CN108570438A - 提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法及改造菌 - Google Patents

提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法及改造菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α‑酮异戊酸的方法及改造菌。所述方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶，或者还同时失活吲哚‑3‑丙酮酸脱羧酶和/或乳酸脱氢酶。该方法中酶失活后的克雷伯氏肺炎杆菌为改造菌。将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中改造的克雷伯氏肺炎杆菌将培养基中的碳源转化成α‑酮异戊酸。本发明提供的提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α‑酮异戊酸的方法，改造的菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。

Description

提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法及改造菌
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸。
背景技术
α-酮异戊酸又称为2-酮基异戊酸、酮缬氨酸。是一种α-酮酸，α-酮酸不稳定，容易脱羧，导致自然界天然存在的α-酮酸很少。在生物体内，α-酮酸一般仅以中间体的形式存在，作为生物体内多种物质的前体。α-酮异戊酸是一种重要的细胞中间代谢产物。α-酮异戊酸是L-缬氨酸，L-亮氨酸和泛酸合成的前体，现在作为慢性肾脏疾病患者服用L-缬氨酸，L-亮氨酸的替代品。利用α-酮异戊酸作为原料，利用L-缬氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化反应，可以还原氨基化合成L-缬氨酸(Appl Microbiol Biotechnol,1990,34:236-241)。
α-酮异戊酸主要通过化学合成方法进行生产，包括海因法、草酸法等。将海因水溶液与丙酮混合，滴加乙醇胺，通过回流反应可以合成异亚丙基海因。异亚丙基海因在氢氧化钠溶液中回流再用硫酸调节pH到酸性可以获得α-酮异戊酸钠盐(化工时刊，2007,12:5-8)。将草酸二乙酯加入甲醇钠溶液反应，再加入异丁醛反应，再加入氢氧化钠溶液反应后，加入盐酸反应。反应产物经过萃取后加入氢氧化钠，再加入氯化钙，可以合成α-酮异戊酸钠盐(中国专利201210171694)
目前未见野生微生物合成α-酮异戊酸的公开报道。谷氨酸棒杆菌中敲除aceE基因，aceE是丙酮酸脱氢酶复合物中一个亚基的编码基因，敲除转氨酶基因ilvE，同时表达ilvBNCD基因，再敲除丙酮酸：醌氧化还原酶基因pqo构建工程菌株，该工程菌株可以21.8g/L的α-酮异戊酸(Applied And Environmental Microbiology,2010,8053–8061)。
克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏肺炎杆菌用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产菌株，具有底物转化率高和产物终浓度高等优点。未发现关于克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的公开报道。
发明内容
本发明的目的是，提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其应用于生产α-酮异戊酸的方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，该方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶，或者还同时失活吲哚-3-丙酮酸脱羧酶和/或乳酸脱氢酶。
本发明还提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。
所述乙酰乳酸脱羧酶是指催化乙酰乳酸脱羧生成乙偶姻的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，Genebank编号为(gene ID206569613)；所述乳酸脱氢酶是指催化丙酮酸还原成乳酸的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342中基因阅读框如SEQ ID NO.2所示，Genebank编号为(gene ID 206567865)；所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶是指催化吲哚-3-丙酮酸脱羧酶脱羧成吲哚-3-乙酸的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342中基因阅读框如SEQ ID NO.3所示，Genebank编号为(gene ID 008803889)。
本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产α-酮异戊酸中的应用。
本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中菌体将培养基中的碳源转化成α-酮异戊酸。
优选地，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L。所述碳源选自能代谢转化成丙酮酸的化合物，具体包括葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液、以及它们的混合物。所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
优选地，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养的条件为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间。
进一步优选地，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养的条件为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。
优选地，所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌提升菌株生产α-酮异戊酸的方法还包括：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶失活对克雷伯氏肺炎杆菌进行改造，改造后的克雷伯氏肺炎杆菌利用碳源进行发酵培养时，提升了该菌株将碳源转化形成α-酮异戊酸的能力，并使得发酵液中高水平积累α-酮异戊酸。本发明提供的方法，生产菌株基因组中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，原料转化率高，产物终浓度高，原料范围广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01，AC01)乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，来实现乙酰乳酸脱羧酶活性失活。
克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的菌株已经在公开文献(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiellapneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2012 39:1219–1226)中公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见文献(Hao Jian,等.Isolationand characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol underaerobic conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。
1)利用PCR扩增CGMCC 1.6366菌株乙酰乳酸脱羧酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
克雷伯氏肺炎杆菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎杆菌，其全基因组已经测序，并且提交到了genebank。根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶基因PCR引物，上游引物budA-s：GAAGATCAGAACATCGCCAGA(SEQID NO.4所示)，下游引物budA-a：CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT(SEQ ID NO.5所示)。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-budA质粒。测序确定这段DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。
本步骤中的操作，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-budA质粒进行同源重组，获得pMD18T-budA质粒上重组失活的budA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budA基因同源的序列，中间连接抗性盒。
本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见(Wei et.al.Redrecombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：
a.pMD18T-budA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-budA。
b.设计引物budA-F-s和budA-F-a，序列分别为：
GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO.7所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ IDNO.8所示)。
利用引物budA-F-s和budA-F-a，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与budA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。
c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-budA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素用量为50mg/L。
DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-budA上的budA同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔbudA质粒。
d.利用引物budA-s2 TGCCTCAGTGCATGGCCTGGTAG(SEQ ID NO.9所示)和budA-a2TGGCCTCCAGCAAGCGGCGTAGC(SEQ ID NO.10所示)，以pMD18T-ΔbudA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B。
DNA片段B两端具有budA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上budA基因重组的线性DNA片段。
3)利用转化将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙酰乳酸脱羧酶重组失活的菌株，具体步骤如下：
将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，将转化有pDK6-red质粒的CGMCC 1.6366命名为CGMCC 1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。
同样的方法，利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌SARI 01、SARI 02菌株乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，来实现乙酰乳酸脱羧酶活性失活。SARI01和SARI 02菌株为中国科学院上海高等研究院从土壤中分离到的两株克雷伯氏肺炎杆菌。分离方法与(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of MicrobiologyBiotechnology 2008,24:1731-1740)描述相同。
将pDK6-red质粒转化到SARI 01中，将转化有pDK6-red质粒的SARI 01命名为SARI01-pDK6-red菌株。线性DNA片段B电击转化SARI01-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS1-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。
将pDK6-red质粒转化到SARI 02中，将转化有pDK6-red质粒的SARI 02命名为SARI02-pDK6-red菌株。线性DNA片段B电击转化SARI02-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS2-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。
实施例2
利用基因重组方法构建乙酰乳酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶基因同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌，来实现乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时失活。
1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乳酸脱氢酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
根据克雷伯氏肺炎杆菌342基因组信息，设计乳酸脱氢酶基因PCR引物，上游引物ldhA-s：AGAGCGCACAGGACCACTATCCA(SEQ ID NO.11所示)，下游引物ldhA-a：TCGGCGAGCTTATAGACCAGCGT(SEQ ID NO.12所示)。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乳酸脱氢酶基因及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-ldhA质粒。经过序列测定，其序列如(SEQ ID NO.13所示)
2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。
本步骤中的操作，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-ldhA质粒进行同源重组，获得pMD18T-ldhA质粒上重组失活的ldhA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与ldhA基因同源的序列，中间连接抗性盒。
具体步骤如下：
a.pMD18T-ldhA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-ldhA。
b.设计引物ldhA-F-s和ldhA-F-a，序列分别为：
ACCGCCAAAACCGCCCACGGTTGCGAAGCGGTATGCATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO.14所示)和CAGCGCCTCGGCGGTGAGGAACGCCTGATGGCCGGTGAACTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQID NO.15所示)。
利用引物ldhA-F-s和ldhA-F-a，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A2。该片段的两端分别具有与乳酸脱氢酶序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。
c.利用DNA片段A2转化感受态DH5α-pMD18T-ldhA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。
DNA片段A2两侧的同源序列与质粒pMD18T-ldhA上的ldhA同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔldhA质粒。
d.利用引物ldhA-s2 CTGCTGCTGCTGGGAACATTC(SEQ ID NO.14所示)和ldhA-a(SEQID NO.11所示)，以pMD18T-ΔldhA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B2。
DNA片段B2两端具有ldhA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B2中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上ldhA基因重组的线性DNA片段。
3)利用转化将制备的DNA片段B2转入到克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA中，DNA片段B2与染色体上的乳酸脱氢酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体乳酸脱氢酶重组失活的菌株，具体步骤如下：
线性DNA片段B2电击转化已经含有pDK6-red质粒的Kp-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA-ΔldhA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和乳酸脱氢酶基因通过同源重组而同时失活。
4)线性DNA片段B2电击转化已经含有pDK6-red质粒的KpS1-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS1-ΔbudA-ΔldhA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和乳酸脱氢酶基因通过同源重组而同时失活。
线性DNA片段B2电击转化已经含有pDK6-red质粒的KpS2-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS2-ΔbudA-ΔldhA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和乳酸脱氢酶基因通过同源重组而同时失活。
实施例3
利用基因重组方法构建乙酰乳酸脱羧酶基因和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌，来实现乙酰乳酸脱羧酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时失活。
1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌吲哚-3-丙酮酸基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
根据克雷伯氏肺炎杆菌342基因组信息，设计吲哚-3-丙酮酸基因PCR引物，上游引物ipdC-s：GCATAGAGCCCATCTCCTGAATCGT(SEQ ID NO.16所示)，下游引物ipdC-a：ACACCGCCTTTATCACCCCCTTTCT(SEQ ID NO.17所示)。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得丙酮酸脱羧酶基因及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-ipdC质粒。经过序列测定，其序列如(SEQ ID NO.18所示)。
2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。
本步骤中的操作，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-ipdC质粒进行同源重组，获得pMD18T-ipdC质粒上重组失活的ipdC基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与ipdC基因同源的序列，中间连接抗性盒。
具体步骤如下：
a.pMD18T-ipdC质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-ipdC。
b.设计引物ipdC-F-s和ipdC-F-a，序列分别为：
CTGACGCATCATCGGCCTGGCTATCTGATGCTGCCGGCCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO.19所示)和GCGTGCCGATGCAGATGATGGTGTCGGCGTTTTCGATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ IDNO.20所示)。
利用引物ipdC-F-s和ipdC-F-a，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A3。该片段的两端分别具有与丙酮酸脱羧酶序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。
c.利用DNA片段A3转化感受态DH5α-pMD18T-ipdC感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。
DNA片段A3两侧的同源序列与质粒pMD18T-ipdC上的ippdC同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔipdC质粒。
d.利用引物ipdC-s(SEQ ID NO.16所示)和ipdC-a(SEQ ID NO.17所示)，以pMD18T-ΔipdC质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B3。
DNA片段B3两端具有ipdC基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B3中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B3用于进行CGMCC1.6366染色体上ipdC基因重组的线性DNA片段。
3)利用转化将制备的DNA片段B3转入到克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA中，DNA片段B3与染色体上的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体吲哚-3-丙酮酸脱羧酶重组失活的菌株，具体步骤如下：
线性DNA片段B3电击转化已经含有pDK6-red质粒的Kp-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA-ΔipdC，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶通过同源重组而同时失活。
实施例4
利用基因重组方法构建乙酰乳酸脱羧酶基因和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌，来实现乙酰乳酸脱羧酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时失活。
1)对实施例2中获得的菌株Kp-ΔbudA-ΔldhA消去安普霉素抗性，具体具体步骤如下：
a.Kp-ΔbudA-ΔldhA中质粒的消除
实施例2中获得的Kp-ΔbudA-ΔldhA在不含抗生素的LB试管培养基内，加入30μl/3ml的10％(w/v)SDS水溶液，再接种Kp-ΔbudA-ΔldhA菌株，12小时传代一次，三次传代后，稀释涂布无抗LB平板。筛选平板上长出的单菌落，接种与无抗LB平板和卡那霉素抗性平板，采用印章法进行筛选。当无抗板上生长而卡那霉素抗性平板上不生长的，即为pDK6-red质粒已消除的菌。
b.Kp-ΔbudA-ΔldhA中安普霉素抗性的消除
将质粒pDK6-flp电转入Kp-ΔbudA-ΔldhA中。于LB培养基中过夜培养，加入终浓度1mmol/L的IPTG，每隔12h传代一次，3次传代。涂布于不含抗生素的LB平板培养。筛选平板上长出的单菌落，用无抗LB平板和安普霉素抗性平板筛选。当无抗板上生长而安普霉素抗性平板上不生长的，即为抗性基因已消除的菌。得到消除安普霉素抗性的菌株Kp-ΔbudA(Str)-ΔldhA。
2)利用转化将制备的DNA片段B3转入到消除安谱霉素抗性的克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA(Str)-ΔldhA中，DNA片段B3与染色体上的丙酮酸脱羧酶基因进行同源重组，筛选获得染色体丙酮酸脱羧酶基因重组失活的菌株，具体步骤如下：
线性DNA片段B3电击转化已经含有pDK6-red质粒的和Kp-ΔbudA(Str)-ΔldhA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC。菌株Kp-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC的乙酰乳酸脱羧酶基因、乳酸脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因同时失活。
实施例5
采用实施例2、3、4中相同的方法，分别利用SARI 01、SARI 02替代实施例2、3、4中的CGMCC 1.6366及其衍生菌株，获得KpS1-ΔbudA-ΔldhA、KpS1-ΔbudA-ΔipdC、KpS1-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA、KpS2-ΔbudA-ΔipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC菌株。
实施例6
将实施例1-5中获得的菌株进行摇瓶批次发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基，摇瓶柜转速100转每分钟，恒温30℃进行发酵培养。
培养基组分为：葡萄糖10g/L，酵母膏1g/L，碳酸钙0.5g每瓶。
培养24小时，测定发酵液中组分。测定采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱60℃。α-酮异戊酸和α-酮异戊酸盐在本发明中不做区分，都以α-酮异戊酸计。各菌株发酵结果如表1所示。
表1，摇瓶发酵实验中各菌株的发酵数据结果
从表1的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖好氧发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA，KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔipdC)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性、乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。
实施例7
将实施例1-5中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：甘油100g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L,硫酸铵5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量3L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度25℃，利用氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在5.5，发酵48小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表2所示。
表2，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果
野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用甘油好氧发酵不合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用甘油培养合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用甘油培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔipdC)利用甘油培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性、乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC)利用甘油培养合成α-酮异戊酸能力提高。
实施例8
将实施例1-5中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖200g/L，玉米浆50g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量2L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度45℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在8.5，发酵72小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表3所示。
表3，实施例6发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果
从表3的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔipdC)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性、乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。
实施例9
将实施例1-5中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，木糖30g/L玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度30℃，利用氨水保持发酵液的pH值稳定在6.5，发酵48小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表4所示。
表4，实施例7发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果
从表4的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖和木糖发酵培养主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔipdC)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性、乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。
实施例10
将实施例1-3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度40℃，利用氨水保持使发酵液的pH值稳定在7.5，发酵48小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表5所示。
表5，实施例8中各菌株的发酵数据结果
从表5的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖好氧发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔipdC)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。乙酰乳酸脱羧酶活性、乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA-ΔipdC)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸能力提高。
实施例11
将将实施例4-5中获得的菌株进行流加发酵罐发酵实验。
将实施例4-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。
培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度37℃，利用氢氧化钠稳定发酵液pH 7.0，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1-20g/L时，补加50％(g/g)的葡萄糖溶液，发酵82小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表6所示。
表6，实施例9中各菌株的发酵数据结果
从表6的数据可以看出：利用流加发酵，乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性失活的菌株可以合成33.2-38.9g/L的α-酮异戊酸。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院上海高等研究院
<120> 提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法及改造菌
<130> 2017
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342
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gtttctatat tggaactgtg agctgaatcg ggtcaacatt tatttaacct ttcttatatt 960
tgttgaacga ggaagtggta tatgaatcat tctgctgaat gcacctgcga agagagtctg 1020
tgcgaaaccc tgcgggcgtt ttccgcgcag catcccgaga gcgtgctcta tcagacatcg 1080
ctcatgagcg ccctgctgag cggggtttac gaaggcagca ccaccatcgc ggacctgctg 1140
aagcacggcg atttcggtct cggcaccttt aatgagctgg acggggagct gatcgccttc 1200
agcagtcagg tctatcagct gcgggccgac ggcagcgcgc gcaaagccca gccggatcag 1260
aaaacgccgt tcgcggtgat gacctggttc cagccgcagt accggaaaac cttcgaccat 1320
ccggtgagcc gccagcagct gcacgaggtg atcgaccagc aaatcccctc tgacaacctg 1380
ttctgcgccc tgcgcatcga cggccatttc cgccatgccc atacccgcac cgtgccgcgc 1440
cagacgccgc cgtaccgggc gatgaccgac gtcctcgacg atcagccggt gttccgcttt 1500
aaccagcgcg aaggggtgct ggtcggcttc cgtaccccac agcatatgca ggggatcaac 1560
gtcgccgggt atcacgagca ctttataacc gatgaccgca aaggcggcgg tcacctgctg 1620
gattaccagc tcgaccacgg ggtattgacc ttcggcgaaa ttcacaagct gatgatcgac 1680
ctgcccgccg acagcgcgtt cctgcaggcc aatctgcatc ccgataatct cgatgccgcc 1740
atccgttccg tagaaagtta agggggtcac atggacaaac agtatccggt acgccagtgg 1800
gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagccag ctggaagccc agggggtacg tcaggtgttc 1860
ggcatccctg gcgccaaaat cgacaaggta ttcgactcac tgctggattc ctccattcgc 1920
attattccgg tacgccacga agctaacgcc gcctttatgg ccgccgccgt cgggcgcatt 1980
accggtaaag cgggcgtggc gctggtcacc tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc 2040
ggtatggcca ccgccaacag cgaaggcgac ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtgaaa 2100
cgcgccgata aggccaaaca ggtccaccag ag 2132
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccctgctga gcggggttta cgaaggcagc accaccatca ttccggggat ccgtcgacc 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgcggtcat cggttataaa gtgctcgtga tacccggcga tgtaggctgg agctgcttc 59
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgcctcagtg catggcctgg tag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggcctccag caagcggcgt agc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agagcgcaca ggaccactat cca 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcggcgagct tatagaccag cgt 23
<210> 13
<211> 2163
<212> DNA
<213> 克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366
<400> 13
tcggcgagct tatagaccag cgtctggtcg gcggtcgcca gcgtcaactg gttttccgtc 60
agatcgacct gcgcgccctc gcgcagcatc ttaccaatgg tcgcgtcaag ggtattgagc 120
tgggcatcgt ggcacagcat ccgggtcatc gccagcgatt taaccttcag ctcgccgtcc 180
gacaccttac cttccccgct gaagccgttg cacatattgc ccgaaacata catattgccc 240
gtaagagtcg tcttctcgcc gaagctcagc tccagcggcc ggtcgcccgc gttcaccgcc 300
tggccgttga cgctggtcaa cacgaaacga tgatgctgta gctgttccgc gccggtggac 360
accttactgt tatagacaca gccggacagc agcaaccctg ccgccagtaa tgccgcaaat 420
ttgttcattt ttactccaaa acattcacat tactaataaa acaaagccag tgtaacggta 480
tcgcagcggg gatctgtggg gattatctga atgtgctccc ccggggagag gagcacaaaa 540
gggaaaggaa tcagacgata gcgttcgggc aggtttcacc gttggcgacc tgctgcagat 600
tgcccagggt ggtctccgaa atgctgatca gcgcctcggc ggtgaggaac gcctgatggc 660
cggtgaacag cacgttgtgg caggcggaga ggcgacggaa gacgtcgtcc tggatcacgt 720
cgttagattt gtcttcgaag aacagatcgc gttcgttctc ataaacgtcc agccccagcg 780
cgccgatttt ctggtgcttc agggcatcga tggccgcctg ggaatcgatc agcgcgccgc 840
ggctggtgtt aatcaccatc accccgtcct tcatctgatc gaaggcctcg cgattgagca 900
gatggtagtt ttcgtcggtg agcgggcagt gcagggagat cacgtccgac tccttgtaca 960
gcgtggccag gtcaacatat tccaccccca gctccagcgc ggcggcgctt gggtacgggt 1020
caaaagccag cagacgcatg ccgaagcctt taaggatccg tagcatcgcc acgccaattt 1080
tcccggtgcc gatcaccccg gcggttttgc cgtacatggt gaaaccggtg aggccttcga 1140
gggagaaatt ggcatcacgg gtacgctggt aggcgcggtg gatgcggcgg ttaagcgaca 1200
tcatcatgcc gatcgcatgt tcagcgaccg cttccggcga gtaggccggg acgcgcacga 1260
cgcgcaggcc aagcgctttc gccgcctcga ggtcgacgtt gttaaacccg gcgcagcgca 1320
gggcgatata cttcacgccg tgggccttca gctcctccag caccggacgg ctgccgtcgt 1380
cattgacgaa gatgcatacc gcttcgcaac cgtgggcggt tttggcggtt ttctctgtca 1440
gcaggaagtc gaagaattcc agttcaaagc cgtaagtatc attaacgtgc tgcaggtact 1500
ttttatcgta ctgcttcgta ctgtaaaccg cgattttcat aagacttttc tccagtgatt 1560
ataacgtcac ggtagcatat ttaaaataat cgtacaatta ttaaaaaata gtttaaatag 1620
caggtgctta tcctaattct agagcatatc gcggatttgc ggaatctctt tgaaagacaa 1680
agttttttca ccacaaactc aggcttaaag cgccggggga gagcagcaga aacggccaca 1740
gcagaccgga ggtgacgtta gccagctgaa acgaccacag cggcaggccg ctggcgccgc 1800
tgaccagggg cagggtggcg cgcaggggag agaggaagcg actgaaaaag accgcccaca 1860
gcccgcggcg ctgaaaaaag agtcgactgc gggccagccg ctcggcggtc agccagcgca 1920
actgcgtgag gcggtgacga tagcgaacgc ctaaccacca cgagagccag aatccgccga 1980
tggcgccgag gctggcgctg gaccacatta acaggaaatg acccaggctg gcggacgcga 2040
atgtccccag cagcagcagg ccggaggtgc ccgggatcgc cagcgacacc agcgcgcagg 2100
atttagtgaa agtgagcagg aaaaccatca gtaataccaa tggatagtgg ccctgtgcgc 2160
tct 2163
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
accgccaaaa ccgcccacgg ttgcgaagcg gtatgcatat tccggggatc cgtcgacc 58
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagcgcctcg gcggtgagga acgcctgatg gccggtgaac tgtaggctgg agctgcttc 59
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcatagagcc catctcctga atcgt 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acaccgcctt tatcaccccc tttct 25
<210> 18
<211> 1432
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcatagagcc catctcctga atcgtcagct gggcggcgcc atcgccgacg atcagcacca 60
cccgccgctc tgccgccgcg gtttgcgcgc cataggcggc cgggagggta aaaccaatcg 120
agccccacag cggctggacg atcagcgacg cctctgacgg cagcttcagc gcggcaatgc 180
cgaaggcggc cgtcccctgg tcggcgagaa taatatcgcc gggacgcagc gccccctgca 240
ccgtcgccca gaaatttttc tgcgtgagtt cgccgtcggc cccctcctcc acttccggcg 300
ccacgacctg aggcgcagcc cactccgccg ccagcggtgc ggaaagggtc atcagcgcag 360
ccagtgcctg atccatcggc acgccgctga accagtgatc gcccaccctg accgcgaagg 420
gctggatctc tatcgtctta tcccgcgcca gatgctgggt gaatcccgcg gtgatggtgt 480
cggtgaagcg cgtgccgatg cagatgatgg tgtcggcgtt ttcgatggcc tcccgggtct 540
gcggcgcgct ggcgataccg ctgtaggtgc cgacaaaacc tctctgctgc tcatcgaaca 600
gccccttgcc cattagcatg gtggcgtggg cgacgggggt tttcgccacc cactcccgga 660
gcgtgttttg caggccatag cgttgcgcga ggaagtccgc cagcagggag atgcgtcgac 720
tgccccgcag caggcggctg gcatgctcgc agaatccggc gagctggttt tcatccgccg 780
gagcggcctc caccagcaag cgctgcgctg gggcaatcgc tgccgctctg gcgacatcgg 840
ccggcagcat cagatagcca ggccgatgat gcgtcagcat atcgcgcaga acacggtcga 900
tctcatggca ggcgttgccg gcggtcagca gcgcctggct acaggtgatc tgctcgctca 960
tccgcgcaaa atggcggaaa tcgccgtcgc ccagggtgtg atgcagcagt tcgccgcgct 1020
gctgagcgcc agtggagggc gcgccgacga tatgtaatac cggaatatgc tccgcatagc 1080
tgcccgccac gccgttcagg gcgctcagtt cgccgacgcc gtaggttgta agtaacgcac 1140
cggctccctt aatgcgtgca taaccgtcag cagcataggc cgcattgagc tcgttggcgc 1200
agccgaccca ccccaacgcg ctgtgcgcaa tgacccggtc gagaaactgt aagttgtaat 1260
ctcccggcac gccgaacaag cggtcaatac cgcagtcgac gaggcgatcc agcagataat 1320
ccccaatagt gtaagtcggt tgcatatcca ttttcctcat tttggcgcag gtgtaatttg 1380
agtattgaat aagcgatccg cctgtccaga aagggggtga taaaggcggt gt 1432
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctgacgcatc atcggcctgg ctatctgatg ctgccggcca ttccggggat ccgtcgacc 59
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcgtgccgat gcagatgatg gtgtcggcgt tttcgatggt gtaggctgga gctgcttc 58

Claims (8)

1.提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，该方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶，或者还同时失活吲哚-3-丙酮酸脱羧酶和/或乳酸脱氢酶。
2.改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者乙酰乳酸脱羧酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。
3.权利要求2所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，该方法为：将所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中菌体将培养基中的碳源转化成α-酮异戊酸。
4.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，其特征在于，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌发酵培养的条件为：发酵温度为25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间。
5.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，其特征在于，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌发酵培养的条件为：发酵温度为30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。
6.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，其特征在于：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。
7.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L；所述碳源选自葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液中的一种或多种；所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
8.权利要求2所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产α-酮异戊酸中的应用。
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