CN111996157B - 一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效生产1,3‑丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在肺炎克雷伯氏菌中强化表达1,3‑丙二醇氧化还原酶来增强1,3‑丙二醇氧化还原酶的酶活，同时构建NADH再生途径，以降低3‑羟基丙醛的积累，强化3‑羟基丙醛转化为1,3‑丙二醇，从而提高1,3‑丙二醇的产量。本发明构建得到的基因工程菌1,3‑丙二醇氧化还原酶的酶活是出发菌株的3.25‑3.5倍；甲酸脱氢酶的酶活为0.414‑0.45U/mg。采用本发明构建得到的基因工程菌进行分批补料发酵29h，1,3‑丙二醇的产量比出发菌株提高了43.89％‑97.93％，双基因协同作用，显著提高了1,3‑丙二醇的产量和产率。

Description

一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PD)是一种重要的化工原料，除了能够作溶剂外，其主要作用是作为合成聚酯、聚氨酯的单体，以1,3-丙二醇和对苯二甲酸为单体合成的聚合物聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)是一种新型聚酯材料，具有易染色、弹性好、抗静电、可降解、良好的柔软性等特点，近年来也受到了人们的关注。1,3-丙二醇的生产方法有化学法和微生物发酵法两种。随着化石燃料资源的日益枯竭，基于石油资源的化学合成法受到严重限制，微生物发酵法生产1,3-丙二醇已经成为当前的研究热点。
3-羟基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)是甘油代谢生产1,3-丙二醇的重要中间产物。在甘油转化生产1,3-丙二醇的途径中，甘油在甘油脱水酶(GNlyceroldehydratase,GDHt)的催化下脱水生成了3-HPA，3-HPA在消耗还原力NADH(还原型辅酶I)的基础上，在1,3-丙二醇氧化还原酶(l,3-propanedioldehydroenase，PDOR)的催化下生成了1,3-丙二醇。而在利用肺炎克雷伯氏菌发酵法生产1,3-丙二醇的过程中，3-HPA的高浓度积累会对细胞的生长和代谢产物的合成产生严重的抑制作用，造成发酵过程非正常终止。
3-HPA的积累是由于3-HPA的产生和消耗速率不平衡造成的，发酵前期甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活不平衡也是造成3-HPA积累的关键因素，而还原力NADH的消耗和供应不足也会影响发酵途径的正常进行和1,3-丙二醇的生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在肺炎克雷伯氏菌中强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶来增强1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活，同时构建NADH再生途径，以降低3-羟基丙醛的积累，强化3-羟基丙醛转化为1,3-丙二醇，从而提高1,3-丙二醇的产量。
本发明的技术方案如下：
一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌，所述基因工程菌同时强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶。
根据本发明优选的，所述基因工程菌为重组的肺炎克雷伯氏菌。
根据本发明优选的，所述1,3-丙二醇氧化还原酶为来自肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶，其编码基因为Dhat，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者来自大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶，其编码基因为YqhD，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明优选的，所述甲酸脱氢酶为来自奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶，其编码基因为FdhD，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明优选的，所述基因工程菌构建所用的表达载体中1,3-丙二醇氧化还原酶基因位于甲酸脱氢酶基因的上游，1,3-丙二醇氧化还原酶基因的表达采用1,3-丙二醇氧化还原酶基因启动子。
根据本发明优选的，所述1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活是出发菌株的3.25-3.5倍，所述甲酸脱氢酶的酶活为0.414-0.45U/mg。
采用本发明的基因工程菌进行分批补料发酵29h，1,3-丙二醇的产量比出发菌株提高了43.89％-97.93％。
上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将载体质粒pET28a上的T7启动子替换为肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat，构建表达载体pET28a-dhat；
(2)将肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat，或者大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD插入pET28a-dhat，构建表达载体pET28a-dhat-Dhat或pET28a-dhat-YqhD；
(3)将奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶基因FdhD插入pET28a-dhat-Dhat或pET28a-dhat-YqhD，构建表达载体pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD；
(4)将表达载体pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD转化进肺炎克雷伯氏菌，挑选阳性重组子，得基因工程菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD或K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD。
根据本发明优选的，所述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat序列，PCR引物序列如下：
Primer1:5′-CGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGA-3′(含BglII酶切位点)，
Primer2:5′-CCCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含SacI酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将载体质粒pET28a和PCR扩增产物分别用BglII和SacI双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat质粒；
(2)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat序列，PCR引物序列如下：
Primer3:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGG-3′(含SacI酶切位点)，
Primer4:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含HindIII酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，68℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将PCR扩增产物和步骤(1)得到的载体质粒pET28a-dhat分别用SacI和HindIII双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-Dhat质粒；
或者，以大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD序列，PCR引物序列如下：
Primer5:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAACAACTTTAATCTGCACACCC-3′(含SacI酶切位点)，
Primer6:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGCGGGCGGCTTCGTA-3′(含HindIII酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，70℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将PCR扩增产物和步骤(1)得到的载体质粒pET28a-dhat分别用SacI和HindIII双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-YqhD质粒；
(3)以奥奈达希瓦式菌MR-1基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到甲酸脱氢酶基因FdhD序列，PCR引物序列如下：
Primer7:5′-CCCAAGCTTATGGAATATCATTCACATACTGTGGT-3′(含HindIII酶切位点)，
Primer8:5′-ATTTGCGGCCGCTTAAATGGCTTTCGCTAA-3′(含NotI酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，61℃30sec；延伸，72℃1min(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将PCR扩增产物和步骤(2)得到的载体质粒pET28a-dhat-Dhat或pET28a-dhat-YqhD分别用NotI和HindIII双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒；
(4)将步骤(3)得到的pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒电转化肺炎克雷伯氏菌感受态细胞，挑选阳性重组子，得基因工程菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD或K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD。
上述基因工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
根据本发明优选的，所述应用是以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇，生产工艺如下：
将上述基因工程菌在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入种子培养基中，在37℃、200r/min培养12h，按照3％～10％的接种量接入发酵培养基中，37℃厌氧发酵生产1,3-丙二醇；
其中，种子培养基组成(/L)：柠檬酸0.42g，甘油20.0g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O0.2g，FeSO4·7H2O 5×10-3g，CaCl2 2×10-3g，K2HPO4 3.4g，KH2PO4 1.3g；酵母浸粉1.0g，微量元素B液2mL；
发酵培养基组成(/L)：柠檬酸0.42g，甘油50.0g，NaH2PO4 1.38g，MgCl2·6H2O0.26g，CaCl2·2H2O 0.29g，(NH4)2SO4 6.6g，KCl 0.75g，，Na2SO4 0.28g，酵母浸粉1.0g，微量元素A液5mL；
微量元素A液组成(/L)：CuCl2·2H2O 0.17g，ZnCl2·6H2O 0.68g，MnCl2·4H2O2.0g，CoCl2·6H2O0.47g，Na2MoO4·2H2O 0.005g，H3BO3 0.06g，FeCl3·6H2O 5.4g；
微量元素B液组成(/L)：ZnCl2 0.07g，CoCl2·6H2O 0.2g，NiCl2·6H2O 0.025g，Na2MoO4·2H2O 0.035g，H3BO3 0.06g，CuCl2·2H2O 0.02g，MnCl2·4H2O 0.1g。
本发明的有益效果：
1、本发明在构建基因工程菌时选用肺炎克雷伯氏菌作为宿主菌，该菌株不但具有较高的甘油耐受力、转化率和1,3-丙二醇生产能力，自身也可以合成辅酶B12，并且属兼性菌，可在微氧或厌氧条件下发酵。肺炎克雷伯氏菌的生化特性与大肠杆菌非常相近，这就为菌种的基因改良和利用基因工程构建新的菌种提供了便利。
2、本发明在构建强化表达载体时，将载体质粒pET28a上的T7启动子替换为更适合肺炎克雷伯氏菌表达1,3-丙二醇氧化还原酶的启动子，提高了启动子的诱导效果；强化表达肺炎克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶或大肠杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶，同时构建NADH再生途径，强化表达奥奈达希瓦式菌MR-1甲酸脱氢酶；构建得到的重组肺炎克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活是出发菌株的3.25-3.5倍；甲酸脱氢酶的酶活为0.414-0.45U/mg，而在肺炎克雷伯氏菌的出发菌株中未检测到甲酸脱氢酶的酶活。采用本发明构建得到的基因工程菌进行分批补料发酵29h，1,3-丙二醇的产量比出发菌株提高了43.89％-97.93％，双基因协同作用，降低3-羟基丙醛的积累，强化3-羟基丙醛转化为1,3-丙二醇，从而提高1,3-丙二醇的产量和产率。
附图说明
图1为六种质粒图谱；图中，A为pET28a-dhat质粒，B为pET28a-dhat-Dhat质粒，C为pET28a-dhat-YqhD质粒，D为pET28a-dhat-Dhat-FdhD质粒，E为pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒，F为pET28a-dhat-FdhD质粒；
图2为阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat的菌落PCR凝胶电泳图；图中，各泳道均为dhat基因片段条带；
图3为阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD的菌落PCR凝胶电泳图；图中，泳道1、2为Dhat基因片段条带，泳道3、4为YqhD基因片段条带；
图4为阳性重组肺炎克雷伯氏菌和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD和K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD的菌落PCR凝胶电泳图；图中，泳道1为K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD菌落的FdhD基因片段条带，泳道2为K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD菌落的FdhD基因片段条带；
图5为阳性重组肺炎克雷伯氏菌和K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD的菌落PCR凝胶电泳图；图中，泳道1、3、4为FdhD基因片段条带；
图6为阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD的1,3-丙二醇氧化还原酶蛋白电泳图；图中，泳道2为重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat的蛋白条带，泳道3为重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD的蛋白条带；
图7为阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD的甲酸脱氢酶蛋白电泳图；图中，泳道1为重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD的蛋白条带，泳道2为重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD的蛋白条带；
图8为阳性重组肺炎克雷伯氏菌厌氧发酵一周的1,3-丙二醇产量对比图；
图9为阳性重组肺炎克雷伯氏菌分批补料发酵29h的1,3-丙二醇产量对比图；
图10为阳性重组肺炎克雷伯氏菌厌氧发酵一周的甘油剩余量对比图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
本发明中使用的肺炎克雷伯氏菌出发菌株、大肠杆菌、奥奈达希瓦式菌MR-1均为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得。
实施例1：质粒pET28a-dhat的构建：
将载体质粒pET28a上的T7启动子替换为肺炎克雷伯氏菌中启动1,3-丙二醇氧化还原酶的启动子dhat，并将乳糖操纵子替换为与启动子dhat相对应的操纵子，构建pET28a-dhat质粒，pET28a-dhat质粒的图谱如图1A所示。具体操作步骤如下：
以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，利用生物信息学软件设计启动子dhat序列的扩增引物，扩增得到启动子dhat序列，引物序列如下：
Primer1:5′-CGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGA-3′(含BglII酶切位点)，
Primer2:5′-CCCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含SacI酶切位点)；
PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，得到大小约为180bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒pET28a和回收之后的目的片段分别用BglII和SacI双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat质粒，将pET28a-dhat质粒用电转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含35μg/mL卡那霉素固体LB平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存；重组菌命名为DH5α/pET28a-dhat；采用质粒提取试剂盒从重组菌DH5α/pET28a-dhat中提取pET28a-dhat质粒。
实施例2：质粒pET28a-dhat-Dhat的构建：
将肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat克隆入pET28a-dhat质粒，1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat位于启动子dhat的下游，构建pET28a-dhat-Dhat质粒，pET28a-dhat-Dhat质粒的图谱如图1B所示。具体操作步骤如下：
以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，根据肺炎克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat序列和表达载体pET28a-dhat上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计扩增引物，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat序列(登录号MT674525)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；引物序列如下：
Primer3:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGG-3′(含SacI酶切位点)，
Primer4:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含HindIII酶切位点)；
PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，68℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为1.2kb的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒pET28a-dhat和回收之后的目的片段分别用SacI和HindIII双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-Dhat质粒，将pET28a-dhat-Dhat质粒用化学转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含35μg/mL卡那霉素固体LB平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存，重组菌命名为DH5α/pET28a-dhat-Dhat；采用质粒提取试剂盒从重组菌DH5α/pET28a-dhat-Dhat中提取pET28a-dhat-Dhat质粒。
实施例3：质粒pET28a-dhat-YqhD的构建
将大肠杆菌中的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD克隆入pET28a-dhat质粒，1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD位于启动子dhat的下游，构建pET28a-dhat-YqhD质粒，pET28a-dhat-YqhD质粒的图谱如图1C所示。具体操作步骤如下：
以大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增，根据大肠杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD序列和表达载体pET28a-dhat上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计扩增引物，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD序列(登录号MT674524)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物序列如下：
Primer5:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAACAACTTTAATCTGCACACCC-3′(含SacI酶切位点)，
Primer6:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGCGGGCGGCTTCGTA-3′(含HindIII酶切位点)；
PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，70℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为1.2kb的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒pET28a-dhat和回收之后的目的片段分别用SacI和HindIII双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-YqhD质粒，将pET28a-dhat-YqhD质粒用化学转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含35μg/mL卡那霉素固体LB平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存，重组菌命名为DH5α/pET28a-dhat-YqhD；采用质粒提取试剂盒从重组菌DH5α/pET28a-dhat-YqhD中提取pET28a-dhat-YqhD质粒。
实施例4：质粒pET28a-dhat-Dhat-FdhD/pET28a-dhat-YqhD-FdhD的构建
将奥奈达希瓦式菌MR-1中的甲酸脱氢酶基因FdhD分别克隆入pET28a-dhat-Dhat和pET28a-dhat-YqhD质粒，甲酸脱氢酶基因FdhD位于1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat或1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD的下游，构建pET28a-dhat-Dhat-FdhD质粒或pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒，pET28a-dhat-Dhat-FdhD质粒的图谱如图1D所示，pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒的图谱如图1E所示。具体操作步骤如下：
以奥奈达希瓦式菌MR-1基因组为模板进行PCR扩增，根据奥奈达希瓦式菌MR-1甲酸脱氢酶基因FdhD序列和载体质粒pET28a-dhat-YqhD/pET28a-dhat-Dhat上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计扩增引物，扩增得到甲酸脱氢酶基因FdhD序列(登录号MT674526)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；引物序列如下：
Primer7:5′-CCCAAGCTTATGGAATATCATTCACATACTGTGGT-3′(含HindIII酶切位点)，
Primer8:5′-ATTTGCGGCCGCTTAAATGGCTTTCGCTAA-3′(含NotI酶切位点)；
PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，61℃30sec；延伸，72℃1min(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为800bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒pET28a-dhat-Dhat/pET28a-dhat-YqhD和回收之后的目的片段分别用NotI和HindIII双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-Dhat-FdhD/pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒。将pET28a-dhat-Dhat-FdhD质粒用化学转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含35μg/mL卡那霉素固体LB平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存，重组菌命名为DH5α/pET28a-dhat-Dhat-FdhD；采用质粒提取试剂盒从重组菌DH5α/pET28a-dhat-Dhat-FdhD中提取pET28a-dhat-Dhat-FdhD质粒。同理得重组菌DH5α/pET28a-dhat-YqhD-FdhD和pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒。
对比例1：质粒pET28a-dhat-FdhD的构建
将奥奈达希瓦式菌MR-1甲酸脱氢酶FdhD基因克隆入pET28a-dhat质粒，甲酸脱氢酶基因FdhD位于启动子dhat的下游，构建pET28a-dhat-FdhD质粒，pET28a-dhat-FdhD质粒的图谱如图1F所示。具体操作步骤如下：
以奥奈达希瓦式菌MR-1基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到甲酸脱氢酶基因FdhD序列，PCR引物序列如下：
Primer7:5′-CCCAAGCTTATGGAATATCATTCACATACTGTGGT-3′(含Hind III酶切位点)，
Primer8:5′-ATTTGCGGCCGCTTAAATGGCTTTCGCTAA-3′(含Not I酶切位点)；
PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，61℃30sec；延伸，72℃1min(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为800bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒pET28a-dhat和回收之后的目的片段分别用Not I和Hind III双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-FdhD质粒，将pET28a-dhat-FdhD质粒用化学转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含35μg/mL卡那霉素固体LB平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存，重组菌命名为DH5α/pET28a-dhat-FdhD；采用质粒提取试剂盒从重组菌DH5α/pET28a-dhat-FdhD中提取pET28a-dhat-FdhD质粒。
实施例5：重组肺炎克雷伯氏菌的构建
(1)肺炎克雷伯氏菌感受态细胞的制备
取保存在甘油中的肺炎克雷伯氏菌，取一环接种于固体LB无抗性培养板上37℃培养过夜；将平板上的单个菌落接种到50mL液体LB培养基中，37℃、200r/min培养12h左右；按1％的接种量接种于50mL液体LB培养基中37℃、200r/min培养，并测定OD600值，当OD600达到0.7时冰浴放置30min；然后取出培养物10mL，4℃、10000r/min离心10min收集菌体，用4℃冰浴的10％的甘油5mL洗涤菌体，离心10min，弃上清，重复洗涤两次；将菌体重悬于500μL预冷的10％的甘油中，得肺炎克雷伯氏菌感受态细胞，100μL每管分装。
(2)转化感受态细胞，制备重组菌
取实施例1制备的pET28a-dhat质粒、实施例2制备的pET28a-dhat-Dhat质粒、实施例3制备的pET28a-dhat-YqhD质粒、实施例4制备的pET28a-dhat-Dhat-FdhD质粒和pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒、对比例1制备的pET28a-dhat-FdhD质粒各10uL，取肺炎克雷伯氏菌感受态细胞90uL，将各质粒载体分别与感受态细胞混合，转入电转杯，放置冰上5min，擦拭干净后进行电转化，电击条件为1900V、5ms；取出混合液体立即加入到1mLLB液体培养基中37℃、200r/min振荡培养3-4h，然后涂布于LB固体培养基平板上37℃培养过夜。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，其中K.pneumoniae/pET28a-dhat单菌落采用实施例1中的Primer1、Primer2进行PCR扩增，鉴定结果如图2所示；K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat单菌落采用实施例2中的Primer3、Primer4进行PCR扩增，K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD单菌落采用实施例3中的Primer5、Primer6进行PCR扩增，鉴定结果如图3所示，K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD单菌落和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD单菌落采用实施例4中的Primer7、Primer8进行PCR扩增，鉴定结果如图4所示，K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD单菌落采用对比例1中的Primer7、Primer8进行PCR扩增，鉴定结果如图5所示，上述凝胶电泳图中均出现目的条带且条带单一，K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat单菌落和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD单菌落的目的片段长度约为1.2kb，K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD单菌落和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD单菌落的目的片段长度约为800bp，K.pneumoniae/pET28a-dhat单菌落的目的片段长度约为180bp，K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD单菌落的目的片段长度约为800bp，均显示菌落为阳性克隆，得阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat，将重组菌保存于-80℃。
实施例6：重组肺炎克雷伯氏菌的基因表达
将实施例5中的阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD以1％的接种量接种至50mL的含有35μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃、200rpm活化培养12h；取活化菌株1mL接入100mL含有35μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为0.6时，加入50％的甘油诱导表达，厌氧条件发酵一周。
发酵结束后，取发酵液100mL，13000rpm、4℃离心10min，收集菌体，加入10mL碳酸盐缓冲液(pH9.0)重悬菌体；超声破碎菌体细胞：超声4s，间隔1s，300W，工作10min获得粗酶液；将获得的粗酶液用SDS-PAGE电泳检测目标蛋白大小，结果如图6、图7所示，目的条带单一，其中重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD表达的1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶的蛋白大小约为41KDa，重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD表达的甲酸脱氢酶的蛋白大小约为30KDa。
其中，1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶活性的定义：当1,3-丙二醇在室温下转化为3-羟丙醛时，NAD+在340nm处消耗的微摩尔数或NADH产生的微摩尔数。比酶活性用每毫克蛋白质单位表示。
甲酸脱氢酶的酶活定义：每分钟生成1μmol NADH所需要的酶量为1个酶活单位U。
以牛血清白蛋白为标准，用Lowry等人描述的方法测定蛋白质浓度(Proteinmeasurement with the Folin phenol reagent.J Biol Chem 193:265–275)。
以野生型肺炎克雷伯氏菌为对照，测得对照组1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶活性分别为1.52U/mg和0.51U/mg；测得重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD的1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶活性分别为5.32U/mg和0.41U/mg，其1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活是对照组的3.5倍；重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD的1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶活性分别为1.93U/mg和1.66U/mg，其1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活是对照组的3.25倍。说明1,3-丙二醇氧化还原酶或其同工酶基因的插入，可以显著强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶或其同工酶。
以野生型肺炎克雷伯氏菌为对照，测得对照组基本不存在甲酸脱氢酶酶活；测得重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD的甲酸脱氢酶活性为0.414U/mg，重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD的甲酸脱氢酶活性为0.45U/mg。说明甲酸脱氢酶基因插入肺炎克雷伯氏菌后可以成功表达，表达水平也较高。
实施例7：1,3-丙二醇检测
将实施例5中的阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入种子培养基中，在37℃、200rpm培养12h得种子液；将种子液按照10％的接种量接入含有100mL发酵培养基的厌氧瓶中，每天采集一次样本，测定甘油剩余量和1,3-丙二醇产量，静置发酵一周。
将实施例5中的阳性重组肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入种子培养基中，在37℃、200rpm培养12h得种子液；将种子液按照3％的接种量接入到5L自动搅拌发酵罐中，在200r/min的转速下，向发酵罐中引入0.4vvm的氮气，以维持厌氧发酵环境，自动补加2.5mol/L氢氧化钾以调节发酵液pH为7.0，发酵温度维持为37℃。发酵方法用甘油反馈，当发酵进入对数生长期(7h)，每2小时采集一次样本，测定1,3-丙二醇产量，发酵时间为29h。
其中，种子培养基组成(/L)：柠檬酸0.42g，甘油20.0g，(NH4)2SO4 2g，FeSO4·7H2O5×10-3g，KH2PO4 1.3g，CaCl2 2×10-3g，K2HPO4 3.4g；MgSO4·7H2O 0.2g，酵母浸粉1.0g，微量元素B液2mL；
发酵培养基组成(/L)：柠檬酸0.42g，甘油50.0g，Na2SO4 0.28g，NaH2PO4 1.38g，CaCl2·2H2O 0.29g，(NH4)2SO4 6.6g，KCl 0.75g，MgCl2·6H2O 0.26g，酵母浸粉1.0g，微量元素A液5mL；
微量元素A液组成(/L)：H3BO3 0.06g，CuCl2·2H2O 0.17g，CoCl2·6H2O 0.47g，ZnCl2·6H2O 0.68g，MnCl2·4H2O 2.0g，Na2MoO4·2H2O 0.005g，FeCl3·6H2O 5.4g；
微量元素B液组成(/L)：CuCl2·2H2O 0.02g，CoCl2·6H2O 0.2g，ZnCl2 0.07g，NiCl2·6H2O 0.025g，Na2MoO4·2H2O 0.035g，H3BO3 0.06g，MnCl2·4H2O 0.1g。
分别取上述发酵结束后的发酵液，采用气相色谱法测定发酵液中1,3-丙二醇的含量。气相色谱条件为：氢火焰离子化检测器、填充材料GDX-401，2m×Φ3mm填充柱。色谱条件：N2为载气，柱温230℃，检测器温度250℃，入口温度260℃，载气(氮气)流速40mL/min，每次进样量1μL。1,3-丙二醇的保留时间为2.5min，利用外标法来计算1,3-丙二醇的浓度，结果见图8和图9。
测定厌氧瓶发酵一周发酵液中的甘油剩余量，甘油剩余量测量方法：采用改进的高锰酸钾氧化法测定发酵液中甘油的残留量；实验原理：用过量的高碘酸钠溶液氧化甘油，甘油被氧化成甲酸和甲醛。滴加过量的高碘酸溶液能够使甘油完全被氧化，再用乙二醇中和高碘酸生成甲醛，用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定生成甲酸，可以通过消耗的0.1mol/L标准NaOH溶液计算发酵液中甘油的剩余量，结果见图10。
厌氧瓶发酵一周后重组菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD和K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD产1,3-丙二醇浓度分别可达29.704g/L和24.058g/L，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率分别达到84％和74.99％。分批补料发酵29h后K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD菌株的最高产量为77.18g/L，比野生型菌株(38.99g/L)提高了97.93％；K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD菌株的产量为56.11g/L，比野生型菌株(38.99g/L)提高了43.89％。K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD菌株的产量为53.78g/L，比野生型菌株(38.99g/L)提高了37.92％；K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat菌株和K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD菌株最终浓度分别为43.01g/L和44.82g/L，1,3-丙二醇产量与野生菌(38.99g/L)相差不大，产量分别提高了10.3％和14.95％。5株重组菌株K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat、K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD、K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD和K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD的发酵强度分别为1.55g/(L·h)、1.48g/(L·h)、1.85g/(L·h)、2.34g/(L·h)和1.93g/(L·h)，甘油转化率分别为47.18％、46.91％、59.7％、75.84％和61.02％。上述结果，尤其是重组菌株K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD的增产量高于重组菌株K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD和K.pneumoniae/pET28a-dhat-FdhD增产量之和，表明了YqhD/Dhat和FdhD两个基因的共表达进一步促进了3-羟基丙醛向1,3-丙二醇的转化，从而提高了1,3-丙二醇的产量。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种高效生产1,3-丙二醇基因工程菌及其构建方法与应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1164
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 1
atgagctatc gtatgtttga ttatctggtg ccaaacgtta acttttttgg ccccaacgcc 60
atttccgtag tcggcgaacg ctgccagctg ctggggggga aaaaagccct gctggtcacc 120
gacaaaggcc tgcgggcaat taaagatggc gcggtggaca aaaccctgca ttatctgcgg 180
gaggccggga tcgaggtggc gatctttgac ggcgtcgagc cgaacccgaa agacaccaac 240
gtgcgcgacg gcctcgccgt gtttcgccgc gaacagtgcg acatcatcgt caccgtgggc 300
ggcggcagcc cgcacgattg cggcaaaggc atcggcatcg ccgccaccca tgagggcgat 360
ctgtaccagt atgccggaat cgagaccctg accaacccgc tgccgcctat cgtcgcggtc 420
aacaccaccg ccggcaccgc cagcgaggtc acccgccact gcgtcctgac caacaccgaa 480
accaaagtga agtttgtgat cgtcagctgg cgcaacctgc cgtcggtctc tatcaacgat 540
ccgctgctga tgatcggtaa accggccgcc ctgaccgcgg cgaccgggat ggatgccctg 600
acccacgccg tagaggccta tatctccaaa gacgctaacc cggtgacgga cgccgccgcc 660
atgcaggcga tccgcctcat cgcccgcaac ctgcgccagg ccgtggccct cggcagcaat 720
ctgcaggcgc gggaaaacat ggcctatgct tctctgctgg ccgggatggc tttcaataac 780
gccaacctcg gctacgtgca cgccatggcg caccagctgg gcggcctgta cgacatgccg 840
cacggcgtgg ccaacgctgt cctgctgccg catgtggccc gctacaacct gatcgccaac 900
ccggagaaat tcgccgatat tgctgaactg atgggcgaaa atatcaccgg actgtccact 960
ctcgacgcgg cggaaaaagc catcgccgct atcacgcgtc tgtcgatgga tatcggtatt 1020
ccgcagcatc tgcgcgatct gggggtaaaa gaggccgact tcccctacat ggcggagatg 1080
gctctgaaag acggcaatgc gttctcgaac ccgcgtaaag gcaacgagca ggagattgcc 1140
gcgattttcc gccaggcatt ctga 1164
<210> 2
<211> 1164
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60
ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120
gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180
gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240
gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300
accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360
caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420
gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480
caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540
tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600
gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660
ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720
cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780
ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840
cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900
cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960
gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020
acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080
gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140
cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164
<210> 3
<211> 837
<212> DNA
<213> Shewanclla oneidenisi
<400> 3
atggaatatc attcacatac tgtggtcacg gaaagaaaag tgaccctttt agagcaggga 60
caggcatcgg atctgaccga ttatgtcgcc aacgaggtgc gtgtggcact ggtgtacaac 120
ggcatttccc acactgtgat gttagccagt cccgaaaacc tcgaagagtt cgccattggc 180
tttaccttgt cggagcggat tgtttcccat gtgaatgaaa tcaaaggtgt ggatcttgag 240
ttcactcccg aaggcgtgct cattcaagtg gaaatcaccc aaagatgttt tatggcgctt 300
aagcagctgc ggcgtaatat ggcggggcgg actggctgtg gactctgtgg cgttgcccag 360
cttgaagaag cggtaaaacc cgtgatccgc gttgactcgg atgccagatt taatatcgat 420
catctccagt ttgccctcga gcaagtcaaa gataatcagc atcactttaa gctcacaggg 480
gcgacccatg ctgccatggg tttagatcta gagggacaga ttatcgccgc ctatgaggac 540
attggtcggc acattgcact ggataaatta atcggtggat gctcaatgcg gcacgctaag 600
cgacctgtgg ccgtattgct taccagccgt gccagtttcg aaatggtgca aaaggccgcc 660
agtgccaata tccaaattct gtttgctatg tccgccgtga cttcactggc gttggaatta 720
gcagagaaaa gcaacatcac gcttatcggt ttttgtcgta acggcagagc cacgctttac 780
acccatggct atcggctatt ggggctgaat cgtgccagct tagcgaaagc catttaa 837

Claims (6)

1.一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌，所述基因工程菌同时强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶，所述基因工程菌为重组的肺炎克雷伯氏菌，其特征在于，所述1,3-丙二醇氧化还原酶为来自大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶，其编码基因为YqhD，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述甲酸脱氢酶为来自奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶，其编码基因为FdhD，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
（1）将载体质粒pET28a上的T7启动子替换为肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat，构建表达载体pET28a-dhat；
（2）将大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD插入pET28a-dhat，构建表达载体pET28a-dhat-YqhD；
（3）将奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶基因FdhD插入pET28a-dhat-YqhD，构建表达载体pET28a-dhat-YqhD-FdhD；
（4）将表达载体pET28a-dhat-YqhD-FdhD转化进肺炎克雷伯氏菌，挑选阳性重组子，得基因工程菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌构建所用的表达载体中1,3-丙二醇氧化还原酶基因位于甲酸脱氢酶基因的上游，1,3-丙二醇氧化还原酶基因的表达采用肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活是出发菌株的3.25倍，所述甲酸脱氢酶的酶活为0.45U/mg。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，其构建方法具体包括如下步骤：
（1）以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat序列，PCR引物序列如下：
Primer1:5′-CGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGA-3′，含BglII酶切位点，
Primer2:5′-CCCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′，含Sac I酶切位点；
PCR扩增程序：预变性，95℃ 5min；变性，95℃ 30sec，退火，60℃ 30sec，延伸，72℃30sec，30个循环；终止延伸，72℃ 10min；最后4℃保温；
将载体质粒pET28a和PCR扩增产物分别用BglII和Sac I双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat质粒；
（2）以大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD序列，PCR引物序列如下：
Primer5:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAACAACTTTAATCTGCACACCC-3′，含Sac I酶切位点，
Primer6:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGCGGGCGGCTTCGTA-3′，含Hind III酶切位点；
PCR扩增程序：预变性，95℃ 5min；变性，95℃ 30sec，退火，70℃30sec，延伸，72℃90sec，30个循环；终止延伸，72℃ 10min；最后4℃保温；
将PCR扩增产物和步骤（1）得到的载体质粒pET28a-dhat分别用Sac I和Hind III双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-YqhD质粒；
（3）以奥奈达希瓦式菌MR-1基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到甲酸脱氢酶基因FdhD序列，PCR引物序列如下：
Primer7:5′-CCCAAGCTTATGGAATATCATTCACATACTGTGGT-3′，含Hind III酶切位点，
Primer8:5′-ATTTGCGGCCGCTTAAATGGCTTTCGCTAA-3′，含Not I酶切位点；
PCR扩增程序：预变性，95℃ 5min；变性，95℃ 30sec，退火，61℃30sec，延伸，72℃1min，30个循环；终止延伸，72℃ 10min；最后4℃保温；
将PCR扩增产物和步骤（2）得到的载体质粒pET28a-dhat-YqhD分别用Not I和Hind III双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒；
（4）将步骤（3）得到的pET28a-dhat-YqhD-FdhD质粒电转化肺炎克雷伯氏菌感受态细胞，挑选阳性重组子，得基因工程菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD。
5.权利要求1所述的基因工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇，生产工艺如下：
将权利要求1所述的基因工程菌在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入种子培养基中，在37℃、200r/min培养12h，按照3%~10%的接种量接入发酵培养基中，37℃厌氧发酵生产1,3-丙二醇；
其中，每升种子培养基组成为：柠檬酸0.42g，甘油20.0g，FeSO4·7H2O 5×10-3g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 3.4g，CaCl2 2×10-3g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1.3g；酵母浸粉1.0g，微量元素B液2mL；
每升发酵培养基组成为：柠檬酸0.42g，甘油 50.0g，(NH4)2SO4 6.6g，CaCl2·2H2O0.29g，KCl 0.75g，MgCl2·6H2O0.26g，Na2SO4 0.28g，NaH2PO4 1.38g，酵母浸粉1.0g，微量元素A液5mL；
每升微量元素A液组成为：H3BO3 0.06g，CuCl2·2H2O 0.17g，CoCl2·6H2O0.47g，MnCl2·4H2O 2.0g，Na2MoO4·2H2O 0.005g，ZnCl2·6H2O 0.68g，FeCl3·6H2O 5.4g；
每升微量元素B液组成为： NiCl2·6H2O 0.025g，CoCl2·6H2O 0.2g，CuCl2·2H2O0.02g，Na2MoO4·2H2O 0.035g，H3BO3 0.06g，ZnCl2 0.07g，MnCl2·4H2O 0.1g。
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