CN111607623B - 一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法 - Google Patents

一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种代谢工程改造大肠杆菌制备α‑酮异戊酸的方法，属于生物工程领域。本发明构建了一种偶联表达乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基酸脱水酶的重组菌株，并对该宿主菌株进行改造优化，获得能够发酵法高效生产α‑酮异戊酸的重组菌。该重组菌株能够以廉价的葡萄糖为底物，发酵生成附加值更高的α‑酮异戊酸，发酵36h，α‑酮异戊酸产量可达22.91g/L，葡萄糖转化率达80％。

Description

一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法
技术领域
本发明涉及一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法，属于生物工程领域。
背景技术
α-酮异戊酸(α-ketoisovalerate)是酮酸的一种，其在医药、食品、化妆品等领域都有着广泛的应用和较大的市场开发潜力。
目前，通过化学法和生物转化法可合成α-酮异戊酸，并且主要以化学合成法较为常见。然而，化学法工艺繁琐且反应条件严苛，伴随有毒副产物的产生，不适用于大规模工业生产。生物转化法以L-缬氨酸为底物在氨基酸脱氨酶和氨基酸氧化酶的催化下转化为α-酮异戊酸。利用氨基酸氧化酶法产α-酮酸在我国已实现工业化。然而，酶转化法生产α-酮异戊酸的效率都比较低且反应过程中会有H2O2的生成难以除去。利用发酵法生产可以有效地消除有毒副产物的产生且成本更低，更利于环保。
此外，利用大肠杆菌发酵生产α-酮异戊酸的研究很少，目前所报道的大多数是利用谷氨酸棒杆菌为宿主菌进行α-酮异戊酸的发酵积累，且大多数情况下α-酮异戊酸仅仅作为异丁醇生产过程中的副产物被积累。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种偶联表达乙酰乳酸合成酶(AlsS)、乙酰乳酸异构还原酶(IlvC)和二羟基酸脱水酶(IlvD)，利用发酵法生产α-酮异戊酸的方法，提供了一种偶联表达乙酰乳酸合成酶(来源于枯草芽孢杆菌)、乙酰乳酸异构还原酶(来源于大肠杆菌)和二羟基酸脱水酶(来源于大肠杆菌)的重组菌株，并对该重组菌株进行改造优化，获得能够高效发酵生产α-酮异戊酸的重组菌。
本发提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌偶联表达乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基酸脱水酶。
在本发明的一种实施方式中，将EcilvC、BsalsS、EcilvD顺次连接进行表达。
在本发明的一种实施方式中，EcilvC与EcilvD添加了终止子片段EcilvC-Term。
在本发明的一种实施方式中，编码乙酰乳酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述乙酰乳酸异构还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述二羟基酸脱水酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述EcilvCNCBI上登录号为948286；BsalsS NCBI上登录号为936852；EcilvD NCBI上登录号为948277。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌沉默了支链氨基酸转氨酶B基因(ilvE)、异丙基苹果酸合酶基因(leuA)的表达；所述ilvE NCBI上登录号为948278；所述leuA NCBI上登录号为947456。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌过表达大肠杆菌来源的吡啶核苷酸转氢酶基因(pntAB)；所述pntAB NCBI上登录号为946628和946144。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌B0016-050或者大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
本发明提供了一种生产α-酮异戊酸的方法，利用所述重组大肠杆菌为发酵菌株生产α-酮异戊酸。
在本发明的一种实施方式中，以葡萄糖或者丙酮酸钠或含有丙酮酸钠的物质为底物。
在本发明的一种实施方式中，以100～200rpm培养菌株。
在本发明的一种实施方式中，在菌株OD600为1.5～2.5时，用IPTG进行诱导。
本发明还保护所述重组大肠杆菌，或生产α-酮异戊酸的方法在药物分析、食品分析、环境监测、物化工程和生物制药中制备α-酮异戊酸中的应用。
本发明的有益效果：本发明构建了一种偶联表达乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基酸脱水酶的重组菌株，并对该宿主菌株进行改造优化，获得能够发酵法生产α-酮异戊酸的重组菌。该重组菌株能够以廉价的葡萄糖为底物，发酵生成附加值更高的α-酮异戊酸，发酵36h，α-酮异戊酸产量可达22.91g/L，葡萄糖转化率达80％。
附图说明
图1为本发明AlsS、IlvC、IlvD偶联表达的不同策略。
图2为PCR扩增BsalsS、EcilvC和EcilvD基因的凝胶电泳图。
图3为三酶单表达与三酶不同偶联表达的SDS-PAGE结果(图3a-3c)，蛋白浓度测定结果(图3d-3e)。
图4为不同偶联表达体外转化结果。
图5为BL21(DE3)/pSDC与BL21(DE3)/pCTSDT发酵验证结果。
图6为染色体改造凝胶电泳图；6a：T7 RNAP整合同时敲除ilvE基因验证；6b：ilvA基因敲除验证；6c：leuA基因敲除验证。
图7为不同敲除菌株发酵验证结果。
图8为B0016-050T3/pCTSDT与B0016-050T3/pCTSDT+pntAB发酵验证结果及染色体上pntAB替换为不同强度T7启动子发酵验证结果。
具体实施方式
α-酮异戊酸的检测方法：
α-酮异戊酸的浓度都用高效液相色谱(HPLC)法检测。HPLC检测条件：色谱柱Prevail Organic Acid(250mm×4.6mm,5m；Grace Davison Discovery Sciences)，流动相为pH 2.5、浓度25mM的KH2PO4溶液，流速1mL/min，柱温40℃，紫外检测器波长210nm，进样量10μL。
吉布森组装方式：具体步骤参见Gibson et al.,Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases.Nat.Methods,2009,6(5):343-5.
质粒pUC-Term：在商业化pUC57-Kan载体的酶切位点EcoR V间加入了化学合成序列，化学合成序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例1：乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基酸脱水酶多酶表达体系的构建与优化
1)乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；乙酰乳酸异构还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。二羟基酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示根据目的基因和载体，选择合适的连接方式，设计引物(如表1)；
表1质粒构建引物设计
Figure GDA0002521495440000031
Figure GDA0002521495440000041
注：下划线标出的为酶切位点
2)分别以B.subtilis 168基因组、E.coli MG1655基因组为模板，分别以表1中P1+P2、P13+P14、P25+P26为引物，分别克隆基因BsalsS、EcilvC、EcilvD。将质粒pETDuet-1与克隆基因BsalsS、EcilvC、EcilvD分别用表1中对应的酶切位点进行双酶切后，利用T4 DNA连接酶在16℃进行过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，挑选阳性转化子进行菌落PCR验证，测序后得到重组质粒pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD。
以pET-BsalsS为模板，以表1中P3+P4为引物，克隆得到片段PT7-BsalsS；将质粒pET-EcilvC与PT7-BsalsS用P3、P4上相对应的酶切位点进行双酶切后连接，得到重组质粒pET-EcilvC-BsalsS；将质粒pET-EcilvD与PT7-BsalsS用P3、P4上相对应的酶切位点进行双酶切后连接，得到重组质粒pET-EcilvD-BsalsS。
以pET-EcilvC为模板，以P15+P16为引物，扩增得到片段PT7-EcilvC，将质粒pET-EcilvD与PT7-EcilvC用P15、P16上相对应的酶切位点进行双酶切后连接，得到重组质粒pET-EcilvD-EcilvC。
以pET-EcilvD为模板，以表1中P27+P28为引物，克隆得到片段PT7-EcilvD；将质粒pET-BsalsS与PT7-EcilvD用P27、P28上相对应的酶切位点进行双酶切后连接，得到重组质粒pET-BsalsS-EcilvD；将质粒pET-EcilvC与PT7-EcilvD用相对应的酶切位点进行双酶切后连接，得到重组质粒pET-EcilvC-EcilvD。
分别以表1中P5+P6、P7+P8为引物，以B.subtilis 168基因组、质粒pET-EcilvC-EcilvD或pET-EcilvD-EcilvC为模板，获得片段BsalsS与质粒骨架后进行吉布森组装，得到重组质粒pCDS、pDCS。分别以表1中P17+P18、P19+P20为引物，以E.coli MG1655基因组、质粒pET-BsalsS-EcilvD或pET-EcilvD-BsalsS为模板，获得片段EcilvC与质粒骨架后进行吉布森组装，得到重组质粒pSDC、pDSC。分别以表1中P29+P30、P31+P32为引物，以E.coli MG1655基因组、质粒pET-EcilvC-BsalsS为模板，获得片段EcilvD与质粒骨架后进行吉布森组装，得到重组质粒pCSD；
3)以质粒pUC-Term为模板，以表1中P21+P22为引物，获得EcilvC终止子片段EcilvC-Term；以pCSD为模板，以表1中P23+P24为引物，获得质粒骨架，将两者进行吉布森组装，在EcilvC基因后加上了终止子EcilvC-Term，得到重组质粒pCTSDT。分别以质粒pUC-Term、pCTSDT为模板，以表1中P9+P10、P11+P12为引物，获得终止子片段BsalsS-Term及质粒骨架，将两者进行吉布森组装，在BsalsS基因后加上了终止子BsalsS-Term，得到重组质粒pCTSTDT；各质粒基因排列顺序如图1所示；
将重组质粒pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD、pSDC、pCSD、pCDS、pDSC、pDCS、pCTSDT、pCTSTDT分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌BL21(DE3)/pS、BL21(DE3)/pC、BL21(DE3)/pD、BL21(DE3)/pSDC、BL21(DE3)/pCSD、BL21(DE3)/pCDS、BL21(DE3)/pDSC、BL21(DE3)/pDCS、BL21(DE3)/pCTSDT、BL21(DE3)/pCTSTDT。
4)重组菌蛋白表达量的测定
挑取单菌落接种于含有100μg/mL氨苄抗生素的5mL LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养8h，按照2％的接种量转接至含有100μg/mL氨苄抗生素的50mL 2YT培养基(16g蛋白胨、10g酵母膏、5g NaCl定容到1L)的250mL的摇瓶中，与37℃、200r/min培养至OD600约为0.8时，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为30℃，诱导20h后收集菌体；
离心收集菌体，调节菌体浓度OD600为40，用pH 7.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液重悬菌体后进行超声破碎得粗酶液。将粗酶液统一稀释8倍，利用Bradford法进行粗酶液的蛋白浓度测定并利用SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况；各个组合蛋白表达情况及蛋白浓度测定结果如图3所示。
图3a显示，当三个酶分别单独表达时，均有明显的表达条带，而三个酶共表达时，三个酶的表达量都有明显的下降，且由于AlsS与IlvD分子量相近，并不能明显的分辩出来。图3b显示，当不同串联组合时，组合pCSD具有最高的表达量，同时，由蛋白浓度测定结果图3d所示，组合pSDC、pDSC、pDCS、pCDS的蛋白浓度分别为0.34mg/mL、0.32mg/mL、0.35mg/mL、0.42mg/mL，组合pCSD具有最高的蛋白浓度，为0.46mg/mL，该结果与SDS-PAGE结果一致。图3c显示，当EcilvC基因后添加终止子后，总蛋白量有了相对明显的提升，而且由蛋白浓度测定结果图3e所示，组合pCTSDT的蛋白总量有明显提升，由0.46mg/mL提升至0.62mg/mL，提升了34.8％，该结果同样与SDS-PAGE结果一致，而pCTSTDT的蛋白总量为0.48mg/mL。
体外转化反应体系为1mL，其中含有100μL粗酶液，50μL 1mol/L丙酮酸钠，10μLTPP，10μL NADPH，剩下的用pH 7.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液补足。置于30℃金属浴中反应30min后，于100℃煮沸10min灭活，离心取上清，检测上清中产物α-酮异戊酸的含量。检测结果如图4所示。
图4a显示，重组菌BL21(DE3)/pCSD催化底物丙酮酸钠可生成0.40g/Lα-酮异戊酸，相比于优化前菌株BL21(DE3)/pSDC的0.28g/L，该菌株产量提高了42.9％；而重组菌BL21(DE3)/pDSC、BL21(DE3)/pDCS、BL21(DE3)/pCDS的α-酮异戊酸产量分别为0.30g/L、0.31g/L、0.30g/L。图4b显示，当EcilvC添加终止子后，得到的重组菌BL21(DE3)/pCTSDT体外催化丙酮酸钠可产生0.91g/Lα-酮异戊酸，对比未加终止子前的菌株BL21(DE3)/pCSD的产量(0.40g/L)，该菌株α-酮异戊酸产量提高了1.28倍。而在对BsalsS添加了终止子之后，重组菌BL21(DE3)/pCTSTDT体外催化丙酮酸钠可产生0.80g/Lα-酮异戊酸。
实施例2：敲除竞争代谢途径的产α-酮异戊酸工程菌株的构建方法
1)出发菌株为本实验室保藏大肠杆菌B0016-050(Δack-pta,ΔpflB,ΔadhE,ΔfrdA,ΔldhA)(公开于文献Zhou et al.,Efficient L-alanine production by athermo-regulated switch in Escherichia coli.Appl.Biochem.Biotechnol.,2016,178:324-37.)，该菌株中已敲除了副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成代谢途径的编码基因，可以避免这些代谢副产物的大量合成，并为α-酮异戊酸的发酵合成提供充足的丙酮酸前体。为保证T7启动子正常行使功能，在基因组上整合T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)基因，并同时为了阻断α-酮异戊酸的进一步被分解利用，将染色体上支链氨基酸转氨酶编码基因ilvE利用Red重组方法进行敲除。
2)以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组为模板，以表2中P33+P34为引物，克隆T7RNAP基因，得到目的片段后与T-vector进行连接，得到重组质粒pMD19-T7 RNAP。以质粒pKD13为模板，以表2中P35+P36为引物，克隆Kan抗性基因片段，将获得的kan片段与质粒pMD19-T7 RNAP对P35、P36上相应的酶切位点酶切后连接，获得重组质粒pMD19-T7 RNAP-kan。以质粒pMD19-T7 RNAP-kan为模板，以表2中P37+P38为引物，克隆打靶片段T7 RNAP::ilvE-kan(该片段可将T7RNA聚合酶基因整合至ilvE基因处，同时将ilvE突变)。
3)将质粒pKD46电转化至B0016-050中，置于30℃培养箱中培养12-16h，挑取单菌落接种于含有100μg/mL氨苄抗生素的5mL LB液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养12h，按照1％的接种量转接至含有100μg/mL氨苄抗生素的50mL LB培养基(10g蛋白胨、5g酵母膏、10g NaCl定容到1L)的250mL的摇瓶中，与30℃、200r/min培养至OD600约为0.1-0.2.时，加入终浓度为30mmol/L的阿拉伯糖进行诱导，诱导温度为30℃，待菌体长至OD600约为0.6时，进行电转化法感受态细胞的制备。
4)将菌液置于冰上冰浴30min，4℃、6000rpm冷冻离心5min。弃去上清，分别用已预冷的水和10％的甘油洗涤三次，最后用10％的甘油进行重悬浮。
5)取10μL打靶片段和90μL感受态细胞于1.5mL离心管中，冰浴5min后，转移至电转杯中，按下按钮进行点击，迅速加入1mLLB培养基，吹吸过后转移至1.5mL离心管中，并于离心管中添加终浓度为30mmol/L的阿拉伯糖，于30℃下后培养2-3h。取适量菌液进行涂布，于30℃培养箱中培养12-16h，挑取合适的单菌落进行验证。
6)以表2中P39+P40为验证引物，挑取单菌落进行验证。正确条带大小约为5000bp，错误条带约为1300bp。
7)挑选验证正确的菌落于42℃下培养12-16h，丢质粒pKD46。验证pKD46有无丢掉，可挑取同一个菌落分别点样于Kan抗性和Amp抗性平板上，在Kan抗性平板上长而Amp平板上不长的即为成功丢掉pKD46的菌。
8)将pCP20转化至已丢掉pKD46的菌里，进行kan抗性的摘除。于30℃下培养12-16h，挑取合适的单菌落进行验证。
9)重复步骤6，此时正确条带大小约为3700bp，而错误条带约为5000bp。
10)重复步骤7，丢质粒pCP20。最终，验证正确的菌应于无抗性平板上长，在Kan抗性平板和Amp抗性平板上均无法生长。由此得到B0016-050T(B0016-050,ilvE::T7RNAP)。
11)以pKD13为模板，以表2中P41+P42为引物，获得打靶片段ilvA-kan(可将ilvA基因突变)。
12)将pKD46转入B0016-050T中，重复步骤3-5。
13)以表2中P43+P44为引物，重复步骤6，正确条带大小约为1400bp，错误条带约为1700bp。
14)重复步骤7-9，此时，正确条带大小约为100bp，错误条带约为1400bp。
15)重复步骤10，最终得到敲除了ilvA的B0016-050T1(B0016-050,ilvE::T7RNAP,ΔilvA)。
17)以pKD13为模板，以表2中P45+P46为引物，获得打靶片段leuA-kan(可将leuA基因突变)。
18)将pKD46分别转入B0016-050T1、B0016-050T中，得到转入了pKD46的B0016-050T1、B0016-050T，再以同样的方法将打靶片段leuA-kan转入B0016-050T1，将打靶片段leuA-kan转入B0016-050T。
19)以表2中P47+P48为引物，重复步骤6.正确条带大小约为1400bp，错误条带约为1700bp。
20)重复步骤7-9，此时，正确条带大小约为100bp，错误条带约为1400bp。
21)重复步骤10。最终得到B0016-050T2(B0016-050,ilvE::T7RNAP,ΔilvA,ΔleuA)、B0016-050T3(B0016-050,ilvE::T7RNAP,ΔleuA)。
表2敲除竞争代谢途径所使用的引物
Figure GDA0002521495440000081
实施例3：辅酶NADPH循环再生的产α-酮异戊酸工程菌株的构建方法
1)分别以大肠杆菌基因组和质粒pACYCDuet为模板，以表3中P49+P50、P51+P52为引物，扩增得到pntAB片段和质粒骨架pACYC，将两者进行吉布森组装，得到重组质粒pACYC-pntAB。
2)分别以质粒pACYC-pntAB和pKD13为模板，以表3中P53+P54、P55+P56为引物，扩增得到质粒骨架pACYC-pntAB与kan片段，将两者进行吉布森组装，获得重组质粒pACYC-kan-pntAB。
3)以质粒pACYC-kan-pntAB为模板，以表3中P57+P58、P59+P60、P61+P62为引物进行全质粒PCR，得到不同强度的T7启动子，并同时删除T7启动子后的lacO基因，得到重组质粒pACYC-kan-T7100、pACYC-kan-T792、pACYC-kan-T716。
4)分别以质粒pACYC-kan-T7100、pACYC-kan-T792、pACYC-kan-T716为模板，以表3中P63+P64为引物，得到打靶片段T7100-kan、T792-kan、T716-kan。
5)将pKD46转化至B0016-050T3中，重复实例2中的步骤3-10，得到染色体上pntAB基因的启动子分别被T7、TM1(T792)、TM3(T716)启动子取代的菌株B0016-050T4(050T3,PpntA::PT7)、B0016-050T4-1(050T3,PpntA::PTM1)、B0016-050T4-2(050T3,PpntA::PTM3)。
表3辅酶NADPH再生体系引物设计
Figure GDA0002521495440000091
实施例4：重组菌生产α-酮异戊酸性能比较
1)将质粒pCTSDT转入B0016-050T、B0016-050T1、B0016-050T2、B0016-050T3中过夜培养，挑取单菌落接种于含有100μg/mL氨苄抗生素的5mL LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养8h，按照2％的接种量转接至含有100μg/mL氨苄抗生素的50mL M9-2培养基(NaHPO4 6g,KH2PO4 3g，NaCl 0.3g，NH4Cl 1g，酵母粉5g，葡萄糖36g，MgSO4 2mM，微量元素0.1％)的250mL的摇瓶中，于37℃、200r/min培养至OD600约为0.8时，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为30℃，发酵过程中每隔4h进行取样并对发酵液的pH进行调节，使其维持在pH为7左右。
结果如图7所示，发酵26h后，菌株B0016-050T3/pCTSDTα-酮异戊酸生成量明显高于原始菌株B0016-050T/pCTSDT，产量由8.6g/L提升至9.6g/L，有11.6％的提升。而菌株B0016-050T1/pCTSDT产量却有较为明显的下降，发酵26h可产生7.7g/Lα-酮异戊酸，相比原始菌株B0016-050T/pCTSDT，有10.5％的下降；而菌株B0016-050T2/pCTSDT可产生8.3g/Lα-酮异戊酸。
2)将质粒pACYC-pntAB转入菌株B0016-050T3/pCTSDT中，使两个质粒共表达，挑取单菌落接种于含有100μg/mL氨苄抗生素和34μg/mL氯霉素抗生素LB液体培养基中，其他操作步骤如步骤1，发酵定时取样检测α-酮异戊酸的产生情况，比较菌株B0016-050T3/pCTSDT与菌株B0016-050T3/pCTSDT+pntABα-酮异戊酸的生成量。结果如图8所示，发酵26h，B0016-050T3/pCTSDT+pntABα-酮异戊酸产量为10.7g/L，B0016-050T3/pCTSDT为9.6g/L，该菌株产量有11.5％的提高。
3)将质粒pCTSDT转入B0016-050T4、B0016-050T4-1、B0016-050T4-2中过夜培养，其他操作步骤同步骤1，比较四株菌B0016-050T3/pCTSDT、B0016-050T4/pCTSDT、B0016-050T4-1/pCTSDT、B0016-050T4-2/pCTSDTα-酮异戊酸的生成量。结果如图8所示，发酵26h，B0016-050T4/CTSDTα-酮异戊酸产量有明显的提升，为11.2g/L，相比于B0016-050T3/CTSDT的9.6g/L，该菌株产量有16.7％的提升。而B0016-050T4-1/pCTSDT产量为8.8g/L、B0016-050T4-2/pCTSDT产量为9.0g/L，这两株菌相较于B0016-050T3/pCTSDT产量分别有0.8g/L和0.6g/L的降低。
实施例5：发酵法生产α-酮异戊酸的发酵条件优化
发酵培养基组分：
Na2HPO4 6.0g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.3g/L，NH4Cl 1.0g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖36.0g/L，MgSO4 2.0mM，微量元素液0.1％；
微量元素液：MnSO4·4H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10.0g/L，CaCl2 2.0g/L，(NH4)Mo7O24 0.1g/L，CuSO4·5H2O 3.0g/L，Na2B4O7·10H2O 0.23g/L，ZnSO4·7H2O 5.25g/L，溶于1mol/LHCl定容至1L。
1)对菌株B0016-050T4/pCTSDT进行发酵条件优化。
首先进行摇瓶转速优化。于37℃、200r/min培养至OD600约为0.8时，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为30℃，然后分别将转速调至0rpm、50rpm、100rpm、200rpm，定时取样测定α-酮异戊酸的生成情况，测定发酵液中葡萄糖的剩余量，计算α-酮异戊酸对葡萄糖的得率。结果如表4所示，当转速为200rpm时，发酵36h后，α-酮异戊酸产量可达17.65g/L，整个发酵过程对葡萄糖的摩尔转化率为0.657mol/mol，与100rpm下的摩尔转化率相当，但产量却明显的高于100rpm下的产量，于是，接下来仍采用200rpm的转速进行下一步优化。
2)确定摇瓶转速为200rpm后，对诱导时机进行优化。分别于37℃、200r/min下培养菌体至OD600分别为1.5、2.5、4、5时，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为30℃，定时取样测定α-酮异戊酸的生成情况，测定发酵液中葡萄糖的剩余量，计算α-酮异戊酸对葡萄糖的得率。结果如表4所示，当OD600为2.5时，发酵36h，α-酮异戊酸产量可达22.91g/L，整个发酵过程对葡萄糖的摩尔转化率为0.800mol/mol，达到理论转化率的80％。
3)对诱导剂IPTG的添加浓度进行优化。在200rpm的转速下，待OD600至约2.5时，分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L的IPTG进行诱导，调节诱导温度30℃，定时取样测定α-酮异戊酸的生成情况，测定发酵液中葡萄糖的剩余量，计算α-酮异戊酸对葡萄糖的得率。结果如表4所示，当IPTG添加浓度为0.4mmol/L时，发酵36h，α-酮异戊酸产量可达22.91g/L，整个发酵过程对葡萄糖的摩尔转化率为0.800mol/mol。于是，最佳揺瓶发酵条件确定为转速200rpm、OD600为2.5进行诱导，诱导剂添加浓度为0.4mmol/L。
表4 B0016-050T4/pCTSDT发酵条件优化
Figure GDA0002521495440000111
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gln Lys Ser Leu Val Lys Asn Arg Gly
1 5 10 15
Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His Val
20 25 30
Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu Gln
35 40 45
Asp Lys Gly Pro Glu Ile Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala Ala
50 55 60
Phe Met Ala Gln Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val Val
65 70 75 80
Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu Leu
85 90 95
Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ile Arg Ala Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Leu Asp Asn Ala
115 120 125
Ala Leu Phe Gln Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Val Glu Val Gln Asp Val
130 135 140
Lys Asn Ile Pro Glu Ala Val Thr Asn Ala Phe Arg Ile Ala Ser Ala
145 150 155 160
Gly Gln Ala Gly Ala Ala Phe Val Ser Phe Pro Gln Asp Val Val Asn
165 170 175
Glu Val Thr Asn Thr Lys Asn Val Arg Ala Val Ala Ala Pro Lys Leu
180 185 190
Gly Pro Ala Ala Asp Asp Ala Ile Ser Ala Ala Ile Ala Lys Ile Gln
195 200 205
Thr Ala Lys Leu Pro Val Val Leu Val Gly Met Lys Gly Gly Arg Pro
210 215 220
Glu Ala Ile Lys Ala Val Arg Lys Leu Leu Lys Lys Val Gln Leu Pro
225 230 235 240
Phe Val Glu Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Thr Leu Ser Arg Asp Leu Glu
245 250 255
Asp Gln Tyr Phe Gly Arg Ile Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Leu Glu Gln Ala Asp Val Val Leu Thr Ile Gly Tyr Asp Pro
275 280 285
Ile Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Trp Asn Ile Asn Gly Asp Arg Thr Ile
290 295 300
Ile His Leu Asp Glu Ile Ile Ala Asp Ile Asp His Ala Tyr Gln Pro
305 310 315 320
Asp Leu Glu Leu Ile Gly Asp Ile Pro Ser Thr Ile Asn His Ile Glu
325 330 335
His Asp Ala Val Lys Val Glu Phe Ala Glu Arg Glu Gln Lys Ile Leu
340 345 350
Ser Asp Leu Lys Gln Tyr Met His Glu Gly Glu Gln Val Pro Ala Asp
355 360 365
Trp Lys Ser Asp Arg Ala His Pro Leu Glu Ile Val Lys Glu Leu Arg
370 375 380
Asn Ala Val Asp Asp His Val Thr Val Thr Cys Asp Ile Gly Ser His
385 390 395 400
Ala Ile Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Tyr Glu Pro Leu Thr Leu
405 410 415
Met Ile Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala
420 425 430
Ile Gly Ala Ser Leu Val Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Ser Val Ser
435 440 445
Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr Ala Val
450 455 460
Arg Leu Lys Ala Pro Ile Val His Ile Val Trp Asn Asp Ser Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Leu Lys Lys Tyr Asn Arg Thr Ser Ala
485 490 495
Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly
500 505 510
Ala Thr Gly Leu Arg Val Glu Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Val Leu
515 520 525
Arg Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Val Pro Val
530 535 540
Asp Tyr Ser Asp Asn Ile Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro Lys Glu
545 550 555 560
Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu
565 570
<210> 2
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60
gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120
gatgcggtat ttgacgcttt acaagataaa ggacctgaaa ttatcgttgc ccggcacgaa 180
caaaacgcag cattcatggc ccaagcagtc ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg 240
ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact 300
gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga aacgtgatcc gtgcagatcg tttaaaacgg 360
acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420
gttcaagatg taaaaaatat accggaagct gttacaaatg catttaggat agcgtcagca 480
gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat 540
acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc 600
agtgcggcca tagcaaaaat ccaaacagca aaacttcctg tcgttttggt cggcatgaaa 660
ggcggaagac cggaagcaat taaagcggtt cgcaagcttt tgaaaaaggt tcagcttcca 720
tttgttgaaa catatcaagc tgccggtacc ctttctagag atttagagga tcaatatttt 780
ggccgtatcg gtttgttccg caaccagcct ggcgatttac tgctagagca ggcagatgtt 840
gttctgacga tcggctatga cccgattgaa tatgatccga aattctggaa tatcaatgga 900
gaccggacaa ttatccattt agacgagatt atcgctgaca ttgatcatgc ttaccagcct 960
gatcttgaat tgatcggtga cattccgtcc acgatcaatc atatcgaaca cgatgctgtg 1020
aaagtggaat ttgcagagcg tgagcagaaa atcctttctg atttaaaaca atatatgcat 1080
gaaggtgagc aggtgcctgc agattggaaa tcagacagag cgcaccctct tgaaatcgtt 1140
aaagagttgc gtaatgcagt cgatgatcat gttacagtaa cttgcgatat cggttcgcac 1200
gccatttgga tgtcacgtta tttccgcagc tacgagccgt taacattaat gatcagtaac 1260
ggtatgcaaa cactcggcgt tgcgcttcct tgggcaatcg gcgcttcatt ggtgaaaccg 1320
ggagaaaaag tggtttctgt ctctggtgac ggcggtttct tattctcagc aatggaatta 1380
gagacagcag ttcgactaaa agcaccaatt gtacacattg tatggaacga cagcacatat 1440
gacatggttg cattccagca attgaaaaaa tataaccgta catctgcggt cgatttcgga 1500
aatatcgata tcgtgaaata tgcggaaagc ttcggagcaa ctggcttgcg cgtagaatca 1560
ccagaccagc tggcagatgt tctgcgtcaa ggcatgaacg ctgaaggtcc tgtcatcatc 1620
gatgtcccgg ttgactacag tgataacatt aatttagcaa gtgacaagct tccgaaagaa 1680
ttcggggaac tcatgaaaac gaaagctctc tag 1713
<210> 3
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln
1 5 10 15
Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala
20 25 30
Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln
35 40 45
Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser
50 55 60
Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg
65 70 75 80
Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile
85 90 95
Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser
100 105 110
Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu
115 120 125
Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg
130 135 140
Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu
145 150 155 160
Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala
165 170 175
Val His Pro Glu Asn Asp Pro Lys Gly Glu Gly Met Ala Ile Ala Lys
180 185 190
Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Val Leu Glu Ser
195 200 205
Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile
210 215 220
Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Leu Leu Cys Phe Asp Lys Leu
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Val Glu Glu Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Leu Ile Gln Phe
245 250 255
Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Gln Gly Gly Ile Thr Leu
260 265 270
Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala Leu
275 280 285
Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ile Met Ala Pro Leu Phe Gln Lys His Met
290 295 300
Asp Asp Ile Ile Ser Gly Glu Phe Ser Ser Gly Met Met Ala Asp Trp
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Ala Asn Asp Asp Lys Lys Leu Leu Thr Trp Arg Glu Glu Thr Gly Lys
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Glu Tyr Phe Asp Lys Gly Val Leu Met Ile Ala Met Val Lys Ala Gly
355 360 365
Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Met Val Asp Ser Gly Ile Ile Glu Glu
370 375 380
Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr
385 390 395 400
Ile Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr
405 410 415
Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Tyr Ala Cys Val Pro Leu Leu
420 425 430
Lys Pro Phe Met Ala Glu Leu Gln Pro Gly Asp Leu Gly Lys Ala Ile
435 440 445
Pro Glu Gly Ala Val Asp Asn Gly Gln Leu Arg Asp Val Asn Glu Ala
450 455 460
Ile Arg Ser His Ala Ile Glu Gln Val Gly Lys Lys Leu Arg Gly Tyr
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Met Thr Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Ala Gly
485 490
<210> 4
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
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485 490 495
Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly
500 505 510
Ala Thr Gly Leu Arg Val Glu Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Val Leu
515 520 525
Arg Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Val Pro Val
530 535 540
Asp Tyr Ser Asp Asn Ile Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro Lys Glu
545 550 555 560
Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu
565 570
<210> 6
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60
gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120
gatgcggtat ttgacgcttt acaagataaa ggacctgaaa ttatcgttgc ccggcacgaa 180
caaaacgcag cattcatggc ccaagcagtc ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg 240
ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact 300
gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga aacgtgatcc gtgcagatcg tttaaaacgg 360
acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420
gttcaagatg taaaaaatat accggaagct gttacaaatg catttaggat agcgtcagca 480
gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat 540
acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc 600
agtgcggcca tagcaaaaat ccaaacagca aaacttcctg tcgttttggt cggcatgaaa 660
ggcggaagac cggaagcaat taaagcggtt cgcaagcttt tgaaaaaggt tcagcttcca 720
tttgttgaaa catatcaagc tgccggtacc ctttctagag atttagagga tcaatatttt 780
ggccgtatcg gtttgttccg caaccagcct ggcgatttac tgctagagca ggcagatgtt 840
gttctgacga tcggctatga cccgattgaa tatgatccga aattctggaa tatcaatgga 900
gaccggacaa ttatccattt agacgagatt atcgctgaca ttgatcatgc ttaccagcct 960
gatcttgaat tgatcggtga cattccgtcc acgatcaatc atatcgaaca cgatgctgtg 1020
aaagtggaat ttgcagagcg tgagcagaaa atcctttctg atttaaaaca atatatgcat 1080
gaaggtgagc aggtgcctgc agattggaaa tcagacagag cgcaccctct tgaaatcgtt 1140
aaagagttgc gtaatgcagt cgatgatcat gttacagtaa cttgcgatat cggttcgcac 1200
gccatttgga tgtcacgtta tttccgcagc tacgagccgt taacattaat gatcagtaac 1260
ggtatgcaaa cactcggcgt tgcgcttcct tgggcaatcg gcgcttcatt ggtgaaaccg 1320
ggagaaaaag tggtttctgt ctctggtgac ggcggtttct tattctcagc aatggaatta 1380
gagacagcag ttcgactaaa agcaccaatt gtacacattg tatggaacga cagcacatat 1440
gacatggttg cattccagca attgaaaaaa tataaccgta catctgcggt cgatttcgga 1500
aatatcgata tcgtgaaata tgcggaaagc ttcggagcaa ctggcttgcg cgtagaatca 1560
ccagaccagc tggcagatgt tctgcgtcaa ggcatgaacg ctgaaggtcc tgtcatcatc 1620
gatgtcccgg ttgactacag tgataacatt aatttagcaa gtgacaagct tccgaaagaa 1680
ttcggggaac tcatgaaaac gaaagctctc tag 1713
<210> 7
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggtaagaaa ctgcgcggct atatgacaga tatgaaacgt attgctgttg cgggttaaca 60
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 120
tgctgaaagg aggaactaga gctcgtaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat 180
aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatggatat 240
gacaaaagca acaaaagaac aaaaatccct tgtgaaaaac agaggggcgg agcttgttgt 300
tttagcaagt gacaagcttc cgaaagaatt cggggaactc atgaaaacga aagctctcta 360
gcaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 420
ttttgctgaa aggaggaact agcggccgca taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt 480
attgtacacg gccgcataat cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 540
taacaattcc ccatcttagt atattagtta agtataagaa ggagatatac atatggcaga 600
tctcatgcct aagtaccgtt ccgccaccac cactcatggt cgtaatatgg cgggtgctcg 660

Claims (8)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌偶联表达乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基酸脱水酶；将乙酰乳酸异构还原酶、乙酰乳酸合成酶、二羟基酸脱水酶顺次连接进行表达；所述重组大肠杆菌沉默了支链氨基酸转氨酶B基因、异丙基苹果酸合酶基因的表达；所述支链氨基酸转氨酶B基因在NCBI上的登录号为948278；所述leuA在NCBI上登录号为947465；所述重组大肠杆菌过表达吡啶核苷酸转氢酶基因；所述吡啶核苷酸转氢酶基因是由pntA和pntB组成的基因簇，所述pntA在NCBI上的登录号为946628；所述pntB在NCBI上的登录号为946144。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，乙酰乳酸异构还原酶与二羟基酸脱水酶添加了终止子。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述乙酰乳酸异构还原酶在NCBI上的登录号为948286；所述乙酰乳酸合成酶在NCBI上的登录号为936852；所述二羟基酸脱水酶在NCBI上的登录号为948277。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌B0016-050或者大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
5.一种生产α-酮异戊酸的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一项所述重组大肠杆菌为发酵菌株，以葡萄糖或丙酮酸钠为底物，生产α-酮异戊酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以100～200rpm培养菌株。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述重组大肠杆菌发酵至OD600为1.5～2.5时，用IPTG进行诱导。
8.权利要求1～3任一项所述重组大肠杆菌，或权利要求5～7任一所述方法在药物分析、食品分析、环境监测、物化工程和生物制药领域中制备α-酮异戊酸中的应用。
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