecionada e designada G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA. A supressão foi confirmada por sequenciamento.

[0087] G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA foi avaliada em fermentação de pH controlado (Mg(OH)2) usando STMM2,5. A fermentação foi analisada. Os resultados são resumidos na Tabela 4. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA consumiu xilose e glicose simultaneamente. Pureza quiral do ácido (S)-lático produzido foi de 99,6%, que é considerado quiral puro. Estes dados mostram claramente que a despeito de aparente falta de integridade do caminho metil glioxal em G. thermoglucosidans, interrupção de mgsA resulta na habilidade para produzir ácido (S)-lático quiral puro. Tabela 4 Fermentação com G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA sobre STMM2,5

Exemplo 2 Produção de ácido homo lático enantio puro com G. thermoglucosidans

[0088] G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA ainda produziu quantidades significantes de ácido fórmico e etanol, enquanto ácido acético foi um subproduto menor (Tabela 4). Embora mutações de pflA e/ou pflB e adhE sejam conhecidas impactar produção de ácido fórmico e etanol em muitas bactérias, os efeitos colaterais de interrupção daqueles genes são imprevisíveis.

[0089] Plasmídeo pRM12 foi construído para suprimir os genes pflB, pflA e adhE (parcialmente) em G. thermoglucosidans. A região de flanco a montante de pflBA e a região de flanco a montante do adhE orientado convergentemente foram geradas por PCR usando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinações de iniciadores 739 e 805 para obter o fragmento pflBA a montante e os iniciadores 806 e 807 para adquirir o fragmento adhE a montante. Os dois produtos de PCR resultantes foram subsequentemente usados como molde em uma PCR se sobreposição usando combinação de iniciadores 739 e 807 para fundir os mesmos juntos. O produto foi clonado como fragmento BamHI- Pstl em plasmídeo pNW33n digerido com BamHI e Pstl, resultando em plasmídeo pRM12. Construção de pRM12 foi feita em E. coli DH5α. Integridade da sequência de nucleotídeos pRM12 foi confirmada por sequenciamento.

[0090] Plasmídeo pRM12 foi eletroporado em G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA. Uma colônia transformante simples foi selecionada e usada para obter mutantes cruzados simples como descrito em materiais e processos. Duas colônias foram selecionadas para ainda trabalho, uma com um cruzamento simples via a região de flanco pflBA a montante e uma com um cruzamento simples via a região de flanco adhE a montante.

[0091] Um mutante de cruzamento duplo foi obtido seguindo o procedimento descrito em Materiais e Processos. Cento e vinte colônias, obtidas após subcultura dos integrantes de cruzamento simples em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas TGP com e sem cloranfenicol. Duas colônias foram sensíveis a cloranfenicol. Uma teve a desejada modificação e a outra reverteu para tipo selvagem. Uma colônia foi designada G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA- ΔadhE. A supressão foi confirmada por sequenciamento. Tabela 5. Fermentação com G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔpflBA-ΔadhE sobre TMM5. Tabela 5. Fermentação com G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA-ΔadhE sobre TMM5 1 Amostragem após inoculação 2 n.d. = não determinado: concentração de ácido lático muito baixa para determinar pureza quiral

[0092] G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, Δ-pflBA- ΔadhE foi avaliada em fermentações de pH controlado (Ca(OH)2) usando meio STMM contendo 5,0 g/L de extrato de levedura, 60 g/L de glicose e 30 g/L de xilose. A fermentação foi analisada em três pontos de tempo. Os resultados são resumidos na Tabela 5. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA-ΔadhE consumiu xilose e glicose simultaneamente. Pureza quiral do ácido (S)-lático produzido por G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA- ΔadhE foi 99,7% ou maior. Produção de ácido acético e ácido fórmico foi de 6,7 mg por grama de ácido lático. Produção de etanol não pode ser detectada. Estes dados claramente demonstram que interrupção dos genes de complexo piruvato - formiato liase e álcool desidrogenase reduzem significantemente a produção de etanol, ácido fórmico, e ácido acético resultando em uma fermentação de ácido (S)-lático quiral puro e homolático.

Claims (13)

1. Célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada, em que é Gram-positiva anaeróbica facultativa, produtora de (S)-lático e pertencente a espécie Geobacillus thermoglucosidans, caracterizada pelo fato de que compreende: um gene da metil glioxal sintase endógeno mgsA inativado ou deletado de SEQ ID NO: 23, e produz ácido (S)-lático com uma pureza enantiomérica de pelo menos 98%.

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que, em adição, o gene piruvato - formiato liase A e/ou B endógeno é inativado ou deletado.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é um derivado deficiente em esporulação devido à inativação ou deleção de um gene de esporulação endógeno.

4. Célula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o gene de esporulação é sigF.

5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o gene piruvato - formiato liase A e/ou B endógeno é inativado por inativação ou deleção do lócus piruvato - formiato liase/álcool desidrogenase pflBA-adhE.

6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que produz ácido (S)-lático com uma pureza enantiomérica de pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, 99,8% ou 99,9%.

7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que, em adição, o gene fosfotransacetilase (pta) endógeno é inativado ou deletado.

8. Célula bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que os genes são inativados ou deletados através de recombinação homóloga.

9. Processo para produção de ácido (S)-lático enantiomérico puro, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula de Geobacillus thermoglucosidans termofílica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, usando um estoque de alimentação contendo carbono fermentável apropriado e isolar o ácido (S)-lático, em que a cultura é realizada a uma temperatura entre 52°C e 60°C.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o estoque de alimentação contendo carbono compreende xilose, glicose ou sacarose.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a cultura é realizada em uma temperatura entre 55°C e 60°C.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que não mais que 15% (peso/peso) de subprodutos são formados, baseado no peso total de subprodutos sobre o peso total de ácido lático produzido, em particular ou não mais que 10% (peso/peso), ou não mais que 5%, 4%, 3% ou 2% (peso/peso).

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a quantidade formada de pelo menos um de ácido fórmico, etanol e ácido acético não é mais que 10% (peso/peso) baseado no peso total de ácido fórmico, etanol ou ácido acético sobre o peso total de ácido lático produzido, em particular não mais que 6%, 1%, 0,25% ou 0,1% (peso/peso).