CN102712912A

CN102712912A - 在乳酸菌中改善流向乙酰乳酸来源产物的流量

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Publication number: CN102712912A
Application number: CN2010800539407A
Authority: CN
Inventors: B·J·保罗; W·苏
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2012-10-03
Also published as: BR112012006941A2; AU2010300722A1; WO2011041402A1; US9169499B2; JP2013505739A; US20110136192A1; EP2483400A1; CA2776151A1; IN2012DN02396A

Abstract

本发明开发了工程化方法以允许基因修饰以及缺失乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶活性的乳酸菌细胞的分离。在具有这些修饰和异丁醇生物合成途径的细胞中，观察到改善的异丁醇产量。

Description

在乳酸菌中改善流向乙酰乳酸来源产物的流量

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2009年9月29日提交的美国临时专利申请61/246717的优先权，将所述文献全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及工业微生物学和乳酸菌代谢领域。更具体地讲，制备工程化的基因修饰以降低或消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶基因的酶活性，从而提高作为生物合成期望产物(包括异丁醇)底物的乙酰乳酸的可用性。

发明背景

已经改变了在乳酸菌的内源生物合成途径中的代谢流量以产生使用丙酮酸作为起始底物的产物。在乳酸菌中的主要丙酮酸代谢途径是通过乳酸脱氢酶(LDH)的活性将其转化成乳酸。在乳酸菌中使丙酮酸代谢产物从乳酸改为其他产物的代谢工程已经产生不可预知的结果。在表达丙氨酸脱氢酶的LDH缺陷型乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中产生丙氨酸在Hols等人(Nature Biotech.17：588-592(1999))中示出。然而，在表达丙酮酸脱羧酶的LDH缺陷型植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)中乙醇的产量是非常有限的，流向乙醇的碳流未显著改善并且仍产生乳酸(Liu等人(2006)J.Ind.Micro.Biotech.33：1-7)。

在乳酸菌中也通过某个途径将丙酮酸转化成乙酰乳酸，然后通过乙酰乳酸脱羧酶将其转化成乙偶姻，随后转化成2，3-丁二醇。附加的途径将乙酰乳酸转化成丁二酮、缬氨酸或亮氨酸。Monnet等人(Applied andEnvironmental Microbiology 66：5518-5520(2000))已经通过化学诱变消除了乙酰乳酸脱羧酶活性并降低了LDH活性以提高乙酰乳酸、乙偶姻和丁二酮的产量。在美国专利申请公布20100112655中公开了在乳酸菌中通过表达异源丁二醇脱氢酶活性并基本上消除乳酸脱氢酶活性以工程化从丙酮酸转化为2，3-丁二醇的高流量。

在共同未决的美国专利申请公布2010-0081183中公开了通过表达异源DHAD并基本上消除乳酸脱氢酶活性来工程化乳酸菌以获得高二羟酸脱水酶(DHAD)活性。DHAD是在共同未决的美国专利申请公布US20070092957A1中公开的用于合成异丁醇的生物合成途径中的一个酶。在其中公开了用于产生异丁醇的重组微生物的工程化。异丁醇作燃料添加剂是有用的，其可用性可减少对石油化学燃料的需求。

在de Vos等人(Int.Dairy J.8：227-233(1998))中公开了在快速生长的乳酸菌细胞中组合灭活编码乙酰乳酸脱羧酶的aldB与灭活编码乳酸脱氢酶的ldh似乎是不可能的。

需要改变乳酸菌中流向乳酸和从乙偶姻流向2，3-丁二醇途径的代谢流，并且使其流向乙酰乳酸下游的其他生物合成途径，例如产生异丁醇的生物合成途径。

发明概述

本文所公开的是经基因修饰以消除乳酸脱氢酶活性并降低或消除乙酰乳酸脱羧酶活性的乳酸菌细胞，所述酶由编码乳酸脱氢酶(ldh)和乙酰乳酸脱羧酶(aldB)的基因内源性表达。所述细胞无可检测到的脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶活性。这些细胞可用于产生异丁醇和利用乙酰乳酸作为中间体的其他产物。

因此，提供重组乳酸菌细胞，所述细胞包含降低或消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰和消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰。

在另一个实施方案中，重组乳酸菌细胞还可包含至少一个降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的基因修饰。也可包括其他基因修饰例如附加的生物合成途径和/或附加的修饰，所述修饰使细胞可利用多种底物或产生其他产物。

在另一个实施方案中，提供了制备重组乳酸菌细胞的方法，包括：

a)提供乳酸菌细胞；

b)通过基因工程来修饰(a)的细胞中编码乳酸脱氢酶的至少一个内源性基因以消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性；

c)在(b)的细胞中从质粒表达乙酰乳酸脱羧酶活性以产生具有非染色体表达的乙酰乳酸脱羧酶的细胞；

(d)通过基因工程来修饰(c)的细胞中编码乙酰乳酸脱羧酶的内源性基因以消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性；以及

(e)从(d)的细胞去除表达乙酰乳酸脱羧酶活性的所述质粒；

从而制备缺失内源性表达的乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的重组乳酸菌细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了产生异丁醇的方法，包括：

(a)提供乳酸菌细胞，该细胞包含：

i)消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的至少一个基因修饰和消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性的至少一个基因修饰；和

ii)异丁醇生物合成途径：以及

(b)在其中产生异丁醇的条件下培养(a)的细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了乳酸菌的整合载体，其包含：

a)可操作地连接至在LAB细胞中有活性的启动子的Tn-5转座酶编码区；

b)邻接在乳酸菌细胞中有活性的选择标记和被靶向用于整合的DNA片段的Tn5IE和TN5OE元件；

c)在大肠杆菌细胞中有活性的选择标记；

d)大肠杆菌细胞的复制起点；

e)温度敏感型的乳酸菌细胞的复制起点；

其中所述Tn5IE和TN5OE元件指导b)的DNA片段的随机整合。

在另一个实施方案中，本发明提供了将DNA片段随机整合到LAB细胞基因组的方法，包括：

a)提供载体，该载体包含：

(i)可操作地连接至在乳酸菌细胞中有活性的启动子的Tn-5转座酶编码区；

(ii)邻接在大肠杆菌和乳酸菌细胞中有活性的选择标记的Tn5IE和TN5OE元件；

(iii)在乳酸菌细胞中有活性的第二选择标记；

(iv)大肠杆菌细胞的复制起点；

(v)条件性有活性的乳酸菌细胞的复制起点；

b)将用于整合的DNA片段置于步骤a(ii)的元件之间以产生整合构建体；

c)将所述整合构建体转化到乳酸菌细胞中，从而制备转化的细胞；

d)使用步骤a(ii)的选择标记，在允许条件下培养并选择步骤(c)的转化的细胞以制备选择的转化子；以及

e)在非允许条件下培养步骤(d)的选择的转化子；

其中从所述乳酸菌细胞中去除所述载体并将所述用于整合的DNA片段随机整合到所述乳酸菌细胞的基因组中。

附图和序列简述

从下文的发明详述、附图和附带的序列描述中可较充分地理解本发明的多个实施方案，它们形成本专利申请的一部分。

图1示出乳酸菌中起始于丙酮酸的生物合成途径的图表。

图2示出生物合成异丁醇的生物合成途径。

下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(a-bis规则)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

表1：乳酸脱氢酶编码区和蛋白质的SEQ ID NO

表2：乙酰乳酸脱羧酶编码区和蛋白质的SEQ ID NO

表3：丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸甲酸裂解酶激活酶编码区和蛋白质的SEQ ID NO

表4：表达编码区和蛋白质的SEQ ID NO

^*由天然序列或最优化序列编码的相同蛋白质序列

SEQ ID NO：95和96是转座酶识别位点Tn5IE和Tn5OE。

SEQ ID NO：97是质粒pFP996的序列。

SEQ ID NO：89、90、98-113、117、118、120-122、124-129、131-136、139-142、144-147、149-151、153、154、156、159-169、171-175、178-182和184-190是PCR和测序引物。

SEQ ID NO：114是核糖体结合位点(RBS)。

SEQ ID NO：115是质粒pDM20-ilvD(乳酸乳球菌(L.lactis))的序列。

SEQ ID NO：116质粒pDM1的序列。

SEQ ID NO：119是PCR片段的序列，该片段包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的RBS和ilvD编码区。

SEQ ID NO：123是右同源臂DNA片段，其包含suf操纵子(sufC和部分sufD)的5′部分。

SEQ ID NO：130是左同源臂DNA片段，其包含天然suf启动子和feoBA操纵子的上游序列。

SEQ ID NO：137是质粒pTN6的序列。

SEQ ID NO：138是Tn5IE-loxP-cm-Pspac-loxP盒的序列。

SEQ ID NO：143是Pnpr启动子。

SEQ ID NO：148是Pnpr-tnp融合DNA片段。

SEQ ID NO：152是PgroE启动子序列。

SEQ ID NO：155是PCR片段，其包含kivD(o)编码区以及RBS。

SEQ ID NO：157是sadB编码区，其经优化以在植物乳杆菌(L.plantarum)中表达。

SEQ ID NO：158是DNA片段，其包含RBS和sadB(o)编码区。

SEQ ID NO：170是PrrnC1启动子。

SEQ ID NO：176质粒pDM5的序列。

SEQ ID NO：177是lacI-PgroE/lacO片段。

SEQ ID NO：183是质粒pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))的序列。

发明详述

本发明涉及经基因工程修饰以降低或消除由编码乙酰乳酸脱羧酶(aldB)和乳酸脱氢酶(ldh)的基因编码的内源性表达酶的酶活性的重组乳酸菌(LAB)细胞。由于这些修饰基因表达的降低或消除，所述细胞具有降低的或不具有乙酰乳酸脱羧酶活性，并且不具有乳酸脱氢酶活性。本发明也涉及获取LAB细胞的方法，所述细胞缺失乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性，具有aldB和ldh的工程化基因修饰，其需要非染色体地表达其中一个活性，同时修饰染色体基因。然后去除非染色体基因。

在这些细胞中从丙酮酸流向乙酰乳酸而不是乙偶姻的流量增加。这些细胞可用于产生异丁醇和利用乙酰乳酸作为中间体的其他产物。异丁醇用作燃料或燃料添加剂以取代化石燃料。

以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的判读。

如本文所用，术语“包含”、“含有”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“具备”、“包容”或“容纳”或任何其它变型旨在涵盖非排他性的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，并且不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真实的(或存在的)且B是虚假的(或不存在的)，A是虚假的(或不存在的)且B是真实的(或存在的)，以及A和B都是真实的(或存在的)。

同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。

如本文所用，用术语“约”修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变化，它们可能发生在，例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。

术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。

术语“乳酸脱氢酶”指具有催化丙酮酸转化成乳酸的酶活性的多肽(或多个多肽)。已知乳酸脱氢酶是EC 1.1.1.27(L-乳酸脱氢酶)或EC1.1.1.28(D-乳酸脱氢酶)。

术语“乙酰乳酸脱羧酶”指具有催化乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶活性的多肽(或多个多肽)。已知乙酰乳酸脱羧酶是EC 4.1.1.5。

术语“丙酮酸甲酸裂解酶”，也称为“甲酸C-乙酰转移酶”，指具有催化丙酮酸转化成甲酸的酶活性的多肽。已知丙酮酸甲酸裂解酶是EC 2.3.1.54。

术语“丙酮酸甲酸裂解酶激活酶”，也称为“甲酸C-乙酰转移酶激活酶”，指丙酮酸甲酸裂解酶活性必需的多肽。已知甲酸C-乙酰转移酶激活酶是EC 1.97.1.4。

术语“兼性厌氧菌”是指在有氧和缺氧环境中均能生长的微生物。

术语“碳底物”或“可发酵碳底物”指能够被本发明的宿主生物体代谢的碳源，特别是选自下列的碳源：单糖、低聚糖、多糖和一碳底物或它们的混合物。

术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，任选地包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外源基因”或“异源基因”指正常情况下不存在于宿主生物中，但是通过基因转移导入宿主生物或经某些方法修饰而改变其天然状态如改变其表达的基因。“异源基因”包括天然编码区或其部分，将其以不同于对应天然基因的形式再导入来源生物中。例如，异源基因可包括是被再引入至天然宿主的嵌合基因的一个部分的天然编码区，其中所述嵌合基因包括非天然的调控区。外源基因还可以包括插入到非天然生物内的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至可包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，以便其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

如本文所用，术语“表达”指转录和有义(mRNA)的稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，术语“转化”指将核酸分子转化到宿主细胞中，可将其以质粒形式或整合到基因组中保持。含有转化核酸分子的宿主细胞被称为“转基因”或“重组”或“转化”细胞。

如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且通常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起导入细胞中。

如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成编码区用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对编码区进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。

如本文所用，“分离的核酸片段”或“分离的核酸分子”将可以互换使用，并且将指单链或双链的RNA或DNA聚合体，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是为人们所熟知的并例示于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，尤其是其中的第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。可以调节严格条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组较优选的严格条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高严格条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC，0.1％SDS进行。例如，另一组严格条件包括在0.1X SSC，0.1％SDS中于65℃下杂交并用2X SSC，0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％SDS洗涤。

杂交需要包含互补序列的两种核酸，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最小长度优选地为至少约15个核苷酸；更优选地为至少约20个核苷酸；并且最优选地长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域的技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Altschul，S.J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。受益于本文所报道的序列，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的基本部分用于本领域的技术人员已知的目的。因此，本发明包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。

如本领域已知的，术语“％同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类序列串之间的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知的方法容易地计算，包括但不限于以下文献中所述的方法：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)，Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informaticsand Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in MolecularBiology(von Heinje，G.编辑)，Academic(1987)；和5.)Sequence AnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。

设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和％同一性可使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM程序进行计算。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为Clustal V比对方法的“Clustal V比对方法”，该方法描述于Higgins和Sharp，(CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))并存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlign^TM程序中。对于多重比对，默认值对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10和空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的％同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“％同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W(在Higgins和Sharp，CABIOS；5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)，Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22：46734680)并存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)的MegAlign^TM v6.1程序中。用于多重比对的默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列、DNA权重矩阵(DNA WeightMatrix)＝IUB)。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“％同一性”。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。％同一性的有用实例包括但不限于：24％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或从24％至100％的任何整数百分比可用于描述本发明，例如25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。

术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1.)GCG程序软件包(Wisconsin PackageVersion 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments withGene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)出版。

改善乳酸菌中的异丁醇产量

本发明提供异丁醇产量极大改善的乳酸菌(LAB)细胞，其具有基因修饰例如某些基因的去除，所述修饰消除了这些细胞中的乳酸脱氢酶活性并降低或消除了乙酰乳酸酶活性。

在LAB细胞中通过减少乳酸脱氢酶(Ldh)活性的表达改变了流向乳酸的丙酮酸主要流量。随着Ldh活性降低，可提高丙酮酸经由乙酰乳酸合酶流向乙酰乳酸的流量，并且从乙酰乳酸转化成乙偶姻(参见图1)。乙酰乳酸脱羧酶催化乙酰乳酸转化成乙偶姻。已经发现在乙酰乳酸脱羧酶无效LAB细胞中的乳酸脱氢酶活性降低引起生长约20小时后乙酰乳酸和乙偶姻增加(Monnet等人，Appl and Envrt.Microbiology66：5518-5520(2000)。因此，乙酰乳酸高效转化成乙偶姻甚至在缺失乙酰乳酸脱羧酶活性的情况下发生。Monnet等人(ibid.)通过化学诱变、随后通过筛选酶活性降低的细胞制备经修饰的LAB细胞。因此，与制备工程化基因修饰相比，基因组改变的实际情况是未知的。

在本发明中开发了方法以工程化基因修饰，从而消除LAB细胞中由乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶基因编码的酶活性。如本发明所述消除酶活性意味着消除可评估的或可检测到的功能活性水平。不能使用标准工程化方法获得这些修饰。如本文所述，发现在存在异丁醇生物合成途径并具有这些修饰的LAB细胞中，异丁醇产量比具有ldh基因去除但无aldB去除的细胞中的异丁醇产量提高了6倍。因此，异丁醇途径能够有效地使流量转向从乙酰乳酸中产生乙偶姻。

工程化基因修饰以消除由修饰编码乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶的基因产生的酶活性可根据下述在任何LAB中完成，也可将其工程化以获得异丁醇生物合成途径。在本公开中可为宿主细胞的LAB包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)和链球菌属(Streptococcus)。

消除乳酸脱氢酶活性

在本发明中工程化LAB中的基因修饰以消除内源性表达的乳酸脱氢酶基因的酶活性，所述基因在发酵以产生产物期间在生长条件下天然表达。LAB可具有一个或多个基因，通常具有一个、两个或三个基因，所述基因编码乳酸脱氢酶。例如，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具有三个编码乳酸脱氢酶的基因，它们名为ldhL2(蛋白质SEQ ID NO：6，编码区SEQ ID NO：5)、ldhD(蛋白质SEQ ID NO：2，编码区SEQ ID NO：1)和ldhL1(蛋白质SEQ ID NO：4，编码区SEQ ID NO：3)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)具有一个编码乳酸脱氢酶的基因，其名为ldhL(蛋白质SEQ ID NO：8，编码区SEQ ID NO：7)，并且戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)具有两个基因，它们名为ldhD(蛋白质SEQ ID NO：14，编码区SEQ ID NO：13)和ldhL(蛋白质SEQ ID NO：16，编码区SEQ IDNO：15)。

对至少一个编码乳酸脱氢酶的基因进行基因修饰以消除其活性。当多于一个乳酸脱氢酶基因在用于制备的生长条件下表达(显示活性)时，可对这些活性基因中的每一个进行基因修饰以影响它们的表达，使得酶活性被消除。例如，在植物乳杆菌(L.plantarum)中修饰ldhL1和ldhD基因。就在典型条件下生长而言，不需要修饰第三个基因ldhL2，因为这个基因似乎在这些条件下无活性。通常中断编码乳酸脱氢酶的一个或多个基因的表达以消除表达的酶活性。可导致中断的LAB乳酸脱氢酶基因的实例为表1中列出的编码区SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21。其他靶基因如编码乳酸脱氢酶蛋白质的那些具有与表1中列出的乳酸脱氢酶SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22至少约80-85％、85％-90％、90％-95％、或至少约96％、97％、98％、或99％的序列同一性，所述基因可在文献中鉴定或使用生物信息学方法鉴定，这是技术人员熟知的，因为乳酸脱氢酶是熟知的。通常用已知的乳酸脱氢酶氨基酸序列如本文提供的那些BLAST(如上所述)搜索公开可用的数据库以鉴定乳酸脱氢酶以及它们的编码序列，可被靶向用于中断上述序列以消除表达的乳酸脱氢酶活性。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.1的默认参数和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵。

此外，本文所述的序列或本领域所述的那些序列还可用于鉴定天然的其他同源物。例如每个编码本文所述的核酸片段的乳酸脱氢酶可用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法，例如多种核酸扩增技术[例如，聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)；或链置换扩增反应(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；以及3)文库构建和互补筛选方法。

在本发明的LAB细胞中制备至少一个工程化的基因修饰，其影响编码乳酸脱氢酶的靶基因的表达，使得酶活性被消除。本领域的技术人员已知的用于消除基因表达的任何基因修饰方法可用于消除表达的酶活性。方法包括但不限于去除整个或部分乳酸脱氢酶编码基因、将DNA片段插入乳酸脱氢酶编码基因(插入启动子或编码区)使得编码蛋白质不能表达或表达水平不足以产生酶活性、将添加终止密码子或移码框的突变导入乳酸脱氢酶编码区使得功能性蛋白质不表达、以及将一个或多个突变导入乳酸脱氢酶编码区以改变氨基酸使得表达的蛋白质无功能。此外，可通过表达反义RNA或干涉RNA阻止乳酸脱氢酶的表达，并且可导入导致共抑制的构建体。本领域的技术人员可容易地实施所有这些方法，利用已知的乳酸脱氢酶编码序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的那些。

就一些方法如基于同源重组的方法而言，围绕乳酸脱氢酶编码序列的基因组DNA序列是有用的。这些序列可得自基因组测序项目如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其得自国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，具有Genbank^TM识别号gi|28376974|ref|NC_004567.1|[28376974]。邻近的基因组DNA序列也可通过利用编码序列内的引物从乳酸脱氢酶编码序列向外测序获得，这是本领域的技术人员熟知的。

如本文实施例1所例示的用于除去乳酸脱氢酶的酶活性的尤其适用的方法是使用侧接DNA序列的乳酸脱氢酶编码区介导的同源重组去除编码乳酸脱氢酶的整个基因。克隆侧接序列使其彼此邻近以便使用这些侧接序列的双交换事件去除乳酸脱氢酶编码区。

消除乙酰乳酸脱羧酶活性

在本发明中工程化LAB细胞中的基因修饰以降低或消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶基因的酶活性。LAB细胞中编码乙酰乳酸脱羧酶的基因通常称为aldB。然而有时已经使用ald和aldC的替代名称。因此ald和aldC是可互换的，aldB本文指编码乙酰乳酸脱羧酶的基因，其任何其他名称指相同的基因。

可导致修饰的LAB乙酰乳酸脱羧酶基因的实例为表2中列出的编码区SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35和37。其他靶基因如编码乙酰乳酸脱羧酶蛋白质的那些具有与表2中列出的乳酸脱氢酶SEQID NO：24、26、28、30、32、34、36或38至少约80-85％、85％-90％、90％-95％、或至少约96％、97％、98％、或99％的序列同一性，所述基因可在文献中鉴定或使用生物信息学方法鉴定，这是技术人员熟知的，因为乙酰乳酸脱羧酶是熟知的。通常用已知的乙酰乳酸脱羧酶氨基酸序列如本文提供的那些BLAST(如上所述)搜索公开可用的数据库以鉴定乙酰乳酸脱羧酶以及它们的编码序列，所述序列可为用于修饰以消除乙酰乳酸脱羧酶活性的目标序列。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.1的默认参数和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵。

此外，可利用本文所述的乙酰乳酸脱羧酶编码序列或本领域所述的那些序列鉴定如上所述的其他天然同源物。在本发明的LAB细胞中制备至少一个工程化的基因修饰，其影响编码乙酰乳酸脱羧酶的靶基因的表达，使得乙酰乳酸脱羧酶的酶活性被降低或消除。使用如下所述组合ldh和aldB修饰的方法修饰乳酸脱氢酶基因以进行修饰。

瞬时表达产生ldh和ald基因敲除

类似于其他人以前已经进行过的报道(de Vos等人(1998)Int.DairyJ.8：227-233)，申请人不能回收在用于消除LAB细胞中的aldB表达的基因修饰后的菌株，如本文实施例4所述，该基因修饰经工程化以消除ldh基因的表达。在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的典型生长条件下有活性的ldh基因，ldhD和ldhL，已经经修饰以消除它们的表达。

在本发明中，在染色体aldB基因的工程化期间从具有消除ldh基因表达(如上所述)的细胞质粒中表达乙酰乳酸脱羧酶活性。在存在非染色体表达(从质粒中表达)的乙酰乳酸脱羧酶活性的情况下，在内源aldB基因中工程化基因修饰以降低或消除它的表达。然后从细胞中去除质粒，产生具有修饰的细胞，所述修饰导致由ldh的表达引起的酶活性消除以及由aldB基因的表达引起的酶活性降低或消除。通过这种方法，可回收具有工程化修饰的细胞，所述修饰使得它们缺失乳酸脱氢酶活性并缺失或具有降低的乙酰乳酸脱羧酶活性。

作为另外一种选择，乳酸脱氢酶活性可在工程化染色体ldh基因期间从消除aldB基因表达的细胞质粒中表达。如果多于一个的ldh基因具有活性，可在从质粒中表达乳酸脱氢酶活性之前消除一个ldh基因的表达。然后消除第二种ldh基因的表达。然后从具有修饰的细胞中去除所述质粒，所述修饰影响ldh和aldB基因的表达，使得酶活性被消除。通过这种方法，可回收缺失乳酸脱氢酶活性和乙酰乳酸脱羧酶活性的工程化细胞。

作为另外一种选择，乳酸脱氢酶活性可在工程化染色体ldh基因期间从消除aldB基因表达的细胞质粒中表达。然后从具有修饰的细胞中去除所述质粒，所述修饰消除ldh的表达并降低或消除aldB基因的表达。通过这种方法，可回收缺失乳酸脱氢酶活性和乙酰乳酸脱羧酶活性的工程化细胞。

可从本领域的技术人员熟知的质粒中表达乙酰乳酸脱羧酶或乳酸脱氢酶活性。本文提供了编码乙酰乳酸脱羧酶的任何序列，它们是SEQID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、或通过如上所述的生物信息学或实验方法附加鉴定的任何乙酰乳酸脱羧酶编码区，可将它们可操作地连接至LAB中从嵌合基因表达的启动子。此外，将合适的乙酰乳酸脱羧酶归类为EC编号4.1.1.5。作为另外一种选择，本文提供了编码乳酸脱氢酶的任何序列，它们是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或通过如上所述的生物信息学或实验方法附加鉴定的任何乳酸脱氢酶编码区，可将它们可操作地连接至LAB中从嵌合基因表达的启动子。此外，将合适的乳酸脱氢酶归类为EC编号EC 1.1.1.27(L-乳酸脱氢酶)或EC 1.1.1.28(D-乳酸脱氢酶)。嵌合表达基因中可包括核糖体结合位点和终止控制区。嵌合基因通常在表达载体或包含选择标记和允许在LAB细胞中自主复制的序列的质粒中构建。此外，具有在LAB细胞中有活性的天然启动子的天然ldh或aldB基因可用于从质粒中表达。

用于驱动LAB细胞中的乙酰乳酸脱羧酶或乳酸脱氢酶编码区表达的启动控制区或启动子是本领域的技术人员所熟悉的。一些实例包括amy、apr、npr和rrnC1启动子；nisA启动子(用于表达革兰氏阳性菌(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.64(8)：2763-2769(1998))；以及合成的P11启动子(对于在植物乳杆菌中的表达是有用的，Rud等人，Microbiology 152：1011-1019(2006))。此外，植物乳杆菌的ldhL1和fabZ1启动子可用于在LAB中表达嵌合基因。fabZ1启动子指导操纵子的转录，该操纵子具有第一基因，fabZ1，其编码(3R)-羟基肉豆蔻酰-[酰基载体蛋白质]脱水酶。

终止控制区也可以源于通常优选宿主的天然的多种基因。任选地，终止位点可能是不必要的。然而，如果含有终止位点则是最优选的。

用于LAB细胞的载体或质粒包括具有两个复制起点和两个选择标记的那些，所述复制起点和选择标记允许在大肠杆菌和LAB中的复制和选择。实例是pFP996，其序列为SEQ ID NO：97，它可用于植物乳杆菌(L.plantarum)和其他LAB。用于转化枯草芽孢杆菌和链球菌的许多质粒和载体一般可用于LAB。合适载体的非限制性实例包括：pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183：175-182(1996)；和O′Sullivan等人，Gene 137：227-231(1993))；pMBB1和pHW800，pMBB1的衍生物(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62：1481-1486(1996))；pMG1，接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184：5800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63：4581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67：1262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.38：1899-1903(1994))。也已经报道了来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的多个质粒(例如van Kranenburg R，GolicN，Bongers R，Leer RJ，de Vos WM，Siezen RJ，Kleerebezem M.Appl.Environ.Microbiol.2005 Mar；71(3)：1223-1230)。

可使用本领域已知的方法将载体或质粒导入宿主细胞中，所述方法如电穿孔(Cruz-Rodz等人，Molecular Genetics and Genomics224：1252-154(1990)，Bringel等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.33：664-670(1990)，Alegre等人，FEMS Microbiology letters 241：73-77(2004))和接合(Shrago等人，Appl.Environ.Microbiol.52：574-576(1986))。

在回收具有ldh和aldB修饰的细胞后，去除细胞的表达质粒。可通过本领域的技术人员已知的任何方法完成质粒的去除。通常使用温度敏感型的复制起点，其中在限制温度下包含质粒的细胞的生长引起质粒丢失。例如另一种方法是将负选择标记置于待去除的质粒上，其中在选择性试剂存在的情况下生长引起质粒丢失。

降低丙酮酸甲酸裂解酶活性

除了修饰上述的本发明细胞ldh和aldB基因之外，它们可任选地具有至少一个降低内源性丙酮酸甲酸裂解酶活性的修饰。丙酮酸甲酸裂解酶活性将丙酮酸转化成甲酸(参见图1)。可降低或消除细胞中的丙酮酸甲酸裂解酶活性。优选地消除所述活性。

为了表达丙酮酸甲酸裂解酶活性，需要编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因(pfl)和编码丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的基因。为了降低丙酮酸甲酸裂解酶活性，可在任一个或两个这些基因中进行修饰。在特定的LAB菌株中可存在编码丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸甲酸裂解酶激活酶中任一个的一个或多个基因。例如，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WCFS 1包含两个pfl基因(pflB1：编码区SEQ ID NO：39，蛋白质SEQ IDNO：40；和pflB2：编码区SEQ ID NO：41，蛋白质SEQ ID NO：42)和两个pfl激活酶基因(pflA1：编码区SEQ ID NO：43，蛋白质SEQ ID NO：44；和pflA2：编码区SEQ ID NO：45，蛋白质SEQ ID NO：46)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512仅包含一个pfl基因(pflB2)和一个pfl激活酶基因(pflA2)。在期望的产生条件下，在产生宿主细胞中有活性的所有pfl编码基因和/或在期望的产生条件下，在产生宿主细胞中有活性的所有pfl激活酶编码基因的表达降低。

可进行修饰以降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的pfl基因的实例通过SEQ ID NO：39、41、47和51的编码区表示。其他用于修饰的靶基因包括编码丙酮酸甲酸裂解酶蛋白质的那些(它们具有SEQ ID NO：40、42、48和52)和编码具有与其中一个这些蛋白质至少约80-85％、85％-90％、90％-95％、或至少约96％、97％、98％、或99％的序列同一性的那些，所述基因可在文献中鉴定或使用生物信息学方法鉴定，这是技术人员熟知的，如上所述用于乳酸脱氢酶蛋白质。此外，可利用本文所述的序列或本领域所述的那些序列鉴定如上所述的其他天然同源物。

可进行修饰以降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的pfl激活酶基因的实例通过SEQ ID NO：43、45、49和53的编码区表示。其他用于修饰的靶基因包括编码丙酮酸甲酸裂解酶激活酶蛋白质的那些(它们具有SEQ IDNO：44、46、50、54)和编码具有与其中一个这些蛋白质至少约80-85％、85％-90％、90％-95％、或至少约96％、97％、98％、或99％的序列同一性的那些，所述基因可在文献中鉴定或使用生物信息学方法鉴定，这是技术人员熟知的，如上所述用于乳酸脱氢酶蛋白质。此外，可利用本文所述的序列或本领域所述的那些序列鉴定如上所述的其他天然同源物。

可使用本领域的技术人员已知的任何用于减少蛋白质表达的基因修饰方法改变丙酮酸甲酸裂解酶的活性。用于降低或消除丙酮酸甲酸裂解酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶激活酶基因表达的方法包括但不限于：去除整个或部分基因，将DNA片段插入基因(插入启动子或编码区)以便编码蛋白质不能表达或表达降低，将添加终止密码子或移码框的突变导入编码区使得功能性蛋白质不表达，以及将一个或多个突变导入编码区来改变氨基酸以便表达的蛋白质无功能或功能降低。此外，靶基因的表达可通过表达反义RNA或干涉RNA部分地或基本上阻止并可导入引起共抑制的构建体。

异丁醇产生

在本发明的一个实施方案中，如上所述具有对ldh和aldB基因的工程化修饰，并且任选地降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的LAB细胞产生异丁醇。用于生物合成异丁醇的生物合成途径在共同未决的美国专利US20070092957A1中公开，其以引用方式并入本文。在图2中提供公开的异丁醇生物合成途径的图表。通过消除ldh和aldB基因表达的酶活性提高在本文所公开的遗传工程的LAB细胞中的异丁醇产量，并且该产量通过消除pfl和/或pflA基因的表达得到进一步的提高。

此外，可工程化LAB宿主细胞以提高铁硫簇形成蛋白质的表达以改善异丁醇途径的需铁硫簇二羟酸脱水酶的活性，如共同未决的美国专利申请公布20100081182所公开的那样，该专利申请以引用方式并入本文。例如，可如本文实施例2所述提高编码铁硫簇形成蛋白质的内源suf操纵子的表达。

如美国专利公布US20070092957A1中所述，在实施例中异丁醇生物合成途径的步骤包括下列转化：

丙酮酸至乙酰乳酸(图2途径步骤a)，其例如通过已知EC编号2.2.1.69的乙酰乳酸合酶(ALS)催化；

乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(图2途径步骤b)其例如通过已知EC编号1.1.1.86的乙酰羟酸异构还原酶，也称为酮醇酸还原异构酶(KARI)催化；

2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(图2途径步骤c)其例如通过已知EC编号4.2.1.9的乙酰羟酸脱水酶，也称为二羟酸脱水酶(DHAD)催化；

α-酮异戊酸至异丁醛(图2途径步骤d)其例如通过已知EC编号4.1.1.72的支链α-酮酸脱羧酶催化；以及

异丁醛至异丁醇(图2途径步骤e)其例如通过已知EC编号1.1.1.265的支链醇脱氢酶催化，但是所述酶也可被归类为其他醇脱氢酶(具体地讲，EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。

就选择性途径的步骤f、g、h、l、j和k而言，底物至产物的转化以及这些反应中所涉及的酶描述于美国专利US20070092957A1中。

可用于表达这些酶以及两个附加异丁醇途径的那些酶的基因在美国专利US20070092957A1中进行了描述，并且如上所述的可用的附加基因可在文献中以及使用生物信息学方法鉴定，这是技术人员熟知的。此外，如上所述，本文提供的序列可用于利用序列依赖性的规程分离编码同源蛋白质的基因，这是本领域熟知的。

例如，可使用的一些代表性的ALS酶包括由芽孢杆菌属(Bacillus)的alsS和克雷伯氏菌属(Klebsiella)的budB编码的那些酶(Gollop等人，J.Bacteriol.172(6)：3444-3449(1990)；Holtzclaw等人，J.Bacteriol.121(3)：917-922(1975))。本文提供了得自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(DNA：SEQ ID NO：55；蛋白质：SEQ ID NO：56)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(DNA：SEQ ID NO：58；蛋白质：SEQID NO：59)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(DNA：SEQ ID NO：60；蛋白质：SEQ ID NO：61)的ALS。可用的附加Als编码区和编码蛋白质包括得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(DNA：SEQ IDNO：62；蛋白质：SEQ ID NO：63)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(DNA：SEQ ID NO：64；蛋白质：SEQ ID NO：65)、变异链球菌(Streptococcus mutans)(DNA：SEQ ID NO：66；蛋白质：SEQ ID NO：67)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(DNA：SEQ ID NO：68；蛋白质：SEQ ID NO：69)、纤细弧菌(Vibrio angustum)(DNA：SEQ ID NO：70；蛋白质：SEQ ID NO：71)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(DNA：SEQ ID NO：72；蛋白质：SEQ ID NO：73)的那些。可使用编码乙酰乳酸合酶的任何Als基因，所述酶与将丙酮酸转化成乙酰乳酸的那些序列SEQ ID NO：56、59、61、63、65、67、69、71或73中的任何一个具有至少约80-85％、85％-90％、90％-95％、或至少约96％、97％、或98％的序列同一性。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.1的默认参数和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵。

此外，美国专利申请公布2009-0305363提供了系统发育树描述的乙酰乳酸合酶，它们是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AlsS序列的100个最近邻居，可使用它们中的任何一个。在本发明菌株中可用的附加Als序列可在文献中或生物信息学数据库中鉴定，这是技术人员熟知的。使用生物信息学方法鉴定编码和/或蛋白质序列通常通过BLAST(如上所述)搜索包含已知的Als编码序列或编码氨基酸序列的公开可用的数据库进行，例如本文提供的那些。基于如上所述的Clustal W比对方法进行鉴定。此外，可利用本文列出的序列或本领域所述的那些序列鉴定如上所述的其他天然同源物。

例如，可使用的KARI酶可来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(DNA：SEQ ID NO：74；蛋白质SEQ ID NO：75)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)(DNA：SEQ ID NO：76；蛋白质SEQ ID NO：77)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(DNA：SEQ ID NO：78；蛋白质SEQ ID NO：79)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PF5(DNA：SEQ ID NO：80；蛋白质SEQ ID NO：81)的ilvC基因。后面的三个基因在美国专利申请公布20080261230中公开，其以引用方式并入本文。附加的KARI酶在美国专利申请61/246844、US专利申请公布2008026123、2009016337和2010019751中进行了描述。

例如，可使用的DHAD酶可来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(DNA：SEQ ID NO：82；蛋白质SEQ ID NO：83)或变异链球菌(Streptococcus mutans)(DNA：SEQ ID NO：84；蛋白质SEQ ID NO：85)的ilvD基因，并且此外DHAD编码区的序列和可使用的编码蛋白质在美国专利申请公布20100081183中提供，其以引用方式并入本文。这一参考文献也包括对获取可用的附加DHAD序列的描述。

例如，可用的支链酮酸脱羧酶包括得自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(DNA：SEQ ID NO：86；蛋白质SEQ ID NO：87)的kivD基因的酶和如上所述可由本领域的技术人员利用生物信息学方法鉴定的其他酶。

例如，可用的支链醇脱氢酶是已知EC编号1.1.1.265的酶，但是所述酶也可被归类为其他醇脱氢酶(具体地讲，EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。这些酶利用NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体，并且在US20070092957A1中提供了可用的支链醇脱氢酶和它们的编码区的序列。

此外，用于将异丁醛转化成异丁醇的最终步骤的酶是新丁醇脱氢酶分离自细菌的环境分离物，所述细菌经鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)(DNA：SEQ ID NO：91，蛋白质SEQ IDNO：92)，其在以引用方式并入本文的美国专利申请公布20090269823中公开。

在基本上无乳酸脱氢酶活性的LAB细胞中活性改善的DHAD在以引用方式并入本文的美国专利申请公布20100081183中公开。此外，提高铁硫簇形成蛋白质的表达以改善DHAD活性在以引用方式并入本文的美国专利申请公布20100081183中公开。

对于利用所公开的生物合成途径的异丁醇产生，US20070092957A1中描述了嵌合基因的构建以及通过植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)例示的LAB的基因工程改造。用于途径酶表达的嵌合基因可存在于细胞的复制质粒中或整合到细胞基因组中，这是本领域的技术人员熟知的并在本文实施例中进行了描述。本文开发的整合新方法在下文中描述并且在实施例3中使用。

附加产物

本发明的工程化LAB细胞可用于制备由乙酰乳酸制成的其他产物以改善产量，其不需要乙酰乳酸脱羧酶活性。这些产物可包括但不限于缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸(维生素B5)、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇(异戊醇)和丁二酮。为了制备这些产物或其他产物，本发明的LAB细胞具有另外的生物合成途径以产生所需的产物，它们可为内源的、工程化的或上述两者的组合，

例如，缬氨酸的生物合成途径包括乙酰乳酸通过乙酰羟酸还原异构酶(ilvC)转化为2，3-二羟基异戊酸，2，3-二羟基异戊酸通过二羟酸脱水酶(ilvD)转化为α-酮异戊酸(也叫2-酮基-异戊酸)，以及α-酮异戊酸通过支链氨基酸氨基转移酶(ilvE)转化为缬氨酸的步骤。亮氨酸的生物合成包括与α-酮异戊酸相同的步骤，随后通过由leuA(2-异丙基苹果酸合酶)、leuCD(异丙基苹果酸异构酶)、leuB(3-异丙基苹果酸脱氢酶)和tyrB/ilvE(芳族氨基酸转氨酶)编码的酶将α-酮异戊酸转化成亮氨酸。泛酸的生物合成包括与α-酮异戊酸相同的步骤，随后通过由panB(3-甲基-2-氧化丁烷酸羟甲基转移酶)、panE(2-脱氢泛解酸还原酶)和panC(泛解酸-β-丙氨酸连接酶)编码的酶将α-酮异戊酸转化成泛酸。用于提高微生物中泛酸产量的酶的工程化表达在美国专利6177264中进行了描述。

2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇可通过用2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶转化来自氨基酸生物合成途径的2-酮酸进行制备(Atsumi和Liao(2008)Current Opinion in Biotechnology 19：414-419)。

与消除ldh和aldB表达组合使用，在任何一个这些途径中的至少一个基因的表达增加可用于提高该途径产物的产量。虽然一些LAB如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)天然具有缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的支链氨基酸途径，但其他LAB如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)不具有所述途径。无产生期望产物或期望产物前体的内源性途径的LAB需要工程化以表达缺失的途径酶。本领域的技术人员能够容易地评估期望的途径具有或缺失哪几种酶。

乙酰乳酸在存在氧的情况下自动产生丁二酮，不需要酶活性。

LAB中Tn5介导的转座

为了外源基因如期望生物合成途径的基因表达酶的长期保持和稳定性，可能期望将表达基因整合到细胞基因组中。本文制备载体以利用LAB细胞中的Tn5转座系统，发现使用本文开发的Tn5转座载体完成LAB细胞的基因组的随机整合。就整合而言，所述载体包括可操作地连接至启动子并从其开始表达的Tn5转座酶编码区(SEQ ID NO：93；编码蛋白质SEQ ID NO：94)和转座酶识别序列Tn5IE和Tn5OE(SEQ IDNO：95和96)，所述启动子在LAB细胞中具有活性，上文列出了其实例。编码与SEQ ID NO：94具有至少约90％、95％、或99％的序列同一性并具有Tn5转座酶活性的蛋白质的任何序列可用于所述载体。在Tn5IE和Tn5OE之间是侧接Cre重组酶位点和多克隆位点(MCS)的氯霉素抗性基因。在大肠杆菌和LAB细胞中的任何活性选择标记可取代氯霉素抗性基因，其实例为四环素抗性、奇放线菌素抗性和红霉素抗性标记。Cre重组酶位点是任选的。此外所述载体具有第二标记基因，其用于筛选Tn5转座载体的转座和丢失。第二标记可为在LAB细胞中有活性的任何标记，包括上文列出的那些标记中的任何一个。所述载体也具有大肠杆菌和LAB的复制起点，所述LAB起点是条件性有活性的，如温度敏感型的起点。位于Tn5IE和Tn5OE元件间的DNA片段通常在MCS中，它们可利用这个载体随机整合到LAB细胞的基因组中。具有在Tn5IE和Tn5OE元件间的DNA片段的所述载体是整合构建体。例如，所述载体具有乳酸菌细胞的温度敏感型复制起点和用于选择转化子的氯霉素抗性标记。所述转化子在允许条件下(温度通常为30℃)生长大约10代，在这期间发生整合。然后转化子在非允许条件下(温度通常为37℃)生长大约20代以去除质粒，并且筛选红霉素敏感的氯霉素抗性菌落(丢失第二标记)以确认所述质粒的丢失。可通过在所述细胞中表达Cre重组酶来切除氯霉素抗性标记，通常从质粒上的嵌合基因中切除，这是本领域熟知的。

用于产生的生长

本文所公开的重组LAB细胞可用于如下发酵产生异丁醇或其他产物。重组细胞在包含合适碳底物的发酵培养基中生长。合适的底物可包括但不限于：单糖，例如葡萄糖和果糖；低聚糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜及大麦麦芽。

尽管预期所有上述碳底物及它们的混合物都适用于本发明，但优选的碳底物为葡萄糖、果糖和蔗糖。蔗糖可来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源，包括谷物如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质，例如，如美国专利申请公布2007/0031918A1中所述，该专利以引用方式并入本文。生物质指任何纤维素或木质纤维素材料，并包括包含纤维素的材料，以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于：生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。

除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域的技术人员已知的适于培养物生长并促进产生异丁醇所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其他组分。

通常，使细胞在约25℃至约40℃的温度范围下在合适的培养基中生长。适用的生长培养基是常见的商业制备培养基，例如BactoLactobacilli MRS肉汤或琼脂(Difco)、Luria Bertani(LB)肉汤、沙氏葡萄糖肉汤(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其他确定的或合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体细菌菌株生长的合适培养基。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷酸2′:3′-单磷酸，也可以掺入发酵培养基中。

适于发酵的pH范围在pH 3.0至pH 9.0之间，其中pH 6.0至pH 8.0优选作为起始条件。

发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中厌氧或微氧条件是优选的。

预期可以或者采用分批发酵、补料分批发酵或者采用连续发酵工艺来实施异丁醇或其他产物产生，并且任何已知的发酵模式均将适用。另外，预期可以将细胞固定在基底上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以产生异丁醇。

用于从发酵培养基中分离异丁醇的方法

生物产生的异丁醇可使用本领域已知的方法用于ABE发酵(参见例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及本文参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离异丁醇。

实施例

缩写的含义如下：“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”是指小时，“psi”是指磅每平方英寸，“nm”是指纳米，“d”是指天，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mm”是指毫米，“nm”是指纳米，“mM”是指毫摩尔每升，“M”是指摩尔每升，“mmol”是指毫摩尔，“μmol”是指微摩尔”，“g”是指克，“μg”是指微克并且“ng”是指纳克，“PCR”是指聚合酶链反应，“OD”是指光密度，“OD₆₀₀”是指在600nm波长测量的光密度，“kDa”是指千道尔顿，“g”是指引力常数，“bp”是指碱基对，“kbp”是指千碱基对，“％w/v”是指重量/体积百分比，“％v/v”是指体积/体积百分比，“wt％”是指重量百分比，“HPLC”是指高效液相色谱，并且“GC”是指气相色谱。术语“摩尔选择率”是消耗每摩尔糖底物制备的产物摩尔数，将其报告为百分比。“SLPM”指每分钟标准升(空气)，“dO”是溶解氧，q_p是“单位产生率”，用经一段时间后每克细胞产生的异丁醇克数衡量。

一般方法

使用本领域已知的标准分子生物学方法构建重组质粒。所有限制性酶和修饰酶以及Phusion High-Fidelity PCR Master Mix购自New EnglandBiolabs(Ipswich，MA)。DNA片段用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QiagenInc.，Valencia，CA)进行纯化。质粒DNA用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)制备。植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA用MasterPure DNA纯化试剂盒(Epicentre，Madison，WI)制备。寡核苷酸由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)或Invitrogen Corp(Carlsbad，CA)合成。

转化

通过以下方法转化植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512：用PN0512细胞接种包含1％甘氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的5mL乳杆菌MRS培养基(Accumedia，Neogen Corporation，Lansing，MI)并在30℃下生长过夜。用过夜培养物接种具有1％甘氨酸的100mL的MRS培养基，使其OD600为0.1并在30℃下生长至OD600为0.7。在4℃下以3700×g处理8分钟收获细胞，所得细胞用100mL冷的1mM的MgCl₂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤，在4℃下以3700×g离心8分钟，用100mL冷的30％PEG-1000(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤，在4℃以3700×g再离心20分钟，然后重悬在1mL冷的30％PEG-1000中。60μl细胞与～100ng质粒DNA在冷的1mm间隙电穿孔管中混合，并且用BioRad Gene Pulser(Hercules，CA)在1.7kV，25μF和400Ω下电穿孔。将细胞重悬在包含500mM蔗糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和100mM的MgCl₂的1mL的MRS培养基中，在30℃下培养2小时，置于包含1μg/mL或2μg/mL红霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的MRS培养基平板上，然后置于包含Pack-Anaero小袋(Mitsubishi Gas Chemical Co.，Tokyo，Japan)的厌氧箱中并在30℃下培养。

实施例1

ilvD整合载体和PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl ⁺ 整合菌株的构建

这个实施例描述了将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ilvD基因整合到植物乳杆菌(L.plantarum)菌株PN0512ΔldhDΔldhL1的染色体以表达DHAD。植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512ΔldhDΔldhL1的构建在共同未决的美国专利申请61/100786的实施例1中进行了描述，其以引用方式并入本文。去除了这个菌株编码主要乳酸脱氢酶的两个基因：ldhD和ldhL1。在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512(ATCC菌株#PTA-7727)中进行了双去除。

使用基于两步同源重组的方法构建基因敲除菌株以产生无标记的基因去除(Ferain等人，1994，J.Bact.176：596)。所述方法利用穿梭载体pFP996(SEQ ID NO：97)。pFP996是用于革兰氏阳性菌的穿梭载体。它既可在大肠杆菌中复制也可在革兰氏阳性菌中复制。它包含得自pBR322(核苷酸#2628至5323)和pE194(核苷酸#43至2627)的复制起点。pE194是最初分离自革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的小质粒(Horinouchi和Weisblum J.Bacteriol.(1982)150(2)：804-814)。在pFP996中，多个克隆位点(核苷酸#1至50)包含EcoRI、BglII、XhoI、SmaI、ClaI、KpnI和HindIII的限制性位点。有两个抗生素抗性标记；一个是氨苄青霉素抗性标记，并且另一个是红霉素抗性标记。为了选择目的，在大肠杆菌的转化中使用氨苄青霉素并且在植物乳杆菌(L.plantarum)中使用红霉素进行选择。

将两个DNA片段(每个包含900bp至1200bp的序列，其在拟去除序列的上游或下游)克隆到质粒以提供两个遗传交换的同源性区域。细胞生长多代(30-50代)以使交换事件发生。初始交换(单交换)通过同源重组，利用质粒上的两个同源性区域中的一个将质粒整合到染色体中。二次交换(双交换)事件生成或者野生型序列或者拟去除的基因。导致初始整合事件的序列间交换将生成野生型序列，而其他同源性区域之间的交换将生成期望的去除。通过抗生素敏感型筛选二次交换事件。通过PCR和DNA测序分析单交换和双交换事件。

ΔldhD

用于去除ldhD基因的敲除盒通过从PN0512基因组DNA中扩增出上游侧接区域而产生，所述侧接区域具有引物Top D F1(SEQ IDNO：98)，其包含EcoRI位点和Top D R1(SEQ ID NO：99)。利用包含Xhol位点的引物Bot D F2(SEQ ID NO：100)和Bot D R2(SEQ IDNO：101)扩增包括部分ldhD编码序列的下游同源性区域。通过如下所述的PCR SOE接合两个同源性区域。凝胶纯化0.9kbp的上游和下游PCR产物。在PCR反应中等量混合PCR产物并用引物Top D F1和Bot D R2进行再扩增。凝胶纯化最终的1.8kbp的PCR产物并将TOPO克隆到pCR4BluntII-TOPO(Invitrogen)以制备载体pCRBluntII::ldhD。为了制备携带内部缺失ldhD基因的整合载体，pFP996用EcoRI和XhoI消化并凝胶纯化5311-bp的片段。载体pCRBluntII::ldhD用EcoRI和XhoI消化并凝胶纯化1.8kbp的片段。ldhD敲除盒和载体用T4DNA连接酶连接，得到载体pFP996::ldhD ko。

制备电感受态植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512细胞，用pFP996::ldhD ko转化并将其置于包含1μg/mL红霉素的MRS上。为了得到单交换事件(sco)，转化子在MRS培养基中，在37℃下传代大约50代。在生长后，将等分试样接种到包含1μg/mL红霉素的MRS平板上以获得单菌落。红霉素抗性菌落通过利用引物ldhD Seq F1(SEQ IDNO：102)和D check R(SEQ ID NO：103)的PCR扩增进行筛选以分辨野生型和携带sco事件的克隆。为了获得具有双交换的克隆，将sco菌株在具有20mM的D，L-乳酸(Sigma，St.Louis，MO)的MRS培养基中，在37℃下传代大约30代，然后接种到具有乳酸盐的MRS平板上以获得单菌落。挑取菌落并涂布在包含乳酸盐的MRS和具有包含1μg/mL红霉素的乳酸盐的MRS上以寻找对红霉素敏感的菌落。敏感型菌落通过利用引物D check R(SEQ ID NO：103)和D check F3(SEQ ID NO：104)的PCR扩增来筛选。野生型菌落提供3.2kbp的产物并且称为PN0512ΔldhD的去除克隆提供2.3kbp的PCR产物。

ΔldhDΔldhL1

为了制备ΔldhL1ΔldhD双去除菌株，在PN0512ΔldhD菌株背景中去除ldhL1基因。用于去除ldhL1基因的敲除盒从PN0512基因组DNA中扩增出来。ldhL1左同源臂利用包含BglII限制性位点的引物oBP31(SEQ ID NO：105)和包含XhoI限制性位点的引物oBP32(SEQ IDNO：106)进行扩增。ldhL1右同源臂利用包含XhoI限制性位点的引物oBP33(SEQ ID NO：107)和包含XmaI限制性位点的引物oBP34(SEQ IDNO：108)进行扩增。将ldhL1左同源臂克隆到BglII/XhoI位点中并将ldhL1右同源臂克隆到XhoI/XmaI位点中，上述位点均属于pFP996pyrFΔerm，它是pFP996的衍生物。pFP996pyrFΔerm包含pyrF序列(SEQ ID NO：109)，该序列编码植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶，代替pFP996中的红霉素编码区。质粒携带的pyrF基因与ΔpyrF菌株中的化学5-氟乳清酸一起可用作用于分离二次同源交换的有效反选择方法。在用XmaI消化后分离包含ldhL1同源臂的Xmal片段并将其克隆到pFP996的XmaI限制性位点中，生成900bp的左同源区和1200bp的右同源区，得到载体pFP996-ldhL1-arms。

PN0512ΔldhD用pFP996-ldhL1-arms转化并在30℃下在含有乳酸盐(20mM)和红霉素(1μg/mL)的乳杆菌MRS培养基中生长大约10代。然后在将培养物置于包含乳酸盐和红霉素(1μg/mL)的MRS上之前，通过将转化子连续接种在MRS+乳酸盐上使其在非选择性条件下，在37℃生长大约50代。通过用于单交换的菌落PCR筛选分离物，所述单交换使用染色体特异性引物oBP49(SEQ ID NO：110)和质粒特异性引物oBP42(SEQ ID NO：111)。在将培养物置于包含乳酸盐的MRS培养基上之前，通过在非选择性条件下连续接种于包含乳酸盐的MRS中使单交换整合子在37℃下生长大约40代。将分离物涂布在包含乳酸盐的MRS平板上，在37℃下生长，然后涂板在包含乳酸盐和红霉素(1μg/mL)的MRS平板上。通过使用染色体特异性引物oBP49(SEQ ID NO：110)和oBP56(SEQ ID NO：112)的菌落PCR筛选红霉素敏感型分离物以确定野生型或二次交换去除的存在。野生型序列生成3505bp的产物，并且去除序列生成2545bp的产物。通过PCR产物测序确认去除并通过利用引物oBP42(SEQ ID NO：111)和oBP57(SEQ ID NO：113)的菌落PCR测试质粒的去除。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512ldhDldhL1双去除菌株称为PNP0001。ΔldhD去除包括83bp的上游片段，其中ldhD起始密码子为332个氨基酸的氨基酸279。ΔldhL1去除包含最后氨基酸fMet。

构建从ldhL1启动子开始表达的乳酸乳球菌(L.lactis)ilvD编码区的单拷贝染色体整合，所述整合如上所述通过相同的两步同源重组方法以产生无标记的整合，该方法使用pFP996穿梭载体，不同的是二次交换事件产生野生型序列或期望的整合而不是去除。将包含期望整合位点的序列上游和下游的两片段DNA克隆到质粒中以提供两个遗传交换的同源性区域。

设计两个DNA片段(同源臂)以提供两个遗传交换的同源性区域，使得整合将位于菌株PN0512ΔldhDΔldhL1中的ldhL1启动子的ilvD编码区下游。克隆到质粒中的左同源臂和右同源臂每个为大约1200个碱基对。左同源臂从植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA中，利用包含BglII限制性位点的引物oBP31(SEQ ID NO：105)和包含XhoI限制性位点的引物oBP32(SEQ ID NO106)，使用Phusion High-FidelityPCR Master Mix进行扩增。右同源臂从植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA中，利用包含XhoI限制性位点的引物oBP33(SEQID NO：107)和包含XmaI限制性位点的引物oBP34(SEQ ID NO：108)，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行扩增。左同源臂用BglII和XhoI消化，而右同源臂用XhoI和XmaI消化。在用合适的限制性酶消化后，两个同源臂用T4DNA连接酶连接到相应的限制性位点pFP996中以生成载体pFP996-ldhL1arms。

从pDM20-ilvD(乳酸乳球菌(L.lactis))(SEQ ID NO：115)中扩增包含来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(SEQ ID NO：82)的ilvD编码区和核糖体结合序列(RBS；SEQ ID NO：114)的DNA片段。pDM20-ilvD(乳酸乳球菌(L.lactis))的构建在以引用方式并入本文的美国专利申请61/100809中进行了描述。这个质粒是包含ilvD编码区的pDM20，其通过PCR得自乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp lactis)NCDO2118(NCIMB 702118)(Godon等人，J.Bacteriol.(1992)174：6580-6589)，并且该质粒包含加到5″PCR引物中的核糖体结合序列(SEQ ID NO：114)。pDM20是经修饰的pDM1(SEQ ID NO：116)，其包含最小的pLF1复制子(～0.7kbp)和得自植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ATCC14917质粒pLF1的pemK-pemI toxin-antitoxin(TA)、来自pACYC184的P15A复制子、用于在大肠杆菌和植物乳杆菌(L.plantarum)中进行选择的氯霉素抗性标记和P30合成启动子(Rud等人，Microbiology(2006)152：1011-1019)。通过去除包括lacZ区域的核苷酸3281-3646修饰载体pDM1，所述lacZ区域被多克隆位点取代。引物oBP120(SEQ ID NO：117)包含XhoI位点，并且oBP182(SEQ ID NO：118)包含DrdI、PstI、HindIII和BamHI位点，它们用于使用PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix扩增来自pDM1的P30启动子。所得PCR产物和pDM1载体用XhoI和DrdI消化，得到lacZ和P30。连接PCR产物和pDM1消化大片段以生成载体pDM20，其中再插入P30启动子，其由XhoI和DrdI限制性位点界定。

包含ilvD编码区和RBS(SEQ ID NO：119)的DNA片段通过PCR获得，所述PCR用pDM20-ilvD(乳酸乳球菌(L.lactis))作为模板，利用包含XhoI限制性位点的引物oBP246(SEQ ID NO：120)和包含XhoI限制性位点的引物oBP237(SEQ ID NO：121)，使用Phusion High-FidelityPCR Master Mix进行。在用XhoI消化后，所得PCR产物和pFP996-ldhL1arms用T4DNA连接酶连接。通过PCR筛选具有与左同源臂中的ldhL1启动子相同取向的插入序列的克隆，该PCR使用载体特异性引物oBP57(SEQ ID NO：113)和ilvD-特异性引物oBP237(SEQ IDNO：121)。具有正确取向的插入序列的克隆称为pFP996-ldhL1arms-ilvDLl。

通过用pFP996-ldhL1arms-ilvDLl转化植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512ΔldhDΔldhL1来整合乳酸乳球菌(L.lactis)ilvD编码区。用PN0512ΔldhDΔldhL1接种包含0.5％甘氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的5mL乳杆菌MRS培养基(Accumedia，Neogen Corporation，Lansing，MI)并在30℃下生长过夜。用过夜培养物接种具有0.5％甘氨酸的100mL的MRS培养基，使其OD600为0.1并在30℃下生长至OD600为0.7。在4℃下以3700×g处理8分钟收获细胞，所得细胞用100mL冷的1mM的MgCl₂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤，在4℃下以3700×g离心8分钟，用100mL冷的30％PEG-1000(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤，在4℃以3700×g再离心20分钟，然后重悬在1mL冷的30％PEG-1000中。60μl细胞与～100ng质粒DNA在冷的1mm间隙电穿孔管中混合，并且用BioRad Gene Pulser(Hercules，CA)在1.7kV，25μF和400Ω下电穿孔。将细胞重悬在包含500mM蔗糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和100mM的MgCl₂的1mL的MRS培养基中，在30℃下培养2小时，然后置于包含2μg/mL红霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的MRS培养基平板上。

通过使用ilvD特异性引物oBP237(SEQ ID NO：121)和oBP246(SEQID NO：120)的PCR筛选转化子。转化子在30℃下在包含红霉素(1μg/mL)的乳杆菌MRS培养基中生长大约8代，然后在37℃下通过连续接种在乳杆菌MRS培养基中生长大约40代。将培养物置于包含红霉素(0.5μg/mL)的乳杆菌MRS培养基上。通过菌落PCR筛选分离物以获得单交换，所述PCR使用染色体特异性引物oBP49(SEQ IDNO：110)和质粒特异性引物oBP42(SEQ ID NO：111)。

通过连续接种在乳杆菌MRS培养基中，单交换整合子在37℃下生长大约43代。将培养物置于MRS培养基上。将菌落涂布接种到MRS平板上并在37℃下生长。然后将分离物涂布接种到包含红霉素(0.5μg/mL)的MRS培养基上。通过使用染色体特异性引物oBP49(SEQID NO：110)和oBP56(SEQ ID NO：112)的(菌落)PCR筛选红霉素敏感型分离物以确定野生型或二次交换整合的存在。野生型序列生成2600bp的产物，并且整合序列生成4300bp的产物。通过对PCR产物测序来确认整合并将鉴定的整合菌株称为PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl⁺。

实施例2

suf操纵子启动子整合载体和 PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl ⁺ suf::P5P4 ⁺ 整合菌株的构建

这个实施例描述了将两个启动子整合到植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl⁺的染色体中。将启动子整合到suf操纵子的上游，其基因产物用于铁硫簇装配。启动子整合产生内源铁硫簇机构表达增加的菌株。

通过两步同源重组方法构建suf操纵子染色体启动子整合以产生无标记的整合，所述方法使用如上所述的穿梭载体pFP996(SEQ IDNO：97)。

suf操纵子启动子整合载体通过三个步骤构建。在第一步骤中，将包含suf操纵子(sufC和部分sufD)5′部分的右同源臂片段克隆到pFP996。在第二步骤中，将合成启动子P5和P4[Rud等人，Microbiology(2006)152：1011]克隆到右臂的pFP996-右臂克隆上游。在最终步骤中，将包含feoBA操纵子中的天然suf启动子和上游序列的左同源臂片段克隆到P5P4启动子的pFP996-P5P4-右臂克隆上游。

通过PCR从植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA中扩增右同源臂DNA片段(SEQ ID NO：123)，所述PCR利用包含XmaI限制性位点的引物AA199(SEQ ID NO：124)和包含KpnI限制性位点的引物AA200(SEQ ID NO：125)，使用Phusion High-Fidelity PCR MasterMix进行。在用XmaI和KpnI消化后利用T4DNA连接酶连接右同源臂PCR片段和pFP996以生成pFP996-sufCD。通过用两个部分互补的引物序列进行PCR生成包含启动子P5和P4的DNA片段。引物AA203(SEQID NO：126)包含XhoI位点、P5启动子序列和部分P4启动子序列，将其与包含XmaI位点和P4启动子序列的引物AA204(SEQ ID NO：127)组合使用，并且使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行PCR。所得PCR产物然后利用引物AA206(SEQ ID NO：128)和AA207(SEQID NO：129)，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行扩增。在用XhoI和XmaI消化后连接P5P4PCR产物和pFP996-sufCD以生成pFP996-P5P4-sufCD。通过从植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA中扩增左同源臂DNA片段(SEQ ID NO：130)，所述扩增利用包含EcoRI限制性位点的引物AA201(SEQ ID NO：131)和包含XhoI限制性位点的引物AA202(SEQ ID NO：132)，使用Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix进行。在用EcoRI和XhoI消化后用T4DNA连接酶连接左同源臂和pFP996-P5P4-sufCD以生成pFP996-feoBA-P5P4-sufCD。通过测序确认载体。所述载体具有五个碱基对去除(TTGTT)，包括在上游P5启动子中的部分-35六聚物。

suf操纵子的合成启动子(P5P4)上游的整合通过如上所述用pFP996-feoBA-P5P4-sufCD转化植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl⁺来完成。转化子在30℃下在包含红霉素(2μg/mL)的乳杆菌MRS培养基中生长大约20代。将培养物置于包含红霉素(0.5μg/mL)的乳杆菌MRS培养基上。通过用于单交换的菌落PCR筛选分离物，所述单交换使用染色体特异性引物AA209(SEQ IDNO：133)和质粒特异性引物AA210(SEQ ID NO：134)。通过连续接种在乳杆菌MRS培养基中，单交换整合子在37℃下生长大约30代。将培养物置于MRS培养基上。筛选对红霉素敏感的分离物。通过使用P5特异性引物AA211(SEQ ID NO：135)和染色体特异性引物oBP126(SEQID NO：136)的(菌落)PCR筛选分离物以确定野生型或二次交换整合的存在。将鉴定的整合菌株称为PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl⁺suf::P5P4⁺。

实施例3

Tn5-转座子载体(pTN6)的构建及其在PgroE-kivD(o)-sadB(o) 盒整合中的应用

Tn5是细菌转座子，其已经在大肠杆菌中进行了充分的表征(Johnson&Reznikoff，Nature(1983)304：280-282)。然而迄今仍未报道乳酸菌(LAB)的Tn5介导的转座系统。在这个实施例中，开发了Tn5-转座子载体用作随机基因整合到LAB染色体中的递送体系。开发的Tn5-转座子载体(pTN6)(SEQ ID NO：137)是大肠杆菌-植物乳杆菌(L.plantarum)穿梭载体。质粒pTN6包含转座酶基因(tnp)、转座酶识别核苷酸序列Tn5IE(末端内的19个碱基对)和Tn5OE(末端外的19个碱基对)、两个抗生素抗性标记；一个是氯霉素抗性标记，另一个是红霉素抗性标记、大肠杆菌P15A复制起点、温度敏感型的植物乳杆菌(L.plantarum)pE194复制起点(Horinouchi和Weisblum J.Bacteriol.(1982)150：804-814)和两个loxP核苷酸序列(34个碱基对)。氯霉素抗性基因侧接用于随后的Cre重组酶切除的loxP位点。多克隆位点(MSC)包含BamHI、NotI、ScaI和SpeI限制性位点，其位于loxP和Tn5OE位点之间。氯霉素抗性基因、两个loxP位点和MCS侧接Tn5IE和Tn5OE。

为了构建Tn5-转座子载体pTN6，首先由Genscript Corp(Piscataway，NJ)合成1,048bp的Tn5IE-loxP-cm-loxP盒，其包含Tn5IE、loxP、氯霉素抗性基因(cm)和loxP(SEQ ID NO：138)。将Tn5IE-loxP-cm-Pspac-loxP盒克隆到pUC57载体中(Genscript Corp，Piscataway，NJ)，生成质粒pUC57-Tn5IE-loxP-cm-loxP。在spac启动子的控制下表达氯霉素抗性基因(Yansura&Henner，(1984)Proc NatlAcad Sci USA.81：439-443)以在大肠杆菌和植物乳杆菌(L.plantarum)中选择。用Nsil和SacI消化质粒pUC57-Tn5IE-loxP-cm-loxP并凝胶纯化1,044bp的Tn5IE-loxP-cm-loxP片段。用Nsil和SacI消化质粒pFP996(SEQ ID NO：97)并凝胶纯化4,417bp的pFP996片段，其包含pBR322和pE194复制起点。Tn5IE-loxP-cm-loxP片段与4,417bp的pFP996片段连接以生成pTnCm。

其次，用P15A复制起点取代pTnCm上的pBR322复制起点。用AatII和SalI消化质粒pTnCm并凝胶纯化2,524bp的pTnCm片段，其包含pE194复制起点和Tn5IE-loxP-cm-loxP盒。913bp的p15A复制起点利用PCR从pACYC184[Chang和Cohen，J.Bacteriol.(1978)134：1141-1156]中扩增出来，所述PCR利用包含SalI限制性位点和19bp的Tn5OE核苷酸序列的引物T-P15A(SalITn5OE)(SEQ ID NO：139)和包含Aatll限制性位点的引物B-P15A(AatII)(SEQ ID NO：140)，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs，Ipswich，MA)进行。在用SalI和AatII限制性酶消化后，P15A片段与2,524bp的pTnCm片段连接以生成pTN5。

第三，将红霉素抗性基因(erm)克隆到pTN5上的HindIII位点。通过PCR扩增从载体pFP996(SEQ ID NO：97)中生成1,132bp的红霉素抗性基因(erm)DNA片段，所述PCR利用包含NsiI限制性位点的引物T-erm(HindIII)(SEQ ID NO：141)和包含NsiI限制性位点的B-erm(HindIII)(SEQ ID NO：142)，使用Phusion High-Fidelity PCR MasterMix进行，并且将上述片段克隆到pTN5上的HindIII限制性位点，生成pTN5-erm。

最后，将编码转座酶的tnp基因序列融合到npr(来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的中性蛋白酶)启动子中[Nagarajan等人，J.Bacteriol(1984)159：811-819]，这通过SOE(重叠延伸拼接)PCR完成并将其克隆到pTN5-erm上的NsiI位点。包含Pnpr启动子(SEQ IDNO：143)的DNA片段通过PCR从pBE83[Nagarajan等人，Appl EnvironMicrobiol(1993)59：3894-3898]中扩增出来，所述PCR利用包含NsiI限制性位点的T-Pnpr(NsiI)(SEQ ID NO：144)和包含17bp重叠序列的B-Pnpr(tnp)(SEQ ID NO：145)的引物组，使用Phusion High-FidelityPCR Master Mix进行。tnp编码区(SEQ ID NO：93)通过PCR从pUTmTn5-(Sharpe等人，Appl Environ Microbiol(2007)73：1721-1728)中扩增出来，所述PCR利用包含21bp重叠序列的T-tnp(Pnpr)(SEQ ID NO：146)和包含NsiI限制性位点的B-tnp(NsiI)(SEQ ID NO：147)的引物组，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行。混合两个反应的PCR产物并使用外引物(T-Pnpr(NsiI)和B-tnp(NsiI))进行扩增，结果得到Pnpr-tnp融合DNA片段(SEQ ID NO：148)。质粒pTN5-erm用NsiI消化并用Calf肠磷酸酶(New England Biolabs，MA)处理以防止自身连接。消化的pTN5-erm载体与用NsiI消化的Pnpr-tnp片段连接。通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)中。在包含25μg/mL氯霉素的LB平板上，在37℃下选择转化子。然后通过菌落PCR，使用Pnpr-tnp盒的外引物筛选转化子，并且通过用引物pTnCm(711)(SEQ ID NO：149)、pTnCm(1422)(SEQ ID NO：150)和pTnCm(3025)(SEQ ID NO：151)进行DNA测序来确认。所得质粒称为pTN6。

将这个Tn5-转座子载体pTN6用作将PgroE-kivD(o)-sadB(o)盒整合到PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl⁺suf::P5P4⁺菌株的染色体中的随机基因递送体系。包含PgroE启动子(Yuan和Wong，J.Bacteriol(1995)177：5427-5433)(SEQ ID NO：152)的DNA片段通过PCR从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组DNA中扩增出来，所述PCR利用包含SalI和KpnI限制性位点的T-groE(SalIKpnI)(SEQ ID NO：153)和包含BamHI限制性位点的B-groE(BamHI)(SEQ ID NO：154)的引物组，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行。在用SalI和BamHI限制性酶消化后所得的154bp的PgroE启动子片段被克隆到质粒pTN6的SalI和BamHI位点中，生成pTN6-PgroE。编码来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的支链酮酸脱羧酶的kivD基因的编码区经密码子优化以在植物乳杆菌(L.plantarum)中表达。经优化的编码区序列称为kivD(o)(SEQ ID NO：88)，其具有RBS，由Genscript Corp(Piscataway，NJ)合成。将kivD(o)编码区连同RBS(SEQ ID NO：155)一起克隆到pUC57载体中，生成质粒pUC57-kivD(o)。质粒pUC57-kivD(o)用BamHI和NotI消化，并且凝胶纯化1,647bp的RBS-kivD(o)片段。将RBS-kivD(o)片段克隆到pTN6-PgroE上的BamHI和NotI限制性位点，生成pTN6-PgroE-kivD(o)。通过菌落PCR确认正确的克隆，所述PCR使用引物T-groE(SalIKpnI)和kivD(o)R(SEQ ID NO：153和156)，生成期望大小的1,822bp片段。然后如美国专利申请#12/430356所述，将来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的支链醇脱氢酶的sadB基因编码区克隆到pTN6-PgroE-kivD(o)的kivD(o)编码区下游。木糖氧化无色杆菌(A.xylosoxidans)sadB编码区经密码子优化以在植物乳杆菌(L.plantarum)中表达。新编码区称为sadB(o)(SEQ ID NO：157)，其具有RBS，由Genscript Corp(Piscataway，NJ)合成并被克隆到pUC57载体中生成质粒pUC57-sadB(o)。包含RBS和sadB(o)编码区的1,089bp的DNA片段(SEQ ID NO：158)通过PCR从pUC57-sadB(o)中扩增出来，所述PCR利用包含NotI限制性位点的T-sadB(o)(NotI)(SEQ ID NO：159)和包含NotI限制性位点的B-sadB(o)(NotI)(SEQ ID NO：160)的引物组，使用PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix进行。在用NotI消化后，将RBS-sadB(o)基因片段克隆到pTN6-PgroE-kivD(o)的NotI限制性位点中，生成pTN6-PgroE-kivD(o)-sadB(o)。通过使用kivD(o)1529(SEQ ID NO：161)和B-spac(cm)(SEQ ID NO：162)引物的DNA测序确认正确的克隆。在这个构建过程中，sadB(o)和kivD(o)编码区在操纵子中从PgroE启动子开始表达。

如一般方法所述，通过电穿孔将所得质粒pTN6-PgroE-kivD(o)-sadB(o)转化到PN0512ΔldhDΔldhL1::ilvDLl⁺suf::P5P4⁺中。在补充有7.5μg/mL氯霉素的乳杆菌MRS培养基上选择转化子。氯霉素抗性菌落在包含7.5μg/mL氯霉素的乳杆菌MRS培养基上，在30℃的许可温度下生长大约10代。将1/100稀释的培养物接种到新鲜MRS培养基上，并且通过连续接种到乳杆菌MRS培养基上使其在37℃下生长大约20代。将培养物置于含有7.5μg/mL氯霉素的乳杆菌MRS上。通过将菌落再次划线接种到包含1.5μg/mL红霉素的乳杆菌MRS平板上筛选分离物，所述平板用于红霉素敏感型菌落，推测其包含染色体整合的PgroE-kivD(o)-sadB(o)盒以及转座子。通过使用kivD(o)序列特异性引物KivD(o)1529和sadB(o)序列特异性引物B-sadB(o)(NotI)的菌落PCR确认转座子介导的整合子，从而制备期望大小的PCR产物(1,220bp)。

为了切除侧接染色体loxP位点的氯霉素抗性标记，根据一般方法中所述的规程将表达Cre重组酶的辅助质粒pFP352(SEQ ID NO：163)转化到转座子介导的整合子中并在30℃下，在包含1.5μg/mL红霉素的乳杆菌MRS平板上生长。cre重组酶通过loxP位点间的重组事件从染色体中切除氯霉素标记。将红霉素抗性的转化子接种到MRS培养基中并在37℃下生长大约10代。将培养物置于无抗生素的乳杆菌MRS上并在30℃下生长。通过分别测试在包含1.5μg/mL红霉素的乳杆菌MRS平板上和在包含氯霉素(7.5μg/mL)的乳杆菌MRS平板上的菌落生长筛选分离物中的红霉素和氯霉素敏感型菌落，从而验证pFP352的丢失和氯霉素标记的移除。最后，通过利用引物B-groE(BamHI)的基因组DNA测序确认整合子。使用MasterPure DNA Purification

试剂盒(Enpicentre，Inc.，Madison，WI)制备基因组DNA。DNA测序结果指示PgroE-kivD(o)-sadB(o)盒被插入编码糖原分支酶的glgB基因的编码区内，该酶催化1，4-α-D-葡聚糖链片段转化成相似葡聚糖链中的伯醇羟基。所得整合子称为PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)。

实施例4

aldB缺失载体的构建和初始的去除尝试

描述了去除菌株PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)中编码乙酰乳酸脱羧酶的aldB基因的尝试。

使用两步同源重组方法尝试生成未标记的去除。同源重组方法利用上述的穿梭载体pFP996(SEQ ID NO：97)。将包含期望去除的序列上游和下游的两片段DNA克隆到质粒中以提供两个遗传交换的同源性区域。初始的单交换将质粒整合到染色体。然后第二交换事件能够产生野生型序列或者整合的基因去除。

设计同源DNA臂使得所述去除将包括编码AldB蛋白质的前23个氨基酸的区域(aldB编码序列的核苷酸1-68)。克隆到所述质粒的左同源臂和右同源臂分别为1186和700个碱基对。同源臂由序列GGTACCT分开，它置换68个核苷酸的aldB序列去除。左同源臂从植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA中，利用包含XhoI限制性位点的引物oBP23(SEQ ID NO：122)和包含KpnI限制性位点的引物oBP24(SEQ IDNO：164)，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行扩增。右同源臂从植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA中，利用包含KpnI限制性位点的引物oBP335(SEQ ID NO：165)和包含BsrGI限制性位点的引物oBP336(SEQ ID NO：166)，使用Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix进行扩增。用XhoI和KpnI消耗左同源臂DNA片段并用KpnI和BsrGI消化右同源臂DNA片段。在用合适的限制性酶消化后，两个同源臂用T4DNA连接酶连接到相应的限制性位点pFP996中以生成载体pFP996aldBdel23arms。

通过用pFP996aldBdel23arms转化植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)获得单交换。用PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)接种包含0.5％甘氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的100mL乳杆菌MRS培养基(Accumedia，Neogen Corporation，Lansing，MI)并在30℃下生长至OD600为0.7。在4℃下以3700×g处理8分钟收获细胞，所得细胞用100mL冷的1mM的MgCl₂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤，在4℃下以3700×g离心8分钟，用100mL冷的30％PEG-1000(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤，在4℃以3700×g再离心20分钟，然后重悬在1mL冷的30％PEG-1000中。60μl细胞与～100ng质粒DNA在冷的1mm间隙电穿孔管中混合，并且用BioRad Gene Pulser(Hercules，CA)在1.7kV，25μF和400Ω下电穿孔。将细胞重悬在包含500mM蔗糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和100mM的MgCl₂的1mL的MRS培养基中，在30℃下培养2小时，然后置于包含1μg/mL红霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的MRS培养基平板上。

通过使用质粒特异性引物oBP42(SEQ ID NO：111)和oBP57(SEQID NO：113)的PCR筛选转化子。转化子在30℃下在包含红霉素(1μg/mL)的乳杆菌MRS培养基中生长大约10代，然后在37℃下通过连续接种在乳杆菌MRS培养基中生长大约35代。将培养物置于包含红霉素(1μg/mL)的乳杆菌MRS培养基上。通过菌落PCR筛选获得的分离物以获得单交换，所述PCR使用染色体特异性引物oBP47(SEQ IDNO：167)和质粒特异性引物oBP42(SEQ ID NO：111)，以及染色体特异性引物oBP54(SEQ ID NO：168)和质粒特异性引物oBP337(SEQ IDNO：169)。

通过连续接种在无葡萄糖的乳杆菌MRS培养基中，单交换整合子在37℃下生长大约41代。将培养物置于无葡萄糖的MRS培养基上并在37℃下生长。将菌落涂布在无葡萄糖的MRS平板上并在37℃下生长。通过使用染色体特异性引物oBP54(SEQ ID NO：168)和去除特异性引物oBP337(SEQ ID NO：169)的(菌落)PCR筛选96个分离物以确定去除二次交换的存在。测试的分离物均不包含所述去除。

实施例5

pTN5-PrrnC1-aldB(乳酸乳球菌(L.lactis))载体的构建

这个实施例的目的是描述将来自乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp lactis)NCDO2118的乙酰乳酸脱羧酶的aldB编码区(SEQ IDNO：37)[Godon等人，J.Bacteriol.(1992)174：6580-6589]克隆到大肠杆菌-植物乳杆菌穿梭载体pTN5中。pTN5载体的构建在实施例3中进行了描述。

包含PrrnC1启动子(SEQ ID NO：170)的DNA片段通过PCR从乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)NCDO2118的基因组DNA中扩增出来，所述PCR利用包含SalI和KpnI限制性位点的T-rrnC1(SalIKpnI)(SEQ ID NO：171)和包含BamHI限制性位点的B-rrnC1(BamHI)(SEQ ID NO：172)的引物组，使用Phusion High-FidelityPCR Master Mix进行。在用SalI和BamHI限制性酶消化后所得的149bp的PrrnC1启动子片段被克隆到质粒pTN5的SalI和BamHI位点中，生成pTN5-PrrnC1。包含RBS和aldB编码区的DNA片段通过PCR从乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)NCDO2118的基因组DNA中扩增出来，所述PCR利用包含BamHI限制性位点的T-aldBLI(BamHI)(SEQ ID NO：173)和包含NotI和SpeI限制性位点的B-aldBLI(NotISpeI)(SEQ ID NO：174)的引物组。用BamHI和NotI消化所得735bp的aldB(乳酸乳球菌(L.lactis))编码区和RBS片段，然后将其克隆到pTN5-PrrnC1上的BamHI和NotI位点，生成pTN5-PrrnC1-aldB(乳酸乳球菌(L.lactis))。通过限制性酶BamHI和NotI作图确认正确的克隆，示出期望大小的(3,569bp和735bp)的DNA片段。

实施例6

在质粒表达的乙酰乳酸脱羧酶的存在下去除aldB

在这个实施例中，在质粒上表达aldB基因的细胞中尝试引起aldB去除的二次交换。

用质粒pTN5-PrrnC1-aldB(乳酸乳球菌(L.lactis))通过电穿孔转化来自实施例5的单交换整合子。如上文实施例4所述制备电感受态细胞。在30℃下，在包含氯霉素(7.5μg/mL)和红霉素(1μg/mL)的乳杆菌MRS琼脂平板上培养5天后选择转化子。氯霉素和红霉素抗性转化子在30℃下通过连续接种在具有氯霉素(7.5μg/mL)的乳杆菌MRS培养基中生长大约20代，然后将培养物置于包含氯霉素(7.5μg/mL)的乳杆菌MRS琼脂平板上。将所得菌落涂布在包含红霉素(1μg/mL)的乳杆菌MRS琼脂平板上以测试红霉素敏感性。130个菌落中有42个显示红霉素敏感性。然后，通过菌落PCR分析筛选42个红霉素敏感的菌落中去除去除编码AldB蛋白质前23个氨基酸的区域(aldB编码序列的核苷酸1-68)的菌落，所述PCR利用染色体特异性引物OBP47和OBP54(期望大小：～3.3kbp)和染色体特异性引物OBP54和OBP337(期望大小：～1.9kbp)。菌落PCR分析显示42个红霉素敏感型菌落中的22个具有Δ23aa aldB。

为了去除质粒pTN5-PrrnC1-aldB(乳酸乳球菌(L.lactis))，Δ23aaaldB缺失突变体菌株在37℃下通过连续接种在乳杆菌MRS培养基中生长大约20代。将培养物置于乳杆菌MRS琼脂平板上。Δ23aa aldB缺失突变体菌株的质粒移除通过所述菌株在包含氯霉素(7.5μg/mL)的MRS琼脂平板上不生长而被证实。在移除质粒pTN5-PrrnC1-aldB(乳酸乳球菌(L.lactis))后，对应于AldB蛋白质的前23个氨基酸的aldB编码序列的核苷酸1-68的缺失通过使用AA213引物(SEQ ID NO：175)的DNA测序而被证实，所述测序显示内源性aldB基因在AldB质粒表达的存在下被成功地去除。所得Δ23aa aldB突变菌株称为PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB。

实施例7

pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))载体的构建

这个实施例的目的是描述将来自乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp lactis)NCDO2118(NCIMB 702118)的酮醇酸还原异构酶的ilvC编码区(SEQ ID NO：74)[Godon等人，J.Bacteriol.(1992)174：6580-6589]克隆到pDM5载体。

质粒pDM5(SEQ ID NO：176)通过用融合到lacO操纵子序列和lacI阻遏蛋白基因上的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)groE启动子(PgroE)取代pDM1的P30启动子进行构建。质粒pDM1在实施例1中进行了描述。质粒pHTO1(Mo Bi Tec，Goettingen，Germany)用SacI消化并用Klenow片段处理以制备平末端，用BamHI消化，然后凝胶纯化1,548bp的lacI-PgroE/lacO片段(SEQ ID NO：177)。将lacI-PgroE/lacO片段克隆到pDM1的KpnI(用Klenow片段处理得到平末端)和BamHI位点以取代P30启动子，生成pDM5。

DNA片段PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))包含ldhL1(得自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512的L-乳酸脱氢酶)启动子(PldhL1)和得自乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsplactis)NCDO2118的ilvC编码区，该片段通过SOE(重叠延伸拼接)PCR生成。包含PldhL1启动子的DNA片段通过PCR从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512的基因组DNA中扩增出来，所述PCR利用包含NotI限制性位点的T-ldhL1(NotI)(SEQ ID NO：178)和包含19bp重叠序列的B-ldhLI(CLI)(SEQ ID NO：179)的引物组，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行。ilvC编码区通过PCR从乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)NCDO2118的基因组DNA中扩增出来，所述PCR利用包含17bp重叠序列的T-CLI(ldh)(SEQ ID NO：180)和包含PvuI限制性位点的B-CLI(PvuI)(SEQ IDNO：181)的引物组，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行。混合两个片段的PCR产物并使用外引物T-ldhL1(NotI)和B-CLI(PvuI)进行扩增，结果得到PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))融合DNA片段。质粒pDM5用NotI和PvuI限制性酶消化，并且在用NotI和PvuI限制性酶消化后与PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))盒连接。通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)中。在包含25μg/mL氯霉素的LB平板上，在37℃下选择转化子。然后通过菌落PCR，使用PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))盒的外引物筛选转化子，并且通过用T-ldhL1(NotI)(SEQ ID NO：178)和pDM(R)new(SEQ ID NO：182)进行DNA测序来确认。所得质粒称为pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))(SEQ ID NO：183)。

实施例8

使用包含载体pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))的 PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4 ⁺ glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB (o)Δ23aa aldB产生异丁醇

这个实施例的目的是展示在重组植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)aldB-菌株背景下的乙醇产量比aldB+菌株背景下的乙醇产量提高。

为了构建表达异丁醇生物合成途径基因的重组植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，如上所述制备两个整合子PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)和PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB-的感受态细胞，并且用质粒pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))进行转化，生成PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)/pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))，称为DWS2269，以及PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB-/pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))，称为DWS2279。通过从内源性基因中天然表达提供异丁醇途径的第一个酶，乙酰乳酸合酶。

把两个菌株DWS2269和DWS2279接种到在10mL培养管中包含7.5μg/mL氯霉素的乳杆菌MRS(100mM的3-吗啉丙磺酸(MOPS)，pH7.0)培养基中并在30℃下有氧生长过夜。将过夜培养物接种到40mL的MRS培养基(100mM的MOPS pH7.0)中至初始OD600＝0.4，所述培养基在120mL血清瓶中包含7.5μg/mL氯霉素，40μM柠檬酸铁，0.5mM半胱氨酸，并且培养物在振荡(100rpm)条件下在37℃厌氧生长96小时。将培养物样品在4℃下以3700×g离心10分钟，并且将上清液滤过0.2μm的过滤器(Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI)。过滤后的上清液通过HPLC(1200系列，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)进行分析，所述分析利用SHODEX Sugar柱，用UV210和折射率进行检测，流动相为10mM的H₂SO₄。表5中的结果显示在MRS培养基(100mM的MOPS pH7.0)中，在37℃下厌氧生长的菌株DWS2269和DWS2279的异丁醇、乙偶姻和乙醇产量。包含aldB-突变的DWS2279的异丁醇产量为8mM，其比包含野生型aldB+的DWS2269的异丁醇产量(1.3mM)高大约6倍。

表5：在MRS培养基(100mM的MOPS pH7.0)中，在37℃下厌氧生长的DWS2269(aldB+)和DWS2279(aldB-)的异丁醇、乙偶姻和乙醇产量。

实施例9

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll) suf::P5P4 ⁺ glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldBΔpflB2A2::alsS (o)菌株的构建

这个实施例的目的是描述在PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB菌株背景下构建植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，所述菌株去除了编码甲酸C-乙酰转移酶(丙酮酸甲酸裂解酶)的基因pflB2和编码甲酸C-乙酰转移酶激活酶的pflA2，因此不包含甲酸C-乙酰转移酶活性。基因(alsS)经密码子优化以在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中表达，它编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)乙酰乳酸合酶，将其整合到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512的pflB2A2基因。

使用上述两步同源重组方法工程化pflB2A2基因敲除菌株和alsS基因整合菌株。敲除去除了PflB2的C-末端351个氨基酸(编码序列的核苷酸1204至2256)和pflA2完整编码序列。在具有截短pflB2的框内用终止密码子置换去除的序列，其后是核糖体结合序列和经密码子优化以在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中表达的枯草芽孢杆菌alsS基因的编码区。

如下在质粒pFP996(SEQ ID NO：97)中构建敲除/整合载体。用于去除pflB2A2基因的同源臂从植物乳杆菌(L.plantarum)PN0512基因组DNA中扩增。pflB2A2左同源臂使用包含XhoI限制性位点的引物oBP309(SEQ ID NO：184)和包含终止密码子(TAA的互补序列)与XmaI限制性位点的引物oBP310(SEQ ID NO：185)进行扩增。pflB2A2右同源臂利用包含KpnI限制性位点的引物oBP271(SEQ ID NO：186)和包含BsrGI限制性位点的引物oBP272(SEQ ID NO：187)进行扩增。将pflB2A2左同源臂克隆到XhoI/XmaI位点并将pflB2A2右同源臂克隆到pFP996的KpnI/BsrGI位点以生成pFP996-pflB2A2arms。经密码子优化以在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中表达的枯草芽孢杆菌alsS编码区(SEQ ID NO：57；由Genscript Corp，Piscataway，NJ合成)用包含XmaI限制性位点的引物oBP282(SEQ ID NO：188)和包含KpnI限制性位点的引物oBP283(SEQ ID NO：189)进行扩增。将密码子优化的alsS编码区克隆到pFP996-pflB2A2arms的XmaI/KpnI位点以生成pFP996-pflB2A2arms-als(o)。

如上所述用pFP996-pflB2A2arms-als(o)转化PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB(在实施例6中制备)，不同的是在缺少甘氨酸的情况下制备感受态细胞，并且在包含1μg/mL红霉素的MRS平板上选择转化子。将转化子划线接种到包含红霉素(1μg/mL)的MRS平板上，然后再划线接种到MRS平板上。通过用于单交换的菌落PCR筛选分离物，所述单交换使用染色体特异性引物oBP278(SEQ ID NO：190)和als(o)特异性引物oBP283(SEQ ID NO：189)。在将培养物置于无葡萄糖的MRS培养基上之前，通过将其连续接种在无葡萄糖的MRS培养基中，单交换整合子在37℃下生长大约25代。通过使用als(o)特异性引物oBP282(SEQ ID NO：188)和染色体特异性引物oBP280(SEQ ID NO：89)的(菌落)PCR筛选红霉素敏感型分离物以确定野生型或缺失/二次交换整合的存在。所得缺失/整合菌株PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB ΔpflB2A2::alsS(o)通过对PCR产物进行测序来确认，所述PCR产物用染色体特异性的引物oBP279(SEQ ID NO：90)和oBP280(SEQ ID NO：89)进行扩增。

实施例10

使用包含载体pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))的 PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4 ⁺ glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB (o)Δ23aa aldBΔpflB2A2::alsS(o)产生异丁醇

这个实施例的目的是展示在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB ΔpflB2A2::alsS(o)菌株背景下的异丁醇产量比在亲本菌株PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB菌株背景下的异丁醇产量提高。

为了构建表达异丁醇生物合成途径基因的重组植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，如实施例1所述制备整合子PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB ΔpflB2A2::alsS(o)的感受态细胞，并且用质粒pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))(如实施例7所述进行构建)进行转化，生成PN0512ΔIdhDΔldhL1::ilvD(Ll)suf::P5P4⁺glgB::Tn5-PgroE-kivD(o)-sadB(o)Δ23aa aldB ΔpflB2A2::alsS(o)/pDM5-PldhL1-ilvC(乳酸乳球菌(L.lactis))，将其称为DWS2307。

使用如实施例8所述的相同培养基、生长条件和样品制备测试菌株DWS2307的异丁醇产量。培养菌株DWS2279(实施例8)作为对照。过滤后的上清液通过HPLC(1200系列，Agilent Technologies，SantaClara，CA)进行分析，所述分析利用SHODEX Sugar柱，用UV210和折射率进行检测，流动相为10mM的H₂SO₄。表6中的结果显示与DWS2279相比较的DWS2307的异丁醇、甲酸、乙偶姻和乙醇产量。包含ΔpflB2A2-突变的DWS2307的异丁醇产量为19.1mM，其比包含野生型pflB2A2+的DWS2279的异丁醇产量(8mM)高大约2.4倍。DWS2307缺失基因pflB2和pflA2，因此不包含甲酸C-乙酰转移酶活性，它不显示产生甲酸。

表6：在MRS培养基(100mM的MOPS pH7.0)中，在37℃下厌氧生长的DWS2279(pflB2A2+)和DWS2307(ΔpflB2A2-)的异丁醇、甲酸、乙偶姻和乙醇产量。