KR20140061303A - 이소부티르산을 생산하기 위한 세포 및 방법 - Google Patents

이소부티르산을 생산하기 위한 세포 및 방법 Download PDF

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리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타
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Abstract

이소부티레이트를 재생가능하게 생산하기 위한 세포 및 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 세포는 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 1개 이상의 효소를 코딩하는 이종성 DNA를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 세포는 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 야생형 버전의 효소보다 더 큰 정도로 촉매하는 유전자 변형 효소를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 세포는 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 1개 이상의 효소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 세포가 이소부티레이트로 전환시킬 수 있는 탄소원을 포함하는 배지에서 세포를 성장시키는 단계가 방법에 포함된다.

Description

이소부티르산을 생산하기 위한 세포 및 방법 {CELLS AND METHODS FOR PRODUCING ISOBUTYRIC ACID}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2011년 2월 11일자로 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/441,939에 대한 우선권을 주장한다.
이소부티르산 (본원에서 "이소부티레이트"로 또한 지칭됨)은 섬유, 수지, 플라스틱 및 염료의 생산에서 사용되고, 제약, 화장품 및 식품 첨가물의 제작에서 중간체로서 사용된다. 또한 이소부티레이트는 범용 화학물질(commodity chemical)인 메타크릴레이트 (즉, 메타크릴산 - MAA)로 추가로 전환될 수 있다.
MAA는 종종 플라스틱 생산에서 사용되는 주요 범용 물질인 MMA (메틸 메타크릴레이트)로 에스테르화된다. MMA는 종종 폴리메틸 메타크릴레이트 플라스틱을 생산하는데 사용되지만, 예를 들어 에틸렌 메타크릴레이트 (EMA), 부틸 메타크릴레이트 (BMA), 아크릴산 도프(dope), 접착제, 이온 교환 수지, 가죽 처리 화학물질, 윤활 첨가제, 및 가교제를 생산하는데 또한 사용된다. 전통적인 화학적 합성 기술을 통해 MAA를 제조하는 다수의 경로가 있다. 대부분의 경로는 공급 재료로서의 천연 가스 또는 미정제 오일로 시작한다.
재생가능한 공급 재료로부터 범용 화학물질을 생산하는 새로운 방법이 요구된다. 재생가능한 물질로부터 범용 화학물질을 생산하는 것은 재생가능하지 않은 고갈 중인 공급 재료 물질로부터의 경제적인 영향의 가능성을 감소시키고, 재생가능한 공급 재료를 제공하는 경제 발전에 박차를 가할 수 있다.
발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 야생형 대조군과 비교하여 증가된 이소부티르산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 미생물 세포를 제공한다. 일부 경우에, 재조합 미생물 세포는 진균 세포, 예를 들어 사카로마이세타세아에(Saccharomycetaceae) 과의 구성원, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 다른 경우에, 재조합 세포는 프로토박테리아(Protobacteria) 문의 구성원과 같은 박테리아 세포, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 구성원 (예를 들어 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)) 또는 슈도모나세아에(Pseudomonaceae) 과의 구성원 (예를 들어 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida))일 수 있다. 다른 경우에, 재조합 세포는 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 구성원과 같은 박테리아 세포, 예를 들어 바실라세아에(Bacillaceae) 과의 구성원 (예를 들어 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)) 또는 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae) 과의 구성원 (예를 들어 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis))일 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 미생물 세포는 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 이종성 DNA 분자를 포함한다.
일부 경우에, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드는 알데히드 데히드로게나제(dehydrogenase), 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 페닐아세트알데히드 데히드로게나제 (PadA), 이. 콜라이 아세트알데히드 데히드로게나제 (AldB), 이. 콜라이 3-히드록시프로피온알데히드 데히드로게나제 (AldH), 이. 콜라이 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 (GabD), 이. 콜라이 γ-아미노부티르알데히드 데히드로게나제 (YdcW), 비. 암비파리아(B. ambifaria) α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHba), 또는 피. 푸티다(P. putida) α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHPP)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드는 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 유사성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드는 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 DNA 분자는 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 유사성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 이종성 DNA 분자는 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 경로의 구성원인 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 이종성 DNA 분자를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태들에서, 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 경로의 구성원인 폴리펩티드는 분지쇄 케토산 데히드로게나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 경로의 구성원인 폴리펩티드는 티오에스테라제(thioesterase)를 포함한다. 이러한 실시양태들 중 일부에서, 티오에스테라제는 TesA 또는 TesB를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이소부티르알데히드를 이소부티레이트로 전환하는 능력이 증가하도록 변형된 1개 이상의 내인성 효소를 포함하는 유전자 변형 세포를 제공한다. 일부 경우에, 변형된 효소는 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매한다. 다른 경우에, 변형된 효소는 높은 수준의 이소부티레이트를 포함하는 환경을 견디는 세포의 능력을 증가시킨다.
재조합 미생물 세포 또는 유전자 변형 미생물 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 이소부티르알데히드가 이소부탄올로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 추가로 포함하며, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타낸다. 일부 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 알콜 데히드로게나제, 예를 들어 유전자 변형 adhE 또는 유전자 변형 adhP에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 에탄올아민 이용 단백질, 예를 들어 유전자 변형 eutG에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 유전자 변형 yiaY, 유전자 변형 yqhD, 또는 유전자 변형 yigB에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다.
재조합 미생물 세포 또는 유전자 변형 미생물 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 피루베이트가 락테이트, 포르메이트 및 아세테이트 중 어느 하나 이상으로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 추가로 포함하며, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타낸다. 일부 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제, 예를 들어 유전자 변형 ldhA에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 피루베이트 포르메이트 리아제(lyase) I, 예를 들어 유전자 변형 pflB에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 피루베이트 옥시다제(oxidase), 예를 들어 유전자 변형 poxB에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다.
재조합 미생물 세포 또는 유전자 변형 미생물 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 아세틸-CoA가 에탄올 또는 아세틸-P로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 추가로 포함하며, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타낸다. 일부 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 알콜 데히드로게나제, 예를 들어 유전자 변형 adhE에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에, 유전자 변형 폴리펩티드는 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase), 예를 들어 유전자 변형 pta에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다.
재조합 미생물 세포 또는 유전자 변형 미생물 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 2-케토이소발레레이트가 이소부티르알데히드로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드, 예를 들어 2-케토산 데카르복실라제(decarboxylase)를 추가로 포함한다.
재조합 미생물 세포 또는 유전자 변형 미생물 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 피루베이트가 2-케토이소발레레이트로 전환되는 것을 순차적으로 촉매하는 다수의 폴리펩티드, 예를 들어 디히드록시산 데히드라타제(dehydratase), 케톨-산 리덕토이소머라제(reductoisomerase), 및 아세토락테이트 신타제(synthase)를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 세포 또는 유전자 변형 세포를, 세포가 이소부티레이트를 생산하는데 효과적인 조건 하에 탄소원을 포함하는 배지에서 인큐베이션하며, 이때 탄소원은 글루코스, 도 1의 화합물 6, 도 1의 화합물 7, 도 1의 화합물 8, 도 1의 화합물 9, 및 도 1의 화합물 10 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하여, 변형된 숙주 세포가 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉매하도록 하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기의 본 발명의 개요는 각각의 개시된 실시양태 또는 본 발명의 모든 실행을 기술하는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 설명은 예시적인 실시양태들을 더욱 특히 예시한다. 본 출원 전반에 걸친 여러 곳에서, 예들의 목록을 통해 지침이 제공되고, 이러한 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 대표적인 군으로서의 역할만 하고, 배타적인 목록으로 해석되지 않아야 한다.
도 1. (a) 석유화학 공급 재료로부터의 이소부티르산의 화학적 합성 및 이의 대표적인 용도, (b) 재생가능한 탄소원인 글루코스로부터의 이소부티르산 생합성을 위한 대사 경로의 디자인. 효소 "X"는 이소부티르알데히드 (10)를 이소부티르산 (1)으로 효율적으로 전환시킨다.
도 2. 합성 대사 경로로의 이소부티르산 생합성. (a) 탄소 흐름을 이소부티르산을 향해 구동시키기 위한 유전자 과발현을 위한 2개의 합성 오페론의 구축. (b) 상이한 알데히드 데히드로게나제들로의 생산 수준: (i) 알데히드 데히드로게나제 없음; (ii) aldB; (iii) aldH; (iv) gabD; (v) kdh ba ; (vi) kdh pp ; (vii) padA; (viii) ydcW.
도 3. 경쟁 경로를 결실시키는 것의 생합성에 대한 효과. (a) 내인성 알콜 데히드로게나제 예컨대 YqhD가 이소부티르알데히드에 대해 PadA와 경쟁하고, 부산물인 이소부탄올을 생산한다. (b) yqhD 녹아웃(knockout)이 크게 이소부티르산 생산을 증가시키고 이소부탄올 수준을 감소시킨다.
도 4. pIBA1의 플라스미드 지도.
도 5. pIBA3의 플라스미드 지도.
도 6. 이. 콜라이에서의 이소부티레이트 합성 경로. 약어: AlsS, 아세토락테이트 신타제; IlvC, 2,3-디히드록시-이소발레레이트:NADP+ 옥시도리덕타제(oxidoreductase); IlvD, 2,3-디히드록시-이소발레레이트 데히드라타제; KIVD, α-케토이소발레레이트 데카르복실라제; PadA, 페닐아세트알데히드 데히드로게나제.
도 7. 진탕 플라스크에서의 이소부티레이트 발효에 대한 알콜 데히드로게나제 녹아웃의 효과. (A) 상이한 녹아웃 균주들에서의 이소부티레이트 생산. (B) 상응하는 녹아웃 균주에서의 이소부탄올 형성. (i) IBA1-1C, ΔyqhD; (ii) IBA11-1C, ΔyqhDΔadhE; (iii) IBA12-1C, ΔyqhDΔadhP; (iv) IBA13-1C, ΔyqhDΔeutG; (v) BIA14-1C, ΔyqhDΔyiaY; (vi) IBA15-1C, ΔyqhDΔyjgB.
도 8. 진탕 플라스크에서의 이소부티레이트 생산에 대한 PadA 발현 수준의 효과. (A) 2개의 PadA 카피가 있는 상이한 녹아웃 균주들에서의 이소부티레이트 수준. (B) 상응하는 이소부탄올 형성. (i) IBA1-2C, ΔyqhD; (ii) IBA13-2C, ΔyqhDΔeutG; (iii) IBA14-2C, ΔyqhDΔyiaY; (iv) IBA15-2C, ΔyqhDΔyjgB.
도 9. 생물반응기에서의 유가식(fed-batch) 배양에 의한 이소부티레이트의 규모 확대 발효. (A) 50％ NH4OH; IBA15-2C 균주. (B) 10N NaOH; IBA15-2C 균주. (C) 20％ Ca(OH)2 현탁액; IBA15-2C 균주. (D) 20％ Ca(OH)2 현탁액, IBA1-2C 균주. 기호: 흑색 사각형, 바이오매스; 흑색 삼각형, 아세테이트; 흰색 원, 이소부티레이트.
도 10. 이. 콜라이에서의 이소부티레이트 합성 경로. 약어: AlsS, 아세토락테이트 신타제; IlvC, 2,3-디히드록시-이소발레레이트:NADP+ 옥시도리덕타제; IlvD, 2,3-디히드록시-이소발레레이트 데히드라타제; BKDH, 분지쇄 케토산 데히드로게나제; TesA, 티오에스테라제 A; TesB, 티오에스테라제 B.
도 11. pIBA16의 플라스미드 지도.
도 12. pIBA17의 플라스미드 지도.
도 13. pIBA18의 플라스미드 지도.
예시적인 실시양태들의 상세한 설명
이소부티르산은 다수의 다양한 용도가 있는 플랫폼(platform) 화학물질이다. 이소부티르산을 제작하기 위한 현재의 공정들은 재생불능성의 유지할 수 없는 석유 공급 재료 및/또는 독성 물질의 사용을 수반한다. 천연 생물은 상업적으로 유의한 양의 이소부티르산을 생산할 수 없다. 그러나, 본 발명가들은 예를 들어 글루코스와 같은 재생가능한 공급 재료로부터의 높은 수준의 이소부티르산 생합성을 위한 합성 대사 경로를 보유하는 재조합 세포를 구축하였다. 따라서, 본 발명가들은 석유에 의존적이지 않은 이소부티르산을 합성하기 위한 신규 경로를 제공한다. 추가로 본 발명가들은 이소부티르산을 합성하기 위한 신규 재조합 미생물을 제공한다.
하기의 설명에서 사용되는 바와 같이, "및/또는"이라는 용어는 열거된 요소들 중 하나 또는 모두 또는 열거된 요소들 중 임의의 2개 이상의 조합을 의미하고, "포함한다"라는 용어 및 이의 변형은 이러한 용어들이 설명 및 청구항에서 나타나는 경우에 제한적인 의미를 지니지 않으며; 달리 특정되지 않는 한, 단수형 관사 ("a", "an", "the"), 및 "하나 이상"은 상호교환가능하게 사용되고, 1개 또는 1개 초과를 의미하고; 종점에 의한 숫자 범위의 열거는 이러한 범위 내에 포괄되는 모든 숫자를 포함한다 (예를 들어 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다).
화석을 기초로 하는 자원은 통상적으로 에너지용으로, 그리고 화학물질 공급 재료로서 이용된다. 오일 매장량의 고갈로 인해, 석유를 기초로 하는 제품에 대한 대안을 탐구하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다. 생합성은 재생가능한 탄소원으로부터의 특정 연료 또는 특정 화학물질의 지속가능한 생산을 가능하게 하는 전도유망한 접근법이다. (문헌 [Atsumi et al., 2008 Nature 451:86-89]; [Steen et al., 2010 Nature 463:559-562]; [Causey et al., 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:825-832]; [Lin et al., 2005 Metab. Eng. 7:116-127]; [Zeng and Biebl, 2002 Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2002:239-259]; [Alper et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:612-616]). 한가지 난점은 다수의 유용한 화학물질이 생물학적 시스템에 의해 천연적으로 생산되지 않는다는 것이다. 따라서, 신규 대사 경로를 디자인하거나 발전시키는 것이 종종 필요하다. (문헌 [Zha et al., 2004 J. Am. Chem. Soc. 126:4534-4535]; [Zhang et al., 2008 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:20653-20658]; [Yan et al., 2005 Appl. Environ. Microbiol. 71:3617-3623]; [Zhang et al., 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:6234-6239]). 본원에서, 본 발명가들은 이소부티르산을 생산하기 위한 생합성 경로의 개발을 보고한다.
이소부티르산 (도 1(a), 화합물 1)은 유용한 플랫폼 화학물질이다. 이는 촉매에 의한 산화성 탈수소화에 의해 메타크릴산 (도 1(a), 화합물 2)으로 전환될 수 있다. (문헌 [Millet, 1998 Catal. Rev.-Sci. Eng. 40:1-38]). 폴리(메틸 메타크릴레이트)의 합성을 위해 메타크릴산의 에스테르인 메틸 메타크릴레이트가 연간 220만 톤의 양으로 생산된다. (문헌 [Nagai, 2001 Appl. Catal. A-Gen. 221:367-377]). 이소부티르산은 매년 100,000 톤의 시장 규모로 인쇄용 잉크, 자동차 페인트 및 음료 첨가물에서 사용되는 유화제인 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 (도 1(a), 화합물 3)를 제작하는데 또한 사용될 수 있다. (문헌 [Godshall, "Sustainability of the Sugar and Sugar-Ethanol Industries", ACS Symposium Series 1058; American Chemical Society: Washington, DC, 2010; pp 253-268]). 이소부티르산의 또 다른 용도는 2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄디올 모노이소부티레이트 (도 1(a), 화합물 4; TEXANOL, 테네시주 킹스포트의 이스트만 케미컬 컴퍼니(Eastman Chemical Co.)) 또는 디이소부티레이트 (TXIB)의 합성을 위한 것이다. TXIB는 비-프탈레이트 가소제이고, TEXANOL은 통상적으로 사용되는 유착제이다. ( 문헌 ["Screening Information Data Set (SIDS) for High Production Volume Chemicals", Organization for Economic Cooperation and Development 2005]). 이소부티르산의 기타 예시적인 용도에는 탈카르복실성 커플링에 의한 이소프로필 케톤 예컨대 이소부티론 (도 1(a), 화합물 5)의 제조가 포함된다 (예를 들어 미국 특허 4,754,074 참조).
현재의 한 이소부티르산 제작 공정은 프로필렌의 산-촉매 코흐(Koch) 카르보닐화를 수반한다 (도 1(a); 예를 들어 미국 특허 4,452,999 참조). 이러한 화학적 공정에서는 2가지 이상의 우려가 발생한다. 먼저, 지속적인 장기 공급이 보장되지 않는, 재생가능하지 않은 자원 예컨대 석유 및 천연 가스로부터 가장 통상적으로 유래되는 더 큰 탄화수소 분자를 열분해(cracking)함으로써 출발 물질인 프로필렌이 생산된다. 두 번째로, 일산화탄소 및 플루오르화수소의 사용이 환경 손상을 야기할 수 있다. 화학적 합성을 미생물 생합성으로 교체함으로써 이같은 문제들이 경감될 수 있다.
부티르산을 과생산할 수 있는 일부 박테리아가 있지만 (문헌 [Liu et al., 2006 Enzyme Microb. Technol. 38:521-528]), 상업적으로 유용한 양의 이소부티르산을 생산하는 것으로 공지된 천연 생물이 없다. 본 발명가들은 예를 들어 글루코스로부터 이소부티르알데히드를 생성시키기 위한 천연 대사 경로를 기초로 하는 합성 대사 경로를 개발하였다. 이러한 천연 대사 경로의 방향을 이소부티레이트의 생산 쪽으로 전환하는 1개 이상의 조작된 대사 단계로 천연 대사 경로가 증대된다 (예를 들어 도 1(b) 및 도 10).
도 1(b)에 제시된 한 조작된 경로에서, 글루코스가 당분해를 통해 피루베이트 (화합물 6)로 대사된다. 그 후, 피루베이트가 발린 생합성 효소 AlsS, IlvC, 및 IlvD에 의해 2-케토발린 (화합물 9)으로 전환된다. (문헌 [Atsumi et al., 2008 Nature 451:86-89]). 락토코쿠스 락티스로부터의 에를리히(Ehrlich) 경로 효소 2-케토산 데카르복실라제 (KIVD)에 의해 2-케토발린이 이소부티르알데히드로 탈카르복실화될 수 있다. (문헌 [de la Plaza et al., 2004 FEMS Microbiol. Lett. 238:367-74]). 이러한 합성 경로에 대해, 본 발명가들은 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 효과적으로 촉매할 수 있는, 도 1(b)에서 "X"로 지시된 효소를 확인할 필요가 있었다.
이소부티르알데히드가 어떤 효소에 대해서도 공지된 천연 또는 실험 기질이 아님에도 불구하고, 본 발명가들은 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 산화되는 것을 촉매할 수 있는 효소를 확인하였다. 본 발명가들은 7개의 알데히드 데히드로게나제를 가능한 후보 효소로 선택하였다: 이. 콜라이 아세트알데히드 데히드로게나제 AldB, 이. 콜라이 3-히드록시프로피온알데히드 데히드로게나제 AldH, 이. 콜라이 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 GabD, 이. 콜라이 페닐아세트알데히드 데히드로게나제 PadA, 이. 콜라이 γ-아미노부티르알데히드 데히드로게나제 YdcW, 부르크홀데리아 암비파리아(Burkholderia ambifaria) α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHba), 및 슈도모나스 푸티다 KT2440 α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHPP). 이러한 효소들은 상동성을 거의 공유하지 않고, 광범위한 알데히드 기질을 다루지만, 이러한 광범위한 알데히드 기질에 이소부티르알데히드가 포함되지는 않는다. 이러한 알데히드 데히드로게나제 중 하나를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 KIVD 뒤에 클로닝하여, 높은 카피수의 플라스미드 상에서 발현 카세트 kivd -x를 만들었다 (도 2(a), X는 알데히드 데히드로게나제-코딩 올리고뉴클레오티드를 나타냄). 탄소 흐름을 2-케토발린 쪽으로 구동시키도록, 전사 순서 ilvD - alsS (도 2(a))의 중간 카피수의 플라스미드 상에서의 또 다른 오페론을 또한 구축하였다 (ilvC는 클로닝되지 않았는데, 이의 기질인 아세토락테이트에 의한 유도 시 염색체 카피가 과발현될 수 있기 때문이었다; 문헌 [Wek and Hatfield, 1988 Mol. Biol. 203:643-663]). 이를 각각의 알데히드 데히드로게나제에 대해 반복하여, 각각의 발현 카세트가 알데히드 데히드로게나제 중 하나를 발현하는 발현 카세트들의 라이브러리가 생성되었다.
클로닝된 플라스미드를 야생형 이. 콜라이 균주 BW25113 내로 형질전환시켰다. 진탕 플라스크 발효를 30℃에서 48시간 동안 수행하였다. 배양물을 40 g/ℓ 글루코스를 탄소원으로 함유하는 M9 최소 배지에서 성장시키고, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 발효 생성물을 굴절률 검출로 HPLC 분석에 의해 정량하였다. 도 2(b)로부터 볼 수 있듯이, 알데히드 데히드로게나제들이 다양한 수준의 이소부티레이트 생산을 제공하였다. 어떠한 플라스미드-코딩 알데히드 데히드로게나제도 없이, 1.3 g/ℓ 이소부티레이트가 검출되었고 (i, 도 2(b)), 이는 내인성 알데히드 데히드로게나제들의 기능으로부터 유래된 것이다. GabD, Kdhba, Kdhpp 및 YdcW는 이소부티레이트의 생산 수준을 약간 증가시켰다 (각각 도 2(b) iv, v, vi, 및 viii). 비교하면, AldB 및 AldH를 보유하는 형질전환체는 2.3 g/ℓ 및 3.8 g/ℓ 이소부티레이트를 생산하였다 (각각 도 2(b) ii, iii). PadA를 보유하는 형질전환체는 4.8 g/ℓ 이소부티레이트를 생산하였다 (도 2(b), vii).
가장 많은 양의 이소부티레이트를 생산하였기 때문에, 본 발명가들은 추가적인 연구용으로 PadA를 선택하였다. 효소를 특성화하기 위해, PadA에 N-말단 6×His-태그(tag)를 부착하고, 이를 과발현시키고, Ni-NTA 칼럼을 통해 정제하였다. 340 nm에서 NAD+가 NADH로 환원되는 것을 측정함으로써 PadA에 의한 이소부티르알데히드 전환의 동역학 파라미터를 결정하였다. 결과가 표 1에서 제시된다. 이소부티르알데히드에 대한 PadA 활성이 이의 천연 생리학적 기질인 페닐아세트알데히드에 대한 것보다 훨씬 더 낮다. k cat 값은 4배 더 낮을 뿐이지만 (1494 min-1 대 5810 min-1), K m 값은 230배 더 높다 (2.67 mM 대 0.0116 mM). 따라서, 페닐아세트알데히드에 대한 PadA의 특이성 상수 k cat/K m이 비-천연 기질인 이소부티르알데히드에 대한 것보다 거의 1000배 더 높다.
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이소부티르알데히드에 대한 PadA의 K m이 비교적 높기 때문에, 내인성 알콜 데히드로게나제 예컨대 YqhD (K m 1.8 mM; 문헌 [Atsumi et al., 2010 Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:651-657])가 알데히드 기질에 대해 경쟁할 수 있고, 이소부티르산 대신 이소부탄올을 생산할 수 있다 (도 3(a)). 이는, 부분적으로, 이소부티레이트의 농도와 등가인, 발효 생성물 내의 4.8 g/ℓ 이소부탄올의 축적을 설명할 수 있다 (도 3(b)). 본 발명가들은 BW25113의 염색체에서 yqhD 유전자를 결실시켰다. 야생형 균주와 비교하여, ΔyqhD 돌연변이체에서 이소부탄올 생산은 0.8 g/ℓ로 감소되었고, 이소부티레이트 생산은 11.7 g/ℓ로 증가되었다 (도 3(b)). 따라서, 진탕 플라스크 발효에서, 이러한 변형된 균주는 글루코스 1 g 당 0.29 g의 수율로 이소부티레이트를 생산할 수 있고 (도 3(b)), 이는 이론적 최대값의 59％이다.
따라서, 본 발명가들은 글루코스로부터의 이소부티레이트 생합성을 위한 합성 대사 경로를 개발하였다. 본 발명가들은 본 발명가들이 조사한 7개의 알데히드 데히드로게나제 각각이 이소부티르알데히드를 이소부티레이트로 전환시켰음을 발견하였다. 이러한 7개의 알데히드 데히드로게나제 중에서, PadA가 생체 내에서 이소부티르알데히드를 이소부티레이트로 산화시키는 것에서 가장 효과적인 효소였다. 이소부티르알데히드에 대해 PadA와 경쟁하는 효소를 코딩하는 yqhD 유전자를 염색체에서 결실시키는 것이 이소부티레이트 생산을 40 g/ℓ 글루코스로부터의 11.7 g/ℓ로 추가로 증가시켰다.
도 10에서 제시된 별법적인 조작된 경로에서, 2-케토발린 (화합물 9)이 이소부티레이트 (화합물 1)로 전환된다. 분지쇄 케토산 데히드로게나제 BKDH가 2-케토발린을 분지쇄 CoA로 전환시킬 수 있고, 차례로 이는 티오에스테라제에 의해 이소부티레이트로 전환될 수 있다.
본 발명가들은 슈도모나스 푸티다 게놈 DNA로부터 bkdh를, 야생형 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 tesA 및 tesB를 클로닝하였다. 플라스미드 pIBA16은 bkdh를 함유하고, pIBA17은 bkdh 및 TesA를 함유하며, pIBA18은 bkdh 및 TesB를 함유한다. TesB 또는 TesA 없이 BKDH를 포함하는 구축물 (pIBA16)에서 이소부티레이트가 5.61 ± 0.67 g/ℓ의 농도로 축적되었고 (표 4), 이는 yqhD 녹아웃 전에 PadA 구축물이 나타낸 이소부티레이트 생산보다 약간 더 높다 (도 3(a)). 그러나, 티오에스테라제의 부가가 이소부티레이트 수율을 추가로 증가시켰다. 예를 들어 BKDH + TesB (pIBA18)는 40 g/ℓ 글루코스로부터 8.6 g/ℓ 이소부티레이트를 생산하였다 (글루코스 1 g 당 0.22 g, 또는 이론적 최대 수율의 약 44％).
결과적으로, 본 발명가들은 이소부티레이트 생합성을 달성하기 위한 다양한 변형된 대사 경로를 실연하였다. 또한, 본 발명가들은 천연적으로는 이소부티레이트를 생산하지 않는 내인성 생합성 경로를 따라 있는 다양한 지점으로부터 생합성의 방향을 전환시킴으로써 효율적인 이소부티레이트 생합성을 달성할 수 있다는 것을 실연하였다. 따라서, 본 발명가들은 이소부티레이트 생합성을 위한 일반적인 플랫폼을 확립하였다.
이소부티레이트 생산에 대한 녹아웃의 효과
다음으로, 본 발명가들은 추가적인 조작이 탄소 수율을 추가로 증가시킬 수 있는지 여부를 조사함으로써 본 발명가들의 초기 발견을 증축하였다. 본 발명가들은 6개의 이. 콜라이 녹아웃 균주를 구축하였고, 1개의 이중 녹아웃 (ΔyqhD, ΔyjgB)이 단일 녹아웃 균주 (ΔyqhD)보다 17％ 더 많은 이소부티레이트를 생산하였음을 발견하였다. 그 후, 본 발명가들은 플라스미드 상의 구성적 프로모터 하에 알데히드 데히드로게나제의 추가적인 카피를 도입하였다. PadA 과발현은 이소부탄올 형성을 더 감소시켰고, 이소부티레이트 생산을 더 증가시켰다. 따라서, 본 발명가들은 이소부티레이트 수율이 글루코스 1 g 당 0.39 g (이론적 최대값의 80％)인 조작된 균주를 구축하는데 성공하였다.
또한 본 발명가들은 발효 공정의 규모를 진탕 플라스크에서 생물반응기로 확대하였다. 본 발명가들은 발효 동안 pH 조정을 위한 염기로서 Ca(OH)2가 NH4OH 또는 NaOH보다 훨씬 더 양호하였음을 발견하였다. 발효 배양물의 pH를 유지하기 위해 Ca(OH)2를 사용하는 것은 세포 밀도를 증가시키고, 아세테이트 축적을 감소시키며, 최종 이소부티레이트 축적을 90 g/ℓ로 증가시켰다.
도 1(b) 및 도 6에 도해된 조작된 생합성 경로에서, 이소부티르알데히드는 이소부티레이트의 중간 전구체이다. 다수의 생물에서, 이소부티르알데히드는 내인성 알콜 데히드로게나제, 예를 들어 이. 콜라이에서의 AdhE, AdhP, EutG, YiaY, YjgB 및 YqhD에 의해 천연적으로 이소부탄올로 환원된다. yqhD 녹아웃이 이소부티레이트 생산에서의 50％ 증가를 나타낼 수 있기 때문에, YqhD가 이소부탄올 형성에서 수반되는 것으로 공지되어 있다. (문헌 [Zhang et al., 2011 ChemSusChem 4:1068-1070]). 그러나, yqhD 녹아웃 후에도, 여전히 이소부탄올이 0.8 g/ℓ의 농도로 발효 부산물로서 존재하였다 (도 7B, i). 따라서, 본 발명가들은 다른 알콜 데히드로게나제 유전자의 녹아웃 (yqhD 결실과 조합됨)이 이소부티르알데히드가 이소부탄올로 전환되는 것을 감소시키고 따라서 이소부티레이트로의 전환을 위해 세포가 이용가능한 이소부티르알데히드의 양을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. adhE 또는 adhP의 추가적인 결실이 이소부탄올 축적을 0.90 g/ℓ로 약간 증가시킨 한편 (각각 도 7B, ii 및 iii), 이소부티레이트 생산은 영향을 받지 않았다 (각각 도 7A, ii 및 iii). eutG 녹아웃은 이소부탄올 수준을 0.76 g/ℓ로 감소시켰고, 이소부티레이트 농도를 12.2 g/ℓ로 증가시켰다 (각각 도 7B, iv 및 도 7A, iv). 흥미롭게도, yiaY 또는 yjgB의 추가적인 결실이 이소부탄올 형성을 감소시키지 않았지만 (각각 도 7B, v 및 vi), 이소부티레이트 생산 수준을 12.4 g/ℓ 및 12.9 g/ℓ로 증가시켰다 (각각 도 7A, v 및 vi). 따라서, IBA1-1C 균주 (ΔyqhD, i)와 비교하여, IBA15-1C 균주 (ΔyqhD, ΔyjgB, vi)는 이소부티레이트 생산 증가를 나타냈다. ΔadhE 균주에서의 결과는 최근 공개된 보고서 (문헌 [Trinh et al., 2011 Appl. Environ. Microbiol. 77:4894-4904])와 상이하였다. 그러나, 이러한 연구는 혐기성 조건을 사용하여 이소부탄올 생산에 대한 adhE 기능을 조사한 반면, 본 발명가들의 발효 조건은 반-혐기성이었다. AdhE 효소는 산소에 의해 불활성화되는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Holland-Staley et al., 2000 J. Bacteriol. 182:6049]).
이소부티레이트 생산에 대한 PadA 발현 수준의 효과
다음으로, 본 발명가들은 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 지시하는 것에 대한 별법적인 접근법을 시험하였고, 이는 이소부티르알데히드를 이소부탄올로 전환시키는 알콜 데히드로게나제에 대해 더욱 경쟁적이도록 PadA의 단백질 발현 수준을 증가시키는 것을 수반하였다. padA의 추가적인 카피를 높은 카피수의 플라스미드 상의 구성적 프로모터 하에 도입하였다. 본 발명가들은 padA의 두 번째 카피를 단일 녹아웃 균주 IBA1 (ΔyqhD), 및 이중 녹아웃 균주 IBA13 (ΔyqhDΔeutG), IBA14 (ΔyqhDΔyiaY), 및 IBA15 (ΔyqhDΔyjgB)에 부가하였고, 이때 이중 녹아웃 균주 각각은 1개의 padA 카피를 보유하였을 때 단일 녹아웃 IBA1 균주보다 더 많은 이소부티레이트를 생산하였다 (도 7A).
단일-PadA 모 균주인 IBA1-1C로부터의 11 g/ℓ (도 7A, i)에 비교하여 이중-PadA 균주 IBA1-2C는 13.7 g/ℓ 이소부티레이트를 생산하였다 (도 8A, i). 반면에, 이소부탄올 농도는 0.82 g/ℓ (도 7B, i)에서 0.35 g/ℓ (도 8B, i)로 감소하였다. 이러한 결과는 PadA 발현을 증가시키는 것이 이소부탄올 축적을 감소시키고 이소부티레이트 생산을 증가시킨다는 것을 실연한다. 이소부탄올 감소 (0.47 g/ℓ)가 이소부티레이트 증가 (2.7 g/ℓ)보다 적었다. 차이에서의 불일치에 대한 한가지 가능한 이유는 이소부티레이트를 생산하는 것이 이소부탄올을 생산하는 것보다 세포에 덜 스트레스를 일으켜서 2개의 padA 카피를 함유하는 세포가 더 적은 양의 부산물을 생산하고 따라서 더 많은 생합성 에너지를 이소부티레이트 생산 쪽으로 향하게 한다는 것일 수 있다. 예를 들어 또 다른 부산물인 아세테이트의 축적이 IBA1-1C에서의 0.6 g/ℓ에서 IBA1-2C에서의 0.1 g/ℓ로 또한 감소하였다.
PadA 과발현의 효과가 IBA13-2C, IBA14-2C, 및 IBA15-2C 균주에서 또한 확증되었다. 2개의 padA 카피로, 이러한 균주들은 약 0.4 g/ℓ 이소부탄올을 생산하였고 (도 8B, ii-iv), 이는 1개의 PadA 카피를 보유하는 균주 (도 7B, iv-vi)보다 유의하게 더 낮았다. 더욱 중요하게, IBA13-2C, IBA14-2C, 및 IBA15-2C에서 이들 각각의 단일-PadA 모 균주 (도 7A, iv-vi)와 비교하여 이소부티레이트 축적이 또한 증가하였다 (각각 14.3 g/ℓ, 14.6 g/ℓ, 및 15.6 g/ℓ (도 8A, ii-iv)).
또한, PadA를 과발현하는 이중 녹아웃 IBA-13-2C, IBA14-2C, 및 IBA15-2C에서의 이소부티레이트 축적이 IBA1-2C에서의 PadA를 과발현하는 단일 (Δyqh) 녹아웃에서의 이소부티레이트 축적보다 더 높았고, 이는 이중 녹아웃이 이소부티레이트 생산을 증가시킨다는 것을 확증한다.
따라서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 선호하는 PadA를 과발현시킴으로써 및/또는 이소부티르알데히드에 대해 PadA와 경쟁할 수 있지만 이소부티르알데히드가 이소부탄올로 전환되는 것을 선호하는 하나 이상의 알데히드 데히드로게나제를 녹아웃시킴으로써, 이소부탄올보다는 이소부티레이트 생산을 선호하도록 미생물을 조작할 수 있다. PadA를 과발현하는 이중 녹아웃 (Δyqh, ΔyjgB) 균주 IBA15-2C는 글루코스 1 g 당 0.39 g (이론적 최대값의 80％)을 산출하였다.
유가식 생물반응기에서의 발효 조건의 최적화
다음으로, 본 발명가들은 발효 규모가 진탕 플라스크에서 생물반응기로 확대되는 경우에 상기 기술된 효과들이 유지되는지 여부를 조사하였다. 균주 IBA15-2C로 생물반응기 발효 실험을 수행하였다. 생물반응기 내에 아세테이트가 과축적되는 것을 피하기 위해, 글루코스를 10 g/ℓ 미만 수준으로 유지하도록 글루코스 공급 속도를 조정하였다. 각각의 생산된 이소부티레이트 분자에 대해 2개의 NADH 분자가 생성되기 때문에, 용존 산소 (DO) 수준을 10％에서 유지하여, 과량의 NADH를 연소시켰다. TCA 사이클을 통해 기질이 CO2로 과도하게 산화되는 것을 방지하기 위해 더 높은 DO 수준을 피했다.
이소부티레이트 생합성 동안, 염기가 발효 배양 배지에 첨가되지 않으면 pH가 급격하게 하락할 수 있다. 본 발명가들은 pH 7.0을 유지하기 위해 3가지 상이한 염기인 NH4OH, NaOH, 및 Ca(OH)2의 효과를 조사하였다. 도 9A-C (흑색 사각형)에 나타난 바와 같이, 모든 조건에 대해, 바이오매스(biomass)가 처음 20시간에는 기하급수적으로 증가하였고, 그 후 점진적으로 감소하였다. NH4OH 또는 NaOH를 사용하여 수득된 최대 바이오매스는 약 7.5 g/ℓ인 반면, Ca(OH)2로 수득된 최대 바이오매스는 약 10 g/ℓ였다. 이러한 결과는 과도한 암모늄 이온 또는 나트륨 이온이 세포 성장에 부정적인 영향이 있을 수 있다는 것을 시사한다. 기존에는 수산화암모늄이 pH 제어 및 질소원 공급 제공에 사용되지었지만, 이러한 염기는 이소부티레이트 생산을 최대화하는데 최적이지 않은 것으로 보인다. 이소부티레이트 축적이 NH4OH를 사용하여 140시간 후에 51.1 g/ℓ (도 9A, 흰색 원), NaOH로는 65.4 g/ℓ (도 9B, 흰색 원), Ca(OH)2로는 90.3 g/ℓ (도 9C, 흰색 원)에 도달하였다. 일반적으로, 최종 이소부티레이트 축적은 각각의 배양에서 최종 아세테이트 축적과 역으로 관련되었다: NH4OH-조정 배양에서는 12.6 g/ℓ 아세테이트가 축적된 한편, NaOH-조정 배양에서는 아세테이트가 7.1 g/ℓ로 감소되었고, Ca(OH)2-조정 배양에서는 3.4 g/ℓ에 불과하였다 (도 9A-C, 흑색 삼각형). 이는 아세테이트가 이. 콜라이 발효의 주요 억제제였다는 기존의 보고들과 일관된다 (문헌 [Eiteman and Altman, 2006 Trends Biotechnol. 24:530-536]; [Koh et al., 1992 Biotechnol. Lett. 14:1115-1118]). 요약하면, Ca(OH)2를 사용하여 배양물 pH 7.0을 유지하는 것이 NH4OH 또는 NaOH를 사용하는 것과 비교하여 세포 밀도를 증가시켰고, 이소부티레이트 축적을 증가시켰으며, 아세테이트 부산물을 감소시켰다.
대조군으로서, 생물반응기에서의 PadA를 과발현하는 단일 유전자 (yqhD) 녹아웃 균주 IBA1-2C의 발효를 또한 조사하였다. 이러한 균주는 122시간 후 57.6 g/ℓ 이소부티레이트 및 1.0 g/ℓ 아세테이트를 생산하였고 (도 9D), 이는 수산화칼슘이 아세테이트 형성을 감소시키는 것 및 이소부티레이트 생산을 증가시키는 것을 도왔다는 것을 확증한다. 그러나, IBA15-2C 균주는 동일한 조건 하에 IBA1-2C 균주보다 57％ 더 많은 이소부티레이트를 생산하였고, 이는 ΔyqhD/ΔygjB 이중 녹아웃의 진탕 플라스크 배양에서 관찰된 증가된 이소부티레이트 생산이 생물반응기 부피로 규모가 확대될 수 있다는 것을 시사한다.
이러한 연구는 이소부티레이트가 조작된 미생물로부터 높은 축적 및 높은 수율로 생산될 수 있다는 것을 실연한다. 이러한 연구에서 기술된 이소부티레이트 생산이 미생물 발효에 부합하기 때문에, 본원에 기술된 변형된 미생물 균주 및 방법은 상업적인 이소부티레이트 생산을 위한 신규 플랫폼을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명가들은 재생가능한 방식으로 이소부티레이트를 생산하기 위한 플랫폼을 개발하였다. 본 발명가들은 화학적 합성과 연관된 문제점들 예컨대 지속가능하지 않은 석유 공급 재료 및 독성 물질의 사용을 다루었다. 본 발명가들의 생합성 접근법은 경제 및 환경 양쪽 모두의 이익을 위한 매력적인 선택권을 제공한다 (문헌 [Dale, 2003 J. Chem. Technol. Biotechnol. 78:1093-1103]).
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 야생형 대조군과 비교하여 증가된 이소부티르산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 미생물 세포를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "증가된 생산"은 야생형 대조군과 비교하여 이소부티레이트 생합성에서의 상대적인 증가로서, 미생물 세포의 배양물이 미리 정해진 농도로 이소부티레이트를 축적하는데 충분한 생합성으로서, 세포에 의해 생산된 이소부티레이트:이소부탄올의 비의 증가로서, 또는 특정한 기준 공급 재료, 예를 들어 글루코스를 사용하는 이론적인 최대 수율의 백분율의 증가로서 특성화될 수 있다.
기준 공급 재료 예컨대 글루코스를 특정하는 것은 미생물 배양물이 특정된 기준 공급 재료를 탄소원 또는 에너지원으로 사용하여 성장되는 것을 필요로 하지 않는다. 실제로, 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 공급 재료는, 예를 들어 도 1(b)에 제시된 화합물 6-9 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 임의의 별법적인 공급 재료를 사용하는 이론적인 최대 수율을 임의의 기준 공급 재료의 대사적으로 등가인 양을 기초로 하는 상응하는 이론적 최대 수율로 산술적으로 변환할 수 있다.
따라서, 일부 경우에, 변형된 미생물 세포는 적합한 야생형 대조군이 생산하는 이소부티레이트의 110％ 이상, 125％ 이상, 150％ 이상, 175％ 이상, 200％ (2배) 이상, 250％ 이상, 300％ (3배) 이상, 400％ (4배) 이상, 500％ (5배) 이상, 600％ (6배) 이상, 700％ (7배) 이상, 800％ (8배) 이상, 900％ (9배) 이상, 1000％ (10배) 이상, 2000％ (20배) 이상, 3000％ (30배) 이상, 4000％ (40배) 이상, 5000％ (50배) 이상, 6000％ (60배) 이상, 7000％ (70배) 이상, 8000％ (80배) 이상, 9000％ (90배) 이상, 10,000％ (100배) 이상, 또는 100,000％ (1000배) 이상, 소정의 숙주 세포가 글루코스 1 g 당 이소부티레이트 0.49 g의 이론적 최대값으로 이소부티레이트를 생산하는데 필요한 배수 증가 이하를 반영하는 이소부티레이트 생합성에서의 증가를 나타낼 수 있다.
다른 경우에, 변형된 미생물 세포는 미생물 세포가 배양에서 특정 시간 동안 성장했을 때 미리 정해진 농도로 이소부티레이트를 축적하는 것으로 반영되는 이소부티레이트 생합성에서의 증가를 나타낼 수 있다. 미리 정해진 농도는 소정의 용도에 적절한 임의의 미리 정해진 이소부티레이트 농도일 수 있다. 따라서, 미리 정해진 농도는, 예를 들어 0.1 g/ℓ 이상, 예컨대 0.5 g/ℓ 이상, 1.0 g/ℓ 이상, 2.0 g/ℓ 이상, 3.0 g/ℓ 이상, 4.0 g/ℓ 이상, 5.0 g/ℓ 이상, 6.0 g/ℓ 이상, 7.0 g/ℓ 이상, 8.0 g/ℓ 이상, 9.0 g/ℓ 이상, 10 g/ℓ 이상, 20 g/ℓ 이상, 50 g/ℓ 이상, 55 g/ℓ 이상, 60 g/ℓ 이상, 65 g/ℓ 이상, 70 g/ℓ 이상, 75 g/ℓ 이상, 80 g/ℓ 이상, 85 g/ℓ 이상, 90 g/ℓ 이상, 95 g/ℓ 이상, 100 g/ℓ 이상, 110 g/ℓ 이상, 120 g/ℓ 이상, 130 g/ℓ 이상, 140 g/ℓ 이상, 150 g/ℓ 이상, 160 g/ℓ 이상, 170 g/ℓ 이상, 180 g/ℓ 이상, 190 g/ℓ, 또는 200 g/ℓ 이상의 농도일 수 있다.
회분식 배양에서, 특정 시간은 최소 12시간, 예를 들어 24시간 이상, 36시간 이상, 48시간 이상, 60시간 이상, 72시간 이상, 84시간 이상, 96시간 이상, 108시간 이상, 120시간 이상, 132시간 이상, 또는 144시간 이상일 수 있다. 회분식 배양에서, 특정 시간은 최대 240 시간 이하 예컨대 216시간 이하, 192시간 이하, 168시간 이하, 144시간 이하, 120시간 이하, 108시간 이하, 96시간 이하, 84시간 이하, 72시간 이하, 60시간 이하, 또는 48시간 이하일 수 있다. 회분식 배양에서, 특정 시간은 종점들이 임의의 최소 시간 및 임의의 적합한 최대 시간으로 정의되는 범위로서 표현될 수도 있다. 연속 배양에서, 특정 시간은 회분식 배양에 대한 것과 동일한 방식으로 시간의 절대량으로서 표현될 수 있다. 별법적으로, 연속 배양에서의 특정 시간은 배양 단계, 예를 들어 항상성의 관점에서 표현될 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 변형된 세포는 48시간 후 4.7 g/ℓ 이상의 이소부티레이트를 생산하는 것으로 특성화될 수 있는 이소부티레이트 생합성에서의 증가를 나타낼 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 이소부티레이트 생산에서의 증가는 120시간의 배양 후 90 g/ℓ 이상의 이소부티레이트를 축적하는 것의 관점에서 표현될 수 있다.
다른 경우에, 변형된 미생물 세포는 세포가 생산한 이소부티레이트:이소부탄올 비의 관점에서 특성화되는 이소부티레이트 생합성에서의 증가를 나타낼 수 있다. 1:1 이상 예컨대 2:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상, 5:1 이상, 6:1 이상, 7:1 이상, 8:1 이상, 9:1 이상, 10:1 이상, 11:1 이상, 12:1 이상, 13:1 이상, 14:1 이상, 15:1 이상, 20:1 이상, 25:1 이상, 30:1 이상, 50:1 이상, 60:1 이상, 70:1 이상, 80:1 이상, 90:1 이상, 또는 100:1 이상의 이소부티레이트:이소부탄올 비로서 이소부티레이트 생합성에서의 증가가 표현될 수 있다.
또 다른 경우에, 변형된 미생물 세포는 특정한 기준 공급 재료, 예를 들어 글루코스로부터의 이론적인 수율의 40％ 이상의 미리 정해진 이소부티레이트 수율을 반영하는 이소부티레이트 생합성에서의 증가를 나타낼 수 있다. 미리 정해진 이소부티레이트 수율은, 예를 들어 이론적인 최대 수율의 40％ 이상, 이론적인 최대 수율의 50％ 이상, 이론적인 최대 수율의 60％ 이상, 이론적인 최대 수율의 70％ 이상, 이론적인 최대 수율의 80％ 이상, 이론적인 최대 수율의 90％ 이상, 이론적인 최대 수율의 95％ 이상, 이론적인 최대 수율의 96％ 이상, 이론적인 최대 수율의 97％ 이상, 이론적인 최대 수율의 98％ 이상, 또는 이론적인 최대 수율의 99％ 이상일 수 있다. 특정 실시양태는 글루코스로부터의 이론적 최대 수율의 약 44％, 약 59％, 또는 약 80％로 이소부티레이트를 생산할 수 있다.
재조합 세포는 원핵생물 미생물 또는 진핵생물 미생물이 예를 들어 포함되는 임의의 적절한 미생물일 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 1개 이상의 이종성 DNA 분자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 미생물에 관하여 "또는 ~로부터 유래됨"이라는 용어는, 간단하게, 이소부티레이트 생합성을 초래하는 조작된 생합성 경로에서 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 DNA 분자를 포함하도록 변형되기 전에 "숙주 세포"가 하나 이상의 유전자 변형을 보유하는 것을 허용한다. 따라서, "재조합 세포"라는 용어는 예를 들어 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것 또는 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것에서 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 DNA 분자가 세포 내로 도입되기 전에 1가지를 초과하는 종으로부터의 핵산 분자를 함유할 수 있는 "숙주 세포"를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 진핵생물 미생물, 예를 들어 진균 세포일 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 이러한 실시양태들 중 일부에서, 진균 세포는 사카로마이세타세아에 과의 구성원, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에, 칸디다(Candida) 속의 구성원, 예를 들어 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 클루베르마이세스(Kluyvermyces) 속의 구성원, 또는 피키아(Pichia) 속의 구성원, 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 다른 실시양태에서, 진균 세포는 디포다스카세아에(Dipodascaceae) 과의 구성원, 예를 들어 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)일 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 세포는 원핵생물 미생물, 예를 들어 박테리아일 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 이러한 실시양태들 중 일부에서, 박테리아는 프로토박테리아 문의 구성원일 수 있다. 프로토박테리아 문의 예시적인 구성원에는, 예를 들어 엔테로박테리아세아에 과의 구성원 (예를 들어 에쉐리키아 콜라이) 및, 예를 들어 슈도모나세아에 과의 구성원 (예를 들어 슈도모나스 푸티다)이 포함된다. 다른 경우에, 박테리아는 피르미쿠테스 문의 구성원일 수 있다. 피르미쿠테스 문의 예시적인 구성원에는, 예를 들어 바실라세아에 과의 구성원 (예를 들어 바실루스 서브틸리스) 및, 예를 들어 스트렙토코카세아에 과의 구성원 (예를 들어 락토코쿠스 락티스)이 포함된다.
하기의 설명에서, 다양한 실시양태의 설명이 유전자 변형을 코딩하는 이종성 DNA 분자를 지칭한다. 다양한 실시양태의 조합이 또한 가능하다. 이같은 실시양태들에서, 1가지를 초과하는 유전자 변형이 단일 이종성 DNA 분자, 예를 들어 플라스미드 벡터 상에 포함될 수 있다. 별법적으로, 상이한 유전자 변형들이 상이한 벡터들 상에 포함될 수 있고, 이들 각각이 숙주 세포 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 이종성 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드는 알데히드 데히드로게나제를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "알데히드 데히드로게나제"라는 용어는 속명 또는 천연 기능과 관계없이 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예시적인 알데히드 데히드로게나제에는, 예를 들어 이. 콜라이 페닐아세트알데히드 데히드로게나제 (PadA), 이. 콜라이 아세트알데히드 데히드로게나제 (AldB), 이. 콜라이 3-히드록시프로피온알데히드 데히드로게나제 (AldH), 이. 콜라이 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 (GabD), 이. 콜라이 γ-아미노부티르알데히드 데히드로게나제 (YdcW), 비. 암비파리아 α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHba), 또는 피. 푸티다 α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHPP)가 포함된다. 특정 실시양태에서, 재조합 세포는 2개 이상의 알데히드 데히드로게나제의 조합물을 코딩하는 이종성 DNA 분자 - 또는 다수의 이종성 DNA 분자 -를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 이종성 DNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (즉, 이종성으로 코딩되는 폴리펩티드)는 서열 1 내지 서열 106 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 기준 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이와 구조적으로 유사하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 이종성으로 코딩되는 폴리펩티드는 이종성으로 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 폴리펩티드와 비교하여 특정량의 유사성 및/또는 동일성을 보유하는 경우에 기준 폴리펩티드와 "구조적으로 유사"하다. 2개의 폴리펩티드의 구조적 유사성은 2개의 폴리펩티드 (예를 들어 이종성으로 코딩되는 폴리펩티드 및 예를 들어 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 폴리펩티드)의 잔기들을 이들의 서열 길이를 따라 동일한 아미노산의 개수를 최적화하도록 정렬함으로써 결정될 수 있다; 동일한 아미노산의 개수를 최적화하기 위해 정렬을 만들 때 한쪽 또는 양쪽 서열 내의 갭(gap)이 허용되지만, 그럼에도 불구하고 각각의 서열 내의 아미노산은 이의 올바른 순서를 유지하여야 한다.
GCG 패키지 (버전 10.2, 위스콘신주 매디슨) 내의 BESTFIT 알고리즘을 사용하여 아미노산 서열의 쌍(pair-wise) 비교 분석을 수행할 수 있다. 별법적으로, 문헌 [Tatiana et al., 1999 FEMS Microbiol Lett, 174:247-250]에 기술된 바와 같고 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (NCBI) 웹사이트에서 입수가능한 BLAST 2 검색 알고리즘의 Blastp 프로그램을 사용하여 폴리펩티드들을 비교할 수 있다. 매트릭스 = BLOSUM62; 오픈 갭 페널티 = 11, 확장 갭 페널티 = 1, 갭 x_드롭오프(dropoff) = 50, 예상값 = 10, 워드(word) 크기 = 3, 및 필터 온(on)을 포함하여, 모든 BLAST 2 검색 파라미터에 대한 디폴트 값을 사용할 수 있다.
2개의 아미노산 서열의 비교에서, 구조적 유사성은 "동일성" 백분율에 의해 지칭될 수 있거나, 또는 "유사성" 백분율에 의해 지칭될 수 있다. "동일성"은 동일한 아미노산의 존재를 지칭한다. "유사성"은 동일한 아미노산의 존재뿐만 아니라 보존적 치환의 존재를 또한 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드 내의 아미노산에 대한 보존적 치환은 이러한 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 특정 크기 또는 특성 (예컨대 전하, 소수성 및 친수성)의 아미노산들의 집단에 속하는 아미노산이, 특히 생물학적 활성과 직접적으로 연관되지 않은 단백질 영역 내에서, 단백질의 활성을 변경시키지 않으면서 또 다른 아미노산을 치환할 수 있다는 것이 단백질 생화학 업계에 주지되어 있다. 예를 들어 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양성 전하를 띠는 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함된다. 음성 전하를 띠는 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 보존적 치환에는, 예를 들어 양성 전하를 유지하기 위해 Lys이 Arg를 치환하는 것 및 반대의 경우; 음성 전하를 유지하기 위해 Glu이 Asp을 치환하는 것 및 반대의 경우; 유리-OH가 유지되도록 Ser이 Thr을 치환하는 것; 및 유리 -NH2를 유지하기 위해 Gln이 Asn을 치환하는 것이 포함된다. 유사하게, 폴리펩티드의 기능성 활성을 제거하지 않는 하나 이상의 연속적 또는 비연속적 아미노산의 결실 또는 부가를 함유하는 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 유사체가 또한 구상된다.
이종성으로 코딩되는 폴리펩티드는 기준 아미노산 서열과의 서열 유사성이 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상인 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
이종성으로 코딩되는 폴리펩티드는 기준 아미노산 서열과의 서열 동일성이 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상인 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
예시적인 기준 아미노산 서열에는 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 아미노산 서열이 포함된다.
1WNB는 NADH 및 베타인 알데히드와 복합체를 이룬 이. 콜라이 단백질 YdcW의 결정 구조이다 (문헌 [Gruez et al., 2004 J. Mol. Biol. 343:29-41]). 결정 구조를 기초로, 잔기 Y150, D279, F436, 및 L438은 베타인 알데히드 기질의 α-탄소로부터 반경 5Å 이내에 있다. PadA와 YdcW 간의 상동성은 낮은 반면에, 결합 주머니는 잘 보존된다. PadA의 활성 부위 내의 상응하는 잔기는 F175, V305, T461 및 I463이다. 폴리펩티드의 촉매 활성을 방해하지 않으면서 변형될 수 있는 아미노산 잔기를 확인하기 위해, 마찬가지로 중요하게는, 기질 결합 및/또는 촉매 활성에서 수반될 것 같은 아미노산을 확인하기 위해 유사한 분석을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 유사성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 DNA 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 예시적인 이종성 DNA 분자는 기준 아미노산 서열에 대한 서열 유사성이 예를 들어 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함한다.
다른 실시양태에서, 이종성 DNA 분자는 서열 1 내지 서열 106 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 코딩한다. 따라서, 예시적인 이종성 DNA 분자는 기준 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 예를 들어 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함한다.
이종성으로 코딩되는 폴리펩티드는 추가적인 서열, 예를 들어 발현 또는 칼럼 상에서의 포착 또는 항체 사용에 의한 정제를 용이하게 할 부가된 C-말단 또는 N-말단 아미노산에 대한 코딩 서열의 부가를 제공하도록 추가로 디자인될 수 있다. 이같은 태그에는, 예를 들어 니켈 칼럼 상에서의 폴리펩티드 정제를 허용하는 히스티딘-풍부 태그가 포함된다. 이같은 유전자 변형 기술 및 적절한 추가적인 서열이 분자 생물학 업계에 주지되어 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 세포는 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 이종성 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드는 분지쇄 케토산 데히드로게나제 (BKDH)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "분지쇄 케토산 데히드로게나제"라는 용어는 속명 또는 천연 기능과 관계없이 2-케토발린이 분지쇄 CoA로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예시적인 분지쇄 케토산 데히드로게나제에는, 예를 들어 슈도모나스 푸티다의 BKDH가 포함될 수 있다. 이러한 실시양태들 중 일부에서, 재조합 세포는 티오에스테라제를 코딩하는 이종성 DNA를 1개 이상 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "티오에스테라제"라는 용어는 속명 또는 천연 기능과 관계없이 분지쇄 CoA가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예시적인 티오에스테라제에는, 예를 들어 이. 콜라이의 TesA 또는 TesB가 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 도 1(b)에 도해된 생합성 전환을 촉매하는 1개 이상의 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 2-케토이소발레레이트가 이소부티르알데히드로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드, 예를 들어 2-케토산 데카르복실라제; 또는, 예를 들어 피루베이트가 2-케토이소발레레이트로 전환되는 것에서의 한 단계를 촉매하는 폴리펩티드들 중 어느 하나 이상, 예를 들어 디히드록시산 데히드라타제, 케톨-산 리덕토이소머라제, 및 아세토락테이트 신타제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이소부티르알데히드를 이소부티레이트로 전환하는 능력이 증가되도록 하나 이상의 내인성 효소가 변형된 유전자 변형 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형 세포는 하나 이상의 내인성 효소에 대한 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 유전자 변형 세포는 배양물 내의 높은 수준의 이소부티레이트를 견디는 세포의 능력을 증가시키는 하나 이상의 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 트랜스트립톰(transcriptome) 분석, 게놈 서열분석, 클로닝, 부위-특이적 돌연변이유발, 및 변형된 효소 또는 효소들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 미생물을 형질전환시키는 것 중 하나 이상이 예를 들어 포함되는 분자 생물학 기술을 사용하여 돌연변이를 일으킬 수 있다. 별법적으로, 고전적인 미생물 유전학 기술, 예를 들어 원하는 자발적 돌연변이를 보유하는 미생물을 선별 및/또는 확인하도록 디자인된 배지 내에서의 또는 이러한 배지 상에서의 성장을 사용하여 돌연변이를 일으킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포 또는 유전자 변형 세포는 이소부티르알데히드가 이소부티레이트 이외의 생성물 예컨대 이소부탄올, 락테이트, 에탄올, 또는 아세틸-P로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 추가로 포함할 수 있고, 이에 의해 더 많은 이소부티르알데히드를 이소부티레이트 생합성 쪽으로 지시한다. 일반적으로, 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 감소된 촉매 활성을 나타낼 수 있다. 이같은 유전자 변형은 이소부티레이트 이외의 생성물, 예를 들어 이소부탄올, 락테이트, 에탄올, 또는 아세틸-P의 생합성을 초래하는 방식으로 이소부티르알데히드가 대사되는 정도를 감소시킬 수 있고, 이에 의해 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 정도를 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, 재조합 세포 또는 유전자 변형 세포는 이소부티르알데히드가 이소부탄올로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 예시적인 폴리펩티드는, 예를 들어 알콜 데히드로게나제의 유전자 변형 버전 예컨대 유전자 변형 adhE 또는 유전자 변형 adhP에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 유전자 변형 폴리펩티드는 에탄올아민 이용 단백질의 유전자 변형 버전, 예를 들어 유전자 변형 eutG에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형 폴리펩티드는 유전자 변형 dkgA, 유전자 변형 yiaY, 유전자 변형 yqhD, 또는 유전자 변형 yjgB에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.
일부 경우에, 재조합 세포 또는 유전자 변형 세포는 피루베이트가 락테이트, 포르메이트 및 아세테이트 중 어느 하나 이상으로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 포함할 수 있고, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타낸다. 이러한 유형의 예시적인 폴리펩티드에는, 예를 들어 락테이트 데히드로게나제의 유전자 변형 버전 예컨대 유전자 변형 ldhA에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 피루베이트 포르메이트 리아제 I의 유전자 변형 버전 예컨대 유전자 변형 pflB에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는 피루베이트 옥시다제의 유전자 변형 버전 예컨대 유전자 변형 poxB에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 포함될 수 있다.
일부 경우에, 재조합 세포 또는 유전자 변형 세포는 아세틸-CoA가 에탄올 또는 아세틸-P로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 포함할 수 있고, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타낸다. 이러한 유형의 예시적인 폴리펩티드에는, 예를 들어 알콜 데히드로게나제의 유전자 변형 버전 예컨대 유전자 변형 adhE에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 유전자 변형 버전 예컨대 유전자 변형 pta에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 포함될 수 있다.
촉매 활성의 감소를 정량적으로 측정할 수 있고, 적합한 야생형 대조군의 촉매 활성의 백분율로서 기술할 수 있다. 유전자 변형 폴리펩티드가 나타내는 촉매 활성은, 예를 들어 적절한 야생형 대조군의 활성의 95％ 이하, 90％ 이하, 85％ 이하, 80％ 이하, 75％ 이하, 70％ 이하, 65％ 이하, 60％ 이하, 55％ 이하, 50％ 이하, 45％ 이하, 40％ 이하, 35％ 이하, 30％ 이하, 25％ 이하, 20％ 이하, 15％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 4％ 이하, 3％ 이하, 2％ 이하, 1％ 이하, 또는 활성의 0％일 수 있다.
별법적으로, 촉매 상수의 적합한 변화로서 촉매 활성의 감소가 표현될 수 있다. 예를 들어 촉매 활성의 감소가 k cat의 감소, 예를 들어 효소성 전환의 k cat 값의 2배 이상의 감소, 3배 이상의 감소, 4배 이상의 감소, 5배 이상의 감소, 6배 이상의 감소, 7배 이상의 감소, 8배 이상의 감소, 9배 이상의 감소, 10배 이상의 감소, 15배 이상의 감소 또는 20배 이상의 감소로서 표현될 수 있다.
K m의 증가, 예를 들어 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상, 75배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 230배 이상, 250배 이상, 300배 이상, 350배 이상 또는 400배 이상의 K m의 증가의 관점에서 촉매 활성의 감소가 또한 표현될 수 있다.
촉매 활성의 증가를 정량적으로 측정할 수 있고, 적합한 야생형 대조군의 촉매 활성의 백분율로서 기술할 수 있다. 유전자 변형 폴리펩티드가 나타내는 촉매 활성은, 예를 들어 적합한 야생형 대조군의 활성의 110％ 이상, 125％ 이상, 150％ 이상, 175％ 이상, 200％ (2배) 이상, 250％ 이상, 300％ (3배) 이상, 400％ (4배) 이상, 500％ (5배) 이상, 600％ (6배) 이상, 700％ (7배) 이상, 800％ (8배) 이상, 900％ (9배) 이상, 1000％ (10배) 이상, 2000％ (20배) 이상, 3000％ (30배) 이상, 4000％ (40배) 이상, 5000％ (50배) 이상, 6000％ (60배) 이상, 7000％ (70배) 이상, 8000％ (80배) 이상, 9000％ (90배) 이상, 10,000％ (100배) 이상, 또는 100,000％ (1000배) 이상일 수 있다.
별법적으로, 촉매 활성의 증가가 k cat의 증가, 예를 들어 효소성 전환의 k cat 값의 2배 이상의 증가, 3배 이상의 증가, 4배 이상의 증가, 5배 이상의 증가, 6배 이상의 증가, 7배 이상의 증가, 8배 이상의 증가, 9배 이상의 증가, 10배 이상의 증가, 15배 이상의 증가 또는 20배 이상의 증가로서 표현될 수 있다.
K m의 감소, 예를 들어 효소성 전환의 K m 값의 2배 이상의 감소, 3배 이상의 감소, 4배 이상의 감소, 5배 이상의 감소, 6배 이상의 감소, 7배 이상의 감소, 8배 이상의 감소, 9배 이상의 감소, 10배 이상의 감소, 15배 이상의 감소 또는 20배 이상의 감소의 관점에서 촉매 활성의 증가가 또한 표현될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하여, 변형된 숙주 세포가 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉매하도록 하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 이러한 방법은 상기 기술된 유전자 변형 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 이같은 이종성 폴리뉴클레오티드에는, 예를 들어 이소부티르알데히드에 대한 생합성 경쟁을 감소시키고 이에 의해 나중에 이소부티레이트로 전환되는 것을 위해 이소부티르알데히드가 축적되는 것을 촉진하는 유전자 변형이 포함될 수 있다. 이같은 이종성 폴리뉴클레오티드는 탄소원 기질이 이소부티르알데히드로 전환되는 것에서의 한 단계를 촉매하는 폴리펩티드를 또한 코딩할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 세포를 재조합 세포가 이소부티레이트를 생산하는데 효과적인 조건 하에 탄소원을 포함하는 배지에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 도 1(b)를 참조로, 일부 실시양태에서, 글루코스를 피루베이트를 전환시키고, 그 후, 예를 들어 도 1(b)에 도해된 생합성 경로에 의해, 피루베이트를 이소부티르알데히드로 전환시키고, 그 후 이소부티르알데히드를 이종성으로 코딩되는 폴리펩티드의 활성을 통해 이소부티레이트로 전환시키는 것에 의해 재조합 세포가 글루코스를 이소부티레이트로 전환시킬 수 있다. 그러나, 다른 실시양태에서, 반드시 이소부티르알데히드가 임의의 특정 생합성 경로를 통해 임의의 특정 공급 재료의 대사로부터 초래될 필요는 없다. 예를 들어 이소부티르알데히드가 배양 배지 내의 재조합 세포에 직접적으로 제공될 수 있다. 다른 예에서, 배양 배지는 도 1(b)에 제시된 생합성 경로 또는 이소부티르알데히드를 생산하는 임의의 다른 생합성 경로의 하나 이상의 중간체, 또는 이소부티르알데히드를 생산하기 위한 도 1(b)에 제시된 생합성 경로 내로의 공급물을 포함할 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 탄소원은 글루코스, 도 1(b)의 화합물 6, 도 1(b)의 화합물 7, 도 1(b)의 화합물 8, 도 1(b)의 화합물 9, 및 도 1(b)의 화합물 10 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
이소부티레이트는 범용 화학물질이기 때문에, 이소부티레이트 합성이 다른 화합물의 합성으로 확장될 수 있다. 예를 들어 이소부티레이트는 메타크릴산을 생산하도록 탈수될 수 있는 3-히드록시 부티레이트 (하기 반응식 I의 화학식 5)의 합성을 위한 출발 물질일 수 있다. 반응식 I은 3-히드록시 부티레이트의 합성을 도해한다. 반응식 I은 이소부티레이트 합성의 하류에 있는 4개의 단계로 이루어진다. 이러한 단계들 각각을 촉매하는 효소를 코딩하는 후보 유전자들이 확인되었다. 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제(transferase) 효소 (I, 반응식 I) (예를 들어 클로스트리디움 SB4(Clostridium SB4) 또는 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum)으로부터의 것)에 의해 이소부티레이트가 이소부티릴-CoA (반응식 I의 화학식 2)로 전환될 수 있다. 그 후, 이소부티릴-CoA가 2-메틸아실-CoA 데히드로게나제 효소 (II, 반응식 I) (예를 들어 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)로부터의 acdH 또는 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)로부터의 Acadsb)에 의해 메틸아크릴릴-CoA (반응식 I의 화학식 3)로 탈수소화될 수 있다. 그 후, 메틸아크릴릴-CoA가 에노일-CoA 히드라타제(hydratase) (III, 반응식 I) (예를 들어 보스 타우루스(Bos taurus)로부터의 ECHS1 또는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로부터의 ech)에 의해 3-히드록시 이소부티릴-CoA (반응식 I의 화학식 4)로 수화될 수 있다. 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제(hydrolase) (IV, 반응식 I) (예를 들어 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)로부터의 Hibch)에 의해 3-히드록시 이소부티릴-CoA가 3-히드록시 부티레이트로 전환된다.
[반응식 I]
Figure pct00002
반응식 I에서 수반되는 예시적인 효소:
I: 효소: 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제
종: 클로스트리디움 SB4
종: 푸소박테리움 누클레아툼 (엔트레즈 진(Entrez Gene) ID 993155, 991616, 또는 992527, 992528)
II: 효소: 2-메틸아실-CoA 데히드로게나제
유전자: acdH 접속 번호: G-9098 (MetaCyc) 종: 스트렙토마이세스 아베르미틸리스
유전자: Acadsb 접속 번호: G-9097 (MetaCyc) 종: 라투스 노르베기쿠스
III: 효소: 단쇄 에노일-CoA 히드라타제
유전자: ECHS1 접속 번호: G-9101 (MetaCyc) 종: 보스 타우루스
효소: 에노일-CoA 히드라타제
유전자: ech 접속 번호: G-9099 (MetaCyc) 종: 슈도모나스 플루오레센스
IV: 효소: 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제
유전자: Hibch 접속 번호: G-9102 (MetaCyc) 종: 라투스 노르베기쿠스
본원에 기술된 재조합 세포 또는 본원에 기술된 유전자 변형 세포를 (a) 이소부티레이트를 단독 탄소원으로서 사용할 수 있고 (b) 천연적으로든 또는 유전자 조작을 통해서든, 원하는 생성물을 생산하는 대사 능력을 보유하는 미생물과 함께 공동 배양함으로써 이소부티레이트로부터의 다른 화합물의 생합성을 달성할 수 있다.
예를 들어 조작된 이. 콜라이를 발효 동안 이소부티레이트 공급원으로서 사용할 수 있다. 예를 들어 (S)-3-히드록시이소부티레이트를 합성하기 위해, 조작된 이. 콜라이를 이소부티레이트로부터 48％ 수율로 3-히드록시산의 S 이성질체를 생산할 수 있는 슈도모나스 푸티다 (ATCC 21244) 균주와 함께 공동 배양할 수 있다. R 이성질체를 합성하기 위해, 조작된 이. 콜라이를 효모 균주 칸디다 루고사(Candida rugosa) (ATCC 10571)와 함께 공동-배양할 수 있다. 이러한 종은 이소부티레이트로부터 81.8％의 몰 전환 수율로 150 g/ℓ (R)-3-히드록시이소부티레이트를 생산할 수 있다.
별법적으로, 단일 생체촉매(biocatalyst)가 생체변환에 요구되도록 이소부티레이트-동화 능력을 미생물 내로 도입함으로써 본원에 기술된 재조합 세포 또는 본원에 기술된 유전자 변형 세포 (총괄적으로, "생체촉매")를 추가로 변형시키는 것에 의해 이소부티레이트로부터의 다른 화합물의 생합성을 달성할 수 있다. 예를 들어 이소부티레이트가 아실-CoA 신테타제(synthetase) (Acs)에 의해 이소부티릴-CoA로 전환될 수 있다. 그 후, 이소부티릴-CoA가 아실-CoA 데히드로게나제 (AcdH)에 의해 메틸아크릴릴-CoA로 변할 수 있다. 에노일-CoA 히드라타제 (Ech)에 의한 메틸아크릴릴-CoA의 수화로 3-히드록시-이소부티릴-CoA가 생성될 수 있고, 이는 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 (Hibch)에 의해 3-히드록시이소부티레이트로 가수분해될 수 있다. 3-히드록시이소부티레이트는 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나제 (MmsB)에 의해 메틸말로네이트-세미알데히드로 산화될 수 있다. 마지막으로, 알데히드가 메틸말로네이트-세미알데히드 데히드로게나제 (MmsA)에 의해 프로파노일-CoA로 전환될 수 있다. 프로파노일-CoA는 성장을 지지하는 생합성을 위한 중심 대사에 진입할 수 있다. Acs, AcdH, Hibch, MmsB, 및 MmsA가 다양한 생물로부터 이. 콜라이 내로 클로닝되었고, 이러한 새로운 숙주에서 적절한 발현 수준 및 효소 활성을 나타냈다. 이같은 단백질들을 코딩하는 유전자들을 클로닝할 수 있고, 이들을 최적의 발현을 위한 합성 오페론 내로 조직할 수 있다.
대조적으로, Ech는 이. 콜라이에서 클로닝 및 발현되지 않았다. 박테리아에서 이러한 대사 효소를 확인 및 특성화하는 연구가 수행되지 않았다. 슈도모나스 푸티다 KT2440에 대한 KEGG 경로 데이터베이스로부터, 10개의 효소 (PP_1412, PP_1845, PP_2136, PP_2217, PP_3283, PP_3284, PP_3358, PP_3491, PP_3726, PP_3732 및 PP_4030)가 Ech 후보인 것으로 주석이 달렸다. 이러한 단백질들을 다른 경로 효소를 보유하는 이. 콜라이 균주 내로 개별적으로 클로닝할 수 있고, 탄소원으로서 이소부티레이트가 있는 배지에서의 형질전환체의 성장을 테스트할 수 있다. 이. 콜라이에서의 개선된 효소 활성을 원하는 경우 경로 내의 임의의 효소를 발달시키는데 이러한 성장-기반 선별 전략을 또한 사용할 수 있다. Acs, AcdH, Ech, 및 Hibch를 이소부티레이트를 생산하는 이. 콜라이 균주 내로 클로닝할 수 있다. 생성된 신규 이. 콜라이 균주는 글루코스로부터 3-히드록시부티레이트를 생합성할 수 있을 것이다.
별개의 단계들을 포함하는 본원에 개시된 임의의 방법에 대해, 이러한 단계들은 임의의 실행가능한 순서로 수행될 수 있다. 그리고, 적합하다면, 2개 이상의 단계의 임의의 조합이 동시에 수행될 수 있다.
하기의 실시예에 의해 본 발명이 설명된다. 특정 예, 물질, 양 및 절차가 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 범주 및 취지에 따라 광범위하게 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1
1. 벡터 구축
모든 클로닝 절차를 이. 콜라이 균주 XL10-골드 (스트라타진(Stratagene), 애질런트 테크놀러지즈 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc.); 캘리포니아주 산타클라라)에서 수행하였다. 유로핀스 엠더블유지 오페론(Eurofins MWG Operon)에서 프라이머 (표 2)를 구입하였다. 퓨전 하이-피델리티(PHUSION High-Fidelity) DNA 중합효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.); 매사추세츠주 입스위치)로 제조사의 설명서에 따라 PCR 반응을 수행하였다. 모든 클로닝 단계로부터 생산된 플라스미드의 서열을 제한효소 지도작성 및 DNA 서열분석을 사용하여 확인하였다.
lac 리프레서 LacI를 코딩하는 유전자 단편을 플라스미드 pZE12 및 pZA22의 SacI 부위 내로 각각 삽입하여 (문헌 [Lutz and Bujard, 1997 Nucleic Acids Res. 25:1203-1210]), 플라스미드 pZElac 및 pZAlac를 산출하였다. 이. 콜라이 게놈 DNA를 ilvd_accfwd 및 ilvd_nherev 프라이머로 증폭시켰다. 수득된 ilvD 유전자 단편을 Acc65I 및 NheI로 소화시켰다. 바실루스(Bacillus) 아세토락테이트 신타제 유전자 alsS를 중첩 PCR을 사용하여 바실루스 서브틸리스의 게놈 DNA로부터 als_accremov/als_accremov_rev 프라이머 (alsS 내의 Acc65I 부위 제거용), 뿐만 아니라 플랭킹(flanking) 올리고인 als_nhefwd 및 als_blprev로 증폭시켰다. 그 후, alsS PCR 생성물을 NheI 및 BlpI로 소화시켰다. 그 후, 정제된 ilvD 및 alsS 유전자 단편을 pZAlac에 결찰시켜 플라스미드 pIBA1을 생성시켰다 (플라스미드 지도에 대해 도 4 참조).
2-케토산 데카르복실라제 유전자 kivd를 락토코쿠스 락티스 (ATCC)의 게놈 DNA로부터 kivd_accfwd 및 kivd_xbarev 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 Acc65I 및 XbaI로 소화시키고, pZElac 내로 결찰시켜, 플라스미드 pIBA2를 산출하였다. kivd를 또한 kivd_accfwd 및 kivd_sphrev로 증폭시키고, PCR 생성물을 Acc65I 및 SphI로 소화시켰다. ydcWv를 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 ydcw_sphfwd 및 ydcw_xbarev 프라이머로 증폭시킨 후, 이를 SphI 및 XbaI로 소화시켰다. 그 후, 정제된 kivd 및 ydcW 유전자 단편을 pZElac 내로 결찰시켜 플라스미드 pIBA3을 생성시켰다 (플라스미드 지도에 대해 도 5 참조). aldB를 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 aldB_sphfwd 및 aldB_xbarev 프라이머로 증폭시키고, SphI 및 XbaI로 소화시킨 후, pIBA3 내로 삽입하여, 플라스미드 pIBA4를 산출하였다. aldH를 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 aldH_sphfwd 및 aldH_sphremov 프라이머 (aldH 내의 SphI 부위 제거용)로 증폭시켰다. 그리고, PCR 생성물을 aldH_sphfwd 및 aldB_xbarev 프라이머로 다시 증폭시키고, SphI 및 XbaI로 소화시킨 후, pIBA3 내로 삽입하여 플라스미드 pIBA5를 산출하였다. 유사하게, 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 gabD를 gabD_sphfwd 및 gabD_xbarev 프라이머로 증폭시키고, padA를 padA_sphfwd 및 padA_xbarev 프라이머로 증폭시켰다. 이들을 pIBA3 내로 클로닝하여 플라스미드 pIBA6 및 pIBA7을 산출하였다. 한편, kdhba를 부르크홀데리아 암비파리아 (ATCC BAA-244)로부터 kdhba_sphfwd 및 kdhba_xbarev 프라이머로 증폭시키고, 소화시키고, pIBA3 내로 결찰시켜 플라스미드 pIBA8을 산출하였다. 그리고, kdhpp를 슈도모나스 푸티다 KT2440 (ATCC 47054D-5)으로부터 kdhpp_sphfwd 및 kdhpp_xbarev 프라이머로 증폭시키고, 소화시키고, pIBA3 내로 결찰시켜 플라스미드 pIBA9를 산출하였다.
padA_bamfwd 및 padA_bamrev 프라이머를 사용하여 padA 유전자 단편을 증폭시켰다. BamHI으로의 소화 후, 유전자 단편을 발현 플라스미드 pQE9 (퀴아젠 인코포레이티드(Qiagen, Inc.), 캘리포니아주 발렌시아) 내로 삽입하여 pIBA10을 산출하였다.
Figure pct00003
2. 발효 절차 및 생성물 분석
숙주 균주
야생형 이. 콜라이 K-12 균주 BW25113 (rrnB T14 ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBAD AH33 ΔrhaBAD LD78)을 pIBA1, 및 이소부티레이트 생산을 위한 pIBA2 내지 pIBA9로부터의 임의의 플라스미드로 형질전환시켰다.
yqhD 유전자 결실 균주는 케이오(Keio) 선집 (문헌 [Baba et al., 2006 Mol. Syst. Biol. 2:10.1038])으로부터의 것이었다. 이를 플라스미드 pCP20으로 형질전환시켜 카나마이신 저항성 마커를 제거하였다. 이러한 ΔyqhD 균주를 이소부티레이트 생산을 위한 pIBA1 및 pIBA7로 형질전환시켰다.
발효 공정
LB 배지에서 인큐베이션된 철야 배양물을 125 ㎖ 원뿔 플라스크 내의 0.5％ 효모 추출물 및 4％ 글루코스가 보충된 5 ㎖ M9 배지 내로 25배 희석하였다. 항생제를 적합하게 첨가하였다 (앰피실린 100 mg/ℓ 및 카나마이신 25 mg/ℓ). 0.1 mM 이소프로필-b-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 0.5 g CaCO3를 첨가하여 배양 배지를 완충하였다. 배양물을 30℃ 진탕기 (250 rpm)에 놓고, 48시간 동안 인큐베이션하였다.
애질런트(Agilent) 1100 모세관 HPLC를 사용하여 굴절률 검출로 HPLC 분석에 의해 발효 생성물을 정량하였다.
3. 효소 검정법
단백질 과발현 및 정제
pIBA10을 pREP4 플라스미드 (퀴아젠(Qiagen); 캘리포니아주 발렌시아)를 보유하는 BL-21 이. 콜라이 숙주 내로 형질전환시켰다. 철야 예비배양물을 50 mg/ℓ 앰피실린, 25 mg/ℓ 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 함유하는 2× YT 강화 배지 300 ㎖에서 100배 희석하였다. 재조합 단백질을 30℃에서 철야로 발현시켰다.
세포 펠릿을 30 ㎖ 용해 완충제 (250 mM NaCl, 2 mM DTT, 5 mM 이미다졸 및 50 mM 트리스 pH 8.0)에서 초음파처리하였다. 15,000 RPM에서 20분 동안 원심분리하여 세포 잔해물을 제거하였다. 상청액을 Ni-NTA 칼럼에 통과시켰다. 그 후, 칼럼을 10 ㎖ 세정 완충제 (250 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 및 50 mM 트리스 pH 8.0)로 4회 세정하였다. 마지막으로, 표적 단백질을 10 ㎖ 용출 완충제 (250 mM NaCl, 250 mM 이미다졸 및 50 mM 트리스 pH 8.0)로 용출시켰다. 용출액의 완충제를 아미콘 울트라(AMICON ULTRA) 원심분리 필터 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.); 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하여 보관 완충제 (100 μM 트리스 완충제, pH 8.0, 및 20％ 글리세롤)로 교환하고 농축하였다. 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 결정하였다 (흡광 계수, 75070 cm-1 M-1). 농축된 단백질 용액을 PCR 튜브 내로 분취하고 (100 ㎕), 장기 보관을 위해 -80℃에서 급속 냉동시켰다.
PadA 활성 측정
이소부티르알데히드 기질을 피셔 사이언티픽 인터내셔널 인코포레이티드(Fisher Scientific International, Inc.) (뉴햄프셔주 햄프턴)에서 구입하였고, NAD+를 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드 (매사츄세츠주 입스위치)에서 구입하였다. 반응 혼합물은 총 부피 80 ㎕의 검정 완충제 (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 1 mM DTT) 내에 0.5 mM NAD+ 및 0.2-4 mM 이소부티르알데히드를 함유하였다. 2 ㎕의 KIVD (최종 효소 농도 25 nM)를 첨가함으로써 반응이 시작되었고, NADH 생성을 340 nm에서 모니터링하였다 (흡광 계수, 6.22 mM-1cm-1). 오리진(Origin) 소프트웨어를 사용하여 초기 속도 데이터를 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식에 피팅(fitting)함으로써 동역학 파라미터 (k cat 및 K m)을 결정하였다.
실시예 2
박테리아 균주 및 플라스미드
모든 프라이머는 유로핀스 엠더블유지 오페론 (알라바마주 헌츠빌)으로부터의 것이었고, 표 3에서 열거된다. 이러한 연구에서 사용된 이. 콜라이 균주가 표 3에서 열거되고, 이들은 모두 yqhD 결실이 있는 야생형 이. 콜라이 K-12 균주 BW25113으로부터 유래되었다. 모든 클로닝 절차를 이. 콜라이 균주 XL10-골드 (스트라타진; 캘리포니아주 산타클라라)에서 수행하였다. 이소부티레이트를 생산하는데 사용된 플라스미드 pIBA1 및 pIBA7은 기존의 연구로부터의 것이었다 (문헌 [Zhang et al., 2011 ChemSusChem 4:1068-1070]). 2개의 padA 카피를 보유하는 pIBA1 플라스미드 1을 만들기 위해, padA 유전자를 padA_SacIfwd 및 padA_SacIrev 올리고로 PCR에 의해 증폭시키고, SacI로 소화시킨 후, pIBA7 내로 결찰시켜 pIBA11을 생성시켰다. pIBA11에서, 추가적인 padA 카피는 구성적 프로모터의 조절 하에 앰피실린 저항성 유전자 bla와 동일한 오페론 내에 있다. adhE, adhP, eutG, yiaY 및 yjgB의 P1 파지를 케이오 선집 (문헌 [Baba et al., 2006 Mol. Syst. Biol. 2:10.1038])으로부터 수득하였다. 이러한 파지들을 IBA1 균주를 형질감염시키는데 사용하여, 이중 녹아웃 균주를 구축하였다. 그 후, 모든 녹아웃 균주를 pCP20 플라스미드로 형질전환시켜 카나마이신 마커를 제거하였다. PCR에 의해 정확한 녹아웃을 확증하였다. 이소부티레이트를 생산하기 위해, 각각의 균주를 플라스미드 pIBA1 + pIBA7, 또는 pIBA1 + pIBA11로 형질전환시켰다.
Figure pct00004
세포 배양 및 진탕 플라스크 발효
달리 언급되지 않는 한, 세포를 100 mg/ℓ 앰피실린 및 50 mg/ℓ 카나마이신이 보충된 2×YT 강화 배지 (16 g/ℓ 박토-트립톤, 10 g/ℓ 효모 추출물 및 5 g/ℓ NaCl)에서 37℃에서 시험관에서 성장시켰다. 2×YT 배지에서 인큐베이션된 200 ㎕의 철야 배양물을 125 ㎖ 원뿔 플라스크 내의 5 g/ℓ 효모 추출물, 40 g/ℓ 글루코스, 100 mg/ℓ 앰피실린 및 50 mg/ℓ 카나마이신이 보충된 M9 최소 배지 5 ㎖로 옮겼다. 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 0.1 mM 농도로 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 0.5 g CaCO3의 존재에 의해 발효 브로스(broth)가 완충되었다. 발효 배양물을 30℃에서 250 rpm 속도의 진탕기 내에 놓았다.
발효기용 배양 배지
g/ℓ 단위의 하기의 조성물이 이. 콜라이 배양용 시딩(seeding) 배지이다: 글루코스, 10; (NH4)2SO4, 1.8; K2HPO4, 8.76; KH2PO4, 2.4; 시트르산나트륨, 1.32; 효모 추출물, 15; 앰피실린, 0.1; 카나마이신, 0.05. 생물반응기 배양용 발효 배지는 g/ℓ 단위의 하기의 조성물을 함유하였다: 글루코스, 30; (NH4)2SO4, 3; K2HPO4, 14.6; KH2PO4, 4; 시트르산나트륨, 2.2; 효모 추출물, 25; MgSO4.7H2O, 1.25; CaCl2.2H2O, 0.015, 칼슘 판토테네이트, 0.001; 티아민, 0.01; 앰피실린, 0.1; 카나마이신, 0.05; 및 1 ㎖/ℓ의 미량 금속 용액. 미량 금속 용액은 g/ℓ 단위로 하기를 함유하였다: NaCl, 5; ZnSO4.7H2O, 1; MnCl2.4H2O, 4; CuSO4.5H2O, 0.4; H3BO3, 0.575; Na2MoO4.2H2O, 0.5; FeCl3.6H2O, 4.75; 6N H2SO4, 12.5 ㎖. 공급 용액은 g/ℓ 단위로 하기를 함유하였다: 글루코스, 600; (NH4)2SO4, 5; MgSO4.7H2O, 1.25; 효모 추출물, 5; CaCl2.2H2O, 0.015; 칼슘 판토테네이트, 0.001; 티아민, 0.01; 앰피실린, 0.1; 카나마이신, 0.05, 0.2 mM의 IPTG; 및 1 ㎖/ℓ의 미량 원소.
발효 배양 조건
이. 콜라이 배양을 1.3 ℓ 바이오플로(Bioflo) 115 발효기 (NBS; 뉴저지주 에디슨)에서 0.6 ℓ의 작업 부피를 사용하여 수행하였다. 발효기에 10％의 철야 예비배양물 + 시딩 배지를 접종한 후, 세포를 37℃, 30％ 용존 산소 (DO) 수준, 및 pH 7.0에서 성장시켰다. OD600이 8.0에 도달한 후, 0.2 mM IPTG를 첨가하고, 온도를 30℃로 이동시켜, 이소부티레이트 생산을 시작시켰다. 10 M 수산화나트륨 용액, 50％ 수산화암모니아, 또는 200 g/ℓ 수산화칼슘 현탁액 각각의 자동 첨가에 의해 pH가 7.0에서 제어되었다. 전체 공정에서 공기 유속을 1 wm에서 유지시켰다. 교반 속도 (300 내지 800 rpm)를 조정함으로써 공기 포화에 관하여 DO를 약 10％에서 유지시켰다. 공급 배지를 자동으로 첨가하는 것에 의해 발효기 내의 글루코스 수준은 계속 약 10 g/ℓ였다. DO가 40％를 초과하고 이소부티레이트 수준이 증가하지 않았을 때, 발효 공정이 정지되었다. 상이한 시점들에서의 발효 샘플을 수집하여, 광학 밀도 및 대사산물 농도를 결정하였다.
대사산물 분석 및 건조 세포 중량 결정
아미넥스(Aminex) HPX 87H 칼럼 (바이오-래드(Bio-Rad); 캘리포니아주 에르큘레스) 및 굴절률 검출기가 장착된 애질런트 1260 인피니티(Infinity) HPLC를 사용하여 발효 생성물을 분석하였다. 이동상은 유속 0.6 ㎖/분의 5 mM H2SO4였다. 칼럼 온도 및 검출 온도는 각각 35℃ 및 50℃였다. 5 ㎖ 배양물을 0.45 ㎛ 유리 섬유 필터 (미시건 파이버글래스 세일즈(Michigan Fiberglass Sales); 미시건주 세인트 클레어 쇼어스)에 여과함으로써 세포 건조 중량을 결정하였다. 배지 제거 후, 필터를 15 ㎖의 밀리큐(MilliQ) 물로 세정하고, 오븐에서 건조시킨 후 칭량하였다. 세포 건조 중량을 삼중으로 결정하였다.
실시예 3
클로닝 절차
BKDH 효소 복합체 유전자들을 슈도모나스 푸티다 KT2440 게놈 DNA로부터 bkdh_ecofwd (TGCATCGAATTCAGGAGAAATTAACTATGAACGAGTACGCCCCCCTGCGTTTGC (서열 145)) 및 bkdh_hindrev (TGCATCAAGCTTTCAGATATGCAAGGCGTGGCCCAG (서열 146)) 프라이머로 증폭시켰다. 그 후, PCR 생성물을 EcoRI 및 HindIII로 소화시키고, pZE12 내로 삽입하여 pIBA16을 만들었다.
tesA 유전자를 이. 콜라이 균주 K12 게놈 DNA로부터 프라이머 쌍 TesA_HindIII_F (GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGATGAACTTCAACAATGTTTTCCG (서열 147)) 및 TesA_Xba1_R (GGGCCCTCTAGATTATGAGTCATGATTTACTAAAGGCT (서열 148))을 사용하여 증폭시켰다; tesB를 프라이머 쌍 TesB_HindIII_F (GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGATGAGTCAGGCGCTAAAAAATTTACT (서열 149)) 및 TesB_Xba1_R (GGGCCCTCTAGATTAATTGTGATTACGCATCACCCCTT (서열 150))로 증폭시켰다. PCR 후, DNA 단편을 정제하고, 제한 효소 HindIII 및 Xba1을 사용하여 소화시켰다. tesA를 함유하는 소화된 단편을 pIBA16 내로 삽입하여 pIBA17을 만들었다; tesB를 함유하는 소화된 단편을 pIBA16 내로 삽입하여 pIBA18을 만들었다.
발효 공정
LB 배지에서 인큐베이션된 철야 배양물을 125 ㎖ 원뿔 플라스크 내의 0.5％ 효모 추출물 및 4％ 글루코스가 보충된 5 ㎖ M9 배지 내로 25배 희석하였다. 항생제를 적합하게 첨가하였다 (앰피실린 100 mg/ℓ 및 카나마이신 25 mg/ℓ). 0.1 mM 이소프로필-b-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 0.5 g CaCO3를 첨가하여 배양 배지를 완충하였다. 배양물을 30℃ 진탕기 (250 rpm)에 놓고, 48시간 동안 인큐베이션하였다.
애질런트 1100 모세관 HPLC를 사용하여 굴절률 검출로 HPLC 분석에 의해 발효 생성물을 정량하였다. 결과가 표 4에 제시된다.
Figure pct00005
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 전체 개시내용, 및 전자적으로 입수가능한 물질 (뉴클레오티드 서열 제출물, 예를 들어 진뱅크(GenBank) 및 RefSeq의 제출물, 및 아미노산 서열 제출물, 예를 들어 SwissProt, PIR, PRF, PDB의 제출물, 및 진뱅크 및 및 RefSeq의 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역물이 예를 들어 포함됨)은 이의 전문이 참고로 포함된다. 본 출원의 개시내용과 본원에 참고로 포함되는 임의의 문서의 개시내용(들) 간에 임의의 불일치가 존재하는 경우, 본 출원의 개시내용이 지배할 것이다. 상기의 상세한 설명 및 실시예는 오직 명확한 이해를 위해서 제공되었다. 이로부터 불필요한 제한이 해석되지 않아야 한다. 본 발명은 제시되고 설명된 엄밀한 상세사항에 제한되지 않는데, 당업자에게 자명한 변형이 청구항에 의해 규정되는 본 발명 내에 포함될 것이기 때문이다.
달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 사용된 성분, 분자량 등의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에 기재된 숫자 파라미터는 본 발명에 의해 수득되도록 추구되는 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사값이다. 최소한, 그리고 균등론을 청구항의 범주로 제한하려 하지 않으면서, 적어도 각각의 숫자 파라미터는 보고된 유효 숫자의 수의 견지에서, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 발명의 광범위한 범주를 기재하는 숫자 범위 및 파라미터가 근사값임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치는 이들 각각의 테스트 측정치에서 발견되는 표준 편차로부터 필수적으로 초래되는 범위를 본질적으로 함유한다.
모든 제목은 독자의 편의를 위한 것이고, 달리 특정되지 않는 한, 제목에 이어지는 내용의 의미를 제한하도록 사용되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA ZHANG, Kechun <120> CELLS AND METHODS FOR PRODUCING ISOBUTYRIC ACID <130> 110.03410201 <150> US 61/441,939 <151> 2011-02-11 <160> 150 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 499 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Thr Glu Pro His Val Ala Val Leu Ser Gln Val Gln Gln Phe Leu 1 5 10 15 Asp Arg Gln His Gly Leu Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gln 20 25 30 Ser Glu Lys Arg Leu Ala Ile Phe Asp Pro Ala Thr Gly Gln Glu Ile 35 40 45 Ala Ser Thr Ala Asp Ala Asn Glu Ala Asp Val Asp Asn Ala Val Met 50 55 60 Ser Ala Trp Arg Ala Phe Val Ser Arg Arg Trp Ala Gly Arg Leu Pro 65 70 75 80 Ala Glu Arg Glu Arg Ile Leu Leu Arg Phe Ala Asp Leu Val Glu Gln 85 90 95 His Ser Glu Glu Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Glu Gln Gly Lys Ser 100 105 110 Ile Ala Ile Ser Arg Ala Phe Glu Val Gly Cys Thr Leu Asn Trp Met 115 120 125 Arg Tyr Thr Ala Gly Leu Thr Thr Lys Ile Ala Gly Lys Thr Leu Asp 130 135 140 Leu Ser Ile Pro Leu Pro Gln Gly Ala Arg Tyr Gln Ala Trp Thr Arg 145 150 155 160 Lys Glu Pro Val Gly Val Val Ala Gly Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro 165 170 175 Leu Met Ile Gly Met Trp Lys Val Met Pro Ala Leu Ala Ala Gly Cys 180 185 190 Ser Ile Val Ile Lys Pro Ser Glu Thr Thr Pro Leu Thr Met Leu Arg 195 200 205 Val Ala Glu Leu Ala Ser Glu Ala Gly Ile Pro Asp Gly Val Phe Asn 210 215 220 Val Val Thr Gly Ser Gly Ala Val Cys Gly Ala Ala Leu Thr Ser His 225 230 235 240 Pro His Val Ala Lys Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr Gly Lys 245 250 255 Gly Ile Ala Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Thr Arg Val Thr Leu Glu 260 265 270 Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ala Ile Val Leu Lys Asp Ala Asp Pro Gln 275 280 285 Trp Val Ile Glu Gly Leu Met Thr Gly Ser Phe Leu Asn Gln Gly Gln 290 295 300 Val Cys Ala Ala Ser Ser Arg Ile Tyr Ile Glu Ala Pro Leu Phe Asp 305 310 315 320 Thr Leu Val Ser Gly Phe Glu Gln Ala Val Lys Ser Leu Gln Val Gly 325 330 335 Pro Gly Met Ser Pro Val Ala Gln Ile Asn Pro Leu Val Ser Arg Ala 340 345 350 His Cys Asp Lys Val Cys Ser Phe Leu Asp Asp Ala Gln Ala Gln Gln 355 360 365 Ala Glu Leu Ile Arg Gly Ser Asn Gly Pro Ala Gly Glu Gly Tyr Tyr 370 375 380 Val Ala Pro Thr Leu Val Val Asn Pro Asp Ala Lys Leu Arg Leu Thr 385 390 395 400 Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Val Asn Leu Val Arg Val Ala Asp 405 410 415 Gly Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Asn Asp Thr Glu Tyr Gly Leu Thr 420 425 430 Ala Ser Val Trp Thr Gln Asn Leu Ser Gln Ala Leu Glu Tyr Ser Asp 435 440 445 Arg Leu Gln Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Ser His Thr Leu Ile Asp 450 455 460 Ala Asn Leu Pro Phe Gly Gly Met Lys Gln Ser Gly Thr Gly Arg Asp 465 470 475 480 Phe Gly Pro Asp Trp Leu Asp Gly Trp Cys Glu Thr Lys Ser Val Cys 485 490 495 Val Arg Tyr <210> 2 <211> 512 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Thr Asn Asn Pro Pro Ser Ala Gln Ile Lys Pro Gly Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Phe Pro Leu Lys Leu Lys Ala Arg Tyr Asp Asn Phe Ile Gly Gly Glu 20 25 30 Trp Val Ala Pro Ala Asp Gly Glu Tyr Tyr Gln Asn Leu Thr Pro Val 35 40 45 Thr Gly Gln Leu Leu Cys Glu Val Ala Ser Ser Gly Lys Arg Asp Ile 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Escherichia fergusonii <400> 19 Met Thr Glu Pro His Val Ala Val Leu Ser Gln Val Gln Gln Phe Leu 1 5 10 15 Asp Arg Gln His Gly Leu Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gln 20 25 30 Ser Glu Lys Arg Leu Pro Ile Phe Asn Pro Ala Thr Gly Gln Glu Ile 35 40 45 Ala Ser Thr Ala Asp Ala Asn Glu Ala Asp Val Asp Asn Ala Val Met 50 55 60 Ser Ala Trp Arg Ala Phe Val Ser Arg Arg Trp Ala Gly Arg Leu Pro 65 70 75 80 Ala Glu Arg Glu Arg Ile Leu Leu Arg Phe Ala Asp Leu Val Glu Gln 85 90 95 His Ser Glu Glu Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Glu Gln Gly Lys Ser 100 105 110 Ile Ala Ile Ser Arg Ala Phe Glu Val Gly Cys Thr Leu Asn Trp Met 115 120 125 Arg Tyr Thr Ala Gly Leu Thr Thr Lys Ile Ala Gly Lys Thr Leu Asp 130 135 140 Leu Ser Ile Pro Leu Pro Gln Gly Ala Arg Tyr Gln Val Trp Thr Arg 145 150 155 160 Lys Glu Pro Val Gly Val Val Ala Gly Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro 165 170 175 Leu Met Ile Gly Met Trp Lys Val Met Pro Ala Leu Ala Ala Gly Cys 180 185 190 Ser Ile Val Ile Lys Pro Ser Glu Thr Thr Pro Leu Thr Met Leu Arg 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<213> Photorhabdus asymbiotica <400> 73 Met Ser Asp Ile Thr Leu Leu Gln Gln Val Thr Ala Phe Leu Gln Arg 1 5 10 15 Asn His Gly His Tyr Ile Asn Gly Gln Ser Val His Gly Gln Glu Asn 20 25 30 Gln Thr Phe Ser Val Val Asn Pro Ala Val Asp Glu Val Ile Ala Thr 35 40 45 Val Asn Gln Gly Gly Glu Thr Glu Val Asn Ala Ala Met Gln Ala Ala 50 55 60 His Thr Ala Phe His Gly Val Trp Ala Gln Thr Ser Pro Met Glu Arg 65 70 75 80 Gly His Cys Leu Asn Arg Leu Ala Asp Leu Leu Leu Ala His Arg Glu 85 90 95 Glu Leu Ala Gln Leu Glu Ser Leu Cys Ser Gly Lys Thr Ile Gln Leu 100 105 110 Ser Arg Met Leu Glu Ile Asp Ser Ser Ala Gln Phe Leu Arg Tyr Phe 115 120 125 Ala Gly Trp Ser Ser Lys Ile Ser Gly Glu Thr Leu Asn Val Ser Leu 130 135 140 Pro Ser Phe Lys Gly Glu Gln Tyr Thr Ala Phe Thr Arg Arg Glu Pro 145 150 155 160 Ile Gly Val Val Val Gly Ile Ile Pro Trp Asn Phe Ser Ile Met Val 165 170 175 Ala Ile Trp Lys Met Ala Ala Ala Leu Thr Cys Gly Cys Thr Ile Val 180 185 190 Leu Lys Pro Ser Glu Tyr Thr Pro Leu Thr Met Leu Arg Val 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<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 80 Met Ser Ile Ala Ile Asp Pro Ser Val Ser Ala Phe Leu Arg Ser Pro 1 5 10 15 His Gly Leu Leu Ile Glu Gly Glu Ser Gly Pro Ala Arg Ser Gly Ala 20 25 30 Asp Met Pro Leu Tyr Asp Pro Ala Thr Gly Ala Glu Leu Ala Arg Val 35 40 45 Ala Arg Ala Gly Ala Glu Asp Val Asp Arg Ala Val Ala Ala Ala Arg 50 55 60 Arg Ala Phe Glu Gly Asn Trp Ala Gly Gln Arg Pro Ala Asp Arg Glu 65 70 75 80 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Ala Glu Arg Ile Glu Ala His Gly Glu Gln 85 90 95 Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Asn Asn Gly Lys Ser Ile Asn Leu Ser 100 105 110 Arg Ala Leu Glu Val Gly Ala Ser Val Glu Phe Ile Arg Tyr Met Ala 115 120 125 Gly Trp Ala Thr Lys Ile Glu Gly Arg Ser Leu Asp Leu Ser Ile Ala 130 135 140 Ala Val Pro Gly Ala Arg Tyr Arg Ala Tyr Thr Val Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Gly Val Val Gly Ala Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Ala 165 170 175 Ile Trp Lys Ile Val Pro Ala Leu Ala Cys Gly Cys Thr Val Val Leu 180 185 190 Lys Pro Ala Asp Glu Thr Pro Leu Thr Ala Leu Arg Leu Gly Gln 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Arg Tyr 485 490 495 <210> 91 <211> 501 <212> PRT <213> Burkholderi pseudomallei <400> 91 Met Asn Leu Ala Ala Leu Ser Thr Gln His Gln Arg Gln Ser Gly Phe 1 5 10 15 Leu Ala Arg Arg Gln Phe Gly Asn Trp Ile Asp Gly Arg Ala Ala Glu 20 25 30 Pro Arg Ser Gly Cys Tyr Leu Pro Val Val Asp Pro Ala Thr Glu Met 35 40 45 Thr Ile Ala Glu Val Ala Ala Ser Asp Ala Arg Asp Val Asp Ala Ala 50 55 60 Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala Phe Asp Ser Gly Asp Trp Pro Arg Met 65 70 75 80 Arg Pro Ala Ser Arg Glu Lys Leu Leu His Gln Leu Ala Glu Arg Leu 85 90 95 Glu Arg Tyr Ala Asp Glu Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Glu Thr Gly 100 105 110 Lys Leu Ile Gly Val Ala Arg Ala Ile Asp Val Leu Gly Gly Ala Glu 115 120 125 Tyr Val Arg Tyr Met Ala Gly Trp Ala Thr Lys Leu Glu Gly Ser Thr 130 135 140 Leu Asp Thr Ser Ile Ala Ala Pro Ala Gly Ala Glu Tyr Phe Ala Tyr 145 150 155 160 Thr Arg Arg Glu Ala Val Gly Val Val Gly Ala Ile Val Pro Trp Asn 165 170 175 Phe Pro Leu Ala Ile Ala Leu Trp Lys Val Ala Thr Ala Leu Ala Cys 180 185 190 Gly Cys 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Ala Glu Val Ala Ala Ser Asp Ala Arg Asp Val Asp Ala Ala 50 55 60 Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala Phe Asp Ser Gly Asp Trp Pro Arg Met 65 70 75 80 Arg Pro Ala Ser Arg Glu Lys Leu Leu His Gln Leu Ala Glu Arg Leu 85 90 95 Glu Arg Tyr Ala Asp Glu Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Glu Thr Gly 100 105 110 Lys Leu Ile Gly Val Ala Arg Ala Ile Asp Val Leu Gly Gly Ala Glu 115 120 125 Tyr Val Arg Tyr Met Ala Gly Trp Ala Thr Lys Leu Glu Gly Ser Thr 130 135 140 Leu Asp Thr Ser Ile Ala Ala Pro Ala Gly Ala Glu Tyr Phe Ala Tyr 145 150 155 160 Thr Arg Arg Glu Ala Val Gly Val Val Gly Ala Ile Val Pro Trp Asn 165 170 175 Phe Pro Leu Ala Ile Ala Leu Trp Lys Val Ala Thr Ala Leu Ala Cys 180 185 190 Gly Cys Thr Val Val Leu Lys Pro Ser Glu Glu Thr Pro Leu Thr Ala 195 200 205 Leu Arg Leu Gly Glu Leu Ala Gln Glu Ala Gly Leu Pro Asp Gly Val 210 215 220 Leu Asn Ile Val Thr Gly Ala Gly Ala Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ala 225 230 235 240 Ala His Pro Gly Ile Asp Lys Ile Thr Phe Thr Gly Ser Val Gly Val 245 250 255 Gly Arg Ala Ile 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MWYL1 <400> 99 Met Ser Asp Ile Pro Leu Leu Asp Ser Thr Gln Arg Phe Leu Gln Gln 1 5 10 15 Asp His Gly Gln Phe Ile Asn Gly Gln Thr Lys Ala Ser Gly Asp Asn 20 25 30 Thr Phe Asp Ile Ile Asn Pro Ser Thr Glu Ala Val Ile Ala Lys Ile 35 40 45 His Ser Ala Thr Thr Gln Glu Val Asp Ala Ala Ile Glu Ser Ser Tyr 50 55 60 Gln Val Phe Lys Gly Ala Trp Gly Lys Thr Ser Pro Tyr Ile Arg Gly 65 70 75 80 Val Val Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Ile Glu Gln Asn Gly Glu Glu 85 90 95 Ile Ala Gln Leu Glu Thr Leu Cys Ser Gly Lys Ser Ile His Leu Ser 100 105 110 Arg Met Phe Glu Val Gln Gln Ser Ala Met Phe Leu Arg Tyr Phe Ala 115 120 125 Gly Trp Ser Thr Lys Ile Asn Gly Glu Thr Met Thr Pro Ser Phe Pro 130 135 140 Ser Met Gln Gly Glu Glu Tyr Ser Ala Phe Thr Arg Arg Glu Ala Ile 145 150 155 160 Gly Val Val Ala Gly Ile Leu Pro Trp Asn Phe Ser Val Met Ile Ala 165 170 175 Cys Trp Lys Ile Gly Ala Ala Leu Cys Thr Gly Cys Thr Ile Val Leu 180 185 190 Lys Pro Ser Glu Phe Thr Pro Leu Thr Ile Leu Arg Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Ala Lys 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CCGE1003 <400> 103 Met Asn Asp Asn Ser Arg Pro Leu Asp Met Leu Asp Ser Thr Arg Thr 1 5 10 15 Phe Leu Ala Ala Pro Lys Arg Met Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala 20 25 30 Ser Ala Ser Gly Ala Thr Leu Asp Val Leu Asn Pro Ala Asp Gly Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Gln Val Pro Ser Ala Asp Glu Ala Asp Val Asp Leu Ala 50 55 60 Val Gln Ala Ala Arg Arg Ala Phe Asp Asp Ser Ala Trp Ser Arg Met 65 70 75 80 Lys Pro Thr Asp Arg Glu Arg Ile Leu Leu Arg Val Ala Glu Leu Ile 85 90 95 Glu Ala Asn Ala Arg Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ser Leu Asp Asn Gly 100 105 110 Lys Pro Val Ala Val Ala Gln Gly Leu Asp Val Ser Met Ala Ala Gln 115 120 125 Cys Phe Arg Tyr Met Ala Gly Trp Ala Thr Lys Ile Glu Gly Ser Thr 130 135 140 Leu Asp Ala Ala Leu Pro Tyr Ser Pro Ser Asn Ala Phe Phe Ala Tyr 145 150 155 160 Thr Arg Lys Glu Ala Val Gly Val Val Gly Ala Ile Ile Pro Trp Asn 165 170 175 Phe Pro Leu Leu Met Ala Ser Trp Lys Leu Ala Pro Ala Leu Ala Thr 180 185 190 Gly Cys Thr Val Val Leu Lys Pro Ala Glu Asp Thr Pro Leu Ser Ala 195 200 205 Leu Arg Leu Ala Thr Leu Leu Ser Glu Ala Gly Leu Pro Lys Gly Val 210 215 220 Val Asn Ile Val Thr Gly Tyr Gly Arg Ser Ala Gly Ala Ala Leu Ala 225 230 235 240 Arg His Pro Gly Ile Asp Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Thr Gln Thr 245 250 255 Gly Lys Ala Ile Gly His Ala Ala Leu Asp Asn Met Thr Arg Met Ser 260 265 270 Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Val Ile Val Leu Pro Asp Val Asp 275 280 285 Ile Glu Arg Ala Ala Glu Gly Val Ala Asn Ala Ile Phe Phe Asn Ser 290 295 300 Gly Gln Val Cys Thr Ala Gly Ser Arg Val Tyr Val His Glu Thr Val 305 310 315 320 Phe Asp Arg Val Met Glu Arg Val Ala Ala Ile Ala Glu Ala Leu Pro 325 330 335 Val Gly Pro Gly Leu Asp Ala Asn Thr Gln Ile Gly Pro Leu Val Ser 340 345 350 Ala Arg Gln Met Asp Arg Val Leu Gly Tyr Ile Glu Ala Gly Arg Asp 355 360 365 Glu Gly Ala Arg Ala Ile Ala Gly Gly Ala Arg Glu Gly Gly Ala Gly 370 375 380 Phe Phe Val Lys Pro Thr Val Leu Val Asp Thr Asp His Ser Met Arg 385 390 395 400 Val Val Arg Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu Val Ala Met Pro Phe 405 410 415 Lys Asp Ile Asp Ser Ala Val Ala Gln Ala Asn Asp Thr Pro Tyr Gly 420 425 430 Leu Gly Ala Ser Ile Trp Ser Asn Asn Leu Ser Ala Ile His Asn Leu 435 440 445 Ile Pro Arg Ile Lys Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys His Ser Leu 450 455 460 Leu Asp Asn Ala Met Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Phe Gly 465 470 475 480 Arg Glu Leu Gly Arg Ala Val Ile Asp Met Tyr Thr Glu Met Lys Ser 485 490 495 Val Leu Ile Asn His Ala 500 <210> 104 <211> 495 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. SH024 <400> 104 Met Ser Glu Val Gln Ile Leu Glu Ser Val Gln Gln Phe Met Ala Arg 1 5 10 15 Gln His Gly His Phe Ile Asp Gly Lys Leu Val Ala Ala Glu Leu Leu 20 25 30 Asp Lys Val Asp Ile Val Asn Pro Ser Thr Glu Glu Val Val Ala Gln 35 40 45 Ile Ser Ile Gly Ser Gln Gln Asp Val Asp Ser Ala Val Lys Ser Ala 50 55 60 Glu His Ala Phe Gln Asn Ala Trp Ala Glu Thr Thr Pro Tyr Glu Arg 65 70 75 80 Gly Val Lys Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Ile Glu Gln Tyr Gly Glu 85 90 95 Glu Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Ser Thr Gly Lys Leu Ile Asn Ile 100 105 110 Ser Arg His Leu Glu Val Ala Gln Ser Val Ile Phe Leu Arg Tyr Phe 115 120 125 Ala Gly Trp Ala Thr Lys Ile Asn Gly Gln Thr Met Gln Pro Ser Ile 130 135 140 Pro Ser Met Gln Gly Glu Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Leu Arg Gln Pro 145 150 155 160 Ile Gly Val Val Ala Gly Ile Val Pro Trp Asn Phe Ser Leu Met Ile 165 170 175 Gly Val Trp Lys Ile Gly Ser Ala Leu Thr Thr Gly Cys Thr Ile Val 180 185 190 Leu Lys Pro Ser Glu Phe Ala Ser Leu Ser Leu Leu Arg Leu Ala Glu 195 200 205 Leu Ala Ile Glu Ala Gly Ile Pro Val Gly Val Ile Asn Val Val Thr 210 215 220 Gly Lys Gly Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ile Glu Ser Pro Leu Val Lys 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Thr Gly Ser Val Pro Thr Gly Ile Ala Ile Gly Lys 245 250 255 Leu Ala Met Ser Ser Asp Leu Thr Arg Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Ile Ala Val Leu Ala Asp Ala Asn Ile Asp Glu Ile Leu 275 280 285 Pro Thr Leu Leu Gln Ala Thr Phe Val His Gln Gly Gln Val Cys Ala 290 295 300 Ser Pro Glu Arg Phe Phe Val His Arg Ala Lys Tyr Asp Glu Leu Val 305 310 315 320 Glu Lys Leu Ser Lys Ala Leu Ser Ser Phe Lys Ile Gly Ser Ala Met 325 330 335 Asp Glu Gly Ser Met Phe Gly Pro Leu Ser Asn Gln Pro His Phe His 340 345 350 Lys Val Lys His Tyr Leu Asp Met Ala Lys Ala Lys Asn Gln Ile Ile 355 360 365 Ala Gly Gly Glu Thr Leu Asp Arg Ser Gly Tyr Phe Val Gln Pro Thr 370 375 380 Leu Ile Ser Phe Lys Asn Thr Asp Asp Pro Leu Phe Ser Glu Glu Thr 385 390 395 400 Phe Gly Pro Val Val Gly Ile Met Pro Phe Glu Thr Asp Glu Glu Leu 405 410 415 Val Gln Leu Met Asn Gln Ser Arg Phe Gly Leu Thr Ala Ser Ile Trp 420 425 430 Thr Asn Asp Leu Ser Lys Ala Leu Arg Leu Ile Pro Lys Ile Glu Ala 435 440 445 Gly Thr Leu Trp Val Asn Met His Thr Phe Leu Asp Pro Ser Val Pro 450 455 460 Phe Gly Gly Val Lys Ala Ser Gly Ile Gly Arg Glu Phe Ser Asp Ala 465 470 475 480 Phe Ile Glu Asp Tyr Thr Glu Leu Lys Ser Val Met Ile Arg Tyr 485 490 495 <210> 105 <211> 495 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. RUH2624 <400> 105 Met Ser Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Val Gln Gln Phe Met Ala Arg 1 5 10 15 Gln His Gly His Phe Ile Asp Gly Lys Leu Val Ala Ala Glu His Leu 20 25 30 Asp Lys Val Asp Ile Val Asn Pro Ser Thr Glu Gln Val Val Ala Gln 35 40 45 Ile Ser Ile Gly Ser Gln Gln Asp Val Ala Ser Ala Val Lys Ser Ala 50 55 60 Lys His Ala Phe Gln Asn Ala Trp Ala Glu Thr Thr Pro Tyr Glu Arg 65 70 75 80 Gly Val Lys Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Ile Glu Gln His Gly Glu 85 90 95 Glu Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Ser Thr Gly Lys Leu Ile Asn Ile 100 105 110 Ser Arg His Leu Glu Val Ala Gln Ser Val Ile Phe Leu Arg Tyr Phe 115 120 125 Ala Gly Trp Ala Thr Lys Ile Asn Gly Gln Thr Met Gln Pro Ser Ile 130 135 140 Pro Ser Met Gln Gly Glu Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Leu Arg Gln Pro 145 150 155 160 Val Gly Val Val Ala Gly Ile Val Pro Trp Asn Phe Ser Leu Met Ile 165 170 175 Gly Ile Trp Lys Ile Gly Ser Ala Leu Thr Thr Gly Cys Thr Ile Val 180 185 190 Leu Lys Pro Ser Glu Phe Ala Ser Leu Ser Leu Leu Arg Leu Ala Glu 195 200 205 Leu Ala Ile Glu Ala Gly Ile Pro Ala Gly Val Ile Asn Val Val Thr 210 215 220 Gly Lys Gly Asp Thr Gly Gln Tyr Leu Ile Glu Ser Pro Leu Val Lys 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Thr Gly Ser Val Pro Thr Gly Ile Ala Ile Gly Lys 245 250 255 Leu Ala Met Ser Ser Asp Leu Thr Arg Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Ile Ala Val Leu Ala Asp Ala Asn Ile Asp Glu Ile Leu 275 280 285 Pro Thr Leu Leu Gln Ala Thr Phe Val His Gln Gly Gln Val Cys Ala 290 295 300 Ser Pro Glu Arg Phe Phe Val His His Thr Lys His Asn Glu Leu Val 305 310 315 320 Glu Lys Leu Ser Lys Ala Leu Ser Ser Leu Lys Ile Gly Ser Ala Met 325 330 335 Asp Glu Gly Ser Met Phe Gly Pro Leu Ser Asn Gln Pro His Phe His 340 345 350 Lys Val Lys His Tyr Leu Asp Met Ala Lys Ala Asn Asn Gln Ile Ile 355 360 365 Ala Gly Gly Glu Ala Leu Asp Arg Ser Gly Tyr Phe Val Gln Pro Thr 370 375 380 Leu Ile Ser Phe Lys Asn Thr Asp Asp Pro Leu Phe Ser Glu Glu Thr 385 390 395 400 Phe Gly Pro Val Val Gly Val Met Pro Phe Glu Thr Asp Glu Glu Leu 405 410 415 Ile Gln Leu Met Asn Gln Ser Arg Phe Gly Leu Thr Ala Ser Ile Trp 420 425 430 Thr Asn Asp Leu Ser Lys Ala Leu Arg Leu Ile Pro Lys Ile Glu Ala 435 440 445 Gly Thr Leu Trp Val Asn Met His Thr Phe Leu Asp Pro Ser Val Pro 450 455 460 Phe Gly Gly Val Lys Ala Ser Gly Ile Gly Arg Glu Phe Ser Asp Ala 465 470 475 480 Phe Ile Glu Asp Tyr Thr Glu Leu Lys Ser Val Met Ile Arg Tyr 485 490 495 <210> 106 <211> 495 <212> PRT <213> Acinetobacter baumanni <400> 106 Met Ser Glu Val Gln Ile Leu Glu Ser Val Gln Gln Phe Ile Ala Arg 1 5 10 15 Gln His Gly His Phe Ile Asp Gly Lys Leu Val Ala Ala Glu Leu Leu 20 25 30 Asp Lys Val Asp Ile Val Asn Pro Ser Thr Glu Gln Val Val Ala Gln 35 40 45 Ile Ser Ile Gly Ser Gln Gln Asp Val Glu Ser Ala Val Lys Ser Ala 50 55 60 Glu His Ala Phe Gln Asn Ala Trp Ala Glu Thr Thr Pro Tyr Glu Arg 65 70 75 80 Gly Val Lys Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Ile Glu Gln His Gly Glu 85 90 95 Glu Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Ser Thr Gly Lys Leu Ile Asn Ile 100 105 110 Ser Arg His Leu Glu Val Ala Gln Ser Val Ile Phe Leu Arg Tyr Phe 115 120 125 Ala Gly Trp Ala Thr Lys Ile Asn Gly Gln Thr Met Gln Pro Ser Ile 130 135 140 Pro Ser Met Gln Gly Glu Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Leu Arg Gln Pro 145 150 155 160 Val Gly Val Val Ala Gly Ile Val Pro Trp Asn Phe Ser Leu Met Ile 165 170 175 Gly Val Trp Lys Ile Gly Ser Ala Leu Thr Thr Gly Cys Thr Ile Val 180 185 190 Leu Lys Pro Ser Glu Phe Ala Ser Leu Ser Leu Leu Arg Leu Ala Glu 195 200 205 Leu Ala Ile Glu Ala Gly Ile Pro Ala Gly Val Ile Asn Val Val Thr 210 215 220 Gly Lys Gly Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ile Glu Ser Pro Leu Val Lys 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Thr Gly Ser Val Pro Thr Gly Ile Ala Ile Gly Lys 245 250 255 Leu Ala Met Ser Ser Asp Leu Thr Arg Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Ile Ala Val Leu Ala Asp Ala Asn Ile Asp Glu Ile Leu 275 280 285 Pro Thr Leu Leu Gln Ala Thr Phe Val His Gln Gly Gln Val Cys Ala 290 295 300 Ser Pro Glu Arg Phe Leu Val His Arg Thr Lys Tyr Asp Glu Leu Val 305 310 315 320 Asp Lys Leu Ser Lys Ala Leu Ser Gln Phe Lys Ile Gly Ser Ala Met 325 330 335 Asp Glu Gly Ser Met Phe Gly Pro Leu Ser Asn Gln Pro His Phe His 340 345 350 Lys Val Lys His Tyr Leu Asp Met Ala Lys Ala Asn Asn Gln Ile Ile 355 360 365 Ala Gly Gly Glu Ala Leu Asp Gln Thr Gly Tyr Phe Val Gln Pro Thr 370 375 380 Leu Ile Ser Phe Lys Asn Thr Asp Asp Pro Leu Phe Ser Glu Glu Thr 385 390 395 400 Phe Gly Pro Val Val Gly Val Met Ser Phe Asp Thr Asp Glu Glu Leu 405 410 415 Ile Gln Leu Met Asn Gln Ser Arg Phe Gly Leu Thr Ala Ser Ile Trp 420 425 430 Thr Asn Asp Leu Ser Lys Ala Leu Arg Leu Ile Pro Lys Ile Glu Ala 435 440 445 Gly Thr Leu Trp Val Asn Met His Thr Phe Leu Asp Pro Ser Val Pro 450 455 460 Phe Gly Gly Val Lys Ala Ser Gly Ile Gly Arg Glu Phe Ser Asp Ala 465 470 475 480 Phe Ile Glu Asp Tyr Thr Glu Leu Lys Ser Val Met Ile Arg Tyr 485 490 495 <210> 107 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 107 atgatcgcta gcaggagaaa ttaactatgt tgacaaaagc aacaaaagaa ca 52 <210> 108 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 108 gactatgctc agcttagaga gctttcgttt tcatgagttc 40 <210> 109 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 109 gactatgctc agcttagaga gctttcgttt tcatgagttc 40 <210> 110 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 110 tcctctaaat ctctagaaag ggtgccggca gcttgatatg tt 42 <210> 111 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 111 atgatcggta ccatgcctaa gtaccgttcc gcca 34 <210> 112 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 112 atgatcgcta gcttaacccc ccagtttcga tttatcg 37 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 113 gactatggta ccatgtatac agtaggagat tacctattag 40 <210> 114 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 114 gactatgcat gcttatgatt tattttgttc agcaaatag 39 <210> 115 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 115 gactattcta gattatgatt tattttgttc agcaaatag 39 <210> 116 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 116 gactatgcat gcaggagata taccatgcaa cataagttac tgattaacgg ag 52 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 117 gactattcta gattaatgtt taaccatgac gtggcggacg 40 <210> 118 <211> 48 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 118 gactatgcat gcaggagata taccatgacc aataatcccc cttcagca 48 <210> 119 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 119 gactattcta gattagaaca gccccaacgg tttatccga 39 <210> 120 <211> 53 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 120 gactatgcat gcaggagata taccatgaat tttcatcatc tggcttactg gca 53 <210> 121 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 121 ggcttatcca gatggttttc agttcagtga atttttcaag ggcgtgcagg gatttgtcgc 60 <210> 122 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 122 gactattcta gattaggcct ccaggcttat ccagatggtt ttcagttcag 50 <210> 123 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 123 gactatgcat gcaggagata taccatgaaa cttaacgaca gtaacttatt cc 52 <210> 124 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 124 gactattcta gattaaagac cgatgcacat atatttga 38 <210> 125 <211> 48 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 125 ctagtagcat gcaaggagat ataccatgac agagccgcat gtagcagt 48 <210> 126 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 126 gactattcta gattaatacc gtacacacac cgacttagtt 40 <210> 127 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 127 gactatgcat gcaggagata taccatggct aacgtgactt atacggatac g 51 <210> 128 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 128 gactattcta gattagaccg ccatcaccgt cacc 34 <210> 129 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 129 gactatgcat gcaggagata taccatgccc ctcacaggca acctg 45 <210> 130 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 130 gactattcta gattagtctt cccgtttacc atcaagca 38 <210> 131 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 131 gactatggat ccatgacaga gccgcatgta gcagt 35 <210> 132 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 132 gactatggat ccttaatacc gtacacacac cgacttagtt 40 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 133 ttgcttacgc cacctggaag t 21 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 134 gaacggtcgc atgagcagaa ag 22 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 135 tgacgataat ttctggcaag c 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 136 gcaggctgac attaagttcg t 21 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 137 agatttggcc tgcggtgaaa 20 <210> 138 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 138 ctgttagttg ttatttattg gcgg 24 <210> 139 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 139 catttattgc gcgacgcatt at 22 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 140 atagcgggct tttaacttga gg 22 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 141 cactgaagag gtatgcggaa aa 22 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 142 ctgggcattt tatgccggta g 21 <210> 143 <211> 48 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 143 ctagtagagc tcaaggagat ataccatgac agagccgcat gtagcagt 48 <210> 144 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 144 gactatgagc tcttaatacc gtacacacac cgacttagtt 40 <210> 145 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 145 tgcatcgaat tcaggagaaa ttaactatga acgagtacgc ccccctgcgt ttgc 54 <210> 146 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 146 tgcatcaagc tttcagatat gcaaggcgtg gcccag 36 <210> 147 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 147 gggcccaagc ttaggagaaa ttaactatga tgaacttcaa caatgttttc cg 52 <210> 148 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 148 gggccctcta gattatgagt catgatttac taaaggct 38 <210> 149 <211> 55 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 149 gggcccaagc ttaggagaaa ttaactatga tgagtcaggc gctaaaaaat ttact 55 <210> 150 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 150 gggccctcta gattaattgt gattacgcat cacccctt 38

Claims (70)

  1. 야생형 대조군과 비교하여 증가된 이소부티르산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 미생물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 진균 세포인 재조합 미생물 세포.
  3. 제2항에 있어서, 진균 세포가 사카로마이세타세아에(Saccharomycetaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  4. 제2항에 있어서, 진균 세포가 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)인 재조합 세포.
  5. 제1항에 있어서, 박테리아 세포인 재조합 세포.
  6. 제5항에 있어서, 박테리아 세포가 프로토박테리아(Protobacteria) 문의 구성원인 재조합 세포.
  7. 제6항에 있어서, 박테리아 세포가 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  8. 제7항에 있어서, 박테리아 세포가 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)인 재조합 세포.
  9. 제6항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나세아에(Pseudomonaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  10. 제9항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)인 재조합 세포.
  11. 제5항에 있어서, 박테리아 세포가 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 구성원인 재조합 세포.
  12. 제11항에 있어서, 박테리아 세포가 바실라세아에(Bacillaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  13. 제12항에 있어서, 박테리아 세포가 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 재조합 세포.
  14. 제11항에 있어서, 박테리아 세포가 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  15. 제14항에 있어서, 박테리아 세포가 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)인 재조합 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 이종성 DNA 분자를 포함하는 재조합 세포.
  17. 제16항에 있어서, 이소부티르알데히드가 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드가 알데히드 데히드로게나제(dehydrogenase)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  18. 제17항에 있어서, 알데히드 데히드로게나제가 이. 콜라이(E. coli) 페닐아세트알데히드 데히드로게나제 (PadA)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  19. 제17항에 있어서, 알데히드 데히드로게나제가 이. 콜라이 아세트알데히드 데히드로게나제 (AldB), 이. 콜라이 3-히드록시프로피온알데히드 데히드로게나제 (AldH), 이. 콜라이 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 (GabD), 또는 이. 콜라이 γ-아미노부티르알데히드 데히드로게나제 (YdcW)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  20. 제17항에 있어서, 알데히드 데히드로게나제가 비. 암비파리아(B. ambifaria) α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHba)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  21. 제17항에 있어서, 알데히드 데히드로게나제가 피. 푸티다(P. putida) α-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제 (KDHPP)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이소부티르알데히드가 이소부탄올로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 추가로 포함하며, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타내는 것인 재조합 세포.
  23. 제22항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 알콜 데히드로게나제를 포함하는 것인 재조합 세포.
  24. 제23항에 있어서, 알콜 데히드로게나제가 유전자 변형 adhE 또는 유전자 변형 adhP에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  25. 제22항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 에탄올아민 이용 단백질을 포함하는 것인 재조합 세포.
  26. 제25항에 있어서, 에탄올아민 이용 단백질이 유전자 변형 eutG에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  27. 제22항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 유전자 변형 yiaY, 유전자 변형 yqhD, 또는 유전자 변형 yigB에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 촉매 활성의 감소가 야생형과 비교하여 50％ 이상의 감소를 포함하는 것인 재조합 세포.
  29. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 경로의 구성원인 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 이종성 DNA 분자를 포함하는 재조합 세포.
  30. 제29항에 있어서, 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 경로의 구성원인 폴리펩티드가 분지쇄 케토산 데히드로게나제를 포함하는 것인 재조합 세포.
  31. 제30항에 있어서, 2-케토발린이 이소부티레이트로 전환되는 것을 촉매하는 경로의 구성원인 폴리펩티드가 티오에스테라제(thioesterase)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  32. 제31항에 있어서, 티오에스테라제가 TesA 또는 TesB를 포함하는 것인 재조합 세포.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 피루베이트가 락테이트, 포르메이트 및 아세테이트 중 어느 하나 이상으로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 추가로 포함하며, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타내는 것인 재조합 세포.
  34. 제33항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 락테이트 데히드로게나제를 포함하는 것인 재조합 세포.
  35. 제34항에 있어서, 락테이트 데히드로게나제가 유전자 변형 ldhA에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  36. 제33항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 피루베이트 포르메이트 리아제(lyase) I을 포함하는 것인 재조합 세포.
  37. 제36항에 있어서, 피루베이트 포르메이트 리아제 I이 유전자 변형 pflB에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  38. 제33항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 피루베이트 옥시다제(oxidase)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  39. 제35항에 있어서, 피루베이트 옥시다제가 유전자 변형 poxB에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 아세틸-CoA가 에탄올 또는 아세틸-P로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드의 유전자 변형 버전을 추가로 포함하며, 이때 유전자 변형 버전 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 촉매 활성의 감소를 나타내는 것인 재조합 세포.
  41. 제40항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 알콜 데히드로게나제를 포함하는 것인 재조합 세포.
  42. 제41항에 있어서, 알콜 데히드로게나제가 유전자 변형 adhE에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  43. 제40항에 있어서, 유전자 변형 폴리펩티드가 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  44. 제43항에 있어서, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제가 유전자 변형 pta에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 2-케토이소발레레이트가 이소부티르알데히드로 전환되는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는 재조합 세포.
  46. 제45항에 있어서, 폴리펩티드가 2-케토산 데카르복실라제(decarboxylase)를 포함하는 것인 재조합 세포.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 피루베이트가 2-케토이소발레레이트로 전환되는 것을 순차적으로 촉매하는 다수의 폴리펩티드를 추가로 포함하는 재조합 세포.
  48. 제47항에 있어서, 다수의 폴리펩티드가 디히드록시산 데히드라타제(dehydratase), 케톨-산 리덕토이소머라제(reductoisomerase), 및 아세토락테이트 신타제(synthase) 중 하나 이상을 포함하는 것인 재조합 세포.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 세포를, 재조합 세포가 이소부티레이트를 생산하는데 효과적인 조건 하에 탄소원을 포함하는 배지에서 인큐베이션하며, 이때 탄소원은 글루코스, 도 1의 화합물 6, 도 1의 화합물 7, 도 1의 화합물 8, 도 1의 화합물 9, 및 도 1의 화합물 10 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  50. 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하여, 변형된 숙주 세포가 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉매하도록 하는 단계
    를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 숙주 세포가 진균 세포인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 진균 세포가 사카로마이세타세아에 과의 구성원인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 진균 세포가 사카로마이세스 세레비시아에인 방법.
  54. 제50항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 박테리아 세포가 프로토박테리아 문의 구성원인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 박테리아 세포가 엔테로박테리아세아에 과의 구성원인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 박테리아 세포가 에쉐리키아 콜라이인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나세아에 과의 구성원인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나스 푸티다인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 박테리아 세포가 피르미쿠테스 문의 구성원인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 박테리아 세포가 바실라세아에 과의 구성원인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 박테리아 세포가 바실루스 서브틸리스인 방법.
  63. 제60항에 있어서, 박테리아 세포가 스트렙토코카세아에 과의 구성원인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 박테리아 세포가 락토코쿠스 락티스인 방법.
  65. 제50항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 제16항 내지 제48항 중 어느 하나 이상의 항의 재조합 세포를 포함하는 것인 방법.
  66. (없음)
  67. 제49항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 이소부티레이트를 또 다른 화합물로 전환하는 1개 이상의 단계를 추가로 포함하는 방법.
  68. 이소부티르알데히드를 이소부티레이트로 전환하는 능력이 증가하도록 변형된 1개 이상의 내인성 효소를 포함하는 유전자 변형 미생물 세포.
  69. 제68항에 있어서, 변형된 효소가 이소부티르알데히드의 이소부티레이트로의 전환을 촉매하는 것인 유전자 변형 미생물 세포.
  70. 제68항에 있어서, 변형된 효소가 높은 수준의 이소부티레이트를 포함하는 환경을 견디는 세포의 능력을 증가시키는 것인 유전자 변형 미생물 세포.
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