CN117165543A - 一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents
一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117165543A CN117165543A CN202311104588.0A CN202311104588A CN117165543A CN 117165543 A CN117165543 A CN 117165543A CN 202311104588 A CN202311104588 A CN 202311104588A CN 117165543 A CN117165543 A CN 117165543A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- yahk
- dehydrogenase
- mutant
- alcohol dehydrogenase
- alcohol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 48
- HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N furfural Chemical compound O=CC1=CC=CO1 HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 120
- XPFVYQJUAUNWIW-UHFFFAOYSA-N furfuryl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CO1 XPFVYQJUAUNWIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 106
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 72
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 29
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims abstract description 25
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 13
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical group Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 11
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 11
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 11
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 7
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 5
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 57
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 57
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 abstract description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- 101100319874 Escherichia coli (strain K12) yahK gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 102220089846 rs183533911 Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000201986 Cassia tora Species 0.000 description 1
- 235000014552 Cassia tora Nutrition 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用，所述的醇脱氢酶突变体是在醇脱氢酶YahK的第208位谷氨酸和209位丙氨酸分别突变为丙氨酸和精氨酸而获得。突变体YahK‑E208A/A209R在催化糠醛还原生成糠醇反应中具备了更高的催化活力。以表达突变体YahK‑E208A/A209R的湿菌体为生物催化剂，以500mM糠醛作为底物，以500mM的葡萄糖做为辅底物，以葡萄糖脱氢酶为辅助酶，以NADPH作为辅酶构建反应体系，在30℃、600rpm条件下反应6h，糠醇得率达93.87％，是野生型酶YahK的1.48倍。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及一种醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R及其催化糠醛合成糠醇的应用。
(二)背景技术
生物质资源作为自然界中碳基可再生资源，来源丰富、成本低廉，是可持续生产化学品和燃料的最佳原料。基于纤维素和半纤维素的水解，最终可以实现向高附加值的生物质基平台分子的转化。其中含有呋喃环的糠醛是连接生物质资源与高附加值化学品的桥梁。在糠醛的还原产物中，糠醇是最重要的下游产物之一，可广泛应用于化工行业，具有重要的经济价值和实际意义。
醇脱氢酶催化糠醛还原生成糠醇需要辅酶的参与，而辅酶NAD(H)或NADP(H)价格较昂贵。两种辅酶相比而言，辅酶NADP(H)的价格约为辅酶NAD(H)偏好型的5倍，并且更不稳定。底物糠醛具有活泼的醛官能团，大多数的醇脱氢酶不耐受高浓度的糠醛。利用蛋白质工程技术改造醇脱氢酶，提高其催化活力，使其在还原高浓度糠醛时具备更高的催化活力，有助于降低实际生产过程中的经济成本。另外通过构建辅酶再生系统可以有效解决氧化还原反应中辅酶需求的问题，保证辅酶的持续供给。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其在催化糠醛还原生成糠醇中的应用，本发明选取源自E.coli的YahK基因作为研究对象，通过序列分析，成功获得催化活力得到了明显提高的突变体YahK-E208A/A209R。醇脱氢酶YahK在催化糠醛还原生成糠醇时更偏好辅酶NADP(H)，利用NADP(H)合成糠醇的得率为63.45％，而改造获得的醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R利用辅酶NADP(H)在催化500mM糠醛还原生成糠醇的反应中，得率为93.87％，是野生型的1.48倍。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体(记为YahK-E208A/A209R)，所述醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第208位谷氨酸突变为丙氨酸，同时209位丙氨酸突变为精氨酸获得的。所述醇脱氢酶双突变体YahK-E208A/A209R的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种所述醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
本发明还涉及一种含所述醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R编码基因的重组载体及所述重组载体构建的基因工程菌。所述重组载体以pET28a为基础载体，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
所述基因工程菌由如下方法得到：以质粒pET28a-YahK为模板，利用带有突变碱基的引物经过反向PCR扩增全质粒，得到的PCR产物经DpnⅠ酶消化甲基化的模板，酶切产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可得到所述含醇脱氢酶突变体YahK-E208A基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A，其中含重组醇脱氢酶突变体编码基因的质粒命名为pET28a-YahK-E208A。类似地，以质粒为pET28a-YahK-E208A模板，在209位点引入A209R突变，获得重组质粒pET28a-YahK-E208A/A209R及对应的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R。
此外，本发明还提供一种所述醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R在催化糠醛还原生成糠醇中的应用，所述应用为：将含醇脱氢酶突变体编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以糠醛为底物，加入NADPH、辅助酶和辅底物，以pH 4-9缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-50℃、500 -800rpm条件下反应完全后(优选30℃、600rpm条件下反应6h)，获得含糠醇反应液，反应液分离纯化获得糠醇；所述辅助酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶；所述辅底物包括葡萄糖、异丙醇、甲酸钠；所述辅酶和辅底物构成辅酶体系：葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系、异丙醇脱氢酶/异丙醇体系、甲酸脱氢酶/甲酸钠体系。所述催化剂与辅助酶质量比为0.5-2.5:1，优选2:1。
进一步，所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体计20-100g/L，优选80g/L，所述底糠醛酸加入量为300-500mM，优选500mM，NADPH加入量为0.1-0.5mM，优选0.2mM；辅底物与底物浓度比为0.5-2.5:1，优选1：1。
进一步，所述葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶各自以含相应编码基因工程菌经发酵培养获得湿菌体形式加入，所述湿菌体加入量均为20-100g/L，优选40g/L；所述葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9。
进一步，所述反应介质为pH为7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液。
进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8-12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，24℃、200rpm诱导过夜，诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
所述葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶各自以含相应编码基因工程菌经发酵培养获得湿菌体，制备方法同含醇脱氢酶突变体编码基因的工程菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R与野生型YahK相比，催化糠醛还原生成糠醇的活力明显提高。以表达突变体YahK-E208A/A209R的湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R为生物催化剂，以糠醛500mM作为底物、0.2mM NADPH作为辅酶，选择葡萄糖脱氢酶/葡萄糖循环体系，在30℃、600rpm条件下反应6h，糠醇的得率可达93.87％，是野生型的1.48倍。
(四)附图说明
图1为醇脱氢酶催化糠醛合成糠醇示意图。
图2为YahK及其突变体PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；泳道M，Marker；泳道1-14，YahK，V39L，K176E，C107I，Y114W，A159D，T162Q，K177R，T205N，S207K，E208A，S225Q，M293F，A209R。
图3为YahK及其突变体湿菌体的SDS-PAGE检测；泳道M，Marker；泳道1-14，YahK，V39L，K176E，C107I，Y114W，A159D，T162Q，K177R，T205N，S207K，E208A，S225Q，M293F，A209R。
图4为醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R编码基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为marker；泳道1为醇脱氢酶YahK编码基因；泳道2为醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R编码基因。
图5为醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R的SDS-PAGE图；泳道M为marker；泳道1为未经诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK菌液；泳道2为诱导后E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK湿菌体，泳道3为诱导后醇脱氢酶YahK分离纯化所得纯酶液，泳道4为醇脱氢酶突变体YahK-Y114W分离纯化所得纯酶液，泳道5为醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R分离纯化所得纯酶液。
图6为BCA法测蛋白质浓度标准曲线。
图7为糠醇和糠醛标准品的GC检测图谱。
图8为三种辅助酶诱导表达后湿菌体的SDS-PAGE图；泳道M为marker；泳道1，E.coli BL21(DE3)/pET28a-ADH；泳道2，E.coli BL21(DE3)/pET28a-CtFDH；泳道3，E.coliBL21(DE3)/pET28a-BmGDHM6。
图9为反应温度对YahK-E208A/A209R催化糠醛转化率的影响。
图10为pH对YahK-E208A/A209R催化糠醛转化率的影响。
图11为NAD+添加量YahK-E208A/A209R催化糠醛转化率的影响。
图12为糠醛和葡萄糖的浓度比YahK-E208A/A209R催化糠醛转化率的影响。
图13为醇脱氢酶和辅助酶的比对YahK-E208A/A209R催化糠醛转化率的影响。
图14为醇脱氢酶YahK及其突变体YahK-E208A/A209R催化糠醛还原反应过程底物转化率曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK的构建与培养
利用TaKaLa基因组DNA提取试剂盒获得大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组。随后利用引物YahK-F和YahK-R进行PCR扩增，获得醇脱氢酶YahK编码基因(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。利用“一步克隆”试剂盒，将获得的醇脱氢酶YahK编码基因插入到pET28a线性化载体的BamH I和Xho I位点，得到重组质粒pET28a-YahK。将重组质粒pET28a-YahK转入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK。构建完成的基因工程菌经提取质粒测序验证正确后，表明醇脱氢酶基因插入无误。重组菌株接种于含100μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上划线分离，37℃培养过夜，获得单菌落。挑取单菌落于50mL含100μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下过夜培养，获得种子液。将新鲜的种子液按照1:1的体积比加入40％的甘油，放入-80℃超低温冰箱进行保藏。
将菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。取5μL的保藏菌液在含100μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上划线，在恒温培养箱中37℃下培养12h进行活化。挑取单菌落至50mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃下放置在200rpm振荡培养箱中12小时后取菌液进行测序。通过测序鉴定无误，获得的种子液即为E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK的基因工程菌种子液，从E coli BL21(DE3)/pET28a-YahK菌液提质粒pET28a-YahK。
LB液体培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0～7.5。
LB固体培养基是在LB液体培养基中添加20g/L琼脂。
YahK-F：
5’-CAAATGGGTCGCGGATCCATGAAGATCAAAGCTGTTGGTGC-3’；
YahK-R：
5’-GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTCTGTTAGTGTGCGATTATCG-3’。
实施例2：醇脱氢酶YahK突变体的理性设计及关键位点确认
醇脱氢酶YahK(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)来源于E.coli，其核苷酸序列长为1050bp，对应氨基酸序列长为350aa，蛋白分子量约为37.98kDa。醇脱氢酶YahK已有晶体结构，以此为基础进行建模。将醇脱氢酶YahK模型与糠醛和NADPH分别进行对接，并在Pymol中对模型进行可视化分析，确定辅酶结合位点，分别为V39、C107、Y114、A159、T162、K176、K177、T205、S207、E208、A209、S225、M293共13个氨基酸残基。
对辅酶结合位点逐一进行突变，替换氨基酸残基所用引物如表1所示。
表1构建突变文库的全质粒PCR引物
以质粒pET28a-YahK为模板、采用表1上下游引物和表2的PCR体系，在特定的PCR程序扩增，得到对应编码基因。PCR扩增程序：95℃预变性5min；之后以95℃变性15s，60℃复性15s，72℃保持80s为一个循环，重复这样循环30次；最后，72℃保持5min。
表2全质粒突变的PCR体系
扩增结束后，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外光下可见8000bp处有明亮的条带，条带与质粒的理论值相符，结果如图2所示。
将目的片段直接转化到宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(D3)：取100μL E.coli BL21(D3)感受态放于冰上融化，加入终浓度30ng/μL突变PCR产物。然后在含100μg/mL的kan抗性的LB固体培养基上涂布，并在37℃的生化培养箱中倒置过夜培养。即得到大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-M，M代表突变子。
采用实施例4方法诱导表达上述BL21(DE3)/pET-28-YahK-M突变子，用SDS-PAGE电泳实验验证表达效果，结果如图3所示，YahK蛋白分子量约为37.98kDa，各突变菌株表达的蛋白条带加粗明显且条带位置在40kDa左右，大小正确。
为验证不同突变子的活力，采用实施例4方法制备YahK及突变体YahK-M粗酶液，采用实施例5方法进行粗酶活力测定。突变子的活力筛选获得了两个活力显著提高的突变子YahK-E208A和YahK-A209R。YahK粗酶利用NADPH比酶活为0.75U/mg，突变子YahK-E208A粗酶利用NADPH比酶活为0.93U/mg，突变子YahK-A209R粗酶利用NADPH比酶活为0.91U/mg，分别比野生型YahK比酶活提高了0.18U/mg和0.16U/mg。
单点突变得到的突变子YahK-E208A和YahK-A209R都明显的提高辅酶NADPH的转化率，为了进一步提高其酶活力，将YahK-E208A和YahK-A209R突变子迭代获得YahK-E208A/A209R。经酶活力测定，迭代突变子YahK-E208A/A209R酶活力大幅度提高，达到3.02U/mg。
实施例3：重组表达质粒pET28a-YahK-E208A/A209R与基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R的构建。
1、重组表达质粒pET28a-YahK-E208A/A209R
以实施例1制备的质粒pET28a-YahK为模板，采用引物E208A-F/R和表3的PCR体系，利用反向PCR扩增出全质粒，转化于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，提取质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，成功得到突变质粒pET28a-YahK-E208A。
以突变质粒pET28a-YahK-E208A为模板，采用引物A209R-F/R和表3的PCR体系，利用反向PCR技术克隆出全质粒，转化于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。提取质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，成功得到突变质粒pET28a-YahK-E208A/A209R，突变体YahK-E208A/A209R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
引物如下：
E208A-F：5’-ACCACTTCTGCGGCAAAACGCGAAGC-3’；
E208A-R：5’-GCGTTTTGCCGCAGAAGTGGTAAATGCCACC-3’。
A209R-F：5’-ACTTCTGCGCGCAAACGCGAAGCGGC-3’；
A209R-R：5’-TTCGCGTTTGCGCGCAGAAGTGGTAAATG-3’。
反向PCR扩增体系见表1所示。
表3 PCR扩增反应体系
PCR反应进程为：预变性：95℃，5min；完全变性：95℃，15s；退火：62℃，15s；延伸：72℃，90S；30次循环；再次延伸：72℃，5min；降至4℃保温。吸取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。如图4所示，电泳完成后放在紫外光下观察可见8000bp处有明亮条带，且与质粒理论值相符合。
2、基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R
PCR产物经37℃酶切1h去除甲基化的模板，酶切体系如表4所示。
表4 PCR产物中甲基化模板的消化体系
DpnⅠ酶切后的PCR产物(质粒所携带的突变体基因YahK-E208A/A209R的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示)，直接转化表达宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R。转化子经菌落PCR验证后接入含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，离心收集菌体，提取质粒，送去测序。测序结果经软件分析氨基酸序列，第208位谷氨酸和209丙氨酸成功突变为丙氨酸和精氨酸。
实施例4：醇脱氢酶YahK及其突变体YahK-E208A/A209R的诱导表达及分离纯化
分别将含醇脱氢酶YahK编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK、含醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8-12h，获得种子液。将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，24℃诱导过夜，诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
将上述湿菌体按1g湿菌体加20mL Tris-HCL缓冲液(pH 7.0、50mM)的比例加入适量Tris-HCL缓冲液(pH 7.0、50mM)，在400W下超声破碎10min(工作1s，间歇3s)后，破碎液于4℃和8000rpm下离心10min，重复离心三次后得到上清，即为粗酶液。
按照Ni-NTA金属螯合亲和层析(购自Bio-Rad公司，简称Ni2+柱，柱内径1.6cm，柱高15cm)使用说明，取粗酶液15mL上样至预平衡Ni2+柱中，再依次用含5mM咪唑、50mM咪唑、100mM咪唑、200mM咪唑、500mM咪唑的洗脱液(洗脱液组成：相应浓度的咪唑、300mM的氯化钠，溶剂为50mM的Tris-HCL缓冲液，pH 6.0)洗脱杂蛋白和目的蛋白，洗脱速度均为2.0mL/min，每个浓度洗脱液洗脱3个柱体积，收集含200mM咪唑的洗脱液对应的流出液，并用截留分子量为10kDa的超滤管在4℃和5000rpm下离心30min进行脱盐浓缩，取截留液即YahK和YahK-E208A/A209R纯酶液，存于-20℃备用。
醇脱氢酶YahK及其突变体YahK-E208A/A209R纯酶液的纯度经SDS-PAGE凝胶电泳验证，SDS-PAGE电泳结果如图5所示。醇脱氢酶YahK突变体YahK-E208A/A209R经SDS-PAGE电泳后为单一条带。醇脱氢酶YahK突变体YahK-E208A/A209R的亚基理论大小为37.98kDa左右，其在SDS-PAGE电泳上的表观大小符合理论分子量。
实施例5：醇脱氢酶YahK及其突变体YahK-E208A/A209R的酶活力与动力学参数测定
1、测定蛋白浓度标准曲线
采用BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒测定粗酶液的蛋白浓度。该方法主要是利用蛋白质在碱性条件下将Cu2+还原为Cu+，该离子可以与BCA试剂盒中的A液形成紫色络合物，该络合物在562nm下有吸光性且有良好的线性关系。
标准曲线：根据BCA试剂盒说明书，按BCA Reagent A比BCA Reagent B为50：1的体积比列混匀，配制BCA工作液。在酶标板的孔中加入200μL的BCA工作液，再加入20μL适量稀释的BCA蛋白。每个样品进行3组平行。振荡混匀后将酶标板放入37℃的培养箱中保温30min。在酶标仪的A562下进行检测，确定其吸光值。以蛋白浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线，线性关系的公式为y＝0.0011x+0.1648，标准偏差为R2＝0.999，如图6所示。
蛋白浓度测定方法如下：将待测蛋白样品用超纯水稀释至符合标准曲线线性范围，20μL稀释样品加入200μL BCA工作液；振荡混匀，37℃放置30min；用酶标仪测定562nm处的吸光值，根据吸光值结果和蛋白标曲，计算出样品的蛋白含量。
2、酶活力测定方法
醇脱氢酶的酶活力是通过使用酶标仪的单因子动力学方法测定辅酶(NADPH或NADH)在340nm处吸光值的下降来计算。酶活检测体系：10mM底物，0.1mM辅酶(NADPH或NADH)，1μL纯酶液，用pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液补足300μL，该体系加入酶标板中，于30℃下孵育5min后检测340nm处吸光值，根据公式1计算体积酶活，根据公式2计算比酶活。每次做三组平行试验。结果如表5所示。经过纯化后的YahK蛋白浓度为10.2mg/mL，使用辅酶NADPH测比酶活为5.28U/mg。YahK-E208A/A209R蛋白浓度为9.6mg/mL，使用辅酶NADPH测比酶活为9.58U/mg，比改造前YahK比酶活提高了4.3U/mg，利用辅酶NADPH/NADH时酶活的比值由1.84提高到3.61，大幅度提高了YahK的酶活力。
酶活力单位U定义为温度为30℃时，1分钟内转化1μmol的辅酶(NADPH或NADH)为辅酶(NADP+或NAD+)所需的酶量。
醇脱氢酶的体积酶活和比酶活计算公式如下：
△A表示吸光度变化值；t表示反应时间min；L表示光程cm；V1表示体系体积mL；V2表示酶液体积mL。
表5纯酶酶活力测定
3、对YahK和YahK-E208A/A209进行动力学参数测定。
在不同浓度(0.3mM、0.5mM、1mM、2mM、10mM、12mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、100mM)的糠醛下测醇脱氢酶及其突变体的酶活，以糠醛浓度为横坐标，以酶活为纵坐标，用PrismDemo软件进行拟合计算。由于YahK和YahK-E208A/A209在高糠醛浓度时活性会下降，故按底物抑制动力学拟合，结果如表6所示。对于野生型YahK，以NADPH为辅因子时kcat/Km为27.32s-1·mM-1。突变体YahK-E208A/A209R以NADPH为辅因子时kcat/Km为42.44s-1·mM-1是以NADH为辅因子时的2.95倍左右。这种变化进一步表明突变体YahK-E208A/A209R利用NADPH作为辅酶时具有更高酶活力。
表6 YahK和YahK-E208A/A209R的动力学参数
实施例6：酶法催化糠醛生成糠醇过程的GC分析
利用气相色谱法检测糠醛转化为糠醇的催化效果。气相色谱仪型号为SHMADZUGC-2014，气相柱型号BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；FID检测器为250℃；N2作为载气，载气流量为1mL/min；分流比为1:20；进样量1.0μL；进样口温度为250℃。
糠醛和糠醇升温程序：80℃下保持9min，以10℃/min的速度升温至190℃，共20min。糠醇和糠醛的保留时间分别为8.4min和9.0min。取适量反应液离心去除菌体，上清液加入800μL乙酸乙酯萃取。萃取结束取上层有机相500μL加入适量无水硫酸钠除水，取100μL上清液于干净的气相瓶，利用气相色谱检测样品中糠醛和糠醇的含量。
底物糠醛和产物糠醇标准品的气相色谱图见图7所示。
底物转化率＝参与反应的底物量/底物总量。
实施例7：三种辅酶循环辅助酶的培养及诱导表达
分别将辅助酶葡萄糖脱氢酶BmGDHM6(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、异丙醇脱氢酶ADH(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)和甲酸脱氢酶CtFDH(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQID NO.10所示)编码基因插入到pET28a载体的BamH I和Xho I位点，得到对应的重组质粒。分别将重组质粒转入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，得到对应的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-BmGDHM6、E.coli BL21(DE3)/pET28a-ADH和E.coli BL21(DE3)/pET28a-CtFDH。构建完成的基因工程菌经提取质粒测序验证正确后，表明醇脱氢酶基因插入无误。基因工程菌于含100μg/mL Kan的LB固体培养基上划线分离，37℃培养过夜，获得单菌落。挑取单菌落于50mL含100μg/mL Kan的LB培养基中，在37℃、200rpm条件下过夜培养，获得种子液。将新鲜的种子液按照1:1的体积比加入40％的甘油，放入-80℃超低温冰箱进行保藏。
将于-80℃保藏的E.coli BL21(DE3)/pET28a-BmGDHM6与E.coli BL21(DE3)/pET28a-ADH和E.coli BL21(DE3)/pET28a-CtFDH菌种甘油管，解冻后取10μL菌液分别划线接种于含100μg/mL Kan的LB平板上，并倒置于37℃恒温培养箱培养12～16h。然后挑选单菌落于含100μg/mL Kan的50mL LB液体培养基，37℃、200rpm过夜培养获得种子液。诱导表达与菌体收集同实施例4一致，诱导表达湿菌体的SDS-PAGE分析如图8所示，分别获得葡萄糖脱氢酶BmGDHM6湿菌体、异丙醇脱氢酶ADH湿菌体、甲酸脱氢酶CtFDH湿菌体，保存于-20℃冰箱备用。
葡萄糖脱氢酶/葡萄糖辅酶循环体系：糠醛终浓度500mM，实施例3方法制备的醇脱氢酶YahK或醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R湿菌体终浓度60g/L，葡萄糖脱氢酶BmGDHM6湿菌体终浓度60g/L，葡萄糖终浓度500mM，辅酶NADP+终浓度0.2mM，最后添加Tris-HCl缓冲液(pH为7.0，50mM)构成反应体系10mL，通过滴加1M NaOH维持pH在pH 7.0，于600rpm和30℃水浴下反应6h。取样200μL反应液，利用实施例6气相色谱检测样品中糠醛和糠醇的含量，计算底物转化率，结果见表7所示。
异丙醇脱氢酶/异丙醇辅酶循环体系：糠醛终浓度500mM，实施例3方法制备的醇脱氢酶YahK或醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R湿菌体终浓度60g/L，异丙醇脱氢酶ADH湿菌体终浓度60g/L，异丙醇终浓度500mM，辅酶NADP+终浓度0.2mM，最后添加Tris-HCl缓冲液(pH为7.0，50mM)构成反应体系10mL，通过滴加0.5MHCl维持pH在pH 7.0。于600rpm和30℃水浴下反应6h。取样200μL反应液，利用实施例6气相色谱检测样品中糠醛和糠醇的含量，计算底物转化率，结果见表7所示。
甲酸脱氢酶/甲酸钠辅酶循环体系：糠醛终浓度500mM，实施例3方法制备的醇脱氢酶YahK或醇脱氢酶突变体YahK-E208A/A209R湿菌体终浓度60g/L，甲酸脱氢酶CtFDH湿菌体终浓度60g/L，甲酸钠终浓度500mM，辅酶NADP+终浓度0.2mM，最后添加Tris-HCl缓冲液(pH为7.0，50mM)构成反应体系10mL，通过滴加0.5MHCl维持pH在pH 7.0。于600rpm和30℃水浴下反应6h。取样200μL反应液，利用实施例6气相色谱检测样品中糠醛和糠醇的含量，计算底物转化率，结果见表7所示。
以突变体YahK-E208A/A209优选辅酶循环体系，结果如表7所示。突变体YahK-E208A/A209催化转化率较高的是葡萄糖脱氢酶循环体系，异丙醇脱氢酶次之，甲酸脱氢酶催化效果最差。考虑转化效果、辅底物的价格、再生酶的稳定性以及副产物的分离等方面的因素，选择葡萄糖脱氢酶循环体系。
表7不同辅酶循环体系转化率比较
实施例8：醇脱氢酶突变子YahK-E208A/A209催化糠醛还原生成糠醇的最适反应温度
反应体系：糠醛终浓度500mM，醇脱氢酶突变子YahK-E208A/A209湿菌体和葡萄糖脱氢酶BmGDHM6湿菌体终浓度均为60g/L，糠醛与葡萄糖浓度比为1：1，辅酶NADP+终浓度0.2mM，最后添加Tris-HCl缓冲液(pH为7.0，50mM)补充至10mL，通过滴加1M NaOH维持pH在pH 7.0，于600rpm和20-50℃(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃)水浴下反应6h。取样200μL反应液，离心去除菌体，上清液加入800μL乙酸乙酯萃取。萃取结束取上层有机相500μL加入适量无水硫酸钠除水，取100μL上清液于干净的气相瓶，利用实施例6气相色谱检测样品中糠醛和糠醇的含量。
结果如图9所示，反应温度为30℃转化率最高，达到了92％。在30-35℃的温度范围内，突变子均能够保持较高的活性，催化反应温度到达45℃时，糠醛的转化率急剧下降。所以将该反应体系的温度确定为30℃。
实施例9：醇脱氢酶突变子YahK-E208A/A209催化糠醛还原生成糠醇的最适反应pH
将实施例8温度设为30℃，反应pH范围为4.0-9.0，配制pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的缓冲液。反应过程中利用pH自动控制加液系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1MNaOH溶液，其他操作同实施例8。结果如图10所示，当pH为4.0-7.0，转化率随着pH升高而升高。当pH为7.0时，反应6h，YahK-E208A/A209R对糠醛的转化率为92.2％，pH超过7.0时，酶活力明显下降，pH到达9.0时转化率几乎为零，所以将反应体系的pH选定为7.0。
实施例10：醇脱氢酶突变子YahK-E208A/A209催化糠醛还原生成糠醇的最适辅酶添加量
将实施例8温度设定为30℃，辅酶NADP+终浓度设为0-0.5mM(选取0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mM)，其他操作同实施例8。结果如图11所示，当不添加NADP+时，糠醛的转化率为15.26％，验证了大肠杆菌细胞中含有辅酶并且能够自发实现辅酶循环的事实。由图11可知添加辅酶会提高催化转化率，随着辅酶浓度的提高而升高，当辅酶NADP+浓度达到0.2mM时，突变子的转化率达到了一个较高水平。然而，当辅酶NADP+的浓度大于0.2mM并继续升高时，转化率只有轻微的提高。因此考虑到工业应用的经济性，该催化体系最佳辅酶添加量确定为0.2mM。
实施例11：醇脱氢酶突变子YahK-E208A/A209催化糠醛还原生成糠醇的最适葡萄糖添加量
将实施例8温度设定为30℃，将反应体系的糠醛和葡萄糖终浓度比设为1:0.5-2.5(选取1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5)进行反应，其他操作同实施例8。结果如图12所示，辅底物葡萄糖的增加在一定程度上会提高糠醛的转化率，当糠醛和葡萄糖终浓度比为1:1时，糠醛的转化率达到较高水平分别为73％，当葡萄糖浓度继续增大时，转化率增加幅度不大。因此，反应中使用1:1的糠醛和葡萄糖终浓度。
实施例12：醇脱氢酶突变子YahK-E208A/A209催化糠醛还原生成糠醇反应体系的醇脱氢酶和辅助酶最适质量比
将实施例8温度设定为30℃，在生物催化剂总添加量(120g/L)不变的前提下，将反应体系的醇脱氢酶YahK-E208A/A209与葡萄糖脱氢酶BmGDHM6的湿菌体质量比设为0.2-5:1(选取1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1和5:1)进行反应。结果如图13所示，催化体系最适的醇脱氢酶YahK-E208A/A209R与葡萄糖脱氢酶BmGDHM6湿菌体质量比为2:1，即在10mL的体系中，醇脱氢酶YahK-Y114W与葡萄糖脱氢酶BmGDHM6按0.8g:0.4g的比例混合加入。
实施例13：醇脱氢酶YahK及其突变体YahK-E208A/A209R催化糠醛还原的反应进程
将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK-E208A/A209R经诱导表达获得的湿菌体作为催化剂，催化剂用量为80g/L，加入终浓度500mM底物糠醛、终浓度0.2mM辅酶NADP+、终浓度40g/L的葡萄糖脱氢酶BmGDHM6湿菌体和终浓度500mM的辅底物葡萄糖，以Tris-HCl缓冲液(pH为7.0，50mM)为反应介质构成反应体系10mL。于30℃、600rpm的条件下反应，每隔一段时间取200μL反应液进行处理，采用实施例6所述GC检测底物的转化率，结果如图14所示，糠醇的得率在6h可达到93.87％。
同样条件下，以基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-YahK经诱导表达获得的湿菌体作为对照，糠醇的得率在6h为63.45％。结果表明经过分子改造之后，YahK-E208A/A209R在还原糠醛生成糠醇反应中具备了更高的催化活力。
Claims (10)
1.一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体是将SEQID N0.1所示氨基酸序列第208位谷氨酸突变为丙氨酸，同时209位丙氨酸突变为精氨酸获得。
2.一种含权利要求1所述醇脱氢酶突变体编码基因的重组载体。
3.一种由权利要求2所述重组载体构建的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述醇脱氢酶突变体在催化糠醛还原生成糠醇中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为：将含醇脱氢酶突变体编码基因的工程菌经诱导表达获得湿菌体为催化剂，以糠醛为底物，加入NADPH、辅酶和辅底物，以pH4-9缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-50℃、500-800rpm条件下反应完全后，获得含糠醇反应液，反应液分离纯化获得糠醇；所述辅酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶；所述辅底物包括葡萄糖、异丙醇、甲酸钠。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体计20-100g/L，所述底糠醛酸加入量为300-500mM，NADPH加入量为0.1-0.5mM；辅底物与底物浓度比为0.5-2.5：1。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶各自以含相应编码基因工程菌经发酵培养获得湿菌体形式加入，所述湿菌体加入量均为20-100g/L。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH为7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液。
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含醇脱氢酶突变体编码基因的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8-12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，24℃、200rpm诱导过夜，诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311104588.0A CN117165543A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311104588.0A CN117165543A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117165543A true CN117165543A (zh) | 2023-12-05 |
Family
ID=88932961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311104588.0A Pending CN117165543A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117165543A (zh) |
-
2023
- 2023-08-30 CN CN202311104588.0A patent/CN117165543A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111876404B (zh) | 一种醛缩酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN108048438B (zh) | 一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用 | |
| Arantes et al. | Enrichment of anaerobic syngas-converting communities and isolation of a novel carboxydotrophic Acetobacterium wieringae strain JM | |
| WO2020147031A1 (zh) | 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用 | |
| CN115960875A (zh) | 一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶的突变体酶 | |
| CN110862980B (zh) | 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用 | |
| WO2013141905A2 (en) | Engineering an increase in ethanol production by altering cofactor specificity | |
| CN117987338A (zh) | 产麦角硫因重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN111996157B (zh) | 一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN108004225B (zh) | 一种成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体 | |
| CN117511831A (zh) | 产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法 | |
| CN113717954B (zh) | 一种热稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN115960879A (zh) | 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体 | |
| CN117165543A (zh) | 一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN113122563B (zh) | 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法 | |
| CN112280725B (zh) | 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法 | |
| CN115975964A (zh) | 一种高活性酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN117165544A (zh) | 一种醇脱氢酶突变体及在合成糠醇中的应用 | |
| CN109370997B (zh) | 一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体 | |
| CN109337891B (zh) | 一种热稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体 | |
| CN116445385B (zh) | 一种生产胞二磷胆碱的方法 | |
| CN118126972B (zh) | 一种羰基还原酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN116445455B (zh) | 一种耐热、耐碱的木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN113667651B (zh) | 一种酶活提高及最适pH改变的NADH氧化酶突变体 | |
| CN115011536B (zh) | 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯d-乳酸的工程菌及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |