CN108728502B - 一种合成精氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成精氨酸的方法，其特征在于，包括利用同源重组技术在原核生物中敲除编码烟酰胺腺嘌呤二核甘酸依赖性的脱乙酰化酶的cobB基因的步骤。本发明通过敲除cobB基因以提高胞内蛋白质赖氨酸残基乙酰化水平，最终达到提高精氨酸产量的目的。

Description

一种合成精氨酸的方法
技术领域
本发明涉及利用同源重组技术将原核生物中cobB基因进行敲除，从而提高原核生物合成精氨酸产量的方法。
背景技术
蛋白质赖氨酸残基乙酰化(lysine acetylation，KAc)是一种普遍存在于三界系统中的可逆的、高度受调控的蛋白质翻译后修饰方式。KAc是指以乙酰CoA等乙酰基供体为辅因子的赖氨酸乙酰化转移酶(lysine acetyltransferase，KATs)对蛋白质的赖氨酸残基进行的乙酰化修饰作用。诸多学者研究了原核生物(如Escherichia coli、Salmonellaenterica、Bacillus subtilis、Mcobacterium smegmatis等)中可逆的KAc作用对新陈代谢的影响，如Wang等(Science,2010,327(5968):1004-1007)报道在S.enterica中，磷酸甘油酸变位酶、乙酰辅酶A和异柠檬酸脱氢酶激酶均是通过可逆的乙酰化来调节酶活性从而引导代谢流的方向，当葡萄糖作为细胞的唯一碳源时，代谢流趋向于糖酵解方向；当柠檬酸盐作为细胞的唯一碳源时，乙醛酸旁路被激活，代谢流趋向于糖异生方向。同时，蛋白质KAc修饰调控中心碳代谢过程及调控次级代谢酶活性。
cobB基因是在原核生物中发现的一种烟酰胺腺嘌呤二核甘酸依赖性的脱乙酰化酶CobB，此基因的敲除将使胞内蛋白质KAc水平升高。而精氨酸的合成是经历了一个代谢网络，从糖的酵解到三羧酸循环的中间代谢物α-酮戊二酸，再在谷氨酸脱氢酶的作用下生成精氨酸前体物质谷氨酸，谷氨酸再经历8种酶的催化最终合成精氨酸。参与合成精氨酸的一系列酶的KAc水平会对精氨酸产量有影响。
发明内容
为了提高精氨酸产量，本发明的目的在于敲除cobB基因以提高胞内蛋白质赖氨酸乙酰化水平，从而利用敲除了cobB基因的原核生物提高合成精氨酸水平。
一种合成精氨酸的方法，其特征在于，包括利用同源重组技术在原核生物中敲除编码烟酰胺腺嘌呤二核甘酸依赖性的脱乙酰化酶的cobB基因的步骤。
更具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)设计引物：通过PCR获得cobB基因的上下同源臂，再通过重叠PCR获得上下同源臂的融合片段；
(2)构建重组载体：选择质粒载体，质粒载体及上述的融合片段经限制性内切酶酶切后，再在连接酶的作用下连接，构建重组质粒；重组质粒经测序验证正确后进行同源重组；
(3)转入宿主进行同源重组：制备感受态宿主，将重组质粒转入感受态宿主细胞中，采用抗性、菌落PCR等方法筛选阳性克隆子；阳性克隆子进行摇瓶发酵生产精氨酸。
所述cobB基因来源于各种原核生物，可以是E.coli，也可以是棒杆菌属的菌株等。
所述的质粒载体是适用于不同原核生物进行同源重组的质粒。
本发明的技术效果是：本发明通过敲除cobB基因提高胞内蛋白质赖氨酸乙酰化水平，最终达到提高精氨酸产量的目的。
附图说明
图1以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)为例，PCR分别扩增敲除cobB基因的上下同源臂。
图2以钝齿棒杆菌为例，重叠PCR获得敲除cobB基因的同源臂。
图3以钝齿棒杆菌为例，A发酵比较cobB基因敲除前后的葡萄糖消耗；B发酵比较cobB基因敲除前后的细胞干重；C发酵比较cobB基因敲除前后的精氨酸产量。
图4以钝齿棒杆菌为例，cobB基因敲除前后菌体上清液的SDS-PAGE电泳和Western-blotting图谱(所用抗体为抗赖氨酸乙酰基团的抗体)。
在图1中，Line 1：长为728bp的cobB上同源臂；Line 2：长为789bp的cobB下同源臂；M：DL2000。
在图2中，Line 1：长为1517bp的cobB敲除的同源片段；M：DL2000。
在图3中，A为葡萄糖的消耗量；B为细胞干重；C为精氨酸产量。图中CCM01为未敲除cobB的菌株，CCM02为敲除cobB的菌株。
在图4中，SDS-PAGE电泳图中1-4泳道分别是CCM01在36h、48h、60h和84h收集的细胞破碎液的上清；5-8泳道分别是CCM02在36h、48h、60h和84h收集的细胞破碎液的上清；9泳道是溶菌酶的电泳图。Western-blotting图中，10-13泳道为CCM01的菌体上清；14-17泳道为CCM02的菌体上清；18泳道为溶菌酶。
具体实施方式
下面将结合附图1-4和实施例1-3详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。
实施例1
敲除钝齿棒杆菌CCM01的cobB重组质粒构建过程，包括以下步骤：
(1)引物的设计：以钝齿棒杆菌CCM01基因组为模板，采用Oligo 6软件设计引物，引物见表1。
表1敲除cobB的引物
Figure GDA0001682991690000031
注：下划线表示融合PCR时的融合臂序列，加粗字体表示酶切位点。
(2)PCR扩增上下同源臂：以CCM01基因组DNA为模板，利用引物对cobB-up-F和cobB-up-R及引物对cobB-down-F和cobB-down-R分别扩增cobB上臂和cobB下臂，PCR反应体系及反应条件见表2。PCR产物经回收试剂盒分别回收cobB的上下同源臂。
表2片段PCR体系和条件
Figure GDA0001682991690000032
注：PCR条件中步骤3-5重复30个循环
(3)敲除cobB的重组载体的构建：以cobB-up-F和cobB-down-R为引物，以纯化的同摩尔的上下臂为模板，通过重叠PCR将上下同源臂融合，PCR反应条件同表2。将纯化的融合臂及pK18mobsacB载体分别用Hind III及Xba I进行酶切后，在连接酶的作用下连接形成重组质粒pK18mobsacB-cobB。
实施例2
构建CCM01基因组中缺失cobB的菌株CCM02，其步骤如下：
(1)制备CCM01感受态细胞：挑取CCM01活化后的单菌落，划线至新配置的LB固体平板上活化于30℃培养24-48h；用接种环挑取单菌落于10mL LBG(g/L：酵母粉5，蛋白胨10，葡萄糖2％，氯化钠10，调pH＝7.0，121℃，30min灭菌)液体培养基中，210rpm，30℃，培养12-16h左右，至OD562大约为5-6；用1mL移液枪吸取2mL上述培养的菌液至100mL感受态培养基(100mL LB培养基中含3％甘氨酸和0.1％的Tween 80)中于30℃，200rpm，培养3-4h至OD600大约为0.3左右；离心收集菌体，并用冰冷的15％甘油洗涤5次至终体积30mL，分装60μL每支。
(2)构建重组菌CCM02：在上述制备好的60μL CCM01感受态细胞中加入2-3μL质粒pK18mobsacB-cobB，轻柔敲打混匀后冰水浴0.5h；取冰浴好的感受态细胞体系转移至提前-20℃冷藏的2mm电转杯中，在电转仪的电转条件为3Kv电击4ms后，立即加入400μL的SOC培养基，再立即将其放入46℃恒温水浴锅中热激6min；热激后于30℃恒温培养箱中静置培养30min，再于30℃、110rpm的恒温摇床上复苏4小时；复苏后菌液全部涂布于含50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，置于30℃恒温培养箱培养36h-48h后长出单菌落。以cobB-up-F和cobB-down-R引物筛选单交换子，其扩增长度为融合臂长。单交换子用10％蔗糖培养基进行二次交换，用表1中cobB-innercheck-F和cobB-innercheck-R引物进行筛选二次交换子，获得CCM02菌株。
实施例3
采用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析两株菌的蛋白质赖氨酸乙酰化水平的变化并进行HPLC/MS-MS分析：(1)采用发酵培养基培养CCM01和CCM02这两株菌，并分别在36h、48h、60h和84h收集3mL菌体，10000rmp离心并洗涤菌体后，超声波破碎菌体，离心收集上清溶液。(2)采用BAC方法测定各上清蛋白质浓度，以最低的菌体上清浓度为统一浓度进行SDS-PAGE电泳，并以抗赖氨酸乙酰化抗体为检测抗体进行Werstern-blotting实验，观察两株菌在不同时间的乙酰化水平。(3)将84h处的两株菌的分子量约为49KDa的蛋白质条带无菌切胶后送华大基因进行测序，以分析两株菌的蛋白质赖氨酸残基乙酰化修饰的差异。结果显示，CCM02获得了17个乙酰化修饰蛋白质，其中3个蛋白质在CCM01中未检测到；11个蛋白质显示乙酰化水平获得了提高，其中有两个蛋白质是精氨酸合成途径的蛋白：ArgC和ArgF；2个蛋白质显示乙酰化水平下降，一个是葡糖酵解途径酶：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，另一个是s-腺苷-l-同型半胱氨酸水解酶。
目前在国内外，还未见有敲除cobB基因改变菌体中蛋白质赖氨酸残基乙酰化水平从而达到提高精氨酸产量的报道。本发明在成功敲除cobB基因后提高了精氨酸产量，从图3C可看出培养120h后精氨酸产量从19.39g/L增加为22.24g/L，提高了14.69％。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种合成精氨酸的方法，其特征在于，包括利用同源重组技术在原核生物中钝齿棒杆菌敲除编码烟酰胺腺嘌呤二核甘酸依赖性的脱乙酰化酶的cobB基因的步骤，包括以下步骤：
（1）通过PCR获得cobB基因的上下同源臂，再通过重叠PCR获得上下同源臂的融合片段；其中，所述的cobB基因来源于原核生物，所述原核生物为钝齿棒杆菌；
（2）选择质粒载体，质粒载体及上述的融合片段经限制性内切酶酶切后，再在连接酶的作用下连接，构建重组质粒；重组质粒经测序验证正确后进行第（3）步；
（3）制备感受态宿主，将重组质粒转入感受态宿主细胞中，采用抗性、菌落PCR筛选阳性克隆子；阳性克隆子进行摇瓶发酵生产精氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质粒载体是适用于不同原核生物进行同源重组的质粒。
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CN101490250A (zh) * 2006-06-12 2009-07-22 J·大卫格莱斯顿学会 通过可逆乙酰化调节蛋白质活性
CN102151335A (zh) * 2010-02-12 2011-08-17 中国科学院上海生命科学研究院 蛋白质赖氨酸乙酰化修饰对代谢的调控及其应用

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proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产;万方等;《中国生物工程杂志》;20150319;第35卷(第8期);第55页左栏第3段，右栏第2段第14至21行 *
To increase the incorporation efficiency of genetically encoding;Yueting Zheng，et al;《Protein Expression and Purification》;20171003;第145卷;第59页摘要 *
代谢酶乙酰化修饰对新陈代谢的调控;明轩等;《生物化学与生物物理进展》;20121130;第40卷(第2期);第130页右栏第2段至第131页左栏第1段第1至14行；图2 *

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