CN102876704A - 利用重组枯草芽孢杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶 - Google Patents

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饶志明
李静静
张显
徐美娟
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Abstract

本发明涉及一种利用重组枯草芽孢杆菌高效表达Staphyloccocusaureusα-乙酰乳酸脱羧酶，以金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)基因组DNA为模板，扩增得到编码α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的基因saald，将其克隆到穿梭表达载体pMA5上，以B.subtilis WB600为表达宿主，构建α-乙酰乳酸脱羧酶基因工程菌pMA5-saald/B.subtilis WB600，实现ALDC的高效表达。该工程菌在LB培养基中的发酵酶活较出发菌S.aureus提高了约1200倍，较宿主菌B.subtilis WB600提高约10588倍，达到36000U/L。该重组菌在发酵培养基中发酵培养48h，ALDC酶活达66500U/L。

Description

利用重组枯草芽孢杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶
技术领域
利用重组枯草芽孢杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase，简称为ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，避免双乙酰的生成，它可以缩短啤酒熟化周期，提高生产效率，对啤酒工业来说极有经济价值。
α-乙酰乳酸脱羧酶主要应用于啤酒酿造工业。在啤酒酵母代谢过程中，α-乙酰乳酸是亮氨酸一缬氨酸生物合成过程的中间产物。大部分α-乙酰乳酸在酵母细胞内代谢形成缬氨酸和亮氨酸，小部分渗漏到细胞外，进入发酵液中，在胞外经非酶氧化生成双乙酰。在啤酒酿造过程中，双乙酰是影响啤酒质量的关键因素，也是决定啤酒成熟与否的重要指标，虽然双乙酰赋予了啤酒特殊的风味，但是其口味阈值比较低(0.02～0.10mg/L)，当含量超过0.15mg/L时就会给啤酒带来不愉快的馊饭味，因此在整个发酵过程中严格控制双乙酰的产生量是至关重要的。α-乙酰乳酸脱羧酶能将啤酒生产过程中双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸迅速分解为乙偶姻，从而快速地降低啤酒中双乙酰的含量。
酿酒酵母不含ALDC，很多细菌中含有该酶。Godtfredsen等测试的34个属79个种(325株)细菌中，有ALDC活性的占20个属40个种。α-乙酰乳酸脱羧酶首次于1952年从产气肠杆菌中分离得到，之后有关该酶在生物界中的分布及菌种选育得到了广泛研究。a-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)存在于多种细菌中，它参与α-乙酰乳酸代谢，将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻。目前还未在真菌、海藻和原生动物等真核生物中发现该酶的存在。
细菌中天然存在的ALDC产量很低，要想将该酶应用于啤酒工业，研究ALDC的分子结构以及ALDC基因，进行基因的克隆和表达，提高酶的产量，是一种必然的选择。随着对ALDC分子水平研究的深入，α-乙酰乳酸脱羧酶基因已经从多种细菌中克隆得到，并在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母中获得了不同程度的表达。
发明内容
本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，缩写为S.aureus)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因在本发明中简称saald，构建重组表达载体pMA5-saald，并将其转化Bacillus subtilis WB600，成功构建了基因工程菌pMA5-saald/B.subtilis WB600将发酵获得的α-乙酰乳酸脱羧酶运用在啤酒发酵中，初步探讨了其降低双乙酰含量的能力。
本发明的技术方案：
1.α-乙酰乳酸脱羧酶引物设计
根据NCBI金黄色葡萄球菌的全基因组核酸序列中saald基因序列，设计α-乙酰乳酸脱羧酶的PCR引物P1和P2。
P1：5’-ATCGGATCCATGACGAATGTCTTGTATC-3’BamH I
P2：5’-TGACTACGCGTCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’Mlu I
2.重组菌的构建
从金黄色葡萄球菌中抽提染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用下共同的限制性内切酶对载体pMA5和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接。取连接产物转入E.coli JM109的感受态细胞进行转化，挑取阳性转化子于10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。将经验证构建成功的重组质粒pMA5-saald用化学转化法转化至B.subtilisWB600中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。经筛选验证获得阳性转化子，即为重组枯草芽孢杆菌pMA5-saald/B.subtilis WB600。
3.重组菌α-乙酰乳酸脱羧酶的表达及酶活测定
取冻管保藏的菌种接入10mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接，37℃培养24h，取发酵液于4℃，10000r/min离心10min，取上清用于胞外酶活力的测定，收集菌体采用超声破破碎，破碎液上清用于胞外酶活力的测定。蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。经测定重组菌ALDC胞外酶活力为9500U/L，胞内酶活力为26500U/L，总酶活36000U/L，约是出发菌的1200倍，宿主菌的10588倍。
4.α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中的应用
将发酵获得的α-乙酰乳酸脱羧酶运用在啤酒发酵中，初步探讨了其降低双乙酰含量的能力。在冷麦汁中加入按照0.05mg/L的量添加所得的纯酶，经检测发现，发酵过程中双乙酰的峰值比不添加的情况下明显降低，且加速了双乙酰的还原，使发酵周期缩短了约3天。啤酒发酵结束后，其中的乙酰乳酸几乎完全生成双乙酰而得到还原，这样就有效避免了成品啤酒中双乙酰的回升现象。
本发明的有益效果：α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，避免双乙酰的生成，它可以缩短啤酒熟化周期，提高生产效率，对啤酒工业来说极有经济价值。鉴于α-乙酰乳酸脱羧酶的应用价值，获得该酶的高表达和高酶活一直以来是研究的热点。因此，通过基因工程技术构建高表达载体达到α-乙酰乳酸脱羧酶的高效表达和比较高的酶活水平具有重要意义。以本实验室保藏的一株金黄色葡萄球菌(S.aureus)为出发菌株，测得较为可观的α-乙酰乳酸脱羧酶活性，克隆其基因saald并在枯草芽孢杆菌中得以高效表达，所构建的工程菌发酵所产生的ALDC酶活达到36000U/L较出发菌S.aureus提高了约1200倍，较宿主菌B.subtilis WB600提高约10588倍，该基因工程菌株，适用于工业化的生产和应用，具有一定的理论和应用价值。
附图说明
图1质粒pMA5-saald的酶切验证。1：pMA5-saald/BamH I+Mlu I；2：pMA5-saald/BamH I；3：DNA Marker：DL 2000；4：DNA Marker：λ-HindIII
图2α-乙酰乳酸脱羧酶的表达。1：Protein Marker(kDa)；2：B.subtilis WB600；3：B.subtilis WB600with recombinant plasmid pMA5-saald
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明。
实施例1：重组质粒pMA5-saald的构建及转化
[1]从金黄色葡萄球菌抽提染色体DNA作为模板，抽提方法如下：用接种环从新鲜的金黄色葡萄球平板上挑取单菌落悬浮于0.5mL的灭菌双蒸水中，沸水煮5-10min，8000r/min离心10min，取上清装入一只干净的1.5mL离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[2]以金黄色葡萄球菌总DNA为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：模板(金黄色葡萄球菌染色体DNA)2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[3]构建重组质粒pMD18-T-saald，导入感受态E.coli JM109。连接体系：PCR胶回收产物4.8μL，solution I 5μL，pMD18-T质粒0.5μL，16℃过夜连接。转化方法：将连接好的10μLpMD18-T-saald加入到120μL感受态E.coil JM109中，于冰上放置45min，42℃热击90s，放置冰上2min，加入800μL LB液体培养基，37℃摇床培养1h，离心，倒掉大部分上清液，留150μL与沉淀混匀，涂布到氨苄青霉素平板(Amp+LB)上，于37℃培养箱培养9h左右，挑去平板上的阳性菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养。提取质粒，经酶切验证连接成功后，将菌液加入终浓度17％(w/v)的甘油，-40℃冰箱保藏。
[4]将[3]中提取的质粒和质粒pMA5分别用BamH I和Mlu I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7.7μL，pET-28a酶切产物0.3μL，T4DNA连接酶buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pMA5-saald转化到感受态E.coli JM109，转化方法参照实施例2[3]，用卡那霉素平板(Kana+LB)挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20℃冰箱保藏备用。
[5]将经验证构建成功的重组质粒pMA5-saald用化学转化法转化至B.subtilis中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。挑取B.subilis WB600接种于一支5mL LB液体培养基试管，37℃摇床培养过夜。取100μL过夜培养的菌液，接种至用5mL SP I Medium中，37℃摇床培养，5h后开始测OD600，当培养物生长到对数末期时，快速取200μL接种到2mL SPII Medium中，37℃100r/min摇床培养1.5h。加20μL 100×EGTA溶液，于37℃100r/min摇床培养10min，用1.5mL离心管分装成500μL每管。向管中加入适量的质粒pMA5-saald，轻轻混匀于37℃100r/min摇床培养30min。将离心管转移到250r/min摇床，37℃养1.5h。以4000r/min离心收集菌体，弃部分上清液，留100μL重悬菌体，涂布于卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养。挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600，-20℃冰箱保藏备用。
实施例2：α-乙酰乳酸脱羧酶表达及酶活测定
[1]将实施例1[5]构建的重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600，与出发菌S.aureus及宿主菌B.subtilis WB600分别接种于10mL含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃摇床160r/min振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接，37℃培养24h，取所得菌液1mL于1.5mL离心管中，8000r/min离心2min，倒掉上清，加入100μL pH6.8的Tris-HCl缓冲液将菌体混匀，加入30μL蛋白胶上样缓冲液，沸水浴30min，使蛋白质变性，8000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，其中SDS-PAGE使用5％的分离胶和15％的浓缩胶，采用不连续垂直电泳，用考马斯亮蓝R250染色，以含有空载质粒pMA5的B.subtilis WB600做空白对照。
[2]将菌液于8000r/min，4℃离心10min，用pH6.0的MES I缓冲液(2-吗啉乙磺酸0.05mol/L，Brij-350.05％，NaCl 0.6mol/L，pH6.0)洗涤两次，最后用pH6.0的MES I缓冲液悬浮菌体，超声波破碎(300W，工作2S停5S，工作10min)，10000r/min离心30min，上清即为粗酶液。采用400μL的酶活测定体系(200μL酶液，200μL底物)，30℃反应10min，用4.6mL显色剂终止，30℃显色30min，于520nm波长下检测反应液的吸光值。一个单位酶活(IU)定义为：在30℃，pH6.0的反应条件下，1min使α-乙酰乳酸脱羧形成1μmol乙偶姻的酶量。测得出发菌S.aureus的总酶活为300U/L，宿主菌.subtilis WB600的总酶活为3.4U/L，重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600的总酶活为36000U/L，其胞外、胞内比酶活分别为26500U/L、9500U/L。重组菌的ALDC酶活力比出发菌S.aureus提高了约1200倍，比宿主菌B.subtilis WB600提高了约10588倍。
实施例3：重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600的发酵
将实施例1[5]构建的重组菌pMA5-saald/B.subtilisWB600经LB培养基活化培养后，按照4％的接种量接种发酵培养基(大豆蛋白胨10g/L，玉米浆15g/L，尿素3g/L，葡萄糖50g/L，k2HPO4·3H2O 1.7g/L，kH2PO4 2.3g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，NaCl 5g/L，pH 6.8)，37℃摇床160r/min培养48h，结束发酵，然后按照实施例2[2]所述的方法进行酶活的测定，其胞外、胞内酶活分别为28300U/L、38200U/L，总酶活达66500U/L。
Figure ISA00000782442900011

Claims (4)

1.一种重组质粒pMA5-saald，其特征是以Staphylococcus aureus基因组DNA为模板，扩增得到编码α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的基因，将其克隆到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5上，获得重组质粒pMA5-saald。
2.权利要求1所述的基因saald的扩增方法，其特征是基因的克隆根据saald基因的特异性设计引物，P1：5’-ATCGGATCCATGACGAATGTCTTGTATC-3’(BamH I)，P2：5’-TGACTACGCGTCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’(Mlu I)；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：金黄色葡萄球菌染色体DNA 2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增saald基因，大小为705bp。
3.一种高效表达S.aureus α-乙酰乳酸脱羧酶的重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600，其特征是构建方法如下：
(1)将含saald基因的重组质粒pMA5-saald通过转化化学转化法转入B.subtilis WB600中，在含氨苄青霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600；
(2)对上述重组菌进行诱导表达，超声波破碎后测定ALDC的酶活力，并与对照菌株进行比较，重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600的酶活力相对较高，重组菌pMA5-saald/B.SubtilisWB600的总酶活为36000U/L，其胞外、胞内比酶活分别为26500U/L、9500U/L。。重组菌的ALDC酶活力比出发菌S.aureus提高了约1200倍，比宿主菌B.subtilis WB600提高了约10588倍。
4.重组菌pMA5-saald/B.subtilis WB600的发酵培养，其特征是经种子活化转接发酵培养基(大豆蛋白胨10g/L，玉米浆15g/L，尿素3g/L，葡萄糖50g/L，k2HPO4·3H2O 1.7g/L，kH2PO42.3g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，NaCl 5g/L，pH 6.8)，37℃摇床160r/min培养48h，结束发酵，其胞外、胞内比酶活分别为28300U/L、38200U/L，总酶活达66500U/L。
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