CN102186973A - 细菌的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途 - Google Patents

细菌的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102186973A
CN102186973A CN2009801385422A CN200980138542A CN102186973A CN 102186973 A CN102186973 A CN 102186973A CN 2009801385422 A CN2009801385422 A CN 2009801385422A CN 200980138542 A CN200980138542 A CN 200980138542A CN 102186973 A CN102186973 A CN 102186973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dhad
sequence
cell
acid
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801385422A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102186973B (zh
Inventor
D·弗林特
S·C·罗思曼
W·苏
J-F·汤布
R·W·叶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Butamax Advanced Biofuels LLC
Original Assignee
Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Butamax Advanced Biofuels LLC filed Critical Butamax Advanced Biofuels LLC
Publication of CN102186973A publication Critical patent/CN102186973A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102186973B publication Critical patent/CN102186973B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01009—Dihydroxy-acid dehydratase (4.2.1.9), i.e. acetohydroxyacid dehydratase
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

发现了具有[2Fe-2S]簇的二羟酸脱水酶的群体。细菌的[2Fe-2S]DHAD被作为异源蛋白质在细菌和酵母细胞中表达，提供了用于使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸和2，3-二羟基甲基戊酸转化为α-异亮氨酸酮酸的DHAD活性。异丁醇和其他化合物可以在包括了细菌[2Fe-2S]DHAD活性的途径中得到合成。

Description

细菌的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途
相关申请的交叉引用
本专利申请涉及并要求2008年9月29日提交的美国临时申请61/100,792的优先权，该专利全文以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及工业微生物学领域和二羟酸脱水酶活性的表达。更具体地讲，鉴定了具有[2Fe-2S]簇的细菌二羟酸脱水酶，并使其在细菌和酵母宿主中作为异源蛋白质被表达。
背景技术
二羟酸脱水酶(DHAD)，也叫乙酰羟酸脱水酶，催化2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸和2，3-二羟基甲基戊酸转化为α-异亮氨酸酮酸。被分类为E.C.4.2.1.9的DHAD酶是天然存在的生产缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素B5)的生物合成途径的部分。对于增强的支链氨基酸或泛酸的微生物生产，活性DHAD的提高的表达是合乎期望的。
2，3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的DHAD催化的转化也是共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US 20070092957 A1中所公开的多种异丁醇生物合成途径的共同步骤。本文公开的是用于生产异丁醇的重组微生物的改造。异丁醇作燃料添加剂是有用的，其可用性可减少对石油化学燃料的需求。
为了提高在包括了二羟酸脱水酶的途径中合成的化合物的生产，在所关注的生产宿主中表达提供这种酶活性的异源酶是合乎期望的。由于这种酶需要Fe-S簇，而这种需求涉及Fe-S簇的可获得性和其向DHAD脱辅基蛋白中的正确装载，二羟酸脱水酶在异源宿主中功能性的高表达的获得是复杂的。
需要Fe-S簇的DHAD是本领域已知的，并且被发现以[4Fe-4S]或[2Fe-2S]形式存在。一些细菌的此类酶是已知的，其中被最好地表征的是来自大肠杆菌的(E.coli)(Flint，DH，等人(1993)J.Biol.Chem.268：14732-14742)。然而，这些细菌的酶均为[4Fe-4S]形式。迄今报道的惟一[2Fe-2S]形式是一种菠菜酶(Flint和Emptage(1988)J.Biol.Chem.263：3558-3564)。
由于[2Fe-2S]形式在Fe-S簇的合成和/或组装方面造成的负担更小，在宿主细胞中使用[2Fe-2S]形式的这种酶以提高所引入的生物合成途径的生产是合乎期望的。遗憾的是，这种酶仅有一种[2Fe-2S]形式是已知的。
因此，存在对鉴定DHAD的新的[2Fe-2S]形式以用于重组宿主细胞中的需求，其中所述重组宿主细胞中，2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸是所期望的生物合成途径中的代谢途径步骤。
发明概述
本文提供了鉴定[2Fe-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括：
a)用序型隐蔽马尔科夫模型(Profile Hidden Markov Model)查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用SEQ ID NO：164、168、230、232、298、310、344和346的蛋白质制备的，其中具有小于10-5的E值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种DHAD相关蛋白质；
b)分析步骤(a)的对应于一种或多种DHAD相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcus mutans)二羟酸脱水酶氨基酸序列(SEQ ID NO：168)的56、129和201位；以及
c)分析步骤(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌DHAD氨基酸序列(SEQ ID NO：168)中的以下位置：88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和454位的亮氨酸。
在本发明的另一方面，上述方法进一步包括：
d)在细胞中表达具有可通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部步骤鉴定的序列的多肽；以及
e)确认所述多肽在细胞中具有DHAD活性。
在本发明的另一方面，上述方法进一步包括：
d)纯化由可通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部鉴定的序列编码的蛋白质；以及
e)通过紫外可见(UV-vis)和电子顺磁共振(EPR)光谱法确认所述蛋白质是[2Fe-2S]DHAD酶。
在本发明的另一方面，上述方法进一步包括选择一种或多种序列，所述序列对应于在步骤a)、b)和c)中任何一个或全部中鉴定的细菌[2Fe-2S]DHAD酶序列。所述选择的序列可在细胞中被表达；并且在该细胞中其DHAD活性可被确认。所述选择的序列可进一步被纯化，从而获得纯化的蛋白质并且所述纯化的蛋白质的[2Fe-2S]DHAD酶活性可通过UV-vis和EPR光谱得到确认。
本发明的另一方面涉及微生物宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一种可通过本文所述方法鉴定的异源[2Fe-2S]DHAD酶。所述细胞可以是细菌细胞或酵母细胞。所述细胞还可以是生产异丁醇的重组细胞。
本发明的另一方面是用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：
a)提供包含至少一种可通过本文所述方法鉴定的异源[2Fe-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含异丁醇生物合成途径；和
b)使(a)的微生物宿主细胞在使异丁醇产生的条件下生长。
本发明的另一方面是用于使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含通过本文所述方法鉴定的至少一种异源[2Fe-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞和2，3-二羟基异戊酸源；和
b)使(a)的微生物宿主细胞在使2，3-二羟基异戊酸被转化为α-酮异戊酸的条件下生长。
附图说明和序列描述
通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。
图1显示在代表性的细菌[2Fe-2S]DHAD和[4Fe-4S]DHAD中的保守的半胱氨酸区域，以粗体的C表示半胱氨酸。采用单字母的氨基酸缩写。
图2显示DHAD相关蛋白的系统发育树。标记了关于[4Fe-4S]和[2Fe-2S]DHAD，以及EDD、醛糖酸脱水酶和未确定的类群(Und)的分枝。标记了选择的个别DHAD。
图3显示用于异丁醇生产的生物合成途径。
图4显示A)变异链球菌DHAD，和B)大肠杆菌DHAD在空气中的活性稳定性的图。
图5显示变异链球菌DHAD的紫外-可见光谱的曲线图。
图6显示变异链球菌DHAD在介于20°K和90°K之间的不同温度的电子顺磁共振(EPR)光谱的曲线图。
图7显示对表达乙酰乳酸合酶、KARI和变异链球菌DHAD基因的酵母细胞提取物的HPLC分析，在47.533分钟有异丁醇峰。
图8显示乳酸乳球菌(L.lactis)DHAD在空气中稳定性的图。
图9显示纯化的乳酸乳球菌DHAD的紫外-可见光谱的曲线图。
表1是基于如实施例1中所述制备的、具有经过检验的功能的酶针对二羟酸脱水酶的序型HMM的表。表1以电子方式附于本文提交，并以引用方式并入本文。
下列序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)，以及行政性指示的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中所列出的规定。
表2a：代表性的细菌[2Fe-2S]DHAD蛋白质和编码序列
Figure BPA00001335031900051
Figure BPA00001335031900061
Figure BPA00001335031900081
Figure BPA00001335031900101
表2b：附加的代表性细菌[2Fe-2S]DHAD蛋白质和编码序列
Figure BPA00001335031900111
Figure BPA00001335031900121
Figure BPA00001335031900131
表3：附加的蛋白质和编码序列的SEQ ID编号
Figure BPA00001335031900132
SEQ ID NO：395-409、412-421、424和431-436是如本文的实施例中所述用于PCR、克隆或序列分析的引物。
SEQ ID NO：410是载体pDM1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：411是载体pLH532的核苷酸序列。
SEQ ID NO：425是啤酒糖酵母FBA启动子。
SEQ ID NO：430是载体pRS423 FBA ilvD(链球菌的)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：437是载体pNY13的核苷酸序列。
SEQ ID NO：438是来自枯草芽孢杆菌的alsS编码区。
SEQ ID NO：439是啤酒糖酵母GPD启动子。
SEQ ID NO：440是啤酒糖酵母CYC1终止子。
SEQ ID NO：442是啤酒糖酵母ILV5基因。
发明详述
如本文所公开的，通过发现鉴定[2Fe-2S]DHAD的方法，申请人已解决了所陈述的问题。通过发现这些酶和它们在重组宿主中的使用，在用DHAD改造的途径中鉴定到了迄今未被认识到的活性优点。
本发明涉及被改造为提供具有[2Fe-2S]簇的二羟酸脱水酶(DHAD)的异源表达的重组酵母或细菌细胞。所表达的DHAD作为生产化合物的生物合成途径的组分起作用，所述化合物例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸泛酸或异丁醇。这些氨基酸和泛酸可被用作营养补充剂，并且异丁醇可被用作燃料添加剂以减少对石油化学产品的需求。
以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的判读。
如本文所用，术语“包含”、“由...组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他的包含物。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，下列中任何一种均使条件A或B得到满足：A为真实(或存在)的且B为虚假(或不存在)的，A为虚假(或不存在)的且B为真实(或存在)的，以及A和B均为真实(或存在)的。
同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
如本文所用，用术语“约”修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变化，它们可能发生在，例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。
术语“[2Fe-2S]DHAD”是指具有结合的[2Fe-2S]簇的DHAD酶。
术语“[4Fe-4S]DHAD”是指具有结合的[4Fe-4S]簇的DHAD酶。
术语“二羟酸脱水酶”，亦缩写为DHAD，是指将2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的酶。
术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
术语“兼性厌氧菌”是指在有氧和缺氧环境中均能生长的微生物。
术语“碳底物”或“可发酵碳底物”指能够被本发明的宿主生物体代谢的碳源，特别是选自下列的碳源：单糖、低聚糖、多糖和一碳底物或它们的混合物。碳底物可包括C6和C5糖类以及它们的混合物。
术语“基因”指能够被表达为特定蛋白的核酸片段，任选地包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外源基因”或“异源基因”指宿主生物中通常不存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。
如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。
如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。
如本文所用，“分离的核酸片段”或“分离的核酸分子”将可以互换使用，并将指单链或双链的RNA或DNA聚合体，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并例示于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，尤其是其中的第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％ SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％ SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％ SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组较优选的严格性条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％ SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1％ SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％ SDS中于65℃下杂交，并用2X SSC、0.1％ SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％ SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按下列顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最小长度优选地为至少约15个核苷酸；更优选地为至少约20个核苷酸；最优选地长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Altschul，S.J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书讲授了编码特定蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如本领域所熟知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中，“同一性”或“序列同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类线性序列的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于下列文献中所述的那些方法：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，编辑)Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informatics and Genome  Projects(Smith，D.W.，编辑)Academic：NY(1993)；3.)Computer  Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje，G.，编辑)Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis Primer (Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性可使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序进行计算。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干种不同的算法，包括对应于称为Clustal V的比对方法的“Clustal V比对方法”(该方法描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM程序中。就多重比对而言，默认值对应于空位罚分＝10以及空位长度罚分＝10。成对比对和使用Clustal方法的蛋白序列百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，WINDOW＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，WINDOW＝4，DIAGONALS SAVED＝4。在使用Clustal V程序的序列比对后，通过观看相同程序中的“序列距离”表获得“百分比同一性”是可能的。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W的比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22：4673 4680)并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTMv6.1程序中。用于多重比对的默认参数(缺口罚分＝10、缺口长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB)。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用实例包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者从55％至100％的任何整数百分比可用于描述本发明，例如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，会议日期1992，111-20。编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(hereinafter “Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。所用的更多方法见于Methods in Enzymology，Volume 194、Guide to Yeast Genetics和Molecular and Cell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)。
[2Fe-2S]DHAD的发现
已知DHAD蛋白质包含为酶活性所需的结合的铁-硫(Fe-S)簇。迄今报道的惟一具有[2Fe-2S]簇的DHAD是一种菠菜的酶(Flint和Emptage(1988)J.Biol.Chem.263：3558-3564)。一些细菌的酶也是已知的，它们中被最好地表征的是来自大肠杆菌的(Flint，DH，等人(1993)J.Biol.Chem.268：14732-14742)，该酶具有[4Fe-4S]簇。
申请人现已确定，存在一类包含[2Fe-2S]簇的细菌的DHAD([2Fe-2S]DHAD)。申请人已发现，通过三个保守的半胱氨酸残基在蛋白质中的存在，可以将[2Fe-2S]DHAD的群体与[4Fe-4S]DHAD的群体区分开来。上述三个保守的半胱氨酸与巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸(一种醛糖酸)脱水酶中报道的三个必需的半胱氨酸(Watanabe，S等人J.Biol.Chem.(2006)281：33521-33536)相似，其中所述阿拉伯糖酸脱水酶被报道包含[4Fe-4S]簇。在巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶蛋白中，位于56、124和197号氨基酸位置的半胱氨酸被确认为酶活性所必需，并且很可能涉及与Fe-S簇的配位。出人意料地，申请人已发现，与巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶的三个必需的半胱氨酸处于对应位置的三个保守的半胱氨酸，是包含[2Fe-2S]簇的DHAD的特征。申请人已发现，包含[4Fe-4S]簇的上述大肠杆菌DHAD具有所述保守的半胱氨酸中的两个，但不具有第三个保守的半胱氨酸。图1中显示的是大肠杆菌包含[4Fe-4S]簇的DHAD的保守半胱氨酸和系统发育的[2Fe-2S]簇DHAD群体的代表的保守半胱氨酸的序列区域的比较，其中所述[2Fe-2S]簇DHAD群体的代表在本文的实施例1中被鉴定并被描述于下文中。
申请人已开发出鉴定[2Fe-2S]DHAD的方法。在本发明中，可通过这种方法被鉴定的细菌的[2Fe-2S]DHAD，可被用于在细菌中异源表达。
为了在结构上表征DHAD酶，利用具有用实验方法被验证(如本文的实施例2中所测定)的功能的DHAD蛋白质的氨基酸序列，制备了序型隐蔽马尔科夫模型(HMM)如实施例1中所述，并且在表1中给出了所述序型HMM。这些DHAD来自欧洲亚硝化单胞菌(DNA SEQ ID NO：309；蛋白质SEQ ID NO：310)、集胞藻属未定名种PCC6803(DNA SEQ ID：297；蛋白质SEQ ID NO：298)、变异链球菌(DNA SEQ ID NO：167；蛋白质SEQ ID NO：168)、嗜热链球菌(DNA SEQ ID NO：163；蛋白质SEQ ID NO：164)、抗重金属罗尔斯通氏菌(DNA SEQ ID NO：345；蛋白质SEQ ID NO：346)、富养罗尔斯通氏菌(DNA SEQ ID NO：343；蛋白质SEQ ID NO：344)和乳酸乳球菌(DNA SEQ ID NO：231；蛋白质SEQ ID NO：232)。此外，来自约氏黄杆菌的DHAD(DNA SEQ ID NO：229；蛋白质SEQ ID NO：230)被发现当在大肠杆菌中表达时具有二羟酸脱水酶活性，并被用于制备上述序型。DHAD的这一序型HMM可被用于鉴定DHAD相关蛋白质。任何以E值＜10-5与所述序型HMM相符的蛋白质均是DHAD相关蛋白质，包括[4Fe-4S]DHAD、[2Fe-2S]DHAD、醛糖酸脱水酶和磷酸葡萄糖脱水酶。符合该序型HMM的序列的系统发育树显示于图2中。
然后分析符合本文给出的序型HMM的序列中的上文所述的三个保守的半胱氨酸的存在。所述三个保守的半胱氨酸的准确位置可以有所不同，而这些可利用多重序列比对在周围序列的背景中得到鉴定，所述多重序列比对用Clustal W算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson T.J.(1994)Nue.Acid Res.22：46734680)采用下列参数进行：1)就成对比对参数而言，空位开放＝10；空位延伸＝0.1；矩阵为Gonnet 250；以及模式慢速-准确(Slow-accurate)，2)就多重比对参数而言，空位开放＝10；空位延伸＝0.2；以及矩阵为Gonnet系列。例如，所述三个保守的半胱氨酸在变异链球菌DHAD(SEQ ID NO：168)中位于56、129和201号氨基酸位置，在乳酸乳球菌DHAD(SEQ ID NO：232)中位于61、135和207号氨基酸位置。所述三个保守的半胱氨酸在其他蛋白质序列中的准确位置对应于变异链球菌或乳酸乳球菌氨基酸序列中的这些位置。利用成对或多重序列比对，本领域的技术人员将能容易地鉴定这三个保守的半胱氨酸在DHAD蛋白质的氨基酸序列中的存在或不存在。此外，其他方法可被用于判定所述三个保守的半胱氨酸的存在，例如通过肉眼分析。
具有两个但不具有第三个(56位)保守半胱氨酸的符合所述DHAD序型HMM的蛋白质，包括[4Fe-4S]DHAD和磷酸葡萄糖脱水酶(EDD)。具有所述三个保守半胱氨酸的蛋白质包括阿拉伯糖酸脱水酶和[2Fe-2S]DHAD，并且是[2Fe-2S]DHAD/醛糖酸脱水酶群体的成员。通过在对应于变异链球菌DHAD氨基酸序列下列位点的位点，分析存在于[2Fe-2S]DHAD中或醛糖酸脱水酶中的特征保守氨基酸，可将[2Fe-2S]DHAD与醛糖酸脱水酶区分开来。这些特征氨基酸在下列位点(以高于90％的发生率)分别存在于[2Fe-2S]DHAD或醛糖酸脱水酶中：88天冬酰胺对谷氨酸；113不保守对谷氨酸；142精氨酸或天冬酰胺对不保守；165不保守对甘氨酸；208天冬酰胺对不保守；454亮氨酸对不保守；477苯丙氨酸或酪氨酸对不保守；以及487甘氨酸对不保守。
所公开的用于鉴定[2Fe-2S]DHAD酶的方法能够在单条序列上或者在一组序列上进行。在一个优选的实施方案中，如本文所述的序型HMM还需要一个或多个序列数据库。适合的序列数据库是本领域的技术人员已知的，包括但不限于Genbank非冗余蛋白质数据库、SwissProt数据库或UniProt数据库，或者其他可用的数据库，例如GQPat(GenomeQuest，Westboro，MA)和BRENDA(Biobase，Beverly，MA)。
在可通过这种方法鉴定的[2Fe-2S]DHAD中，细菌的[2Fe-2S]DHAD可通过作为一种类型的细菌的天然来源生物容易地得到鉴定。任何可通过这种方法被鉴定的细菌的[2Fe-2S]DHAD可适用于在微生物宿主细胞中的异源表达。还应了解的是，本文通过序列明确公开的任何细菌的[2Fe-2S]DHAD可适用于在细菌细胞中的异源表达。优选的细菌[2Fe-2S]DHAD酶能在宿主细胞中被表达并提供DHAD活性。
首先，如实施例1中所述，鉴定了193种具有小于95％的序列同一性的不同的细菌[2Fe-2S]DHAD(大于95％一致性的蛋白质被排除，以简化分析)，并且以表2a中列出的SEQ ID NO，在序列表中提供了这些蛋白质的氨基酸编码序列。
之后的分析(描述于实施例11中)返回了268种不同的细菌[2Fe-2S]DHAD。与初次鉴定提供的193种细菌[2Fe-2S]DHAD中任何一种都不相同的氨基酸和编码序列被包括在序列表中，它们的SEQ ID NO列于表2b中。
任何以至少约95％、96％、97％、98％或99％的一致性与可通过本文所公开的方法鉴定的序列或本文明确公开的序列相匹配的[2Fe-2S]DHAD蛋白质，均是可被用于在如本文所公开的细菌细胞中的异源表达的[2Fe-2S]DHAD。在本文明确公开的细菌[2Fe-2S]DHAD中，在下列位置存在特征氨基酸的100％保守：88天冬氨酸、142精氨酸或天冬酰胺、208天冬酰胺以及454亮氨酸。
此外，可用于本发明中的细菌[2Fe-2S]DHAD可通过它们在DHAD相关蛋白质的系统发育树的[2Fe-2S]DHAD分枝中的位置得到鉴定，所述系统发育树例如显示于图2中并描述于实施例1中的。此外，可使用的细菌[2Fe-2S]DHAD可利用与本文提供了序列的281种细菌[2Fe-2S]DHAD中任何一种的序列比较而得到鉴定，其中序列一致性可以是至少约80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％。
此外，本文提供的[2Fe-2S]DHADs的序列可被用于鉴定其他天然同源物。例如本文所述的每种DHAD编码核酸片段可被用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1.)核酸杂交方法；2.)DNA和RNA扩增方法，例如多种核酸扩增技术[例如，聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)的使用；或链置换扩增反应(SDA)，Walker，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；以及3.)文库构建和互补筛选方法。
例如，与本文提供的[2Fe-2S]DHAD编码基因编码相似的蛋白质或多肽的基因，可以用本领域的技术人员所熟知的方法，通过将本发明的核酸片段的全部或部分用作DNA杂交探针来筛选来自任何目标生物的文库而被直接分离。基于所公开的核酸序列的特异性寡核苷酸探针，可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可用于通过技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)直接合成DNA探针，或使用可用的体外转录体系合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并被用作探针，以通过在适当严格度的条件下的杂交分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域中常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”、in Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)pp 33-50，IRL：Herndon，VA；和Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.(A.编辑，(1993)Vol.15，pp 31-39，PCR Protocols：Current Methods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可以将本文所述序列的两个短片段在聚合酶链反应规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反应也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本文所述核酸片段，而另一个引物的序列利用编码微生物基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。
备选地，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员能够按照RACE规程(Frohman等人，PNAS USA 85：8998(1988))，通过利用PCR扩增转录物中的一个单独位点和3′或5′末端之间的区域的拷贝，生成cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商购获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL，Gaithersburg，MD)，能够分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，PNAS USA 86：5673(1989)；Loh等人，Science 243：217(1989))。
作为另外一种选择，所提供的[2Fe-2S]DHAD编码序列可作为用于鉴定同源物的杂交试剂。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等，这将取决于具体待完成的测试。通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基没有与正确的互补碱基配对。
杂交方法是非常确实的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外，离液剂允许短的寡核苷酸探针在室温下进行灵敏和严格的杂交(Van Ness和Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151，1991)。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯，等等。通常，离液剂将以约3M的终浓度存在。如果需要，技术人员可将甲酰胺加到杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(例如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去垢剂(例如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500kdal)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其他添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
异源的细菌[2Fe-2S]DHAD在细菌和酵母宿主中的表达
申请人已发现，异源[2Fe-2S]DHAD当在微生物细胞中表达时提供了DHAD活性。任何可如本文所述被鉴定的[2Fe-2S]DHAD，均可在异源微生物细胞中被表达。任何这些蛋白质的表达为包括了2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸或2，3-二羟基甲基戊酸转化为α-异亮氨酸酮酸的生物合成途径提供了DHAD活性。与4Fe-4D DHAD相比，[2Fe-2S]DHAD的表达降低了为获得酶活性在簇中对Fe和S的需要。此外，本文显示与大肠杆菌[4Fe-4S]DHAD在空气中的敏感性相比，变异链球菌[2Fe-2S]DHAD在空气中具有更高的稳定性，对于在异源宿主细胞中获得更好的活性，这是合乎期望的。
可作为宿主表达异源的细菌[2Fe-2S]DHAD的细菌细胞包括但不限于：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、以及短杆菌属(Brevibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)和链球菌属(Streptococcus)。在天然地表达[2Fe-2S]DHAD或[4Fe-4S]DHAD的宿主细菌细胞中，构建异源的细菌[2Fe-2S]DHAD的表达可提高DHAD活性。此类宿主细胞可包括，例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外，在不具有内源DHAD活性的宿主细菌细胞中，构建异源的细菌[2Fe-2S]DHAD的表达提供了DHAD活性。此类宿主细胞可包括，例如乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。
具体的宿主包括：大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
宿主细菌细胞可通过为本领域的技术人员所熟知的方法被改造，以表达异源的细菌[2Fe-2S]DHAD。待表达的DHAD的编码区可针对靶标宿主细胞经过密码子优化，如本领域的技术人员所熟知的。对于多种宿主细胞的转化有用的载体是通用的，并且可从例如EPICENTRE
Figure BPA00001335031900281
(Madison，WI)、Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)、Stratagene(La Jolla，CA)和New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)的公司商购获得。载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。此外，适合的载体包含允许实现转录起始控制的启动子区域和转录终止控制区，编码区DNA片段可被插入至二者之间，以提供所插入的编码区的表达。这两种控制区均可来源于与转化的宿主细胞同源的基因，但是应当理解，这种控制区也可能来源于对被选择作生产宿主的特定物种来说是非天然的基因。
可用于驱动细菌[2Fe-2S]DHAD编码区在所期望的细菌宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域的技术人员所熟悉。几乎任何能够驱动这些遗传因子的启动子均适用于本发明，包括但不限于：lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc启动子(对于在大肠杆菌、产碱菌属和假单胞菌属中的表达是有用的)；amy、apr和npr启动子，和多种对于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌中的表达有用的噬菌体启动子；nisA(对于在革兰氏阳性菌中的表达是有用的，Eichenbaum等人Appl.Microbiol.64(8)：2763-2769(1998))；以及合成的P11启动子(对于在植物乳杆菌中的表达是有用的，Rud等人，Microbiology 152：1011-1019(2006))。
终止控制区也可以源于优选宿主的天然的多种基因。任选地，终止位点可能是不必要的，然而，如果含有终止位点则是最优选的。
某些载体能够在广泛的宿主细菌中复制并可通过接合进行转移。pRK404的完整的并且带注释的序列和三种相关载体：pRK437、pRK442和pRK442(H)是可用的。这些衍生物已被证明是在革兰氏阴性菌中进行遗传操纵的有用工具(Scott等人，Plasmid 50(1)：74-79(2003))。广宿主范围的IncP4质粒RSF1010的几种衍生质粒也可获得，其具有在一系列革兰氏阴性菌中发挥功能的启动子。质粒pAYC36和pAYC37具有连同多个克隆位点一起的活性启动子，使得在革兰氏阴性菌中的异源基因能够表达。对于枯草芽孢杆菌和乳杆菌的转化有用的一些载体包括：pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183：175-182(1996)；和O’Sullivan等人，Gene 137：227-231(1993))；pMBB1和pHW800，pMBB1的一种衍生物(Wyckoff等人Appl.Microbiol.62：1481-1486(1996))；pMG1，一种接合型质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184：5800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Microbiol.63：4581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Microbiol.67：1262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.38：1899-1903(1994))。几种来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的质粒也已被报道(vanKranenburg等人，Appl.Microbiol.71(3)：1223-1230(2005))。
染色体基因置换工具也可广泛获得。例如，广宿主范围的复制子pWV101的热敏性变体已被修饰，以构建可用于在一系列革兰氏阳性菌内实现基因置换的质粒pVE6002(Maguin等人，J.Bacteriol.174(17)：5633-5638(1992))。此外，体外转座体可得自商业来源(例如EPICENTRE
Figure BPA00001335031900291
)，用以在各种基因组中产生随机突变。
可作为宿主表达异源的细菌[2Fe-2S]DHAD的酵母细胞是能经受基因操作的任何酵母细胞，并且包括但不限于：糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。适合的菌株包括但不限于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。最适合的是啤酒糖酵母。
表达通过用包含编码任何的这些[2Fe-2S]DHAD的序列的基因进行转化而实现。待表达的DHAD的编码区可以是针对靶标宿主细胞经过密码子优化的，如本领域的技术人员所熟知的。在酵母中用于基因表达的方法是本领域中已知的(参见，例如，Methods in Enzymology，Volume 194，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)。基因在酵母中的表达通常需要可操作地连接至所关注的编码区的启动子，和转录终止子。许多酵母启动子能被用于在酵母中构建基因的表达盒，包括但不限于来源于下列基因的启动子：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUP1、FBA、GPD、GPM、和AOX1。适合的转录终止子包括但不限于：FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1和ADH1。
适合的启动子、转录终止子和[2Fe-2S]DHAD编码区可被克隆进大肠杆菌-酵母穿梭载体，并被转入酵母细胞。这些载体既允许在大肠杆菌中又允许在酵母菌株中的增殖。所用载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。在酵母中通常使用的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，它们包含大肠杆菌复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点，以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择标记是His3(载体pRS423)、Trp1(载体pRS424)、Leu2(载体pRS425)和Ura3(载体pRS426)。携带编码所述DHAD的嵌合基因的表达载体的构建，既可以通过大肠杆菌中标准的分子克隆技术进行，也可以通过酵母中的缺口修复重组方法进行。
缺口修复克隆方法利用了酵母中高效的同源重组。典型地，酵母载体DNA被消化(例如，在其多克隆位点)，以在其序列中产生“缺口”。制备所关注的多种插入DNA，所述插入DNA在其5’和3’末端均包含≥21bp的序列，所述序列依次彼此重叠和与载体DNA的5’和3’末端重叠。例如，为了构建“基因X”的酵母表达载体，选择了用于表达盒的酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA，而基因X通过PCR扩增自其源生物，或者从包含基因X序列的克隆载体获得。线性化载体的5’末端和启动子序列之间、启动子和基因X之间、基因X和终止子序列之间以及终止子和线性化载体的3’末端之间有至少21bp的重叠序列。然后将“带缺口”的载体和插入DNA共转入酵母菌株，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许质粒上营养选择标记的互补作用。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行PCR作图，能够验证正确的插入组合的存在。然后可将从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转入大肠杆菌菌株，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后，所述构建体可通过序列分析得到验证。
与缺口修复技术类似，向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源重组系统。典型地，利用高保真DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望插入发生的基因组区域的5’和3’区域同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转入酵母，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为了将“基因X”整合至染色体位置“Y”，从质粒DNA构建体PCR扩增了启动子-编码区X-终止子构建体，并通过SOE PCR或普通的限制性消化和克隆将其与营养缺陷型标记(例如URA3)相连接。利用引物PCR扩增了包含启动子-编码区X-终止子-URA3区域的完整的盒，其中所述引物包含与酵母染色体上“Y”位置的5’和3’区域同源的40-70bp序列。上述PCR产物被转入酵母，并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过克隆PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。
确认DHAD活性
DHAD活性在经过改造以表达细菌[2Fe-2S]DHAD的细胞中的活性可使用本领域中已知的方法确认。作为一个实例，并且如本文的实施例中所证明的，来自经过改造以表达细菌[2Fe-2S]DHAD的细胞的粗提物可被用于如Flint和Emptage(J.Biol.Chem.(1988)263(8)：3558-64)所述的使用二硝基苯肼的DHAD分析中。在另一个实例中，并且如本文的实施例中所证明的，可通过在缺少内源DHAD活性的酵母菌株中表达可通过本文所公开的方法鉴定的细菌DHAD，对DHAD活性进行分析。如果DHAD活性存在，则所述酵母菌株将在不存在支链氨基酸的条件下生长。DHAD活性还可通过更多的间接方法被确认，例如通过分析在需要DHAD活性的途径中的下游产物。以α-酮异戊酸或α-异亮氨酸酮酸作为途径中间体的任何产物，均可作为对DHAD活性的分析而被测量。此类产物的一份列表包括但不限于：缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和异丁醇。
异丁醇生产
细菌[2Fe-2S]DHAD在细菌或酵母中的表达，如本文所述，提供了转化的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞具有使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸或2，3-二羟基甲基戊酸转化为α-异亮氨酸酮酸的二羟酸脱水酶活性。以α-酮异戊酸或α-异亮氨酸酮酸作为途径中间体的任何产物，均可在本文所公开的具有所述异源[2Fe-2S]DHAD的细菌或酵母菌株中以更高的效率被生产。此类产物的一份列表包括但不限于：缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和异丁醇。
例如，在酵母中，缬氨酸的生物合成包括乙酰乳酸通过乙酰羟酸还原异构酶(ILV5)转化为2，3-二羟基异戊酸、2，3-二羟基异戊酸通过二羟酸脱水酶转化为α-酮异戊酸(也叫2-酮基-异戊酸)、以及α-酮异戊酸通过支链氨基酸转氨酶(BAT2)和支链氨基酸氨基转移酶(BAT1)转化为缬氨酸的步骤。亮氨酸的生物合成包括直到α-酮异戊酸的相同步骤，然后是α-酮异戊酸通过α-异丙基苹果酸合酶(LEU9，LEU4)转化为α-异丙基苹果酸、α-异丙基苹果酸通过异丙基苹果酸异构酶(LEU1)转化为β-异丙基苹果酸、β-异丙基苹果酸通过β-IPM脱氢酶(LEU2)转化为α-酮异己酸、以及α-酮异己酸通过支链氨基酸转氨酶(BAT2)和支链氨基酸氨基转移酶(BAT1)转化为亮氨酸的步骤。细菌的途径与此类似，包括命名有所区别的蛋白质和基因。2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的提高将使这些途径中的流量升高，尤其如果途径的一种或多种其他的酶被过表达。因此，使用本文所公开的菌株对于缬氨酸或亮氨酸的生产而言是合乎期望的。
泛酸的生物合成包括通过DHAD进行的步骤，以及通过酮泛酸羟甲基转移酶和泛酸合酶进行的步骤。构建这些酶的表达以提高微生物中泛酸生物合成的生产描述于US 6177264中。
DHAD的α-酮异戊酸产物是共同拥有和共同未决的美国专利公布20070092957 A1中公开的异丁醇生物合成途径中的中间体，该专利以引用方式并入本文。图3中提供了所公开的异丁醇生物合成途径的图示。本文所公开的菌株中的异丁醇生产受益于提高的DHAD活性。如本文所公开的，通过在细菌或酵母细胞中表达细菌[2Fe-2S]DHAD，提供了DHAD活性。如US 20070092957 A1中所述，在一个实施例中异丁醇生物合成途径的步骤包括下列转化：
-丙酮酸向乙酰乳酸(参见图1，其中途径的步骤a)，例如受乙酰乳酸合酶催化，
-乙酰乳酸向2，3-二羟基异戊酸(参见图1，其中途径的步骤b)，例如受乙酰羟酸异构还原酶催化；
-2，3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸(参见图1，其中途径的步骤c)，例如受乙酰羟酸脱水酶，也叫二羟酸脱水酶(DHAD)催化；
-α-酮异戊酸向异丁醛(参见图1，其中途径的步骤d)，例如受支链α-酮酸脱羧酶催化；和
-异丁醛向异丁醇(参见图1，其中途径的步骤e)，例如受支链醇脱氢酶催化。
就选择性途径的步骤f、g、h、l、j和k而言，底物转化为产物以及这些反应中所涉及的酶描述于US 20070092957 A1中。
除了本文所公开的[2Fe-2S]DHAD之外，可用于表达以上述及的途径步骤的酶的基因，以及两种其他的异丁醇途径的那些基因，描述于US 20070092957 A1中，并且本领域的技术人员通过如上文所述的生物信息学或实验方法能够鉴定可使用的更多的基因。在全部三种途径中，具有特别高活性的酮醇酸还原异构酶(KARI)的优选的使用公开于共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US20080261230A1中。该专利中公开的高活性KARI的实例是来自霍乱弧菌(DNA：SEQ ID NO：389；蛋白质SEQ ID NO：390)、铜绿假单胞菌PAO1(DNA：SEQ ID NO：422；蛋白质SEQ ID NO：423)以及荧光假单胞菌PF5(DNA：SEQ ID NO：391；蛋白质SEQ ID NO：392)的那些。
对于利用所公开的生物合成途径的异丁醇生产，US 20070092957 A1中还描述了嵌合基因的构建以及细菌和酵母的基因工程改造。
用于生产的生长
本文所公开的重组细菌或酵母宿主生长于包含适合的碳底物的发酵培养基中。附加的碳底物可包括但不限于：单糖，例如果糖；低聚糖，例如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽。其他碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。
另外，碳底物也可以是已被证明可以被代谢转化为关键生化中间产物的诸如二氧化碳的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体也已知可以利用多种其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153：485-489(1990))。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
尽管预期以上提及的所有碳底物及它们的混合物均适用于本发明，对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。蔗糖可来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源，包括谷物如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维质的或木质纤维质的生物质，例如，如共同拥有和共同未决的美国专利申请公布2007/0031918A1中所述，该专利以引用方式并入本文。生物质指任何纤维质或木质纤维质材料，并包括包含纤维素的材料，以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。
除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域技术人员已知的适于培养物生长并促进包括[2Fe-2S]DHAD的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其他组分。
培养条件
通常，使细胞在约20℃至约40℃的温度范围下在合适的培养基中生长。本发明中的适合的生长培养基是普通的商品化制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)肉汤，沙氏葡萄糖肉汤(SD)肉汤，酵母培养基(YM)肉汤，或包含酵母氮源、硫酸铵和右旋糖(作为碳/能源)的肉汤，或者YPD培养基——蛋白胨、酵母提取物和右旋糖以大多数啤酒糖酵母菌株生长的最适比例的一种混合物。也可以使用其他确定的或合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷酸2′：3′-单磷酸，也可以掺入发酵培养基中。
适于酵母发酵的pH范围通常在pH3.0至pH9.0之间，其中pH5.0至pH8.0作为初始条件是优选的。适于其他微生物发酵的pH范围在pH3.0至pH7.5之间，其中pH4.5.0至pH6.5作为初始条件是优选的。
发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中厌氧或微氧条件是优选的。
工业分批发酵和连续发酵
发酵可以采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此在发酵开始时，用所需生物体对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在代谢产物容易抑制细胞的代谢作用以及期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。在补料-分批系统中，底物实际浓度的测量是困难的，因此基于可测量因素的变化对其进行估算，所述可测量因素例如pH、溶解氧以及诸如CO2的废气的分压。分批和补料-分批发酵是本领域中一般的和熟知的，实例可见于Thomas D.Brock，Biotechnology ：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)，该文献以引用方式并入本文。
可以使发酵培养适合连续发酵方法。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵通常使培养物维持在稳定的高浓度。
连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物领域众所周知的，并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。
预期分批、补料-分批、连续方法，或者任何已知的发酵模式适用于使所述的重组微生物宿主细胞生长。另外，预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产异丁醇。
用于从发酵培养基中分离产物的方法
生物生产的异丁醇可使用本领域中已知的方法，例如ABE发酵(参见，例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process Biochem.27：61-75(1992)，及其参考文献)，从发酵培养基中分离。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离异丁醇。
因为异丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏能被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏可与其他分离方法组合使用以分离共沸物。可与蒸馏组合使用以分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液萃取、吸附和基于膜的技术。此外，可使用共沸蒸馏用夹带剂(参见例如Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)分离丁醇。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物，从而可组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成。然后冷凝共沸混合物，并且通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。滗析后的含水相可作为回流返回第一蒸馏塔。富含异丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
也可从发酵培养基中用液-液萃取和蒸馏分离异丁醇。在这种方法中，使用液-液萃取用合适溶剂从发酵液中萃取异丁醇。然后蒸馏包含异丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
也可组合使用蒸馏和吸附以从发酵培养基中分离异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成，然后使用吸附剂移除剩余的水，所述吸附剂例如分子筛(Aden等人，Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，June 2002)。
此外，也可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵培养基中分离并纯化异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述讨论和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的实质性特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可以对本发明进行各种改变和修改以适应各种应用和条件。
一般方法
实施例中所述的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域中熟知的并且描述于下列文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，NY，(1989)(Maniatis)；T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)；Ausubel，F.M.等人.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)和Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY。
适合细菌培养物的维持及生长的材料和方法在领域内是众所周知的。适用于下列实施例的技术可在见于Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，编辑)，American Society for Microbiology，Washington，DC.(1994))或者Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.(1989)。使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另外指明。
除非另外指明，微生物菌株获取自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA。下列实施例中使用的寡核苷酸引物由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)或Integrated DNA Technologies(Coralsville，IA)合成。
完全合成培养基描述于Amberg，Burke和Strathern，2005，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中。
HPLC
对发酵副产物组成的分析是本领域的技术人员所熟知的。例如，一种使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱(二者均可购自Waters Corporation，Milford，MA)并联合折射率(RI)检测的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01M H2SO4作为流动相，以0.5mL/min流量和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇的保留时间为约47.6分钟。
缩写的含义如下：“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”是指小时，“psi”是指磅每平方英寸，“nm”是指纳米，“d”是指天，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mm”是指毫米，“nm”是指纳米，“mM”是指毫摩尔每升，“μM”是指微摩尔每升，“M”是指摩尔每升，“mmol”是指毫摩尔，“μmol”是指微摩尔”，“g”是指克，“μg”是指微克而“ng”是指纳克，“PCR”是指聚合酶链反应，“OD”是指光密度，“OD600”是指在600nm波长测量的光密度，“kDa”是指千道尔顿，“g”是指引力常数，“bp”是指碱基对，“kbp”是指千碱基对，“～”是指大约，“％w/v”是指重量/体积百分比，“％v/v”是指体积/体积百分比，“HPLC”是指高效液相色谱，而“GC”是指气相色谱。
实施例1
具有[2Fe-2S]簇的细菌二羟酸脱水酶的鉴定
系统发育分析
对二羟酸脱水酶(DHAD)和相关蛋白质确定了系统发育关系。通过用大肠杆菌DHAD(SEQ ID NO：382)、大肠杆菌磷酸葡萄糖脱水酶(EDD；SEQ ID NO：384；编码区SEQ ID NO：383)和巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶(SEQ ID NO：386；编码区SEQ ID NO：385)的氨基酸序列对可公开获得的数据库进行BlastP检索，鉴定了相关的蛋白质，其中所述检索采用下列检索参数：E值＝10、字长＝3、矩阵＝Blosum62、空位开放＝11和空位延伸＝1。利用这三种不同的蛋白质序列进行的Blast检索产生了匹配序列的重叠的集合。基于截止至10-5的E值，并排除95％一致性的序列，从检索结果中选择了序列。对短于350个氨基酸的序列和长于650个氨基酸的序列同样予以排除。所得到的976种氨基酸序列的集合包括二羟酸脱水酶、磷酸葡萄糖脱水酶和醛糖酸脱水酶。
从实施例2中所述的用实验方法验证了的DHAD产生了序型HMM。关于该序型HMM的构建、校正和检索的细节参见下文。用该序型HMM作为查询项，针对所述976种序列进行的hmmer检索匹配了具有＜10-5的E值的全部序列。氨基酸序列的多重序列比对采用Clustal W算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22：4673 4680)采用下列参数进行：1)就成对比对参数而言，空位开放＝10；空位延伸＝0.1；矩阵为Gonnet 250；以及模式慢速-准确(Slow-accurate)，2)就多重比对参数而言，空位开放＝10；空位延伸＝0.2；以及矩阵为Gonnet系列。基于邻接法，通过序列比对产生了系统发育树。表示所述976种序列之间的系统发育关系的树显示于图2中。这一分析显示了四个主分枝。基于以下所详述的标准，将它们分别标记为“4Fe-4S DHAD”、“2Fe-2S DHAD”、“醛糖酸脱水酶”和“EDD”。包括17种序列的第五个较小的分枝被标记为“Und”，表示未确定的。
首先就三个被确定为酶活性所必需并且很可能在巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶中涉及Fe-S配位的半胱氨酸的存在，对上述匹配的序列进行了分析，其中所述阿拉伯糖酸脱水酶被报道是[4Fe-4S]簇蛋白质(Watanabe，S等人J.Biol.Chem.(2006)281：33521-33536)。所述976种序列中的每一种均具有对应于所述巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶必需半胱氨酸中的两个的半胱氨酸(在124和197位置)。在所述系统发育树中，有一包括168种序列的分枝，包括运动发酵单胞菌的[4Fe-4S]磷酸葡萄糖脱水酶(Rodriguez，M.et.al.(1996)Biochem Mol Biol Int.38：783-789)。在巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶的第三个必需半胱氨酸的位置(56位)，仅发现了丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸或甘氨酸四种氨基酸，而没有发现半胱氨酸。这一168种序列的分枝在图2中被标记为“EDD”。
所述树的一个不同的分枝包括322种序列，其中包括已知的大肠杆菌[4Fe-4S]簇DHAD。这一322种序列的分枝在图2中被标记为“4Fe-4S DHAD”。该分枝中和17种序列的分枝(“Und”)中的全部序列，在对应于所述第三个半胱氨酸的位置均包含甘氨酸。其余469种序列有全部三个半胱氨酸，这469种序列被聚类为两个分枝，并且包括识别醛糖酸的巴西固氮螺菌阿拉伯糖脱水酶和一组DHAD。这些半胱氨酸在变异链球菌DHAD(SEQ ID NO：168)中位于56、129和201位，在乳酸乳球菌DHAD(SEQ ID NO：232)中位于61、135和207位。图1中显示的是来自多重序列比对的包括所述保守半胱氨酸的区域的实例。
对多重序列比对和系统发育树进行了进一步的分析，以鉴定DHAD特异性残基(特征)，从而将DHAD与阿拉伯糖酸脱水酶和其他醛糖酸脱水酶区分开来。在包含所指定的三个保守半胱氨酸的序列中，包括274种序列的进化枝被发现包含来自变异链球菌和乳酸乳球菌的DHAD。巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶存在于包括195种序列的分离的进化枝中。在每一位点，就保守残基的存在，对包含来自274种的DHAD组、醛糖酸脱水酶组、和“[4Fe-4S]DHAD”分枝的序列的多重序列比对进行了分析。发现了一组在两个DHAD组中的大多数保守，但在醛糖酸脱水酶组中不保守的残基，所述残基显示于表4中。此外，还发现了在醛糖酸脱水酶中保守，但在两个DHAD组中均不保守的残基。此类差异化保守的残基在它们各自的酶中可能作为底物特异性的决定因素起作用。
表4：使DHAD与醛糖酸脱水酶相区别的保守残基 *
Figure BPA00001335031900411
在＞90％的多数代表序列中保守的残基。
*位置编号基于变异链球菌DHAD中的位置
**不保守
构成不包括[4Fe-4S]集簇大肠杆菌DHAD、[4Fe-4S]簇运动发酵单胞菌磷酸葡萄糖脱水酶或据报道的[4Fe-4S]簇巴西固氮螺菌阿拉伯糖酸脱水酶的274种序列的进化枝的DHAD群体，通过系统发育和在多重序列比对中发现的保守残基与其他群体相区别地被鉴定出来，如上文所述。与所述群体包括[2Fe-2S]簇DHAD这一设想相符，拟南芥DHAD和硫矿硫化叶菌(S.solfataricus)DHAD是所述群体的部分。由于拟南芥和菠菜一样是植物，而菠菜DHAD已被鉴定为[2Fe-2S]簇DHAD(Flint和Emptage(1988)J.Biol.Chem.263：3558-3564)，拟南芥DHAD可能是[2Fe-2S]簇DHAD。硫矿硫化叶菌DHAD被报道为耐氧的，与菠菜[2Fe-2S]簇DHAD相似(Kim和Lee(2006)J.Biochem.139，591-596)，这暗示硫矿硫化叶菌DHAD可能是[2Fe-2S]簇DHAD。
274种序列的进化枝在图4中被标记为“2Fe-2S DHAD”。这些序列中的193种来自细菌来源。采用上文所述的比对方法，在对这193种细菌DHAD的多重序列比对中能够鉴定到三个保守的半胱氨酸和表4中所指定的保守残基。序列表中提供了所述193种细菌的[2Fe-2S]DHAD的序列，而它们的SEQ ID NO列于表2a中。
在所述[2Fe-2S]DHAD群体中，若干种细菌蛋白质的同一性已通过作为DHAD的功能分析得到确认，这描述于本文的其他实施例中。本文的其他实施例显示，这一群体中的蛋白质，例如变异链球菌DHAD和乳酸乳球菌DHAD，包含[2Fe-2S]簇。
序型HMM的制备
在大肠杆菌中表达了七种被鉴定为[2Fe-2S]系统发育组成员的细菌DHAD，并且发现了二羟酸脱水酶活性，如下文的实施例2中所述。这些DHAD来自欧洲亚硝化单胞菌(蛋白质SEQ ID NO：310)、集胞藻属未定名种PCC6803(SEQ ID NO：298)、变异链球菌(SEQ ID NO：168)、嗜热链球菌(SEQ ID NO：164)、抗重金属罗尔斯通氏菌(SEQ ID NO：346)、富养罗尔斯通氏菌(SEQ ID NO：344)和乳酸乳球菌(SEQ ID NO：232)。此外，来自约氏黄杆菌的DHAD(SEQ ID NO：230)被发现当在大肠杆菌中表达时具有二羟酸脱水酶活性。利用HMMER软件包(序型HMM背后的理论描述于R.Durbin，S.Eddy，A.Krogh和G.Mitchison，Biological sequence analysis：probabilistic models of proteins and nucleic  acids，Cambridge University Press，1998；Krogh等人，1994；J.Biol.235：1501-1531中)，分析了这些以实验方法确定的功能性细菌DHAD的氨基酸序列。HMMER软件程序的输出结果是特征化所输入序列的序型隐蔽马尔科夫模型(HMM)。如用户指南中所述，序型HMM是多重序列比对的统计模型。它们捕获关于比对中的每一列有多保守以及在每一位点哪种氨基酸残基最可能存在的位点特异性信息。因此，HMM具有正规的概率学基础。就大量的蛋白质家族而言，序型HMM可从PFAM数据库(Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA)公开获得。
序型HMM的构建如下：
步骤1：构建序列比对
利用Clustal W，以默认参数对上文列出的功能经验证的DHAD的八条序列进行了比对。
步骤2：构建序型HMM
采用默认参数，对上述比对的序列的集合运行了hmmbuild程序。hmmbuild读取多重序列比对文件，构建新的序型HMM，并将所述序型HMM保存为文件。使用这一程序，从对上文所述的亚单元序列的每一集合的多重比对产生了未校正的序型。
以下基于HMMER软件用户指南的信息给出了关于hmmbuild程序制备序型HMM的方式的一些描述。序型HMM能够建模带缺口的比对，例如包括插入和缺失，这使得软件能描述完整的保守域(而不是仅仅较小的不带缺口的基序)。采用插入(I)状态和缺失(D)状态对插入和缺失建模。包含多于特定部分x的空位字符的所有列将被指定为插入列。默认地，x被设定为0.5。每一匹配状态具有与之相关联的I和D状态。HMMER将比对中相同的共有位点的一组三种状态(M/D/I)称作“节点”。这些状态与称作状态转换概率的箭头互相关联。M和I状态是发射者，而D状态是静默的。转换被安排为使得在每一节点，M状态被使用(并且一个残基被对齐并评分)或者D状态被使用(并且没有残基被对齐，从而产生一个缺失-空位符号’-’)。插入发生在节点之间，并且I状态具有自我转换，允许在共有列之间出现一个或多个插入的残基。
匹配状态的残基的评分(即匹配状态发射评分)或插入状态的残基的评分(即插入状态发射评分)与Log_2(p_x)/(null_x)成比例。其中p_x是根据序型HMM，在比对中的一个特定位点，一种氨基酸残基的概率，而null_x是根据空模型的概率。所述空模型为有预先算出的一组针对20种氨基酸中的每一种的发射概率的简单的单一状态概率模型，其中所述发射概率来源于氨基酸在SWISSPROT版本24中的分布。
状态转换评分同样作为对数比值比参数被算出，并且与Log_2(t_x)成比例。其中t_x是转换为发射者或非发射者状态的概率。
步骤3：序型HMM的校正
用hmmcalibrate读取了序型HMM，hmmcalibrate以所述序型对大量合成的随机序列进行评分(所使用的合成序列的默认数量为5,000)，将极值分布(EVD)拟合至这些评分的直方图，并重新存储已包括了EVD参数的HMM文件。当对蛋白质序列数据库检索所述序型时，这些EVD参数(μ和λ)被用于计算比特评分的E-值。hmmcalibrate在标记为“EVD”的行上向HMM文件中写入了两个参数：这些参数是与对随机生成的序列算出的评分的直方图最佳拟合的极值分布(EVD)的μ(位置)和λ(范围)参数，其中所述随机生成的序列与SWISS-PROT有大致相同的长度和残基组成。对所述序型HMM进行了一次校正。
表1中提供了关于DHAD序列集合的经过校正的序型HMM。所述序型HMM提供于图表中，图表给出了每种氨基酸在氨基酸序列中每一位置出现的概率。对每一位点，突出显示了最高的可能性。对每一位点，第一行报告了匹配发射评分：每种氨基酸处于那种状态的概率(最高的评分被突出显示)。第二行报告了插入发射评分，而第三行报告了状态转换评分：M→M，M→I，M→D；I→M，I→I；D→M，D→D；B→M；M→E。
例如，DHAD序型HMM显示，甲硫氨酸具有位于第1位置的评分为1757的概率，被突出显示的最高的概率。在第2位置，谷氨酸具有最高的概率，其评分为1356。在第3位置，赖氨酸具有最高的概率，其评分为1569。
步骤4：测试构建的序型HMM的特异性和敏感度
利用hmmsearch对所述序型HMM进行了评估，hmmsearch从hmmfile读取序型HMM，并就显著相似的序列匹配检索序列文件。所检索的序列文件包含976种序列(参见上文)。在检索中，数据库的大小(Z参数)被设定为10亿。这一大小设定保证了针对目前的数据库显著的E-值在可以预见的未来将依然是显著的。E-值截止被设定在10。
以从八种功能经过实验方法验证的DHAD的比对产生的序型HMM进行的hmmer检索，以＜10-5的E值匹配了全部976种序列。该结果表明，脱水酶超家族的成员具有显著的序列相似性。以截止10-5的E值进行的hmmer检索被用于将DHAD相关的脱水酶与其他关系更远但相关的蛋白质区别开来，如上文所述。
实施例2
细菌[2Fe-2S]二羟酸脱水酶在大肠杆菌中的表达和表征
在大肠杆菌中，表达了在载体pET28a(Novagen)中处于T7启动子控制下的来自不同细菌的ilvD编码区，从实施例1中所述的系统发育分析来看，这些编码区属于[2Fe-2S]组。每一ilvD编码区用具有NheI限制性位点的特异性正向引物和具有NotI限制性位点的特异性反向引物(列于表5中)扩增。
表5：用于对来自所列生物的DHAD编码区进行PCR的引物的SEQ  ID NO。
Figure BPA00001335031900451
每种细菌菌株的基因组DNA被用作模板。使用MasterPure DNA纯化试剂盒(Epicentre，Madison，WI)从表1中所列的每种菌株制备了基因组DNA。用引物pET28a-F(NotI)(SEQ ID NO：397)和pET28a-R(NheI)(SEQ ID NO：398)扩增了质粒载体，以除去his标签区域。在连接之前，基因和质粒片段均用NheI和NotI消化。连接混合物被转入大肠杆菌(Top 10)感受态细胞(Invitrogen)。使转化体在补充了50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上生长。通过测序确认的阳性克隆被转入大肠杆菌Tuner(DE3)菌株(Novagen)以进行表达。使经过选择的克隆于30℃在补充了卡那霉素的LB液体培养基中生长。当大肠杆菌培养物在600nm达到0.3至0.4的O.D.时，通过加入0.5mM的IPTG进行诱导。诱导5小时后收集培养物。用Tris缓冲液(pH 8.0)洗涤细胞沉淀物。
于37℃对粗提物进行酶活性分析如下。待进行DHAD分析的细胞被重悬于2-5倍体积的50mM Tris，10mM MgSO4，pH8.0(TM8)缓冲液中，然后于0℃通过超声波处理使细胞破碎。离心来自上述破碎细胞的粗提物，使细胞碎片沉淀。移出上清液并储存于冰上直至进行分析(初始分析在破碎细胞后2小时内进行)。本文所分析的DHAD被发现在置于冰上几个小时的粗提物中是稳定的。当小样品在液氮中冷冻并储存于-80℃时，活性同样是保持的。
使用试剂2，4-二硝基苯肼对所述上清液进行了分析，如Flint和Emptage所述(J.Biol.Chem.(1988)263：3558-64)。当活性高至必须稀释粗提物以实现准确的分析时，稀释在含5mg/ml BSA的TM8中进行。
蛋白质分析用Pierce Better布拉德福德试剂(目录号23238)进行，以BSA作为标准品。必要时，蛋白质分析的稀释在TM8缓冲液中进行。
所有的上述DHAD在大肠杆菌中表达时均有活性，特异性活性显示于表6中。来自变异链球菌的DHAD具有最高的特异性活性。
表6：细菌[2Fe-2S]DHAD在大肠杆菌中的活性
Figure BPA00001335031900461
实施例3
在大肠杆菌中表达的来自变异链球菌的DHAD的纯化和表征
对来自变异链球菌的DHAD进一步进行了纯化和表征。为了纯化变异链球菌DHAD，培养了六升携带着含变异链球菌ilvD的pET28a质粒的大肠杆菌Tuner菌株的培养物，并用IPTG进行诱导。如实施例2中所述，通过在包含10mM MgCl2的50mM pH8.0 Tris缓冲液(TM8缓冲液)中破碎细胞并离心除去细胞碎片，然后将粗提物的上清液上样至Q Sepharose(GE Healthcare)柱上并用NaCl浓度渐增的TM8缓冲液洗脱DHAD，纯化了所述酶。基于外观颜色(由于Fe-S簇的存在而呈褐色)，包含DHAD的部分被合并，然后上样至Sephacryl S-100(GE Healthcare)柱并用TM8缓冲液洗脱。如根据SDS凝胶所判断的，从Sephacryl柱洗脱的蛋白质的纯度被估计为60-80％。于37℃对所述部分地纯化的酶的活性进行了分析，如Flint等人所述(J.Biol.Chem.(1988)263(8)：3558-64)。纯化的蛋白质的特异性活性为40μmol min-1 mg-1。纯化的酶的kcat被估算为50-70sec-1。
通过在环境空气的存在下于23℃孵育纯化的酶不同的时间间隔，然后如上文所述进行活性分析，研究了纯化的DHAD在空气中的稳定性。与类似地纯化自大肠杆菌的DHAD不同，来自变异链球菌的DHAD即使在72小时的孵育之后活性仍是稳定的，如图4中所示，其中(A)显示来自变异链球菌DHAD的结果，而(B)显示来自大肠杆菌DHAD的结果。
纯化的变异链球菌的紫外-可见光谱显示于图5中。300nm以上的峰的数量典型地属于具有[2Fe-2S]簇的蛋白质。用连二亚硫酸钠还原了变异链球菌DHAD，并在不同的温度获得了EPR光谱。图6显示了于20°K和70°K之间的温度测得的光谱。变异链球菌的EPR光谱可在最高70°K的温度测得，这暗示其包含[2Fe-2S]簇。众所周知，例如，包含[4Fe-4S]簇的蛋白质的EPR光谱在大大高于10°K的温度是不能观测到的。(参见，例如，Rupp，等人Biochimica et Biophysica Acta(1978)537：255-269。)
实施例4
针对植物乳杆菌的二羟酸脱水酶(DHAD)表达盒的构建
本实施例的目的，是描述在植物乳杆菌PN0512(ATCC PTA-7727)中，如何克隆和表达来自不同细菌来源的二羟酸脱水酶基因(ilvD)。穿梭载体pDM1(SEQ ID NO：410)被用于在植物乳杆菌PN0512中克隆和表达来自乳酸乳球菌乳脂亚种NCDO2118(NCIMB 702118)[Godon等人，J.Bacteriol.(1992)174：6580-6589]和变异链球菌UA159(ATCC 700610)的ilvD基因。质粒pDM1包含来自植物乳杆菌ATCC14917质粒pLF1的最小的pLF1复制子(～0.7Kbp)和pemK-pemI毒素-抗毒素(TA)、来自pACYC184的P15A复制子、用于在大肠杆菌和植物乳杆菌中进行选择的氯霉素标记、和P30合成启动子[Rud等人，Microbiology(2006)152：1011-1019]。质粒pLF1(C.-F.Lin等人，GenBank accession no.AF508808)与质粒p256[
Figure BPA00001335031900481
等人，Microbiology(2005)151：421-431]密切相关，后者的拷贝数据估计就植物乳杆菌NC7而言为～5-10拷贝每染色体。P30合成启动子来源于已知为乳酸菌(LAB)中最强的启动子之一的植物乳杆菌rRNA启动子[Rud等人Microbiology(2005)152：l011-1019]。
用引物3T-ilvDLI(BamHI)(SEQ ID NO：408)和5B-ilvDLI(NotI)(SEQ ID NO：409)从乳酸乳球菌乳脂亚种NCDO2118的基因组DNA PCR扩增了乳酸乳球菌ilvD编码区(SEQ ID NO：231)。乳酸乳球菌乳脂亚种NCDO2118的基因组DNA用Puregene Gentra试剂盒(QIAGEN，CA)制备。用NotI消化了1.7Kbp的乳酸乳球菌ilvD PCR产物(ilvDLI)，并用DNA聚合酶的Klenow片段处理以获得平末端。用BamHI消化了所得到的乳酸乳球菌ilvD编码区片段，并用QIAGEN凝胶回收试剂盒(QIAGEN，CA)进行了凝胶纯化。用ApaLI消化了质粒pDM1，并用DNA聚合酶的Klenow片段处理以获得平末端，然后用BamHI进行了消化。上述凝胶纯化的乳酸乳球菌ilvD编码区片段被连接至质粒pDM1的BamHI和ApaLI(平末端)位点。连接混合物被转入大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen，CA)。转化体被铺板于LB氯霉素平板上以进行选择。通过用SalI消化，产生一个具有预期的5.3Kbp大小的片段，筛选了阳性克隆。通过DNA测序进一步验证了阳性克隆。正确的克隆被命名为pDM1-ilvD(乳酸乳球菌)。
来自质粒pET28a的变异链球菌UA159(ATCC 700610)ilvD编码区被克隆至质粒pDM1。包含变异链球菌ilvD的质粒pET28a的构建描述于实施例2中。用XbaI和NotI消化了包含变异链球菌ilvD的质粒pET28a，用DNA聚合酶的Klenow片段处理以获得平末端，并凝胶纯化了包含变异链球菌ilvD编码区的1,759bp片段。用BamHI消化了质粒pDM1，并用DNA聚合酶的Klenow片段处理以获得平末端，然后用PvuII进行了消化。包含变异链球菌ilvD编码区的凝胶纯化的片段被连接至质粒pDM1的BamHI(平末端)和PvuII位点。连接混合物被转入大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen，CA)。转化体被铺板于LB氯霉素平板上以进行选择。通过用ClaI消化，产生一个具有预期的5.5Kbp大小的片段，筛选了阳性克隆。正确的克隆被命名为pDM1-ilvD(变异链球菌)。
实施例5
在植物乳杆菌PN0512中表达的DHAD活性的测量
用质粒pDM1-ilvD(乳酸乳球菌)或pDM1-ilvD(变异链球菌)通过电穿孔转化了植物乳杆菌PN0512。电感受态细胞按下列程序制备。用PN0512细胞接种了5ml包含1％甘氨酸的乳杆菌MRS培养基，并使细胞于30℃生长过夜。用上述过夜培养物接种100ml包含1％甘氨酸的乳杆菌MRS培养基直至OD600＝0.1，并于30℃使细胞生长至OD600＝0.7。于4℃以3700×g离心8分钟收集细胞，以100ml冷的1mM MgCl2洗涤，于4℃以3700×g离心8分钟，以100ml冷的30％PEG-1000(81188，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤，再于4℃以3700×g离心20分钟，然后重悬于1ml冷的30％PEG-1000中。在冷的1mm间隙电穿孔小槽中将60μl的电感受态细胞与～100ng质粒DNA混合，并在BioRad Gene Pulser(Hercules，CA)中以1.7kV，25μF和400Ω进行电穿孔。细胞被重悬于1ml包含500mM蔗糖和100mM MgCl2的MRS培养基中，于30℃孵育2小时，然后铺板于含10μg/ml氯霉素的MRS培养基平板上。
使携带pDM1-ilvD(乳酸乳球菌)或pDM1-ilvD(变异链球菌)的PN0512转化体，以及单独携带pDM1载体的对照转化体，于30℃在乳杆菌MRS培养基中生长过夜。对每一过夜样品，在125ml旋盖烧瓶中以过夜培养物接种120ml补充了100mM MOPS(pH7.5)、40μM柠檬酸铁、0.5mM L-半胱氨酸和10μg/ml氯霉素的MRS培养基直至OD600＝0.1。于37℃无氧孵育上述培养物直到OD600达到1-2。于4℃以3700×g离心培养物10分钟。用50mM pH6.2的磷酸钾缓冲液(6.2g/L KH2PO4和1.2g/L K2HPO4)洗涤沉淀并再次离心。沉淀被冷冻并储存于-80℃，直到就DHAD活性进行分析。基于如实施例2中所述的方法，利用二硝基苯肼就DHAD活性对细胞提取物样品进行了分析。DHAD活性的结果显示于表7中。乳酸乳球菌DHAD和变异链球菌DHAD在植物乳杆菌PN0512中的特异性活性分别显示为0.02和0.06μmol min-1 mg-1，而载体对照样品未显示可检测到的活性。
表7：植物乳杆菌PN0512中的DHAD活性
Figure BPA00001335031900501
实施例6
来自变异链球菌的二羟酸脱水酶在酵母中的表达
穿梭载体pRS423 FBA ilvD(链球菌的)(SEQ ID NO：430)被用于表达来自变异链球菌的DHAD。这种穿梭载体包含一个在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点(1423至1879)和一个在酵母中复制所需的2微米起点(nt 8082至9426)。该载体含有一个FBA启动子(nt 2111至3108；SEQ ID NO：425)和FBA终止子(nt 4861至5860)。此外，它还携带用于在酵母中进行选择的His标记(nt 504至1163)和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记(nt 7092至7949)。来自变形链球菌UA159(ATCC 700610)的ilvD编码区(nt 3116至4828)位于上述FBA启动子和FBA终止子之间，从而构成了用于表达的嵌合基因。
为了测试来自变异链球菌的DHAD在酵母菌株BY4741(本领域已知的，并且可从ATCC #201388获得)中的表达，将表达载体pRS423 FBA IlvD(链球菌的)连同空载体pRS426转入了BY4741细胞(可从ATCC，#201388获得)。使转化体在缺少组氨酸和尿嘧啶的合成培养基(Teknova)上生长。通过将5ml加入至250ml烧瓶中的100ml培养基，进行了用于分析的在液体培养基中的生长。当培养物在600nm达到1至2O.D.时对它们进行收集。样品用10ml的20mM Tris(pH7.5)洗涤，然后重悬于1ml的相同的Tris缓冲液中。样品被转入包含0.1mm二氧化硅(Lysing Matrix B，MP biomedicals)的2.0ml管中。然后在珠磨式研磨器(BIO101)中破碎细胞。在微量离心机中于4℃以13,000rpm离心30分钟，收集上清液。通常，0.06至0.1mg的粗提蛋白质被用于在37℃用二硝基苯肼进行的DHAD分析，如Flint和Emptage（J.Biol.Chem.(1988)263(8)：3558-64)所述。当在酵母中表达时，来自变异链球菌的脱水酶具有0.24μmol min-1 mg-1的特异性活性。包含空载体pRS423和pRS426的对照菌株具有0.03至0.06μmol min-1 mg-1范围的背景活性。
实施例7
来自乳酸乳球菌的IlvD基因在酵母中的表达
利用正向引物IlvD(L1)-F(SEQ ID NO：420)和反向引物IlvD(L1)-R(SEQ ID NO：421)扩增了来自乳酸乳球菌的ilvD编码区。所扩增的片段通过缺口修复被克隆至穿梭载体pNY13。pNY13(SEQ ID NO：437)来源于pRS423。这种穿梭载体包含一个在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点(1423至1879)和一个在酵母中复制所需的2微米起点(nt 7537至8881)。该载体含有一个FBA启动子(nt 2111至3110)和FBA终止子(nt 4316至5315)。此外，它还携带用于在酵母中进行选择的His标记(nt 504至1163)和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记(nt 6547至7404)。
基于用针对所述ilvD编码区的正向和反向引物进行的扩增，对阳性克隆进行了选择，并通过测序进一步加以验证。新的构建体被命名为pRS423 FBA ilvD(乳酸乳球菌)。该构建体与空载体pRS426一起被转入了酵母菌株BY4743(ΔLEU1)(Open Biosystems，Huntsville，AL；目录号#YSC1021-666629)，如实施例6中所述。包含所述表达载体的酵母菌株的生长和分析也按照如实施例6中所述的规程进行。含有乳酸乳球菌IlvD基因的酵母菌株中的二羟酸脱水酶活性被测定为处于0.05至0.17μmol min-1 mg-1范围内。这一活性比对照组略高。进行了互补实验以研究这种DHAD和来自其他细菌的DHAD的表达(实施例8)。
实施例8
含有细菌DHAD的酵母ILV3缺失菌株的互补作用。
啤酒糖酵母的内源DHAD酶受ILV3基因编码，并且该蛋白质被定位至线粒体。这一基因的缺失导致内源DHAD活性的失去，并提供了测试菌株，在所述测试菌株中，异源的胞浆DHAD活性的表达能被容易地评估。ILV3的缺失导致该菌株不能在缺少支链氨基酸的条件下生长。通过测定不同的细菌DHAD对酵母ILV3缺失菌株进行弥补，从而使其在缺少支链氨基酸的条件下生长的能力，分析了它们的表达。
构建了包含ilvD基因序列的表达穿梭载体，其中所述ilvD基因序列编码来自表8中所列细菌的DHAD。这些表达构建体的基本元件与实施例6中所述的pRS423 FBA ilvD(链球菌的)载体是相同的。通过PCR制备了每种ilvD编码区，如实施例2中所述，并将ilvD编码区克隆进pRS423 FBA ilvD(链球菌的)以取代变异链球菌ilvD，产生了表8中所列的质粒。这些表达构建体被转入ILV3缺失菌株BY4741ilv3::URA3并制备如下。利用SEQ ID NO分别为431和432的引物“ILV3::URA3F”和“ILV3::URA3R”，通过从pRS426(ATCC No.77107)对URA3标记的PCR扩增，构建了ilv3::URA3破坏盒。上述引物产生包含70bp 5’和3’延伸的1.4kb的URA3 PCR产物，所述延伸与ILV3染色体基因座的上游和下游序列一致，以进行同源重组。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将上述PCR产物转入了BY4741细胞(ATCC 201388)，并将所得到的转化体在30℃培养于缺乏尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的完全合成培养基上。利用SEQ ID NO分别为433和434的引物“ILV3 F Check”和“URA3 REV Check”，通过PCR对转化体进行了筛选，以验证在正确位点的整合和内源ILV3基因座的破坏。
在缺少组氨酸的酵母合成培养基平板上，对含有表8中的细菌DHAD的转化体进行了选择。然后将选择的菌落接种至缺少缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的平板上。包含表8中所列表达载体的菌株能够在缺少上述支链氨基酸的这些平板上生长，然而含有对照质粒的对照菌株却不能。这一结果表明，来自这些细菌的DHAD在啤酒糖酵母中被活跃地表达。
表8：测试的细菌DHAD和表达载体
Figure BPA00001335031900521
实施例9
在大肠杆菌中表达的来自乳酸乳球菌的DHAD的纯化和表征
纯化并表征了来自乳酸乳球菌的DHAD。为了纯化乳酸乳球菌DHAD，培养了14升携带着包含乳酸乳球菌ilvD的pET28a质粒的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株(Novagen)的培养物，并用IPTG进行诱导。如实施例2中所述，通过在包含10mM MgCl2的120ml 50mM pH8.0 Tris缓冲液(TM8缓冲液)中破碎细胞并离心除去细胞碎片，然后将粗提物的上清液上样至5×15cm Q Sepharose(GE Healthcare)柱上并用NaCl浓度渐增的TM8缓冲液洗脱DHAD，纯化了所述酶。合并包含DHAD的部分，加入(NH4)2SO4至浓度为1M并上样至用含1M(NH4)2SO4的TM8缓冲液平衡过的2.6×15cm苯基-琼脂糖(phenyl-Sepharose)柱(GE Healthcare)上，然后用递减梯度的(NH4)2SO4洗脱。从苯基-琼脂糖柱洗脱的包含DHAD的部分被合并，并浓缩至10ml。将其上样至3.5×60cmSuperdex-200柱(GE Healthcare)上，并用TM8洗脱。包含DHAD活性的部分被合并、浓缩，并在N2(1)中冷冻为小珠。如通过SDS凝胶所判断的，从Superdex-200柱上洗脱的蛋白质的纯度被估计为＞80％。于37℃对酶的活性进行了分析，如Flint等人(J.Biol.Chem.(1988)263(8)：3558-64)所述。在pH8和37℃，上述纯化的蛋白质的特异性活性为64μmol min-1 mg-1。上述纯化的酶的kcat为71sec-1。
通过在环境空气的存在下于23℃孵育纯化的酶不同的时间间隔，然后如上文所述进行活性分析，研究了纯化的DHAD在空气中的稳定性。来自乳酸乳球菌的DHAD即使在空气中孵育20小时之后还几乎具有完全的活性，如图8中所示。
上述纯化的乳酸乳球菌的紫外-可见光谱显示于图9中。其典型地属于具有[2Fe-2S]簇的蛋白质。
实施例10
在酵母中使用二羟酸脱水酶构建用于生产异丁醇的途径
异丁醇生物合成途径的前三个步骤是通过乙酰乳酸合酶、酮醇酸还原异构酶(KARI)和二羟酸脱水酶进行的。乙酰乳酸合酶由alsS编码。KARI基因在酵母中叫做ILV5，在细菌中叫做ilvC。一旦通过这三种酶的反应从丙酮酸生成了α-酮异戊酸(KIV)，KIV即可在酵母中通过醇脱氢酶被进一步转化为异丁醇。
构建了载体pLH532(SEQ ID NO：411)以表达KARI和alsS基因。该载体源自基于2微米的载体pHR81。在pLH532中，来自枯草芽孢杆菌的alsS编码区(nt 14216至15931)处于CUP1启动子(nt.15939至16386)的控制下。在pLH532中有两个KARI基因：来自荧光假单胞菌Pf5的ilvC编码区(nt.10192至11208)处于酵母ILV5启动子(nt.11200至12390)的控制下，而酵母ILV5编码区(nt.8118-9167)被置于FBA启动子的控制下(nt.7454-8110)。选择标记是URA3(nt.3390至4190)。
用于异丁醇生产的酵母宿主是BY4741 pdc1::FBAp-alsS-LEU2。该菌株的构建如下。首先，构建了表达质粒pRS426-FBAp-alsS。通过凝胶纯化和随后的BbvCI和PacI消化，分离了pRS426::GPD::alsS::CYC的1.7kb alsS编码区片段。该质粒具有包含GPD启动子(SEQ ID NO：439)、来自枯草芽孢杆菌的alsS编码区(SEQ ID NO：438)和CYC1终止子(SEQ ID NO：440)的嵌合基因，并且描述于美国专利公布#US20070092957A1的实施例17中，该专利以引用方式并入本文。通过用BbvCI和PacI进行限制性消化，移除了来自同样描述于US20070092957实施例17中的质粒pRS426::FBA::ILV5::CYC的ILV5片段，并凝胶纯化了剩余的6.6kb载体片段。该载体具有嵌合基因，所述嵌合基因包含FBA启动子(SEQ ID NO：425)和CYC1终止子，以及二者之间的啤酒糖酵母ILV5基因的编码区(SEQ ID NO：442)。将上述两种纯化的片段于16℃连接过夜，并转入大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(Invitrogen)中。通过将细胞铺板于LB Amp100培养基上获得了转化体。通过限制性消化模式和PCR(引物N98SeqF1和N99SeqR2，SEQ ID NO：412和413)确认了alsS向载体中的插入。
通过将来自pRS426-FBAp-alsS的FBAp-alsS片段连接至来自pRS425(ATCC No.77106)的LEU2基因，构建了pdc1::FBAp-alsS-LEU2破坏盒，连接通过SOE PCR(如Horton等人(1989)Gene 77：61-68所述)进行，所述SOE PCR用pRS426-FBAp-alsS和pRS425质粒DNA作为模板，使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA；目录号F-540S)和引物112590-48A以及112590-30B至D，所述引物以SEQ ID NO：414、SEQ ID NO：415、416和417给出。SOE PCR的外侧引物(112590-48A和112590-30D)包含与PDC1启动子和终止子的下游和上游区域同源的5’和3’50bp区域。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将完整的盒PCR片段转入了BY4741(ATCC No.201388)，并将转化体在30℃培养于缺少亮氨酸且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上。利用以SEQ ID NO：419和418给出的引物112590-30E和112590-30F，通过PCR对转化体进行了筛选，以验证PDC1编码区的删除在PDC1基因座处的整合。正确的转化体具有基因型：BY4741 pdc1::FBAp-alsS-LEU2。
为了测试ilvD编码的来自变异链球菌的DHAD是否能被用于异丁醇的生物合成，将实施例6中制备的包含这种ilvD的表达载体pRS423 FBA ilvD(strep)与载体pLH532共转入了酵母菌株BY4741 pdc1::FBAp-alsS-LEU2中。感受态细胞的制备、转化和用于对转化体进行选择的生长培养基与实施例6中所述的是相同的。使选择的菌落在带塞的20ml血清瓶中的15ml培养基中于限氧条件下生长。将所述血清瓶在速度恒定为225转每分钟的摇床上于30℃孵育。孵育48小时之后，就异丁醇的存在利用HPLC对样品进行了分析。HPLC分析的结果显示于图7中。保留时间为47.533分钟的峰表明异丁醇的存在。来自变异链球菌的ilvD基因的表达连同alsS和KARI基因的表达一起，导致了异丁醇在酵母中的生产。
实施例11
查询经过更新的数据库以鉴定更多的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶
后来对经过更新的公开数据库进行了第二次查询，以发现新近被测序的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶。在截止95％的一致性，通过查询数据库产生了1425种序列的初始集合，如实施例1的“系统发育分析”中所述。然后用ClustalW进行了多重序列比对，如实施例1中所述。之后就下列保守的残基在对应于变异链球菌DHAD中的位点对序列进行了分析：56、129和201位的半胱氨酸，88位的天冬氨酸，142位的精氨酸或天冬酰胺，208位的天冬酰胺和454位的亮氨酸。在最初的193种的集合之外，还鉴定了88种新的来自细菌的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶并列于表2b中。
表1
Figure BPA00001335031900561
表1
Figure BPA00001335031900571
表1
Figure BPA00001335031900581
表1
表1
Figure BPA00001335031900601
表1
Figure BPA00001335031900611
表1
Figure BPA00001335031900621
表1
Figure BPA00001335031900631
表1
Figure BPA00001335031900641
表1
表1
Figure BPA00001335031900661
表1
Figure BPA00001335031900671
表1
Figure BPA00001335031900681
表1
Figure BPA00001335031900691
表1
Figure BPA00001335031900701
表1
Figure BPA00001335031900711
表1
Figure BPA00001335031900721
表1
Figure BPA00001335031900731
表1
Figure BPA00001335031900741
表1
Figure BPA00001335031900751
表1
Figure BPA00001335031900761
表1
表1
Figure BPA00001335031900781
表1
Figure BPA00001335031900791
表1
Figure BPA00001335031900801
表1
Figure BPA00001335031900811
表1
Figure BPA00001335031900821
表1
Figure BPA00001335031900831
表1
Figure BPA00001335031900841
表1
Figure BPA00001335031900851
表1
Figure BPA00001335031900861
表1
Figure BPA00001335031900871
表1
Figure BPA00001335031900881
表1
Figure BPA00001335031900891
表1
Figure BPA00001335031900901
表1
Figure BPA00001335031900911
表1
Figure BPA00001335031900921
表1
Figure BPA00001335031900931
表1
Figure BPA00001335031900941
表1
表1
Figure BPA00001335031900961
表1
表1
表1
表1
表1
表1
表1
Figure BPA00001335031901031
Figure ISB00000499395800021
Figure ISB00000499395800031
Figure ISB00000499395800041
Figure ISB00000499395800051
Figure ISB00000499395800061
Figure ISB00000499395800071
Figure ISB00000499395800081
Figure ISB00000499395800091
Figure ISB00000499395800101
Figure ISB00000499395800111
Figure ISB00000499395800121
Figure ISB00000499395800141
Figure ISB00000499395800151
Figure ISB00000499395800161
Figure ISB00000499395800171
Figure ISB00000499395800181
Figure ISB00000499395800191
Figure ISB00000499395800201
Figure ISB00000499395800211
Figure ISB00000499395800221
Figure ISB00000499395800241
Figure ISB00000499395800251
Figure ISB00000499395800271
Figure ISB00000499395800281
Figure ISB00000499395800291
Figure ISB00000499395800301
Figure ISB00000499395800311
Figure ISB00000499395800321
Figure ISB00000499395800331
Figure ISB00000499395800351
Figure ISB00000499395800361
Figure ISB00000499395800371
Figure ISB00000499395800391
Figure ISB00000499395800411
Figure ISB00000499395800421
Figure ISB00000499395800441
Figure ISB00000499395800451
Figure ISB00000499395800461
Figure ISB00000499395800471
Figure ISB00000499395800481
Figure ISB00000499395800501
Figure ISB00000499395800511
Figure ISB00000499395800521
Figure ISB00000499395800531
Figure ISB00000499395800551
Figure ISB00000499395800561
Figure ISB00000499395800581
Figure ISB00000499395800591
Figure ISB00000499395800601
Figure ISB00000499395800611
Figure ISB00000499395800621
Figure ISB00000499395800631
Figure ISB00000499395800641
Figure ISB00000499395800651
Figure ISB00000499395800661
Figure ISB00000499395800681
Figure ISB00000499395800691
Figure ISB00000499395800701
Figure ISB00000499395800721
Figure ISB00000499395800731
Figure ISB00000499395800741
Figure ISB00000499395800751
Figure ISB00000499395800781
Figure ISB00000499395800791
Figure ISB00000499395800801
Figure ISB00000499395800811
Figure ISB00000499395800821
Figure ISB00000499395800831
Figure ISB00000499395800841
Figure ISB00000499395800851
Figure ISB00000499395800861
Figure ISB00000499395800871
Figure ISB00000499395800891
Figure ISB00000499395800901
Figure ISB00000499395800921
Figure ISB00000499395800931
Figure ISB00000499395800941
Figure ISB00000499395800951
Figure ISB00000499395800961
Figure ISB00000499395800971
Figure ISB00000499395800981
Figure ISB00000499395801001
Figure ISB00000499395801011
Figure ISB00000499395801021
Figure ISB00000499395801031
Figure ISB00000499395801041
Figure ISB00000499395801051
Figure ISB00000499395801061
Figure ISB00000499395801071
Figure ISB00000499395801081
Figure ISB00000499395801091
Figure ISB00000499395801101
Figure ISB00000499395801111
Figure ISB00000499395801121
Figure ISB00000499395801131
Figure ISB00000499395801141
Figure ISB00000499395801151
Figure ISB00000499395801161
Figure ISB00000499395801171
Figure ISB00000499395801191
Figure ISB00000499395801201
Figure ISB00000499395801211
Figure ISB00000499395801221
Figure ISB00000499395801231
Figure ISB00000499395801241
Figure ISB00000499395801251
Figure ISB00000499395801261
Figure ISB00000499395801271
Figure ISB00000499395801281
Figure ISB00000499395801291
Figure ISB00000499395801301
Figure ISB00000499395801311
Figure ISB00000499395801321
Figure ISB00000499395801351
Figure ISB00000499395801361
Figure ISB00000499395801371
Figure ISB00000499395801381
Figure ISB00000499395801391
Figure ISB00000499395801401
Figure ISB00000499395801411
Figure ISB00000499395801421
Figure ISB00000499395801431
Figure ISB00000499395801441
Figure ISB00000499395801461
Figure ISB00000499395801471
Figure ISB00000499395801481
Figure ISB00000499395801491
Figure ISB00000499395801511
Figure ISB00000499395801521
Figure ISB00000499395801531
Figure ISB00000499395801541
Figure ISB00000499395801561
Figure ISB00000499395801571
Figure ISB00000499395801581
Figure ISB00000499395801591
Figure ISB00000499395801601
Figure ISB00000499395801621
Figure ISB00000499395801631
Figure ISB00000499395801641
Figure ISB00000499395801651
Figure ISB00000499395801671
Figure ISB00000499395801681
Figure ISB00000499395801691
Figure ISB00000499395801701
Figure ISB00000499395801721
Figure ISB00000499395801731
Figure ISB00000499395801741
Figure ISB00000499395801751
Figure ISB00000499395801761
Figure ISB00000499395801781
Figure ISB00000499395801791
Figure ISB00000499395801811
Figure ISB00000499395801821
Figure ISB00000499395801831
Figure ISB00000499395801841
Figure ISB00000499395801851
Figure ISB00000499395801861
Figure ISB00000499395801871
Figure ISB00000499395801881
Figure ISB00000499395801891
Figure ISB00000499395801901
Figure ISB00000499395801921
Figure ISB00000499395801931
Figure ISB00000499395801941
Figure ISB00000499395801951
Figure ISB00000499395801961
Figure ISB00000499395802001
Figure ISB00000499395802011
Figure ISB00000499395802021
Figure ISB00000499395802031
Figure ISB00000499395802051
Figure ISB00000499395802061
Figure ISB00000499395802081
Figure ISB00000499395802091
Figure ISB00000499395802101
Figure ISB00000499395802111
Figure ISB00000499395802121
Figure ISB00000499395802151
Figure ISB00000499395802171
Figure ISB00000499395802191
Figure ISB00000499395802201
Figure ISB00000499395802211
Figure ISB00000499395802221
Figure ISB00000499395802231
Figure ISB00000499395802241
Figure ISB00000499395802251
Figure ISB00000499395802261
Figure ISB00000499395802271
Figure ISB00000499395802281
Figure ISB00000499395802301
Figure ISB00000499395802311
Figure ISB00000499395802321
Figure ISB00000499395802331
Figure ISB00000499395802341
Figure ISB00000499395802351
Figure ISB00000499395802361
Figure ISB00000499395802371
Figure ISB00000499395802381
Figure ISB00000499395802391
Figure ISB00000499395802401
Figure ISB00000499395802411
Figure ISB00000499395802421
Figure ISB00000499395802431
Figure ISB00000499395802441
Figure ISB00000499395802451
Figure ISB00000499395802461
Figure ISB00000499395802471
Figure ISB00000499395802481
Figure ISB00000499395802491
Figure ISB00000499395802501
Figure ISB00000499395802521
Figure ISB00000499395802531
Figure ISB00000499395802541
Figure ISB00000499395802551
Figure ISB00000499395802561
Figure ISB00000499395802571
Figure ISB00000499395802591
Figure ISB00000499395802601
Figure ISB00000499395802611
Figure ISB00000499395802621
Figure ISB00000499395802631
Figure ISB00000499395802641
Figure ISB00000499395802651
Figure ISB00000499395802661

Claims (13)

1.用于鉴定[2Fe-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括：
a)用序型隐蔽马尔科夫模型查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用SEQ ID NO：164、168、230、232、298、310、344和346的蛋白质制备的，其中具有小于10-5的E值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种DHAD相关蛋白质；
b)分析步骤(a)的对应于一种或多种DHAD相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcus mutans)二羟酸脱水酶氨基酸序列(SEQ ID NO：168)的56、129和201位；以及
c)分析步骤(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌DHAD氨基酸序列(SEQ ID NO：168)中的以下位置：88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和454位的亮氨酸。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括：
d)在细胞中表达具有能够通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部来鉴定的序列的多肽；和
e)确认所述多肽在所述细胞中具有DHAD活性。
3.权利要求1的方法，所述方法还包括：
d)纯化由能够通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部来鉴定的序列编码的蛋白质；和
e)通过紫外-可见和电子顺磁共振光谱法确认所述蛋白质是[2Fe-2S]DHAD酶。
4.权利要求1的方法，所述方法还包括选择一种或多种序列，所述序列对应于在步骤a)、b)和c)中任何一个或全部中鉴定的细菌[2Fe-2S]DHAD酶序列。
5.权利要求2的方法，其中所述细胞缺少内源的DHAD活性。
6.权利要求4的方法，所述方法还包括：
d)在细胞中表达所述选择的一种或多种对应于细菌[2Fe-2S]DHAD酶序列的序列；以及
e)确认所述酶序列在所述细胞中具有DHAD活性。
7.权利要求4的方法，所述方法还包括：
d)纯化由所述选择的一种或多种对应于细菌[2Fe-2S]DHAD酶序列的序列编码的蛋白质，从而产生纯化的蛋白质；和
e)通过紫外-可见和电子顺磁共振光谱法确认所述蛋白质是[2Fe-2S]DHAD酶。
8.包含至少一种异源[2Fe-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞，其中所述[2Fe-2S]DHAD酶可通过权利要求1-7中任一项的方法被鉴定。
9.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞或酵母细胞。
10.权利要求9的微生物宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是选自梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、和短杆菌属(Brevibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)和链球菌属(Streptococcus)的细菌属的成员。
11.权利要求9的微生物宿主细胞，其中所述酵母细胞是选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)的酵母属的成员。
12.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞产生异丁醇。
13.用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞包含异丁醇生物合成途径；以及
b)使步骤(a)的宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。
l4.用于使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求8的微生物宿主细胞和2，3-二羟基异戊酸源；以及
b)使(a)的微生物宿主细胞在使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的条件下生长。
CN200980138542.2A 2008-09-29 2009-09-29 细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途 Active CN102186973B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10079208P 2008-09-29 2008-09-29
US61/100792 2008-09-29
PCT/US2009/058827 WO2010037112A1 (en) 2008-09-29 2009-09-29 IDENTIFICATION AND USE OF BACTERIAL [2Fe-2S] DIHYDROXY-ACID DEHYDRATASES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102186973A true CN102186973A (zh) 2011-09-14
CN102186973B CN102186973B (zh) 2017-08-15

Family

ID=41402186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980138542.2A Active CN102186973B (zh) 2008-09-29 2009-09-29 细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20100081154A1 (zh)
EP (2) EP2337851B1 (zh)
JP (1) JP5846912B2 (zh)
KR (1) KR101659101B1 (zh)
CN (1) CN102186973B (zh)
AU (1) AU2009296225B2 (zh)
BR (1) BRPI0913682A2 (zh)
CA (1) CA2735690A1 (zh)
ES (1) ES2521675T3 (zh)
MX (1) MX2011003238A (zh)
NZ (1) NZ591244A (zh)
WO (1) WO2010037112A1 (zh)
ZA (2) ZA201101367B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111893083A (zh) * 2019-05-05 2020-11-06 中国科学院上海高等研究院 改造的克雷伯氏属细菌及其生产2,3-二羟基异戊酸的应用

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
US8945899B2 (en) 2007-12-20 2015-02-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase using NADH
EP2543721A1 (en) 2007-04-18 2013-01-09 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Fermentive production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes
US8188250B2 (en) 2008-04-28 2012-05-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans
BRPI0909989A2 (pt) 2008-06-05 2021-06-22 Butamax Advanced Biofuels Llc célula de levedura recombinante e método para a produção de um produto
US20160222370A1 (en) * 2008-09-29 2016-08-04 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant Yeast Host Cell With Fe-S Cluster Proteins And Methods Of Using Thereof
CN102186973B (zh) 2008-09-29 2017-08-15 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途
WO2010037105A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Butamax™ Advanced Biofuels LLC Enhanced dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria
US8455224B2 (en) * 2008-09-29 2013-06-04 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Enhanced pyruvate to 2,3-butanediol conversion in lactic acid bacteria
CN102186983A (zh) 2008-09-29 2011-09-14 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 酵母中提高的异源Fe-S酶活性
US8465964B2 (en) 2008-11-13 2013-06-18 Butamax (TM) Advanced Biofules LLC Increased production of isobutanol in yeast with reduced mitochondrial amino acid biosynthesis
US8614085B2 (en) * 2009-02-27 2013-12-24 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving a multidrug efflux pump gene
WO2010119339A2 (en) 2009-04-13 2010-10-21 Butamax™ Advanced Biofuels LLC Method for producing butanol using extractive fermentation
CA2770842A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Gevo, Inc. Cytosolic isobutanol pathway localization for the production of isobutanol
EP2483401B1 (en) * 2009-09-29 2017-06-21 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Improved yeast production host cells
JP5805094B2 (ja) 2009-09-29 2015-11-04 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 高有効性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を用いたイソブタノールの発酵生産
US20110195505A1 (en) * 2009-10-08 2011-08-11 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Bacterial strains for butanol production
AU2010321575A1 (en) 2009-11-23 2012-05-10 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using extractive fermentation with osmolyte addition
JP2013511283A (ja) 2009-11-23 2013-04-04 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 電解質の添加を伴う抽出発酵を用いたブタノールの生成方法
CA2781131C (en) * 2009-11-24 2017-01-03 Gevo, Inc. Methods of increasing dihydroxy acid dehydratase activity to improve production of fuels, chemicals, and amino acids
CA2784903A1 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Alcohol dehydrogenases (adh) useful for fermentive production of lower alkyl alcohols
NZ600585A (en) 2009-12-29 2014-07-25 Butamax Tm Advanced Biofuels Expression of hexose kinase in recombinant host cells
US9297016B2 (en) 2010-02-17 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Activity of Fe—S cluster requiring proteins
KR102032075B1 (ko) 2010-05-24 2019-10-14 질레코 인코포레이티드 바이오매스의 가공처리
AU2011268326B2 (en) 2010-06-17 2015-02-05 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast production culture for the production of butanol
AU2011268220B2 (en) 2010-06-18 2015-01-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Extraction solvents derived from oil for alcohol removal in extractive fermentation
US9040263B2 (en) 2010-07-28 2015-05-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of alcohol esters and in situ product removal during alcohol fermentation
US8871488B2 (en) 2010-06-18 2014-10-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells comprising phosphoketolases
CN103476936A (zh) 2010-06-18 2013-12-25 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 醇发酵过程中醇酯的生产和原位产物移出
US9012190B2 (en) 2011-06-15 2015-04-21 Butamax Advanced Biofuels Llc Use of thiamine and nicotine adenine dinucleotide for butanol production
CA2810244C (en) 2010-09-07 2020-10-06 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion
US20130040340A1 (en) 2011-02-07 2013-02-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of alcohol esters in situ using alcohols and fatty acids produced by microorganisms
US8759044B2 (en) 2011-03-23 2014-06-24 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
US8765425B2 (en) 2011-03-23 2014-07-01 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
HUE045191T2 (hu) 2011-03-24 2019-12-30 Butamax Tm Advanced Biofuels Host sejtek és eljárások izobutanol elõállítására
ES2617970T3 (es) 2011-06-17 2017-06-20 Butamax Advanced Biofuels Llc Co-productos de procesos de producción de biocombustible y métodos de preparación
BR112014001943A2 (pt) 2011-07-28 2018-08-07 Butamax Advanced Biofuels Llc método de converter alfa-cetoisovalerato a isobutiraldeído e método de produção de isobutanol
WO2013043801A1 (en) * 2011-09-20 2013-03-28 Gevo, Inc. High-performance dihydroxy acid dehydratases
JP2015501643A (ja) 2011-12-09 2015-01-19 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 発酵ブロスから生成物アルコールを取り出す方法
CN104321436A (zh) 2011-12-30 2015-01-28 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 醇类的发酵生产
WO2013102147A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Genetic switches for butanol production
US9689004B2 (en) 2012-03-23 2017-06-27 Butamax Advanced Biofuels Llc Acetate supplemention of medium for butanologens
MX370134B (es) 2012-05-11 2019-12-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Enzimas de cetol-acido reductoisomerasa y metodo de uso.
US20140024064A1 (en) 2012-07-23 2014-01-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentative alcohols
EP2888350A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 Butamax Advanced Biofuels LLC Production of fermentation products
MX2015003073A (es) 2012-09-12 2015-07-14 Butamax Advanced Biofuels Llc Procesos y sistemas para la produccion de productos de fermentacion.
US9840724B2 (en) 2012-09-21 2017-12-12 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of renewable hydrocarbon compositions
EP3444339A1 (en) 2012-09-26 2019-02-20 Butamax(TM) Advanced Biofuels LLC Polypeptides with ketol-acid reductoisomerase activity
US20140093931A1 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of fermentation products
US9273330B2 (en) 2012-10-03 2016-03-01 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol tolerance in microorganisms
WO2014059273A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
WO2014106107A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Dhad variants for butanol production
WO2014105840A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentative production of alcohols
WO2014159309A1 (en) 2013-03-12 2014-10-02 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of alcohols
BR112015022612A2 (pt) 2013-03-14 2017-10-24 Du Pont microrganismo recombinante e enzima
US9771602B2 (en) 2013-03-15 2017-09-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism
US9156760B2 (en) 2013-03-15 2015-10-13 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for production of butanol using extractive fermentation
WO2014151645A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Butamax Advanced Biofuels Llc Process for maximizing biomass growth and butanol yield by feedback control
WO2014144643A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using extractive fermentation
WO2014151190A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Butamax Advanced Biofuels Llc Dhad variants and methods of screening
US9663759B2 (en) 2013-07-03 2017-05-30 Butamax Advanced Biofuels Llc Partial adaptation for butanol production
US10280438B2 (en) 2014-08-11 2019-05-07 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of yeast
EP3589740A1 (en) 2017-03-03 2020-01-08 NMR - Bio Cell-free synthesis of isotopic labelled proteins from amino-acids precursors
DE102022119024A1 (de) * 2022-07-28 2024-02-08 INM - Leibniz-Institut für Neue Materialien gemeinnützige Gesellschaft mit beschränkter Haftung Neuartige genetische Werkzeuge

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
FR2696190B1 (fr) * 1992-09-25 1994-12-09 Agronomique Inst Nat Rech Acide nucléique codant pour une alpha-acétolactate synthase et ses applications.
US6800744B1 (en) * 1997-07-02 2004-10-05 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
DE19855312A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
EP1887081A2 (en) * 1999-02-25 2008-02-13 Ceres Incorporated DNA Sequences
US7273769B1 (en) 2000-08-16 2007-09-25 Micron Technology, Inc. Method and apparatus for removing encapsulating material from a packaged microelectronic device
EP1339852A2 (en) * 2000-11-22 2003-09-03 Cargill Dow LLC Methods and materials for the synthesis of organic products
EP1825272A2 (en) 2004-12-01 2007-08-29 F2G Ltd. Fungal signalling and metabolic enzymes
CN101155925B (zh) 2005-04-12 2012-05-09 纳幕尔杜邦公司 处理生物质以获得乙醇的方法
CA2617734A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Suntory Limited Dihydroxy-acid dehydratase gene and use thereof
NZ566406A (en) 2005-10-26 2012-04-27 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
EP2001992B1 (en) 2006-03-13 2016-07-20 Cargill Inc. Yeast cells having disrupted pathway from dihydroxyacetone phosphate to glycerol
US8962298B2 (en) * 2006-05-02 2015-02-24 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cell comprising a diol dehydratase
WO2008098227A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 The Regents Of The University Of California Biofuel production by recombinant microorganisms
EP2543721A1 (en) 2007-04-18 2013-01-09 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Fermentive production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes
ES2563040T3 (es) 2007-12-23 2016-03-10 Gevo, Inc. Organismo de levadura que produce isobutanol a un alto rendimiento
DE102008010121B4 (de) 2008-02-20 2013-11-21 Butalco Gmbh Fermentative Produktion von Isobutanol mit Hefe
EP2657344B1 (en) * 2008-06-04 2016-04-27 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Method for producing butanol using two-phase extractive fermentation
BRPI0909989A2 (pt) * 2008-06-05 2021-06-22 Butamax Advanced Biofuels Llc célula de levedura recombinante e método para a produção de um produto
US8455224B2 (en) 2008-09-29 2013-06-04 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Enhanced pyruvate to 2,3-butanediol conversion in lactic acid bacteria
CN102186983A (zh) * 2008-09-29 2011-09-14 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 酵母中提高的异源Fe-S酶活性
EP2342330A1 (en) 2008-09-29 2011-07-13 Butamax Advanced Biofuels Llc Enhanced iron-sulfur cluster formation for increased dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria
CN102186973B (zh) 2008-09-29 2017-08-15 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途
WO2010037105A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 Butamax™ Advanced Biofuels LLC Enhanced dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria
US8828694B2 (en) * 2008-11-13 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of isobutanol in yeast mitochondria
CA2770842A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Gevo, Inc. Cytosolic isobutanol pathway localization for the production of isobutanol
EP2483401B1 (en) * 2009-09-29 2017-06-21 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Improved yeast production host cells
JP5805094B2 (ja) * 2009-09-29 2015-11-04 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 高有効性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を用いたイソブタノールの発酵生産
JP2013511283A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 電解質の添加を伴う抽出発酵を用いたブタノールの生成方法
AU2010321575A1 (en) * 2009-11-23 2012-05-10 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using extractive fermentation with osmolyte addition

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AJDIC,D ET AL: "Q8DRT7", 《GENBANK》 *
IMLAY JAMES A: "Iron-sulphur clusters and the problem with oxygen", 《MOLECULAR MICROBIOLOGY 》 *
J. RICHARD DICKINSON ET AL: "An Investigation of the Metabolism of Valine to Isobutyl Alcohol in", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
MAKAROVA,K ET AL: "YP_809259.1", 《GENBANK》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111893083A (zh) * 2019-05-05 2020-11-06 中国科学院上海高等研究院 改造的克雷伯氏属细菌及其生产2,3-二羟基异戊酸的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20140051137A1 (en) 2014-02-20
EP2337851A1 (en) 2011-06-29
AU2009296225A1 (en) 2010-04-01
WO2010037112A1 (en) 2010-04-01
ZA201101367B (en) 2014-03-26
CA2735690A1 (en) 2010-04-01
EP2821484B1 (en) 2016-06-29
EP2337851B1 (en) 2014-08-13
MX2011003238A (es) 2011-04-28
EP2821484A1 (en) 2015-01-07
CN102186973B (zh) 2017-08-15
KR20110063575A (ko) 2011-06-10
US20100081154A1 (en) 2010-04-01
BRPI0913682A2 (pt) 2020-08-11
NZ591244A (en) 2013-03-28
US20140030776A1 (en) 2014-01-30
JP5846912B2 (ja) 2016-01-20
ES2521675T3 (es) 2014-11-13
KR101659101B1 (ko) 2016-09-22
US8951937B2 (en) 2015-02-10
ZA201309658B (en) 2016-06-29
AU2009296225B2 (en) 2015-09-17
JP2012503993A (ja) 2012-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102186973B (zh) 细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途
CN104619835B (zh) 酮醇酸还原异构酶及其使用方法
JP6371427B2 (ja) ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素およびその使用方法
US9447385B2 (en) Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans
CN102186983A (zh) 酵母中提高的异源Fe-S酶活性
US20160319307A1 (en) Fermentive Production of Isobutanol Using Highly Effective Ketol-Acid Reductoisomerase Enzymes
US8785166B2 (en) Increased production of isobutanol in yeast with reduced mitochondrial amino acid biosynthesis
CN102782119B (zh) 改善需Fe-S簇蛋白质的活性
MX2011003272A (es) Polipeptidos de eritropoyetina animal modificados y sus usos.
EP2331683A1 (en) Enhanced dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria
CN105102616A (zh) 具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant