CN105296410A - 一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明所提供的大肠杆菌敲除了9种醛还原酶基因以及乳酸脱氢酶基因、延胡索酸还原酶基因、甲酸裂解酶基因和全局转录因子基因。同时过表达乙酰乳酸合成酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟基酸脱水酶基因、2-酮酸脱羧酶基因和脂肪醛去甲酰加氧酶基因。本发明同时还提供了该大肠杆菌的构建方法。通过在改造后的菌株中过表达丙烷合成途径，该菌株成功地实现了丙烷的生物合成。

Description

一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种利用缬氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

全球人口的持续增长和发展中国家经济的发展促进了化石能源的开采和使用，导致了严重的环境污染和气候变化问题。因此，开发环境友好型清洁能源具有重要的意义。

丙烷是液化石油气中的主要成分之一，具有较高的沸点和燃烧热值，因而容易进行液化和运输。其燃烧过程充分，可以与现有的内燃机和能源运输系统相兼容。此外，丙烷可用作制冷剂和喷雾推进剂，替换对臭氧层具有破坏性的氟氯烃类化合物，对环境保护亦有重要的价值。当前，石油化工业是丙烷的主要来源。鉴于丙烷的广泛应用和化石燃料资源的有限性，实现丙烷的生物合成和可再生具有重要的意义。

蓝细菌(蓝藻，Cyanobacterium)是一种能够在体内合成脂肪烃类化合物的原核微生物。Schirmer等人发现了该细菌体内合成脂肪烃的关键性基因：脂肪醛去甲酰加氧酶(Aldehyde-deformylatingoxygenase,ADO)(Schirmeretal.,2010)。ADO属于非血红素类铁蛋白超家族酶，可利用氧气将脂肪醛氧化，发生脱羰基反应，并生成甲酸和相应的脂肪烃。该酶的发现为实现丙烷的生物合成提供了可能的途径。

Kallio等人利用大肠杆菌的脂肪酸合成系统，通过过表达对丁酰ACP具有较高特异性的硫酯酶，使大肠杆菌得以特异性地合成正丁醛，再通过在该菌内同时表达的ADO，最终将正丁醛转化成丙烷，实现了丙烷的生物合成(Kallio2014)。但是，该代谢途径中脂肪酸合成系统提供的正丁醛有限，制约了丙烷产量的提升。因此，为实现丙烷产量的进一步提高，应建立一条能为ADO提供充足底物的代谢途径。

缬氨酸代谢途径是大肠杆菌内的一种氨基酸合成途径。通过过表达来自乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因Kivd，可将缬氨酸代谢途径的中间产物2-酮异戊酸转化为异丁醛(ShotaAtsumi2008)。体外加醛实验证明，异丁醛同样可以被ADO催化生成丙烷。因此，我们希望以大肠杆菌的缬氨酸代谢途径为基础，通过基因工程改造，构建出可以大量合成并累积异丁醛的菌株。再在该菌株中过表达ADO基因，催化异丁醛生成丙烷，从而建立一条新的丙烷合成途径。表达该代谢途径的大肠杆菌可为ADO提供充足的异丁醛底物，为丙烷产量的提高奠定基础。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种利用缬氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种利用缬氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌，该大肠杆菌过表达乙酰乳酸合成酶基因、2-酮酸脱羧酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟基酸脱水酶基因和脂肪醛去甲酰加氧酶基因，并敲除多个醛还原酶基因和全局转录因子基因。

优选地，所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因，来源于蓝藻(Cyanobacteria)。

优选地，所述乙酰乳酸合成酶基因，为来源于枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因alsS；所述2-酮酸脱羧酶基因，为来源于乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因Kivd；所述酮酸还原异构酶基因，为来源于大肠杆菌的酮酸还原异构酶基因ilvC；所述二羟基酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌的二羟基酸脱水酶基因ilvD；所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因，为来源于原绿球藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因PMT1231、集胞藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因sll0208、聚球藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因orf1593或点形念珠藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因NpunR1711。

更优选地，所述乙酰乳酸合成酶基因alsS，GeneBank登录号：CAB15618.2；所述2-酮酸脱羧酶基因Kivd，GeneBank登录号：AAS49166.1；所述酮酸还原异构酶基因ilvC，GeneBank登录号：NP_418222；所述二羟基酸脱水酶基因ilvD，GeneBank登录号：YP_026248；所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因PMT1231，GeneBank登录号：NP_895059；脂肪醛去甲酰加氧酶基因sll0208，GeneBank登录号：NP_442147；脂肪醛去甲酰加氧酶基因orf1593，GeneBank登录号：YP_400610；脂肪醛去甲酰加氧酶基因NpunR1711，GeneBank登录号：YP_001865325。

优选地，所述多个醛还原酶基因是，基因yqhD，基因adhE，基因adhP，基因yjgB，基因eutG，基因yiaY，基因yahK，基因fucO和基因DkgA。

优选地，所述全局转录因子基因，为全局转录因子基因fnr。

优选地，还敲除乳酸脱氢酶基因、延胡索酸还原酶基因、甲酸裂解酶基因。

更优选地，所述乳酸脱氢酶基因，为乳酸脱氢酶基因ldhA；所述延胡索酸还原酶基因，为延胡索酸还原酶基因frdABCD；所述甲酸裂解酶基因，为甲酸裂解酶基因pflB。

所述任一大肠杆菌在合成脂肪烃类燃料中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的在于提供一种所述大肠杆菌的构建方法，该方法的步骤如下：

1)将质粒pKD46转化到宿主菌E.coliBW25113中，获得携带质粒的宿主菌；

2)分别制备含有乙酰乳酸合成酶基因alsS和2-酮酸脱羧酶基因Kivd、酮酸还原异构酶基因ilvC和二羟基酸脱水酶基因ilvD以及脂肪醛去甲酰加氧酶基因的重组质粒，获得代谢途径构建质粒；

3)分别构建醛还原酶基因yqhD，基因adhE，基因adhP，基因yjgB，基因eutG，基因yiaY，基因yahK，基因fucO和基因DkgA，以及全局转录因子基因fnr的基因替换质粒和标签替换质粒；

4)利用步骤3)所得的基因替换质粒和标签替换质粒制备基因敲除片段和标签敲除片段；

5)先后向步骤1)所得的携带质粒pKD46的宿主菌中转化同一个基因的基因敲除片段和标签敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；

6)以步骤5)所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5)的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5)的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3)所述基因全部敲除，获得醛还原酶活性缺失的重组大肠杆菌；

7)将步骤6)中醛还原酶活性缺失的重组大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤2)所得的代谢途径构建质粒转化到所得的溶源菌中，获得能够利用缬氨酸途径合成丙烷的重组大肠杆菌：

优选地，所述构建醛还原酶基因yqhD的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示；构建醛还原酶基因adhE的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5-SEQIDNO.8所示；构建醛还原酶基因adhP的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9-SEQIDNO.12所示；构建醛还原酶基因yjgB的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.13-SEQIDNO.16所示；构建醛还原酶基因eutG的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.17-SEQIDNO.20所示；构建醛还原酶基因yiaY的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.21-SEQIDNO.24所示；构建醛还原酶基因yahK的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.25-SEQIDNO.28所示；构建醛还原酶基因fucO的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.29-SEQIDNO.32所示；构建醛还原酶基因DkgA的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.33-SEQIDNO.36所示；构建醛还原酶基因fnr的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.49-SEQIDNO.52所示。

本发明还提供了一种具体应用所述重组大肠杆菌合成丙烷的方法，该方法的具体的步骤如下：

1)将质粒pKD46转化到宿主菌E.coliBW25113中，获得携带质粒的宿主菌；

2)分别制备含有乙酰乳酸合成酶基因alsS和2-酮酸脱羧酶基因Kivd、酮酸还原异构酶基因ilvC和二羟基酸脱水酶基因ilvD以及脂肪醛去甲酰加氧酶基因的重组质粒，获得代谢途径构建质粒；

3)分别构建醛还原酶基因基因yqhD，基因adhE，基因adhP，基因yjgB，基因eutG，基因yiaY，基因yahK，基因fucO和基因DkgA，以及乳酸脱氢酶基因ldhA，延胡索酸还原酶基因frdABCD，甲酸裂解酶基因pflB和全局转录因子基因fnr的基因替换质粒和标签替换质粒；

4)利用步骤3)所得的基因替换质粒和标签替换质粒制备基因敲除片段和标签敲除片段；

5)先后向步骤1)所得的携带质粒pKD46的宿主菌中转化同一个基因的基因敲除片段和标签敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；

6)以步骤5)所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5)的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5)的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3)所述基因全部敲除，获得缺失13个基因的重组大肠杆菌；

7)将步骤6)中醛还原酶活性缺失的重组大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤2)所得的代谢途径构建质粒转化到所得的溶源菌中，获得能够利用缬氨酸途径合成丙烷的重组大肠杆菌。

8)利用步骤7)所得的重组大肠杆菌发酵合成丙烷。

发明人对获得的菌种到位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏日期为2015年9月8日，保藏号为CGMCCNO.11342，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。

本发明获得的有益效果如下：

通过对大肠杆菌缬氨酸途径的基因工程改造，本发明建立了一条新的丙烷合成途径。本发明同时克服了现有技术难题，获得了一个高效的醛还原酶基因敲除方案，既有效降低了大肠杆菌的醛还原酶活性，又不会影响菌株的正常生长。

本发明提供的重组大肠杆菌，其内源性醛还原酶活性得到了大幅地削弱。实验证明，通过在改造后的菌株中过表达产异丁醛的代谢途径，该菌株合成并累积了大量的异丁醛。与野生型大肠杆菌相比，本发明获得的重组大肠杆菌的异丁醛产量提高了约4倍，达到了15mM。该菌株为ADO提供了充足的底物，为丙烷产量的进一步提高奠定了基础。

本发明所构建的重组菌可以作为合成各种脂肪烃类生物燃料的平台菌，通过在重组菌中构建出不同的脂肪醛合成途径，能够合成并累积相应的脂肪醛，为ADO提供底物。因此，该菌株在以微生物代谢为基础的脂肪烃生产中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为敲除yqhD基因构建的标签替换质粒的结构图。

图2为敲除yqhD基因构建的基因替换质粒的结构图。

图3为敲除adhE基因构建的标签替换质粒的结构图。

图4为敲除adhE基因构建的基因替换质粒的结构图。

图5为敲除adhP基因构建的标签替换质粒的结构图。

图6为敲除adhP基因构建的基因替换质粒的结构图。

图7为敲除yjgB基因构建的标签替换质粒的结构图。

图8为敲除yjgB基因构建的基因替换质粒的结构图。

图9为敲除eutG基因构建的标签替换质粒的结构图。

图10为敲除eutG基因构建的基因替换质粒的结构图。

图11为敲除yiaY基因构建的标签替换质粒的结构图。

图12为敲除yiaY基因构建的基因替换质粒的结构图。

图13为敲除yahK基因构建的标签替换质粒的结构图。

图14为敲除yahK基因构建的基因替换质粒的结构图。

图15为敲除fucO基因构建的标签替换质粒的结构图。

图16为敲除fucO基因构建的基因替换质粒的结构图。

图17为敲除DkgA基因构建的标签替换质粒的结构图。

图18为敲除DkgA基因构建的基因替换质粒的结构图。

图19为敲除ldhA基因构建的标签替换质粒的结构图。

图20为敲除ldhA基因构建的基因替换质粒的结构图。

图21为敲除frdABCD基因构建的标签替换质粒的结构图。

图22为敲除frdABCD基因构建的基因替换质粒的结构图。

图23为敲除pflB基因构建的标签替换质粒的结构图。

图24为敲除pflB基因构建的基因替换质粒的结构图。

图25为敲除fnr基因构建的标签替换质粒的结构图。

图26为敲除fnr基因构建的基因替换质粒的结构图。

图27是质粒pBAD33-alsS-Kivd的图谱，用来过表达异丁醛代谢途径中的alsS和Kivd基因。

图28是质粒pAL96-ilvCD的图谱，用来过表达异丁醛代谢途径中的ilvCD基因。

图29是质粒pET-28a-pMT1231的图谱，用来过表达ADO基因。

图30以野生型菌株BW25113基因组为模板，PCR验证产物的电泳图；

(图中，M:Marker；泳道1-13分别为:ldhAyqhDadhEadhPyjgBeutGyiaYyahKfucODkgAfrdABCDpflBfnr)。

图31以敲除13个基因后的菌株BW25113△13基因组为模板，PCR验证产物的电泳图；

(图中，M:Marker；泳道1-13分别为:ldhAyqhDadhEadhPyjgBeutGyiaYyahKfucODkgAfrdABCDpflBfnr)。

图32野生型BW25113和BW25113△13的异丁醛产量对比。

图33野生型BW25113和BW25113△13的生长曲线对比。

图34为本发明中构建的产丙烷代谢途径。

图35为丙烷的产量随时间的变化曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司PlasmidMiniKitI试剂盒(CatalogNo.:D6942-01)，DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-PureKit试剂盒(CatalogNo.:D6492-01)，凝胶回收是采用OMEGA公司GelExtractionKit试剂盒(CatalogNo.:D2500-01)，化学感受态细胞的制备使用Takara公司的CompetentCellPreparationKit(CatalogNo.:9139)，敲除质粒的构建使用全式金公司的pEASY-BluntSimpleCloningKit(CatalogNo.:CB111-01)，DNA片段的连接使用Fermentas公司的T4DNALigase(CatalogNo.:EL0014)，DNA片段的扩增使用Fermentas公司的pfuDNAPolymerase(CatalogNo.:EP0571)，PCR质粒模板的消化使用Fermentas公司的FastDigestDpnI(CatalogNo.:FD1703)，E.coli电击转化实验使用Bio-Rad的电转仪(CatalogNo.:165-2100)。

实施例1基因敲除质粒的构建

本实施例使用两步无痕法敲除E.coliBW25113的多个基因，该方法每敲除一个目的基因，需要构建两个相对应的含有待敲除目的基因同源臂的质粒。这两个质粒作为PCR模板，提供敲除过程中进行同源重组的两个片段。因此，下面以图1中的pEBS-yqhD和图2中的pEBS-yqhD-Cat-sacB质粒为例，详细阐述敲除质粒的构建步骤。其余12个基因敲除质粒的构建方法与此相同。

在NCBI中查找E.coliBW25113基因组中yqhD基因的核酸序列，分别设计两对引物，yqhD-F/yqhD-fusion-R，yqhD-R/yqhD-fusion-F。以E.coliBW25113基因组为模板，利用引物yqhD-F/yqhD-fusion-R进行PCR反应，获得yqhD的上游同源臂；再利用yqhD-R/yqhD-fusion-F进行PCR反应，获得yqhD的下游同源臂。回收获得的上下游同源臂，进行融合PCR反应，之后用引物yqhD-F/yqhD-R扩增融合成功的片段。将融合片段与pEASY-BluntSimple克隆载体相连，连接产物转化E.coliDH5α，在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上筛选，得到图1质粒pEBS-yqhD。使用EcoRV酶切质粒pEBS-yqhD，切胶回收纯化，再与准备好的Cat-sacB片段连接，连接产物转化E.coliDH5α，并在含有氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的LB平板上筛选，获得图2质粒pEBS-yqhD-Cat-sacB。

为便于衡量敲除9种醛还原酶基因和fnr基因的效果，减少异丁醛中间代谢产物的损失和便于生成异丁醛，本实施例还敲除了大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhA，延胡索酸还原酶基因frdABCD，甲酸裂解酶基因pflB。图1至图26分别是敲除yqhDadhEadhPyjgBeutGyiaYyahKfucODkgAldhAfrdABCDpflBfnr基因时构建的敲除用质粒。每敲除一个目的基因，需要构建含有相应同源臂的两个敲除质粒。其中，图2、图4、图6、图8、图10、图12、图14、图16、图18、图20、图22、图24和图26质粒分别作为PCR模板，提供敲除基因时的Cat-sacB片段，该片段两端各携带200bp的同源臂，替换BW25113基因组中相应的目地基因。图1、图3、图5、图7、图9、图11、图13、图15、图17、图19、图21、图23和图25质粒分别作为PCR模板，提供仅携带同源臂的片段，用来替换整合至BW25113基因组中的Cat-sacB筛选标签。

构建质粒pEBS-yqhD和pEBS-yqhD-Cat-sacB所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示。其中，引物yqhD-fusion-F和yqhD-fusion-R中的gatatc序列是人为添加的EcoRV酶切位点，便于插入Cat-sacB片段。其余12个敲除质粒的构建方法与以上步骤相同，各自使用的引物序列如SEQIDNO.5-SEQIDNO.52所示。

实施例2质粒pBAD33-alsS-Kivd的构建

来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因alsS和乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因Kivd由上海英潍捷基公司合成，连接至pMD18-T载体，分别得到pMD18-T-alsS和pMD18-T-Kivd质粒。利用引物alss-SacI/alss-fusion-R从pMD18-T-alsS中扩增出alsS基因片段，利用Kivd-SphI/Kivd-fusion-F从pMD18-T-Kivd中扩增出Kivd基因片段。将两个片段分别割胶纯化回收，进行融合PCR反应，以融合后的片段为模板，再利用引物alsS-SacI/Kivd-SphI扩增。最终，将扩增出的融合片段alsS-Kivd割胶纯化回收，并用SacI和SphI双酶切。酶切后的alsS-Kivd融合片段与同样经SacI和SphI双酶切的pBAD33载体进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，在含氯霉素的LB平板上筛选，得到pBAD33-alsS-Kivd质粒(图27)。所用引物序列如SEQIDNO.53-SEQIDNO.56所示。

实施例3质粒pAL96-ilvCD的构建

以BW25113基因组为模板，利用引物ilvC-F/ilvC-fusion-R进行PCR反应，获得ilvC基因片段；利用引物ilvD-fusion-F/ilvD-R进行PCR反应，获得ilvD基因片段。割胶纯化回收上述两个片段，进行融合PCR反应，以融合后的片段为模板，利用引物ilvC-F/ilvD-R扩增融合片段。最终，将扩增出的融合片段ilvCD割胶纯化回收，并用SacI和SplI双酶切。酶切后的ilvCD融合片段与同样经过SacI和SplI双酶切的pAL96载体进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选，得到pAL96-ilvCD质粒(图28)。所用引物序列如SEQIDNO.57-SEQIDNO.60所示。

实施例4质粒pET-28a-PMT1231的构建

来自原绿球藻MIT9313的ADO基因(PMT1231，GeneBank登录号1728804)由上海生工合成，并连接至pBluescriptⅡSK载体，得到pBluescriptⅡSK-PMT1231质粒。pBluescriptⅡSK-PMT1231质粒经NdeI和XhoI双酶切，割胶回收目的片段，连接到pET-28a载体上，得到pET-28a-PMT1231质粒(图29)。

实施例5醛还原酶活性缺失型菌株E.coliBW25113△13的构建

5.1质粒pKD46的转化

挑取-80℃冻存的野生型E.coliBW25113在无抗性的LB平板上划线，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，接种至5mLLB培养基中，37℃，220rmp/min培养至OD₆₀₀约为0.4左右，冰浴10min。取1mL菌液，转入已灭菌的EP管中，4℃，1800g离心5min，弃上清，加入TakaraCompetentCellPreparationKit的SolutionA100μL，悬浮菌体。之后4℃，1800g离心5min，弃上清，加入100μLSolutionB，再次悬浮菌体，-80℃冻存。

将-80℃冻存的感受态细胞置于冰中融化10min，加入1μL的pKD46质粒，冰上静止30min。之后42℃水浴锅中热激30s。加入900μL的LB培养基，30℃，220rmp/min复苏1小时，取适量菌液涂布与LB平板上(氨苄青霉素100μg/mL)，30℃倒置培养。第二天长出的单克隆即是携带pKD46质粒的E.coliBW25113。

5.2目的基因的敲除

5.2.1同源重组片段的制备

先以图2中的pEBS-yqhD-Cat-sacB质粒为模板，使用引物yqhD-F/yqhD-R进行PCR反应，DpnI酶切PCR产物，消化质粒模板，割胶纯化回收，获得两端含有yqhD同源臂的敲除片段yqhD-FragmentⅡ；再以图1中的pEBS-yqhD质粒为模板，使用引物yqhD-F/yqhD-R进行PCR反应，DpnI酶切PCR产物，消化质粒模板，割胶纯化回收，获得只含有yqhD同源臂的敲除片段yqhD-FragmentI。

5.2.2第一步同源重组(yqhD-FragmentⅡ的转化)

挑取携带pKD46质粒的E.coliBW25113单克隆，接种至5mL的LB培养基中(氨苄青霉素100μg/mL)，30℃，220rmp/min过夜培养。第二天，按1％的接种比，转接至50mL的LB培养基中(阿拉伯糖0.01g/mL，氨苄青霉素100μg/mL)，30℃，220rmp/min培养至OD₆₀₀约0.7左右，冰浴10min。转入已灭菌的50mL的离心管中，4℃，2000g，离心5min。弃上清，用50mL冰浴过的无菌的10％甘油重悬菌体，4℃，2000g，再次离心5min。重复上述操作三次。最后一次，利用弃上清时的残留液体重悬菌体，取50μL至新的EP管中，加入4μLyqhD-FragmentⅡ片段，混匀后加入电击杯中，冰浴2min。2500V，200Ω，25μFd，电击转化。电击后立即加入1mL的LB培养基混匀，转入15mL的试管中，30℃，100r/min，培养2小时。取100μL涂布于LB平板(氨苄青霉素浓度100μg/mL，氯霉素浓度34μg/mL)，30℃过夜培养。第二天挑取单克隆，PCR鉴定出yqhD被yqhD-FragmentⅡ取代的正确克隆。

5.2.3第二步同源重组(yqhD-FragmentⅠ的转化)

挑取上一步中正确的重组克隆，接种至5mL的LB培养基中(氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素34μg/mL)，30℃，220rmp/min过夜培养。第二天，按1％的接种比，转接至50mL的LB培养基中(阿拉伯糖0.01g/mL，氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素34μg/mL)，30℃，220rmp/min培养至OD₆₀₀约0.7左右，冰浴10min。转入已灭菌的50mL的离心管中，4℃，2000g，离心5min。弃上清，用50mL冰浴过的10％甘油重悬菌体，4℃，2000g，再次离心5min。重复上述操作三次。最后一次，利用弃上清时的残留液体重悬菌体，取50μL至新的EP管中，加入4μLyqhD-FragmentⅠ片段，混匀后加入电击杯中，冰浴2min。2500V，200Ω，25μFd，电击转化。电击后立即加入1mL的LB培养基混匀，转入15mL的试管中，30℃，100r/min，培养4小时。

将菌液转入50mL的LB培养基中(无NaCl，含10％蔗糖)，30℃，220rmp/min培养18个小时。之后将菌液在LB平板(氨苄青霉素100μg/mL)上划线，30℃过夜培养。挑取单克隆同时在LB平板(氨苄青霉素100μg/mL)和LB平板(氯霉素34μg/mL)上划线培养。选取在氯霉素平板上不能生长，而在氨苄青霉素平板上生长的克隆，进行测序验证，得到yqhD基因被敲除的正确克隆。

5.2.4剩余12个基因的敲除

剩余12个基因的敲除原理和步骤与yqhD相同，以敲除了yqhD基因的菌株为基础，通过重复试验步骤中的5.2.1、5.2.2和5.2.3，可依次将全部13个基因敲除，最终构建出醛还原酶活性缺失的E.coliBW25113△13。

图30和图31分别为野生型E.coliBW25113和E.coliBW25113△13的PCR验证结果，两组结果使用相同的验证引物，图31中的条带与图30相比，出现了显著的减小，表明相应目的基因已经被成功敲除。

pKD46质粒为温度敏感型质粒，培养温度高于30℃的条件下，质粒将会丢失，因此，在将pKD46质粒转入E.coli后，菌株将一直在30℃条件下培养，以防止pKD46质粒的丢失。

实施例6E.coliBW25113△13产异丁醛能力的验证

分别以野生型BW25113和敲除后的菌株BW25113△13为基础，制备感受态细胞(方法参照实验步骤4.1)，将pBAD33-alsS-Kivd和pAL96-ilvCD转入，在LB平板(氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素34μg/mL)上筛选正确的单克隆。

分别挑取单克隆接种至5mL的LB培养基(氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素34μg/mL)中，37℃，220rmp/min过夜培养过夜摇菌，第二天按10％的接种比转接至50mL的M9培养基中(葡萄糖30g/L)，OD₆₀₀约0.5时诱导(IPTG0.5mM，阿拉伯糖30mM)。诱导1小时后，每瓶5mL分装至30mL的培养瓶中，密闭培养20小时。

取1mL的培养液加入EP管，10000g，离心5min，取500μL的上清液，转入新的EP管，加入500μL的甲苯，震荡抽提1小时，使用气相色谱仪检测甲苯抽提液中的异丁醛浓度。

检测条件：气相色谱仪为安捷伦7890AGCSystem，色谱柱为HP-INNOWAX(19091N-113)，检测器为FID检测器，进样口温度为200℃，分流比为20:1，进样量为1μL，检测器温度为250℃，载气流量为1mL/min，柱温为63℃，保温6min。

结果如图33所示，野生型的BW25113仅仅累积了约4mM的异丁醛，大部分异丁醛被还原为异丁醇。而敲除醛还原酶基因后的菌株BW25113△13丧失了绝大部分的醛还原能力，异丁醛的积累量可达到15mM，仅有极少量的异丁醛被转化为了异丁醇，说明重组菌丧失了大部分的醛还原酶活性。图33表明，基因敲除实验并未影响BW25113△13的正常生长。

实施例7产丙烷菌株BW25113△13/Propane的构建

利用Novagen公司的λDE3LysogenizationKit将BW25113△13转化为溶源菌。在以该菌为出发菌株，制备感受态细胞(方法参照实验步骤5.1)，将pBAD33-alsS-Kivd、pAL96-ilvCD和pET-28a-PMT1231转入，在LB平板(氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素34μg/mL，卡那霉素50μg/mL)上筛选，经PCR验证，得到携带整个丙烷合成途径的菌株BW25113△13/Propane。图34为本发明中以缬氨酸途径为基础，构建的产丙烷代谢途径。

实施例8BW25113△13/Propane丙烷产量的测定

将菌株BW25113△13/Propane接种至5mL的LB培养基(氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素34μg/mL，卡那霉素50μg/mL)中，37℃，220rmp/min过夜培养。第二天按5％的接种比转接至50mL的TB培养基中(葡萄糖30g/L)，OD₆₀₀约0.5时诱导(IPTG0.5mM，阿拉伯糖30mM)。诱导2个小时后，取1mL菌液，加入体积为6mL的培养瓶中，37℃，180rmp/min密闭培养。3个小时后，使用汉密尔顿的气密针，取培养瓶中200μL上层气体，注入气相色谱仪，检测丙烷产量。

检测条件：气相色谱仪为安捷伦7890AGCSystem，色谱柱为HP-INNOWAX(19091N-113)，检测器为FID检测器，进样口温度为200℃，分流比为20:1，进样量为200μL，检测器温度为250℃，载气流量为1mL/min，柱温为63℃，保温6min。

结果如图35所示，BW25113△13/Propane菌株成功实现了丙烷的生物合成。

除以上实施例以外，按照先前的描述，发明人还构建了其他三株利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌，不同的是其中脂肪醛去甲酰加氧酶基因的来源分别来自集胞藻的sll0208，聚球藻的orf1593和点形念珠藻的NpunR1711。并将所得的重组大肠杆菌按照实施例6的方法进行验证，按照实施例7的方法进行测定，测定结果显示，所得的三株菌均能够合成丙烷。以上实验结果表明，本发明成功地构建出了一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照上述实施例对本发明进行了详细地说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌，其特征在于，过表达乙酰乳酸合成酶基因、2-酮酸脱羧酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟基酸脱水酶基因和脂肪醛去甲酰加氧酶基因，并敲除多个醛还原酶基因和全局转录因子基因。

2.根据权利要求1所述一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌，其特征在于，所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因来源于蓝藻。

3.根据权利要求1所述一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合成酶基因，为来源于枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因alsS；所述2-酮酸脱羧酶基因，为来源于乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因Kivd；所述酮酸还原异构酶基因，为来源于大肠杆菌的酮酸还原异构酶基因ilvC；所述二羟基酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌的二羟基酸脱水酶基因ilvD；所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因，为来源于原绿球藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因PMT1231、集胞藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因sll0208、聚球藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因orf1593或点形念珠藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因NpunR1711。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合成酶基因alsS，GeneBank登录号：CAB15618.2；所述2-酮酸脱羧酶基因Kivd，GeneBank登录号：AAS49166.1；所述酮酸还原异构酶基因ilvC，GeneBank登录号：NP_418222；所述二羟基酸脱水酶基因ilvD，GeneBank登录号：YP_026248；所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因PMT1231，GeneBank登录号：NP_895059；脂肪醛去甲酰加氧酶基因sll0208，GeneBank登录号：NP_442147；脂肪醛去甲酰加氧酶基因orf1593，GeneBank登录号：YP_400610；脂肪醛去甲酰加氧酶基因NpunR1711，GeneBank登录号：YP_001865325。

5.根据权利要求1所述一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌，其特征在于，所述多个醛还原酶基因是，基因yqhD，基因adhE，基因adhP，基因yjgB，基因eutG，基因yiaY，基因yahK，基因fucO和基因DkgA；所述全局转录因子基因，为全局转录因子基因fnr。

6.根据权利要求1所述一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌，其特征在于，还敲除乳酸脱氢酶基因ldhA、延胡索酸还原酶基因frdABCD、甲酸裂解酶基因pflB。

7.权利要求1-6所述任一大肠杆菌在合成脂肪烃类燃料中的应用。

8.一种权利要求1所述大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)将质粒pKD46转化到宿主菌E.coliBW25113中，获得携带质粒的宿主菌；

2)分别制备含有乙酰乳酸合成酶基因alsS和2-酮酸脱羧酶基因Kivd、酮酸还原异构酶基因ilvC和二羟基酸脱水酶基因ilvD以及脂肪醛去甲酰加氧酶基因的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；

3)分别构建醛还原酶基因yqhD，基因adhE，基因adhP，基因yjgB，基因eutG，基因yiaY，基因yahK，基因fucO和基因DkgA，以及全局转录因子基因fnr的基因替换质粒和标签替换质粒；

4)利用步骤3)所得的基因替换质粒和标签替换质粒制备基因敲除片段和标签敲除片段；

5)先后向步骤1)所得的携带质粒pKD46的宿主菌中转化同一个基因的基因敲除片段和标签敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；

6)以步骤5)所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5)的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5)的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3)所述基因全部敲除，获得醛还原酶活性缺失的重组大肠杆菌；

7)将步骤6)中醛还原酶活性缺失的重组大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤2)所得的代谢途径构建质粒转化到所得溶源菌中，获得能够利用缬氨酸途径合成丙烷的重组大肠杆菌。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述构建醛还原酶基因yqhD的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示；构建醛还原酶基因adhE的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5-SEQIDNO.8所示；构建醛还原酶基因adhP的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9-SEQIDNO.12所示；构建醛还原酶基因yjgB的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.13-SEQIDNO.16所示；构建醛还原酶基因eutG的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.17-SEQIDNO.20所示；构建醛还原酶基因yiaY的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.21-SEQIDNO.24所示；构建醛还原酶基因yahK的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.25-SEQIDNO.28所示；构建醛还原酶基因fucO的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.29-SEQIDNO.32所示；构建醛还原酶基因DkgA的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.33-SEQIDNO.36所示；构建醛还原酶基因fnr的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.49-SEQIDNO.52所示。

10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，步骤如下：

1)将质粒pKD46转化到宿主菌E.coliBW25113中，获得携带质粒的宿主菌；

2)分别制备含有乙酰乳酸合成酶基因alsS和2-酮酸脱羧酶基因Kivd、酮酸还原异构酶基因ilvC和二羟基酸脱水酶基因ilvD以及脂肪醛去甲酰加氧酶基因的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；

3)分别构建醛还原酶基因基因yqhD，基因adhE，基因adhP，基因yjgB，基因eutG，基因yiaY，基因yahK，基因fucO和基因DkgA，以及乳酸脱氢酶基因ldhA，延胡索酸还原酶基因frdABCD，甲酸裂解酶基因pflB和全局转录因子基因fnr的基因替换质粒和标签替换质粒；

4)利用步骤3)所得的基因替换质粒和标签替换质粒制备基因敲除片段和标签敲除片段；

5)先后向步骤1)所得的携带质粒pKD46的宿主菌中转化同一个基因的基因敲除片段和标签敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；

6)以步骤5)所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5)的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5)的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3)所述基因全部敲除，获得缺失13个基因的重组大肠杆菌；

7)将步骤6)中醛还原酶活性缺失的重组大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤2)所得的代谢途径构建质粒转化到所得的溶源菌中，获得能够利用缬氨酸途径合成丙烷的重组大肠杆菌；

8)利用步骤7)所得的重组大肠杆菌发酵合成丙烷。