CN107667172A - Aldc 生产方法 - Google Patents

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CN107667172A
CN107667172A CN201680029408.9A CN201680029408A CN107667172A CN 107667172 A CN107667172 A CN 107667172A CN 201680029408 A CN201680029408 A CN 201680029408A CN 107667172 A CN107667172 A CN 107667172A
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J·F·克拉米尔
L·B·詹森
A·H·凯利特-史密斯
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Abstract

本披露提供包含ALDC酶的方法、组合物、装置和试剂盒，所述ALDC酶具有更好的稳定性和活性，并且此外能以提高的产量从微生物中回收所述ALDC酶。

Description

ALDC生产方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时专利申请号的优先权和权益：2015年5月22日提交的62/165690、2015年5月26日提交的62/166616；和2015年5月29日提交的62/168415；每个临时申请标题均为“ALDC方法”。
通过引用并入序列表
将2016年5月5日创建并与此一道提交的、以大小为16,795字节、名称为“20160505_NB40737_PCT_SEQS_ST25.txt”的文件形式提供的序列表通过引用以其全文并入本文。
背景技术
二乙酰有时是含有例如麦芽汁或葡萄汁等物质的碳水化合物的发酵过程中不希望的副产物。二乙酰的形成是最不利的，因为它具有强烈和不愉快的气味，并且在啤酒的情况下，即使少量的约0.10mg/升至0.15mg/升的二乙酰对啤酒的风味和味道也将产生负面影响。在啤酒成熟期间，二乙酰由酵母细胞中的还原酶转化成乙偶姻。相对于啤酒的风味和味道，相较于二乙酰，可以接受更高浓度的乙偶姻。
乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)也可以用作预防二乙酰形成的酶。在发酵期间，通过添加ALDC酶，α-乙酰乳酸可以转化为乙偶姻。然而，在发酵条件下，尤其是在用低麦芽糖含量发酵麦芽汁的那些条件下，ALDC可以是不稳定的。
本发明的目的旨在提供ALDC酶，这些ALDC酶具有更好的稳定性和/或活性，并且任选地，可以从微生物回收的ALDC酶的产量得以提高。
发明内容
本披露提供了用于ALDC酶的组合物和过程。
在以下分别编号的段落中阐述了组合物和方法的多个方面和实施例。
1.一种用于生产乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的方法，所述方法包括：
Ai)提供包含遗传改变的芽孢杆菌属(Bacillus)宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和/或细胞壁蛋白酶(wprA)，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；以及
ii)在适合于产生所述异源ALDC酶的条件下培养所述宿主细胞，使得产生所述异源ALDC酶；或者
Bi)提供包含遗传改变的芽孢杆菌属宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和/或细胞壁蛋白酶(wprA)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；以及
ii)在适合于产生ALDC酶的条件下培养所述宿主细胞，使得产生ALDC酶。
2.如段落1所述的方法，所述方法还包括回收所产生的ALDC酶。
3.如段落1或2所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
4.如段落1至3中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞还缺乏内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。
5.如段落1至4中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞还缺乏内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和/或内源杆菌肽酶(bacillopeptidase)F酶(Bpr)。
6.如段落1至5中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞缺乏中性金属蛋白酶(NprE)。如段落6所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞缺乏内源中性金属蛋白酶(NprE)。
7.如段落1至6中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还缺乏内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)。
8.如段落1至7中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还缺乏内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)。
9.如段落1至8中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还缺乏内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)。
10.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述宿主还具有减少的量的一种或多种另外的蛋白酶，所述蛋白酶选自：ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。如前述段落中任一项所述的方法，其中所述宿主还具有减少的量的一种或多种另外的内源蛋白酶，所述内源蛋白酶选自：ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。
11.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述遗传改变包含亲本细胞中存在的基因的破坏。
12.如段落11所述的方法，其中所述破坏是全部或部分基因的缺失的结果。
13.如段落11所述的方法，其中所述基因的破坏是缺失包含所述基因的基因组DNA的部分缺失的结果。
14.如段落11-13中任一项所述的方法，其中所述基因的破坏是诱变的结果。
15.如段落11-14中任一项所述的方法，其中所述基因的破坏是使用位点特异性重组进行的。
16.如段落11-15中任一项所述的方法，其中与在所述基因的遗传基因座处引入选择性标志组合，进行所述基因的破坏。
17.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)、乳酸乳球菌DX(Lactococcus lactis DX)、或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
18.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
19.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
20.一种芽孢杆菌属宿主细胞，其包含核酸，所述核酸与启动子有效组合以编码异源ALDC酶，其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和/或细胞壁蛋白酶(wprA)的遗传改变；或者一种芽孢杆菌属宿主细胞，其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和/或细胞壁蛋白酶(wprA)的遗传改变，并且其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列的核酸。
21.如段落20所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
22.如段落20或段落21所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。
23.如段落20至22中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和/或内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。
24.如段落20至23中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的中性金属蛋白酶(NprE)。如段落20至23中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的内源中性金属蛋白酶(NprE)。
25.如段落20至24中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主细胞还具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)。
26.如段落20至25中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主细胞还具有减少的量的内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)。
27.如段落20至26中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主细胞还具有减少的量的内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)。
28.如段落20至27中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的一种或多种另外的蛋白酶，所述蛋白酶选自：ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。如段落20至27中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的一种或多种另外的内源蛋白酶，所述蛋白酶选自：ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。
29.如段落20至28中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
30.如段落20至29中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶来自短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
31.如段落20至30中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
32.一种芽孢杆菌属宿主细胞，其包含核酸，所述核酸与启动子有效组合以编码异源ALDC酶，其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶和/或细胞壁蛋白酶和/或中性金属蛋白酶的遗传改变，所述蛋白酶能够剪切来自所述ALDC酶的C-末端的序列；或者一种芽孢杆菌属宿主细胞，其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶和/或细胞壁蛋白酶和/或中性金属蛋白酶的遗传改变，所述蛋白酶能够剪切ALDC酶的C-末端的序列，并且其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列的核酸。
33.如段落32所述的宿主细胞，其中所述ALDC酶是短芽孢杆菌AldB，并且来自C-末端的序列是QVHQAESERK。如段落32所述的宿主细胞，其中所述ALDC酶是短芽孢杆菌AldB并且所述蛋白酶能够剪切来自所述ALDC酶的所述C-末端的序列QVHQAESERK(SEQ ID NO:9)。
34.如段落32所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
35.一种芽孢杆菌属宿主细胞，其包含核酸，所述核酸与启动子有效组合以编码异源ALDC酶，与亲本细胞相比，其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的蛋白酶的遗传改变，其中所述蛋白酶能够切割所述ALDC酶的C-末端和/或N-末端；或者一种芽孢杆菌属宿主细胞，其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的蛋白酶的遗传改变，其中所述蛋白酶能够切割ALDC酶的C-末端和/或N-末端，并且其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列的核酸。
36.如段落35所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
37.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的C-末端位置275处进行切割。
38.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的C-末端位置276处进行切割。
39.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置37处进行切割。
40.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置38处进行切割。
41.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置39处进行切割。
42.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置40处进行切割。
43.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置42处进行切割。
44.如段落35和36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置43处进行切割。
45.如段落35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置39处进行切割。
46.如段落35至45中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中ALDC酶包含与SEQ IDNo:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7具有至少80％同源性的氨基酸序列。
47.如段落35至46中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶是短芽孢杆菌AldB并且来自C-末端的序列是QVHQAESERK。如段落35至46所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶是短芽孢杆菌AldB，并且所述蛋白酶能够切割所述ALDC酶的所述C-末端的序列QVHQAESERK。
48.如段落35至47中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶是中性金属蛋白酶。
49.如段落35至48中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶是嗜热菌蛋白酶。
附图说明
通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1显示用于表达乙酰乳酸脱羧酶aldB的质粒图。
图2显示用于表达乙酰乳酸脱羧酶aldB的RIHI-aldB的质粒图。
图3显示SDS-PAGE，所述SDS-PAGE显示在各个时间在枯草芽孢杆菌菌株中表达的aldB的截短变体，鉴定的AldB变体用点标出。泳道：1)24hr，2-缺失菌株、2)24hr，5-缺失菌株、3)24hr，7-缺失菌株、4)48hr，2-缺失菌株、5)48hr，5-缺失菌株、6)48hr，7-缺失菌株、7)72hr，2-缺失菌株、8)72hr，5-缺失菌株以及9)72hr，7-缺失除菌株。
图4显示在40℃下，在2天(左)和10天(右)的孵育之后，2-、5-和7-缺失芽孢杆菌菌株的两个酪蛋白点板测定。可以在白色光环形成之后，测定蛋白酶活性。在板上详细说明标签；来自枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶nprE用作阳性对照并且缓冲液用作阴性对照。
图5显示在存在或不存在来自各种宿主细胞的aldB酶的三种单独的基于麦芽的发酵过程中连二酮(VDK)的相对显现：A)来自2-缺失菌株的AldB、B)来自5-缺失菌株的aldB、以及C)来自7-缺失菌株的aldB。为了比较，计算的VDK含量(定义为二乙酰和2,3-戊二酮的总和)被标准化为对于没有酶(100％)的对照样品获得的最高值。所有aldB酶都用类似于ALDC活性0.04U/ml麦芽汁给予。接下来是在14℃下的8天发酵期间，VDK的显现。
发明内容
本披露提供包含ALDC酶的方法、组合物、装置和试剂盒，所述ALDC酶具有更好的稳定性和/或活性，并且任选地可以从微生物回收的ALDC酶的产量得以提高。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第20版，John Wiley and Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
本披露并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，否则分别地，任何核酸序列都从左向右以5'到3'方向书写；氨基酸序列都从左向右以氨基到羧基方向书写。
本文提供的标题并不是对本披露的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，以下立即定义的术语得以更全面地定义。
必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如在此和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如提及“蛋白酶”包括多个这样的酶，并且提及“饲料”包括提及一种或多种饲料以及本领域技术人员已知的其等效物，等等。
本文讨论的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的披露内容而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。
本文中所引用的所有专利和公开物均通过引用并入。
ALDC
在一些方面，本发明提供具有更好的稳定性和/或活性的ALDC酶，并且任选地，可以从微生物回收的ALDC酶的产量得以提高。
乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)是属于羧基裂解酶家族的酶，其负责切割碳碳键。乙酰乳酸脱羧酶催化2-乙酰乳酸(也称为2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸)转化为2-乙偶姻并释放CO2。术语“ALDC”和“ALDC酶”在此可以互换使用。
乙酰乳酸脱羧酶催化酶酶反应，属于分类EC 4.l.l.5(乙酰乳酸脱羧酶活性)和基因本体论(GO)术语ID GO:0047605。GO术语ID(GO term ID)规定任何特征为具有该相关GO术语的蛋白质编码具有催化乙酰乳酸脱羧酶活性的酶。
编码乙酰乳酸脱羧酶的各种乙酰乳酸脱羧酶基因(如alsD或aldB))是本领域已知的。编码ALDC酶的alsD基因可以是从枯草芽孢杆菌衍生的或可从其衍生的。编码ALDC酶的aldB基因可以是从短小芽孢杆菌衍生的或可从其衍生的。编码ALDC酶的alsD基因可以是从地衣芽孢杆菌衍生的或可从其衍生的。UNIPROT登录号Q65E52.1是ALDC酶的实例。UNIPROT登录号Q65E52.1是从地衣芽孢杆菌衍生的或可从其衍生的ALDC酶的实例。乙酰乳酸脱羧酶基因的实例包括但不限于gi|375143627|ref|YP_005006068.1|乙酰乳酸脱羧酶[Niastella koreensis OR20-10]；gi|361057673|gb|AEV96664.1|乙酰乳酸脱羧酶[Niastella koreensis OR20-10]；gi|218763415|gb|ACL05881.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans AK-01]；gi|220909520|ref|YP_002484831.1|乙酰乳酸脱羧酶[蓝杆藻属物种(Cyanothece sp.)PCC 7425]；gi|218782031|ref|YP_002433349.1|乙酰乳酸脱羧酶[Desulfatibacillum alkenivorans AK-01]；gi|213693090|ref|YP_002323676.1|乙酰乳酸脱羧酶[长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697＝JCM 1222]；gi|189500297|ref|YP_001959767.1|乙酰乳酸脱羧酶[褐杆状绿菌(Chlorobium phaeobacteroides)BS1]；gi|189423787|ref|YP_001950964.1|乙酰乳酸脱羧酶[可爱地杆菌(Geobacter lovleyi)SZ]；gi|172058271|ref|YP_00181473l.1|乙酰乳酸脱羧酶[戟叶鹅绒藤微杆菌(Exiguobacterium sibiricum)255-15]；gi|163938775|ref|YP_001643659.1|乙酰乳酸脱羧酶[韦氏芽孢杆菌(Bacillusweihenstephanensis)KBAB4]；gi|158522304|ref|YP_001530174.1|乙酰乳酸脱羧酶[石油脱硫球菌(Desulfococcus oleovorans)Hxd3]；gi|57371670|ref|YP_001479659.1|乙酰乳酸脱羧酶[变形斑沙雷菌(Serratia proteamaculans)568]；gi|150395111|ref|YP_001317786.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcus aureussubsp.aureus)JHl]；gi|150394715|ref|YP_001317390.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)JH1]；gi|146311679|ref|YP_001176753.1|乙酰乳酸脱羧酶[肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)638]；gi|109900061|ref|YP_663316.1|乙酰乳酸脱羧酶[大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)T6c]；gi|219866131|gb|ACL46470.1|乙酰乳酸脱羧酶[蓝杆藻属物种(Cyanothece sp.)PCC 7425]；gi|213524551|gb|ACJ53298.1|乙酰乳酸脱羧酶[长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697＝JCM 1222]；gi|189420046|gb|ACD94444.1|乙酰乳酸脱羧酶[可爱地杆菌(Geobacter lovleyi)SZ]；gi|158511130|gb|ABW68097.1|乙酰乳酸脱羧酶[石油脱硫球菌(Desulfococcus oleovorans)Hxd3]；gi|157323434|gb|ABV42531.1|乙酰乳酸脱羧酶[变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)568]；gi|145318555|gb|ABP60702.1|乙酰乳酸脱羧酶[肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)638]；gi|1499475631gb|ABR53499.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)JH1]；gi|149947167|gb|ABR53103.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcusaureussubsp.aureus)JH1]；gi|163860972|gb|ABY42031.1|乙酰乳酸脱羧酶[韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)KBAB4]；gi|109702342|gb|ABG42262.1|乙酰乳酸脱羧酶[大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c]；gi|189495738|gb|ACE04286.1|乙酰乳酸脱羧酶[褐杆状绿菌(Chlorobium phaeobacteroides)BS1]；gi|171990792|gb|ACB61714.1|乙酰乳酸脱羧酶[戟叶鹅绒藤微杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)255-15]；gi|223932563|ref|ZP_03624564.1乙酰乳酸脱羧酶[猪链球菌(Streptococcus suis)89/1591]；gi|194467531|ref|ZP_03073518.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)100-23]；gi|223898834|gb|EEF65194.1|乙酰乳酸脱羧酶[猪链球菌(Streptococcus suis)89/1591]；gi|194454567|gb|EDX43464.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)100-23]；gi|384267135|ref|YP_005422842.1|乙酰乳酸脱羧酶[解淀粉芽孢杆菌植物乳杆菌亚种(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)YAU B9601-Y2]；gi|375364037|ref|YP_005132076.1|乙酰乳酸脱羧酶[解淀粉芽孢杆菌植物乳杆菌亚种(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)CAU B946]；gi|34079323|ref|YP_004758694.1|乙酰乳酸脱羧酶[可变棒状杆菌(Corynebacterium variabile)DSM 44702]；gi|336325119|ref|YP_004605085.1|乙酰乳酸脱羧酶[抵抗棒状杆菌(Corynebacterium resistens)DSM45100]；gi|148269032|ref|YP_001247975.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)JH9]；gi|148268650|ref|YP_001247593.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)JH9]；gi|1485433721|ref|YP_001270742.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM 20016]；gi|380500488|emb|CCG51526.1|乙酰乳酸脱羧酶[解淀粉芽孢杆菌植物乳杆菌亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)YAUB9601-Y2]；gi|371570031|emb|CCF06881.1|乙酰乳酸脱羧酶[B解淀粉芽孢杆菌植物乳杆菌亚种(acillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)CAU B946]；gi|340533141|gb|AEK35621.1|乙酰乳酸脱羧酶[可变棒状杆菌(Corynebacterium variabile)DSM 44702]；gi|336101101|gb|AE108921.1|乙酰乳酸脱羧酶[抵抗棒状杆菌(Corynebacteriumresistens)DSM 45100]；gi|148530406|gb|ABQ82405.1|乙酰乳酸脱羧酶[罗伊氏乳杆菌((Lactobacillus reuteri)DSM 20016]；gi|147742101|gb|ABQ50399.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种((Staphylococcus aureus subsp.aureus)JH9]；gi|147741719|gb|ABQ50017.1|乙酰乳酸脱羧酶[金黄色葡萄球菌金黄色亚种((Staphylococcus aureus subsp.aureus)JH9]；gi|392529510|ref|ZP_10276647.1|乙酰乳酸脱羧酶[Carnobacterium maltaromaticum ATCC 35586]；gi|366054074|ref|ZP_09451796.1|乙酰乳酸脱羧酶[Lactobacillus suebicus KCTC 3549]；gi|339624147|ref|ZP_08659936.1|乙酰乳酸脱羧酶[Fructobacillus jructosus KCTC 3544]；和gi|336393727|ref|ZP_08575126.1|乙酰乳酸脱羧酶[棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.torquens)KCTC 3535]。UNIPROT登录号P23616.1(Diderichsen等人，J Bacteriol.[细菌学杂志](1990)172(8):4315)是ALDC酶的实例。UNIPROT登录号P23616.1是从短小芽孢杆菌衍生的或可从其衍生的ALDC酶的实例。与前述登录号相关的每个序列通过引用结合在此。
在一些实施例中，本发明涉及来自干酪乳杆菌(Godtfredsen 1984)、乙酰短杆菌(Oshiro，1989)、乳酸乳球菌(Vincent Phalip 1994)、乳明串珠菌(O sulivan，2001)、产气肠杆菌(Blomquist，1993)、枯草芽孢杆菌(Renna，1993)、短小芽孢杆菌(Svendsen，1989)和乳酸乳球菌DX(Yuxing，2014)的ALDC酶。在一些实施例中，所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。如在此使用的，术语“ALDC酶来自”是指ALDC酶衍生自或可衍生自。
应当理解的是根据本发明可以使用任何适合的ALDC酶，即由活性依赖于金属离子的任何微生物产生的ALDC。在一些实施例中，在此描述的方法和组合物中使用的ALDC是来自短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的ALDC。
根据本发明的酶组合物的ALDC活性通过如本文所述的ALDC测定法或本领域已知的任何合适的测定法来测量。通常，标准测定法在pH 6.0下进行，并且对于另外的特征和规格的酶的测定法可以在不同pH值和温度下进行。
将一个单位的ALDC活性定义为在测定条件(例如，pH 6.0(或按照说明)和30℃)下产生1μmol乙偶姻/分钟的酶的量。
在一些实施例中，所述ALDC酶包含以下氨基酸序列或其任何功能片段，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。本发明的一个方面涉及展示ALDC活性的酶，所述酶包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。在一些实施例中，所述ALDC酶由以下核酸序列或其任何功能片段编码，所述核酸序列与SEQID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在此使用的术语“核酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”是可互换的。
在一些实施例中，所述酶具有在5℃-80℃的范围内的最适温度，如在5℃-40℃或15℃-80℃的范围内，如在20℃-80℃的范围内，如在5℃-15℃、10℃-40℃、10℃-50℃、15℃-20℃、45℃-65℃、50℃-65℃、55℃-65℃或60-80℃的范围内。在一些实施例中，所述酶具有在45℃-65℃的范围内的最适温度。在一些实施例中，所述酶具有约60℃的最适温度。
在一些实施例中，所述酶的氨基酸总数小于350、例如小于340、例如小于330、例如小于320、例如小于310、例如小于300个氨基酸，例如在200至350个氨基酸的范围内，例如在220至345个氨基酸的范围内。
在一些实施例中，所述酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一个氨基酸序列或其任何功能片段相比具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。
在一些实施例中，所述酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一个氨基酸序列或其任何功能片段相比具有至多一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。
在一些实施例中，所述酶包含通过SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8中任一个鉴定的氨基酸序列或其任何功能片段。
在一些实施例中，所述酶由通过SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8中任一个鉴定的氨基酸序列或其任何功能片段组成。
在一些实施例中，根据本发明的ALDC组合物、培养基和方法包含任何一种或多种另外的酶。在一些实施例中，所述一种或多种另外的酶选自由以下各项组成的列表：乙酰乳酸还原异构酶(reductoisomerases)、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、和木聚糖乙酰酯酶)、β-葡糖苷酶和蛋白酶。
在一些实施例中，根据本发明的组合物、培养基和方法包含显示ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在950至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，根据本发明的组合物、培养基和方法包含显示ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在1000至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，根据本发明的组合物、培养基和方法包含显示ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，显示ALDC活性的酶是包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、和SEQ ID NO:8中任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段的酶。在一些实施例中，显示ALDC活性的酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的核酸序列或其任何功能片段编码。
宿主
在一个方面，本发明提供具有一种或多种遗传改变的宿主细胞，这些遗传改变给出增加的ALDC酶产量和/或产生具有增加的稳定性和/或活性的ALDC酶。术语“包含遗传改变的宿主细胞”、“宿主细胞包含遗传改变”、“变体宿主细胞”、“变体菌株”、“变体”、“宿主细胞”和“微生物”在此可以互换使用。如在此使用的，术语“遗传改变”是指与亲本宿主细胞相比，具有至少一种遗传改变的宿主细胞；典型地，遗传改变是对宿主细胞的基因组的修饰。宿主细胞中的遗传改变可以是自发突变和/或遗传工程(例如用载体转化细胞或从基因组去除特定基因)的结果。遗传改变的实例包括与亲本细胞相比，导致变体菌株的细胞产生减少的量的至少一种内源蛋白酶的遗传改变。在一个实施例中，与亲本菌株相比，所述变体菌株被进一步修饰以包含编码ALDC酶的异源核酸序列。在一个实施例中，所述亲本菌株包含编码ALDC酶的异源核酸序列。在一个实施例中，与亲本菌株相比，所述变体菌株已被修饰以过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。在一个实施例中，用与亲本菌株相比导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列的核酸转化变体菌株。如在此使用的，术语“过量表达(overexpressing、overexpression和overexpress)”是指当在相同的允许编码ALDC的核酸序列的表达的条件下培养时，与在亲本菌株中编码ALDC酶的核酸序列的表达相比，在变体菌株中编码ALDC酶的核酸序列的表达增加。例如，变体菌株中编码ALDC酶的核酸序列的表达比亲本菌株中编码ALDC酶的核酸序列的表达高至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。不希望受理论束缚，当与亲本菌株中的ALDC酶的产生相比时，在宿主细胞中编码ALDC酶的内源核酸序列的过量表达导致宿主细胞中ALDC酶的产生增加。可以通过筛选与亲本细胞相比具有降低的蛋白酶活性和/或蛋白酶功能的细胞来鉴定宿主细胞。遗传改变可以破坏，例如编码蛋白酶的一种或多种基因。由此类基因编码的蛋白酶的实例包括：wprA、vpr、epr、ispA、bpr、nprE、aprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。遗传改变可以破坏，例如编码蛋白酶的基因的调节序列(例如启动子)或能够调节蛋白酶的表达的核酸序列。不希望受理论束缚，所述破坏可以导致全部或部分基因和/或调节序列的缺失。该遗传改变可以例如由将核酸序列引入宿主细胞引起，所述核酸序列编码能够结合至编码蛋白酶的核酸序列、或者该能够调节蛋白酶的表达的核酸序列的反义核酸序列。该遗传改变可以是，例如，编码蛋白酶(如WprA、Vpr、Epr、IspA、Bpr、NprE、AprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD)的一种或多种基因的全部或部分的缺失、或能够调节编码蛋白酶的基因的表达的核酸序列的全部或部分的缺失。该遗传改变可以是，例如，编码蛋白酶的基因的调节序列(例如启动子)的缺失、或能够调节蛋白酶的表达的核酸序列的缺失。该遗传改变可以是包含，例如，编码蛋白酶的基因的基因组DNA的部分的缺失、或能够调节编码蛋白酶的基因的表达的核酸序列的部分的缺失。与ALDC酶的产量连用的术语“提高的”和术语“增加的”是指，与培养亲本宿主细胞时产生的具有ALDC活性的蛋白质的量相比，在相同条件(例如相同的时间和温度)下培养具有遗传改变的宿主细胞时产生的(回收的)具有ALDC活性的蛋白质的量增加。如在此使用的，术语“更好的稳定性”和“增加的稳定性”是指，与培养亲本宿主细胞时产生的ALDC酶的ALDC活性相比，在相同的条件(例如相同的温度)下培养具有遗传改变的宿主细胞时产生的ALDC酶的ALDC活性保持更长的时间。如在此使用的，术语“更好的活性”和“增加的活性”是指，与培养亲本菌株时产生的ALDC酶的ALDC活性相比，在相同条件(例如相同的时间和温度)下培养具有遗传改变的宿主细胞产生的ALDC酶具有增加的ALDC活性。如在此使用的，与蛋白酶连用的术语“减少的量”是指，与培养亲本菌株时产生的蛋白酶的量相比，在相同的条件下培养具有遗传改变的宿主细胞时产生的蛋白酶的量是减少的。如在此使用的，与功能性蛋白酶连用的术语“减少的量”是指，与培养亲本菌株时产生的蛋白酶的量和/或活性相比，在相同的条件下培养具有遗传改变的宿主细胞时产生的蛋白酶的量和/或活性是减少的。蛋白酶的活性由如在此描述的蛋白酶测定(例如酪蛋白点板测定)或本领已知的任何适合的测定进行测量。在一些实施例中，使用在实例中描述的酪蛋白测定，孵育2天、5天或10天之后，根据本发明的宿主细胞没有明显的光环形成。
在一些实施例中，所述ALDC酶是来自干酪乳杆菌(Godtfredsen 1984)、乙酰短杆菌(Oshiro，1989)、乳酸乳球菌(Vincent Phalip 1994)、乳明串珠菌(O sulivan，2001)、产气肠杆菌(Blomquist，1993)、枯草芽孢杆菌(Renna，1993)、短小芽孢杆菌(Svendsen，1989)和乳酸乳球菌DX(Yuxing，2014)的ALDC酶。
在一些实施例中，所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。在一些实施例中，所述ALDC酶是来自短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的ALDC。
在一个实施例中，提供从亲本宿主细胞衍生的或可从其衍生的变体宿主细胞。在一个方面，所述变体宿主细胞包含一种或多种遗传改变，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量一种或多种蛋白酶；优选地，所述蛋白酶选自：WprA、Vpr、Epr、IspA、Bpr、NprE、AprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。此类宿主细胞在此可以称为“蛋白酶缺陷型(protease deficient)”或“蛋白酶负性菌株(protease minus strain)”。在一个方面，所述变体宿主细胞包含编码异源ALDC酶的核酸序列。在一个方面，所述变体宿主细胞包含一种或多种遗传改变，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。在一个方面，所述变体宿主细胞包含核酸，与亲本细胞相比，所述核酸导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。在一个方面，提供衍生自亲本细胞的变体宿主细胞，所述变体宿主细胞包含遗传改变，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性蛋白酶，其中所述蛋白酶能够切割ALDC酶的C-末端和/或N-末端。如在此使用的，术语“所述蛋白酶能够切割ALDC酶的C-末端和/或N-末端”是指该蛋白酶在C-末端和/或N-末端切割ALDC酶。例如，所述蛋白酶可以在对应于SEQ ID NO 5、SEQ ID No 2或SEQ ID No 7的氨基酸位置275或276的氨基酸位置处切割ALDC酶；此外或可替代地，所述蛋白酶可以在对应于SEQ ID NO 5、SEQ ID No 2或SEQ ID No 7的氨基酸位置37、38、39、40、42或43的氨基酸位置处切割ALDC酶。SEQ ID NO 5、SEQ ID No 2或SEQ ID No 7的位置275或276处的氨基酸是ALDC的C-末端。SEQ ID NO 5、SEQ ID No 2或SEQ ID No 7的位置37、38、39、40、42或43处的氨基酸是ALDC的N-末端。在此提及的蛋白酶能够从ALDC酶的C-末端切割序列QVHQAESERK，如与SEQID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7显示的序列具有至少80％同一性的ALDC。术语“剪切”和“切割”在此可以互换使用。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQID No:2或SEQ ID No:7的相应的C-末端位置275处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的C-末端位置276处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置37处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置38处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置39处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置40处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQID No:7的相应的N-末端位置42处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ IDNo:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置43处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置39处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶是中性金属蛋白酶。NprE是中性金属蛋白酶的实例。在一些实施例中，所述蛋白酶是嗜热菌蛋白酶。嗜热菌蛋白酶可以用于谷蛋白水解和/或在谷物加工中使用。
在一些实施例中，所述宿主细胞是细菌宿主，如芽孢杆菌。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，通过培养枯草芽孢杆菌产生所述ALDC酶。
在一些实施例中，本发明提供包含遗传改变的变体宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供包含遗传改变的变体宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。如在此使用的，术语“细胞壁相关的蛋白酶”和“WprA”可以与术语“细胞壁蛋白酶”和“wprA”互换使用。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，所述遗传改变包含亲本菌株中存在的wprA基因的破坏。在一些实施例中，wprA基因的破坏是全部或部分wprA基因的缺失的结果。在一些实施例中，wprA基因的破坏是全部或部分包含wprA基因的基因组DNA的缺失的结果。在一些实施例中，wprA基因的破坏是wprA基因诱变的结果。
在一些实施例中，使用位点特异性重组进行wprA基因的破坏。在一些实施例中，与在wprA基因的遗传基因座处引入选择性标志(如例如壮观霉素抗性基因)组合，进行wprA基因的破坏。
在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性wprA蛋白质。在一些实施例中，变体菌株不产生wprA蛋白质。
在一些实施例中，通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现WprA蛋白质的量的减少。
在一些实施例中，本发明提供包含遗传改变的变体宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供包含遗传改变的变体宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。如在此使用的，术语“胞外丝氨酸蛋白酶”和“vpr”可以与术语“较小胞外丝氨酸蛋白酶”、“Vpr”、“epr”和“Epr”互换使用。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，所述遗传改变包含亲本菌株中存在的vpr基因的破坏。在一些实施例中，vpr基因的破坏是全部或部分vpr基因的缺失的结果。在一些实施例中，vpr基因的破坏是全部或部分包含vpr基因的基因组DNA缺失的结果。在一些实施例中，vpr基因的破坏是vpr基因诱变的结果。
在一些实施例中，使用位点特异性重组进行vpr基因的破坏。在一些实施例中，与在vpr基因的遗传基因座处引入选择性标志(如例如卡那霉素抗性基因)组合，进行vpr基因的破坏。
在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性vpr蛋白质。在一些实施例中，所述变体菌株不产生vpr蛋白质。
在一些实施例中，通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现Vpr蛋白质的量的减少。
在一些实施例中，本发明提供包含遗传改变的变体宿主细胞，与亲本细胞相比，所述变体导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)和功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)两者，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供包含遗传改变的变体宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)和功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)两者，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，通过在此描述的任何方法或通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现蛋白质的量的减少。在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性Vpr和WprA蛋白质。在一些实施例中，所述变体菌株不产生Vpr和WprA蛋白质。
在一些实施例中，所述宿主细胞还具有遗传改变，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、和内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)两者，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞还具有遗传改变，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、和内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)两者，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，通过在此描述的任何方法或通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现蛋白质的量的减少。在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性NprE和AprE蛋白质。在一些实施例中，所述变体菌株不产生NprE和AprE蛋白质。
在一些实施例中，所述宿主细胞还具有减少的量的内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。如在此使用的，术语“缺乏”与术语“减少的量”可互换。在另外的实施例中，所述宿主细胞还缺乏内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)之一或两者。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，通过在此描述的任何方法或通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现蛋白质的量的减少。在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性Epr、IspA和Bpr蛋白质。在一些实施例中，所述变体菌株不产生Epr、IspA和Bpr蛋白质。
在一些实施例中，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，通过在此描述的任何方法或通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现蛋白质的量的减少。在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性AprE、NprE、Vpr、Epr、IspA和Bpr蛋白质。在一些实施例中，所述变体菌株不产生AprE、NprE、Vpr、Epr、IspA和Bpr蛋白质。
在一些实施例中，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，通过在此描述的任何方法或通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现蛋白质的量的减少。在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性AprE、NprE、WprA、Epr、IspA和Bpr蛋白质。在一些实施例中，所述变体菌株不产生AprE、NprE、WprA、Epr、IspA和Bpr蛋白质。
在一些实施例中，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、内源杆菌肽酶F酶(Bpr)、和内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，通过在此描述的任何方法或通过本领域已知的任何适合的方法(例如反义RNA)实现蛋白质的量的减少。在一些实施例中，所述变体菌株不产生功能性AprE、NprE、WprA、Vpr、Epr、IspA和Bpr蛋白质。在一些实施例中，所述变体菌株不产生AprE、NprE、WprA、Vpr、Epr、IspA和Bpr蛋白质。
在另外的实施例中，所述宿主细胞还具有减少的量的一种或多种另外的蛋白酶，如ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO、ywaD，或本领域技术人员已知的其他蛋白酶。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
此外，本发明提供组合物，所述组合物包含通过培养如在此描述的宿主产生的ALDC酶，其中所述组合物具有减少的量的芽孢杆菌蛋白酶活性。在一些实施例中，所述组合物包含小于0.50U/ml蛋白酶活性，优选小于0.05U/ml蛋白酶活性，并且更优选小于0.005U/ml蛋白酶活性。在一些实施例中，使用在实例中描述的酪蛋白测定，孵育10天之后，所述组合物没有明显地光环形成。在一些实施例中，本发明提供组合物，所述组合物包含通过培养如在此描述的宿主产生的ALDC酶，其中所述组合物基本上没有芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶(AprE)污染。在一些优选的实施例中，与其ALDC酶相比，所述AprE污染占按重量计小于约1％。在一些优选的实施例中，所述AprE污染包含小于0.50U/ml丝氨酸蛋白酶活性，优选地小于0.05U/ml丝氨酸蛋白酶活性，并且更优选地小于0.005U/ml丝氨酸蛋白酶活性。在一些特别优选的实施例中，所述ALDC组合物进一步包含选自以下的至少一种另外的酶或酶衍生物：乙酰乳酸还原异构酶、乙酰乳酸异构酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶、木聚糖酶辅助(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、和木聚糖乙酰酯酶)、β-葡糖苷酶和蛋白酶。在一些实施例中，所述组合物包含至少约0.0001重量百分比的ALDC酶，并且优选地包含从约0.001至约5.0重量百分比的ALDC酶。在一些实施例中，所述组合物包含至少约0.01至约3.0重量百分比的ALDC酶。在一些实施例中，所述组合物包含至少约0.5至约2.0重量百分比的ALDC酶。在一些实施例中，所述组合物包含至少约0.8至约1.0重量百分比的ALDC酶。
在一些实施例中，根据本发明的组合物和方法包含显示ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在约950至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，根据本发明的组合物和方法包含显示ALDC活性的酶，其中所述ALDC酶的活性在约1000至2500单位/mg蛋白质或约1500至2500单位/mg蛋白质的范围内。在一些实施例中，显示ALDC活性的酶包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
在一些实施例中，将ALDC酶用戊二醛或已经用戊二醛处理以形成ALDC衍生物。在一些实施例中，将ALDC酶用相应于每克纯ALDC酶约0.1g至约5g的戊二醛浓度的戊二醛处理或已经用戊二醛处理。
在一些实施例中，在此描述的ALDC酶组合物在饮料制备过程(例如啤酒、红酒、苹果酒、或梨酒、或日本米酒)的发酵和/或成熟期间使用以减少二乙酰水平。
如本文所使用的，术语“饮料”和“饮料产品”包括诸如以下的形成泡沫的发酵饮料：用100％麦芽酿造的啤酒、在不同类型的条规下酿造的啤酒、浓啤酒、干啤酒、薄啤酒、低度啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性黑啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等。术语“饮料”或“饮料产品”还包括不起泡啤酒和替代性的麦芽饮料，例如水果风味的麦芽饮料，例如柑橘风味的(例如柠檬风味的、橙子风味的、酸橙风味的或浆果风味的)麦芽饮料，酒风味的麦芽饮料(例如伏特加酒风味的、朗姆酒风味的或龙舌兰酒风味的麦芽酒)，或咖啡风味的麦芽饮料(例如咖啡因风味的麦芽酒)等等。术语“饮料”或“饮料产品”还包括用可替代材料而不是发芽的大麦(如黑麦、玉米、燕麦、大米、粟、黑小麦、木薯、小麦、大麦、高粱及其组合)制成的啤酒。术语“饮料”或“饮料产品”还包括其他发酵的产品，如红酒或苹果酒或梨酒或日本米酒。
啤酒传统上被称为来源于麦芽(例如来源于大麦谷粒的麦芽)和任选地辅料(例如含淀粉的植物材料(例如谷物颗粒))和任选地调味的(例如用啤酒花调味的)的酒精饮料。在本发明的上下文中，术语“啤酒”包括任何通过含有淀粉植物材料的发酵/酿造生产的发酵麦芽汁，因此具体而言还包括专门从辅料生产或者从麦芽和辅料的任何组合生产的啤酒。可以通过基本上相同的方法从各种含淀粉的植物材料制成啤酒，其中淀粉主要由葡萄糖均聚物组成，其中葡萄糖残基通过α-1,4-键或α-1,6-键连接，前者占主导地位。啤酒可以从可替代材料(如黑麦、玉米、燕麦、大米、粟、黑小麦、木薯、小麦、大麦、高粱及其组合)制备。
方法
在一些方面，本发明提供改善从微生物回收ALDC的方法。在其他方面，本发明提供在本文描述的宿主细胞中产生ALDC的方法。
在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性蛋白酶，其中所述蛋白酶能够切割ALDC酶的C-末端和/或N-末端，并且核酸与启动子有效组合以编码异源ALDC酶；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的C-末端位置275处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ IDNo:7的相应的C-末端位置276处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置37处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置38处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置39处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ IDNo:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置40处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置42处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQ ID No:7的相应的N-末端位置43处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5或SEQ ID No:2或SEQID No:7的相应的N-末端位置39处进行切割。在一些实施例中，所述蛋白酶是中性金属蛋白酶。在一些实施例中，所述蛋白酶是嗜热菌蛋白酶。
在一些实施例中，所述方法进一步包括收获产生的异源ALDC酶的步骤。
在一些实施例中，所述宿主细胞是细菌宿主，如芽孢杆菌。在一些实施例中，通过培养枯草芽孢杆菌产生所述ALDC酶。
在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致变体菌株的细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；并且在适合于产生ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致变体菌株的细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；并且在适合于产生ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)和功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)两者，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的功能性胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)和功能性内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)两者，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致变体菌株的细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；并且在适合于产生ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供进一步包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)和内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)两者，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供方法，所述方法包括：提供进一步包含遗传改变的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致变体菌株的细胞产生减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)和内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)两者，其中宿主细胞用核酸转化，所述核酸导致变体菌株的细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；并且在适合于产生ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，所述宿主细胞还具有减少的量的内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。在另外的实施例中，所述宿主细胞还缺乏内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)之一或两者。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，本发明包括方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，本发明包括方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致变体菌株的细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；并且在适合于产生ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，本发明包括方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)，其中所述宿主细用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，本发明包括方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致变体菌株的细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；并且在适合于产生ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，本发明包括方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、内源杆菌肽酶F酶(Bpr)、和内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，其中用与启动子有效组合以编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；并且在适合于产生异源ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，本发明包括方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、内源杆菌肽酶F酶(Bpr)、和内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致变体菌株的细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；并且在适合于产生ALDC酶的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在另外的实施例中，所述宿主细胞还具有减少的量的一种或多种另外的蛋白酶，如ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO、ywaD，或本领域技术人员已知的其他蛋白酶。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌。在一些实施例中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
在一些实施例中，在本披露中提供产生乙偶姻的方法。在一些实施例中，在本披露中提供分解乙酰乳酸的方法。这些方法涉及用如在此描述的ALDC酶组合物处理底物的步骤。
在一些实施例中，ALDC酶包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
在一些实施例中，在本披露中提供在产生发酵的饮料期间产生乙偶姻的方法。在一些实施例中，在本披露中提供在产生发酵的饮料期间分解乙酰乳酸的方法。
发酵的产品
在一个方面，本发明涉及通过用微生物发酵含碳水化合物底物来产生具有低二乙酰含量的发酵的酒精产品的方法。如在此使用的，具有“低二乙酰含量”的发酵的酒精产品是指，与在不存在在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物时，通过发酵含碳水化合物底物产生的发酵的酒精产品相比，在相同的发酵条件(例如相同的温度并持续相同长的时间)下，通过用如在此描述的宿主细胞和/或如在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物发酵含碳水化合物底物产生的发酵的酒精产品(例如啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒)中所述二乙酰水平较低。具有低二乙酰含量的发酵的酒精产品的实例是其中二乙酰水平小于约1ppm和/或二乙酰水平低于约0.5mg/L的发酵的酒精产品。在一个实施例中，所述二乙酰水平小于约0.5ppm、或小于约0.1ppm、或小于约0.05ppm、或小于约0.01ppm、或小于约0.001ppm。在一个实施例中，所述二乙酰水平约小于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或约小于0.01mg/L、或约小于0.001mg/L。
当用酵母和其他微生物发酵含碳水化合物底物(如麦芽汁(例如具有低麦芽糖的麦芽汁))内容物有或水果汁(如葡萄汁、苹果汁或梨汁)时，除了乙醇发酵外还发生各种过程，这些过程可以导致产生不希望的副产物，例如产生在非常低的浓度下具有强烈的和不愉快的气味的二乙酰。如果二乙酰含量显著超过了某些限度，例如在一些啤酒中约0.1ppm的情况下，酒精饮料(如啤酒或红酒或苹果酒或梨酒或日本米酒)因而会具有不能接受的芳香和风味。
二乙酰的形成在乙醇的工业生产中也是不利的，因为难以通过蒸馏从乙醇中分离二乙酰。在通过与苯共沸蒸馏脱乙醇来制备无水乙醇中出现了具体的问题。在共沸蒸馏期间，二乙酰将在苯相中累积，这可以产生二乙酰和苯的混合物，这使得难以回收用于共沸蒸馏的苯。
啤酒的常规酿造包含用适当种类的酵母(如酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)或卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis))发酵麦芽汁。
典型地常规酿造中，发酵通常通过两个步骤进行，主发酵时间通常为5至12天，后发酵(所谓的成熟过程)可能需要长达12周。在主发酵期间，麦芽汁中的大多数碳水化合物转化为乙醇和二氧化碳。成熟通常在低残留量的酵母的存在下在低温下进行。成熟的目的尤其是沉淀不需要的高分子量化合物，并将不希望的化合物转化成不影响风味和芳香的化合物(如二醇)。例如丁二醇，啤酒中的乙酰乳酸和二乙酰转化的最终产物，典型地被报道为具有中性感官特征的化合物。
在一些方面，本发明涉及在此描述的宿主细胞和/或在此描述的组合物在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒的发酵中的用途。在一些实施例中，本发明包含使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC组合物在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间分解乙酰乳酸的用途。此外，本发明包括使用在此描述的宿主细胞和/或根据描述的ALDC衍生物在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间分解乙酰乳酸的用途。
在一些实施例中，本发明的方法的特征在于在发酵过程期间或在发酵过程继续(例如成熟)期间，用如在此描述的宿主细胞和/或包含在此描述的ALDC或ALDC衍生物的组合物处理底物。
因此，在一些实施例中，乙酰乳酸酯被酶促脱羧为乙偶姻，结果是在不希望的时候，避免了从乙酰乳酸形成二乙酰。在一些实施例中，其他酶与宿主细胞和/或ALDC组合用于转化α-乙酰乳酸。此类酶的实例包括但不限于乙酰乳酸还原异构酶或异构酶。
在一些实施例中，在分批发酵中，将在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物与普通酵母一起使用。
代替使用处于游离状态的酶，它能够以固定化状态使用，在发酵期间或在发酵过程继续期间(例如，在成熟期间)将固定化酶加入到麦汁中。固定化酶还可以保持在发酵麦芽汁或啤酒通过的柱中。酶可以单独固定化，也可以使用共固定化的酵母细胞和乙酰乳酸脱羧酶。
在一些实施例中，在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平减少至低于约1ppm、或约小于0.5ppm、或约小于0.1ppm、或小于0.05ppm or小于0.01ppm、或约小于0.001ppm。在一些实施例中，在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平减少至低于0.1ppm。
在一些实施例中，在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将VDK含量减少至低于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或小于0.01mg/L或小于0.001mg/L。总VDK是指二乙酰加2,3-戊二酮的量。在一些实施例中，在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将总VDK含量减少至低于0.1mg/L。
在一些实施例中，在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平减少至低于约0.5mg/L、或约小于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或小于0.01mg/L或小于0.001mg/L。在一些实施例中，在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将二乙酰水平减少至低于0.1mg/L。
在一些实施例中，在啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵或成熟期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物以将其他连二酮水平减少至低于0.1mg/L、或约小于0.05mg/L、或小于0.01mg/L或小于0.001mg/L。
本发明的方法不仅可以被用于关于啤酒的酿造中，而且还适用于其中希望降低二乙酰水平或其他连二酮的水平的任何适合的酒精饮料(例如红酒、日本米酒、苹果酒、梨酒等)的生产中。在一些实施例中，本发明的方法可用于生产其中可获得类似优点的红酒，这些优点特别是成熟期的缩短和方法的简化。在此上下文中特别感兴趣的是使用乙酰乳酸转化与所谓的乳酸发酵有关的酶。这一过程受到为明串珠菌(Leuconostoc)、乳杆菌(Lactobacillus)或片球菌(Pediococcus)物种的微生物的影响，是在红酒的主发酵之后进行的，以便增加产品的pH以及其生物学稳定性并显露出红酒的风味。此外，由于其可以快速装瓶，所以进行发酵是高度希望的，从而大大地提高了酿酒厂的现金流。然而，不幸的是，所述方法可能由于二乙酰而引起异味，所述二乙酰的形成可以在乙酰乳酸转化酶的帮助下降低。
因此，在一些实施例中，与不使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比，提供本发明的方法以生产具有低二乙酰含量的酒精饮料，其中生产具有低二乙酰含量的酒精饮料需要的时间减少了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。在一些实施例中，与不使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比，提供本发明的方法以生产具有低二乙酰含量的酒精饮料，其中完全消除了成熟步骤。
在一些实施例中，与不使用在此描述的宿主细胞和/或使用在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比，在发酵过程(例如啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒发酵)中使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物使得发酵过程所需要的时间减少了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。在一些实施例中，与不使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比，提供本发明的方法以生产具有低二乙酰含量的酒精饮料，其中完全消除了成熟步骤。
在一些实施例中，与不使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比，在成熟或调节工艺过程(例如啤酒成熟/调节工艺)期间使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物使得成熟或调节工艺过程所需要的时间减少了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。在一些实施例中，与不使用在此描述的宿主细胞和/或在此描述的ALDC和/或ALDC衍生物组合物的方法相比，提供本发明的方法以生产具有低二乙酰含量的酒精饮料，其中完全消除了成熟步骤。
此外，在一些实施例中，在此描述的方法可以有利的用于乙醇的工业生产，因为在没有或实际上没有任何二乙酰含量的情况下获得了发酵产品，其简化了蒸馏过程，尤其是在共沸制备无水乙醇(即纯的无水乙醇)的情况下。
在一些实施例中，本发明提供用于产生啤酒和/或红酒和/或苹果酒和/或梨酒和/或日本米酒的方法，所述方法包括添加如在此描述的一种或多种宿主细胞和/或在此描述的ALDC酶/或ALDC衍生物组合物。
ALDC酶的产生
在一个方面，本发明涉及具有在此描述的ALDC酶的异源表达的宿主细胞。在另一个方面，所述宿主细胞包含在此描述的质粒或表达载体，优选地用在此描述的质粒或表达载体转化所述宿主细胞。在另一个方面，本发明涉及用核酸转化的宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列。
在一些实施例中，所述宿主细胞是细菌宿主，如芽孢杆菌。在一些实施例中，通过培养含有编码和表达ALDC酶的基因(例如短小芽孢杆菌的ALDC)的枯草芽孢杆菌菌株产生所述ALDC酶。此类宿主细胞及其培养的实例描述在DK149335B中。在一些实施例中，通过培养含有编码和过量表达ALDC酶的基因的枯草芽孢杆菌菌株产生所述ALDC酶。
适合的表达和/或整合载体的实例提供在Sambrook等人(1989)同上，和Ausubel(1987)同上，和van den Hondel等人(1991)，Bennett和Lasure(编)，More GeneManipulations In Fungi[真菌中更多基因操作]，学术出版社(Academic Press)，第396-428页以及美国专利号5,874,276中。还参考真菌遗传学库存中心菌株目录(FungalGenetics Stock Center Catalogue of Strains)(FGSC，http://www.fgsc.net)以获取载体列表。特别有用的载体包括从例如英杰公司(Invitrogen)和普洛麦格公司(Promega)获得的载体。用于细菌细胞的适合的质粒包括允许在大肠杆菌中复制的pBR322和pUC19，以及例如允许在芽孢杆菌中复制的pE194。适合用于大肠杆菌宿主细胞的其他具体的载体包括载体如pFB6、pBR322、pUC18、pUC100、pDONRTM201、10pDONRTM221、pENTRTM、3Z和4Z。
在一些实施例中，这些宿主细胞是革兰氏阳性菌细胞。非限制性实例包括链霉菌属(Streptomyces)(例如变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、和灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌的菌株。如在此使用的，“芽孢杆菌属”如本领域技术人员已知的包括在“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，所述属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”)的此类生物体。
在一些实施例中，所述宿主细胞是革兰氏阴性菌菌株，如大肠杆菌或假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)。在其他实施例中，所述宿主细胞可以是酵母细胞如酵母菌属物种(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、或假丝酵母属物种(Candida sp.)。在其他实施例中，所述宿主细胞将是遗传工程化的宿主细胞，其中内源基因已被灭活，例如通过在细菌或真菌细胞中的缺失。在希望获得具有一种或多种灭活基因的真菌宿主细胞的情况下，可以使用已知的方法(例如，披露在美国专利号5,246,853、美国专利号5,475,101、和WO 92/06209中的方法)。可以通过完全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式(使得该基因被阻止表达功能性蛋白)来完成基因灭活。在其他实施例中，所述宿主细胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶负性菌株。
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂质转染-介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。一般的转化技术是本领域已知的(参见例如Ausubel等人(1987)同上，chapter 9；和Sambrook等人(1989)同上，和Campbell等人，Curr.Genet.[现代遗传学]16:53-56(1989))。
用于芽孢杆菌的转化方法披露在许多参考文献中，包括Anagnostopoulos C.和J.Spizizen，J.Bacteriol.[细菌学杂志]1:741-746(1961)和WO 02/14490中。
在一个方面，本发明涉及分离如在此定义的ALDC酶的方法，所述方法包括以下步骤：在如在此定义的具有所述ALDC酶的异源表达的宿主细胞中诱导ALDC酶的合成，并回收由所述宿主细胞分泌的胞外蛋白质，以及任选地纯化ALDC酶。在一个方面，本发明涉及分离如在此定义的ALDC酶的方法，所述方法包括以下步骤：在如在此定义的具有所述ALDC酶的同源表达的宿主细胞中诱导ALDC酶的合成，并回收由所述宿主细胞分泌的胞外蛋白质，以及任选地纯化ALDC酶。在另外的方面，本发明涉及用于产生如在此定义的ALDC酶的方法，所述方法包括以下步骤：在如在此定义的具有所述ALDC酶的异源表达的宿主细胞中诱导ALDC酶的合成，并任选地纯化ALDC酶。在另外的方面，本发明涉及用于产生如在此定义的ALDC酶的方法，所述方法包括以下步骤：在如在此定义的具有所述ALDC酶的同源表达的宿主细胞中诱导ALDC酶的合成，并任选地纯化ALDC酶。在另外的方面，本发明涉及表达如在此定义的ALDC酶的方法，所述方法包括：获得如在此定义的宿主细胞、或如本领域普通技术人员已知的任何适合的宿主细胞，并且从所述宿主细胞表达ALDC酶，以及任选地纯化ALDC酶。在另一个方面，如在此定义的ALDC酶是主要分泌的蛋白质。
在一些实施例中，在ALDC产生期间和/或在ALDC产生之后，将金属离子如Zn2+、Mg2 +、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+及其组合添加至培养基中以增加ALDC的稳定性和/或以增加ALDC的活性。在一些实施例中，将金属离子添加至培养基，使得所述金属离子在所述培养基中以约1μM至约1mM，如约25μM至约150μM、或约40μM至约150μM、或约60μM至约150μM、或约25μM至约100μM、或约25μM至约50μM、或30μM至约40μM的浓度存在。在一些实施例中，在ALDC产生期间和/或在ALDC产生之后，将金属离子如Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+及其组合添加至培养基(如发酵和/或成熟培养基)以增加从微生物的回收产量和/或以增加ALDC的稳定性和/或以增加ALDC的活性。在一些实施例中，将金属离子添加至发酵和/或成熟培养基中，使得所述金属离子在所述培养基中以约1μM至约300μM，如约6μM至约300μM、约1μM至约100μM、约1μM至约50μM、约1μM至约25μM、或约6μM至约25μM的浓度存在。如在此使用的，术语“培养基”是指支持微生物(如产ALDC的宿主细胞)的生长的介质。培养基的实例包括：基于MOPs缓冲液的培养基，例如，尿素作为主要氮源以及玛尔特灵(maltrin)作为主要碳源；以及TSB肉汤。如在此使用的，术语“发酵培养基”是指包含含碳水化合物底物的培养基，这些底物可以通过酵母或其他微生物发酵以产生例如啤酒或红酒或苹果酒或梨酒或日本米酒。发酵培养基的实例包括：麦芽汁和水果汁(如葡萄汁、苹果汁或梨汁)。如在此使用的，术语“成熟培养基”是指包含含碳水化合物底物的培养基，这些底物已经通过酵母或其他微生物发酵以产生例如啤酒或红酒或苹果酒或梨酒或日本米酒。成熟培养基的实例包括部分地发酵的麦芽汁和水果汁(如葡萄汁、苹果汁或梨汁)。与添加有金属离子的培养基连用的术语“增加稳定性”是指，与培养基中不存在金属离子的ALDC酶的ALDC活性相比，金属离子(如Zn2+)存在下时酶的ALDC活性维持较长的一段时间。与添加有金属离子的培养基连用的术语“增加活性”是指，与培养基中不存在金属离子的ALDC酶的ALDC活性相比，金属离子(如Zn2+)存在下时酶具有增加的ALDC活性。与添加有金属离子的培养基中的ALDC酶的产量连用的术语“提高的”是指，与宿主微生物在不存在金属离子时产生的ALDC活性比较，宿主微生物在存在金属离子(如Zn2+)时产生的ALDC活性是增加的。不希望受理论束缚，可以在培养过程(如ALDC生产)期间和/或培养过程之后添加金属离子(如Zn2+)，以增加ALDC酶的稳定性和/或增加活性和/或增加产量。
在一些实施例中，本发明提供用于产ALDC的宿主细胞的培养基，所述培养基包含在约1μM至约1mM(如约25μM至约150μM、或约40μM至约150μM、或约60μM至约150μM、或约25μM至约100μM、或约25μM至约50μM、or 30μM至约40μM)的浓度的金属离子。在一些实施例中，本发明提供用于产ALDC的宿主细胞的培养基，所述培养基包含在约25μM至约100μM的浓度的金属离子。在一些实施例中，本发明提供用于产ALDC的宿主细胞的培养基，所述培养基包含在约25μM至约50μM的浓度的金属离子。在一些实施例中，所述金属离子选自：Zn2+、Mg2+、Mn2 +、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+和Fe2+及其组合。在一些实施例中，所述金属离子选自：Zn2+、Mn2+、和Co2+。在一些实施例中，所述金属离子选自：Zn2+、Cu2+、和Fe2+。在一些实施例中，所述金属离子是Zn2+。磷酸锌(ZnSO4)是Zn2+离子的来源的实例。硫酸镁(MgSO4)是Mg2+离子的来源的实例。硫酸锰(II)(MnSO4)是Mn2+离子的来源的实例。氯化钴(II)(CoCl2)是Co2+离子的来源的实例。硫酸铜(II)(CuSO4)是Cu2+离子的来源的实例。硫酸钡(BaSO4)是Ba2+离子的来源的实例。硫酸钙(CaSO4)是Ca2+离子的来源的实例。硫酸铁(II)(FeSO4)是Fe2+离子的来源的实例。在一些实施例中，所述ALDC酶的活性是在950至2500单位/mg的蛋白质的范围内。在一些实施例中，所述ALDC酶的是在1000至2500单位/mg的蛋白质或1500至2500单位/mg的蛋白质蛋白质的范围内。在此使用的，术语“产ALDC的宿主细胞”是指，当宿主细胞在允许编码ALDC的核酸序列表达的条件下培养时，能够表达ALDC酶的所述宿主细胞。编码ALDC酶的核酸序列可以与该宿主细胞异源或同源。如在此提及的“产ALDC宿主菌株”是蛋白酶缺陷或蛋白酶负性菌株。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是包含编码和表达ALDC酶的基因的枯草芽孢杆菌，其中所述ALDC酶包含与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是包含编码ALDC的核酸序列或其任何功能片段的枯草芽孢杆菌，其中所述编码ALDC的核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施例中，产ALDC的宿主细胞是包含编码ALDC的基因的、衍生自短小芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌。
实例
本披露在以下实例中进一步详细描述，所述实例不意欲以任何方式限制本披露所要求保护的范围。附图意在被考虑为本披露说明书和描述的组成分。提供下列实例以说明但不限制所要求保护的披露内容。
实例1-乙酰乳酸脱羧酶aldB的异源表达
先前鉴定了短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)(其也可以称为短小芽孢杆菌)乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)aldB基因(Diderichsen等人，J Bacteriol.[细菌学杂志](1990)172(8):4315)，序列如UNIPROT登录号P23616.1所列。此基因，aldB，的序列号描述于SEQ ID NO:1中。以粗体和下划线突出显示的核苷酸是编码信号肽的核苷酸。
SEQ ID NO:1列出了aldB基因的核苷酸序列：
gctacaacggctactgtaccagcaccacctgccaagcaggaatccaaacctgcggttgccgctaatccggcaccaaaaaatgtactgtttcaatactcaacgatcaatgcactcatgcttggacagtttgaaggggacttgactttgaaagacctgaagctgcgaggcgatatggggcttggtaccatcaatgatctcgatggagagatgattcagatgggtacaaaattctaccagatcgacagcaccggaaaattatcggagctgccagaaagtgtgaaaactccatttgcggttactacacatttcgagccgaaagaaaaaactacattaaccaatgtgcaagattacaatcaattaacaaaaatgcttgaggagaaatttgaaaacaagaacgtcttttatgccgtaaagctgaccggtacctttaagatggtaaaggctagaacagttccaaaacaaaccagaccttatccgcagctgactgaagtaaccaaaaaacaatccgagtttgaatttaaaaatgttaagggaaccctgattggcttctatacgccaaattatgcagcagccctgaatgttcccggattccatctccacttcatcacagaggataaaacaagtggcggacacgtattaaatctgcaatttgacaacgcgaatctggaaatttctccgatccatgagtttgatgtacaattgccgcacacagatgattttgcccactctgatctgacacaagttactactagccaagtacaccaagctgagtcagaaagaaaataa
SEQ ID NO:6列出了编码乙酰乳酸脱羧酶的核苷酸序列的实例-以粗体和下划线突出显示的核苷酸是编码信号肽的核苷酸：
accatcaatgatctcgatggagagatgattcagatgggtacaaaattctaccagatcgacagcaccggaaaattatccgagctgccagaaagtgtgaaaactccatttgcggttactacacatttcgagccgaaagaaaaaactacattaaccaatgtgcaagattacaatcaattaacaaaaatgcttgaggagaaatttgaaaacaagaacgtcttttatgccgtaaagctgaccggtacctttaagatggtaaaggctagaacagttccaaaacaaaccagaccttatccgcagctgactgaagtaaccaaaaaacaatccgagtttgaatttaaaaatgttaagggaaccctgattggcttctatacgccaaattatgcagcagccctgaatgttcccggattccatctccacttcatcacagaggataaaacaagtggcggacacgtattaaatctgcaatttgacaacgcgaatctggaaatttctccgatccatgagtttgatgtacaattgccgcacacagatgattttgcccactctgatctgacacaagttactactagccaagtacaccaagctgagtcagaaagaaaataa
由aldB基因编码的酶原描述于SEQ ID NO:2中。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP-NN(Emanuelsson等人，Nature Protocols[自然试验方案](2007)2:953-971)预测的长度为24个氨基酸的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO:2中加下划线并以粗体显示。信号肽的存在指示乙酰乳酸脱羧酶是分泌的酶。预测的完全加工的成熟链的序列(aldB，261个氨基酸)描述于SEQ ID NO:3中。
SEQ ID NO:2列出了乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)前体aldB的氨基酸序列：
ATTATVPAPPAKQESKPAVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDYNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERK
SEQ ID NO:7列出了乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)前体aldB的氨基酸序列的实例-信号肽序列加下划线并以粗体显示：
ATTATVPAPPAKQESKPVVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDYNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERK
SEQ ID NO:3列出了成熟乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)aldB的预测的氨基酸序列(261个氨基酸)：
ATTATVPAPPAKQESKPAVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDYNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERK
SEQ ID NO:8列出了成熟乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)aldB的预测的氨基酸序列的实例(261个氨基酸)：
ATTATVPAPPAKQESKPVVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDYNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERK
在枯草芽孢杆菌中使用由枯草芽孢杆菌aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列、成熟aldB和BPN’终止子组成的表达盒产生编码乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的aldB基因。将该盒克隆到基于pBN的复制穿梭载体(巴贝(Babe)等人(1998)，Biotechnol.Appl.Biochem.)27:117-124[生物技术与应用生物化学]中，并转化到枯草芽孢杆菌菌株中。
含有aldB基因(pBN-Bbrev-ssoU)的pBN载体的图显示于图1中。
为了生产aldB，将含有pBN-aldB的枯草芽孢杆菌转化体在15ml福尔肯(Falcon)管中在具有10ppm新霉素的TSB(肉汤)中培养16小时，并且将300μl该预培养物添加到500mL烧瓶中，所述烧瓶装有补充有10ppm新霉素的30mL培养基(如下所述)。随着在180rpm下的持续转动混合，将这些烧瓶在33℃下孵育24小时、48小时和72小时。通过在锥形管中以14500rpm离心20分钟来收获培养物。将培养上清液用于蛋白质测定和分析。培养基是基于MOPs缓冲液的富集的半定义培养基，以尿素为主要氮源，以葡萄糖为主要碳源，并补充有1％大豆蛋白胨用于稳健的细胞生长。
在质粒pBN-aldB中的aldB基因的核苷酸成熟序列描述于SEQ ID NO:4中
gctacaacggctactgtaccagcaccacctgccaagcaggaatccaaacctgcggttgccgctaatccggcaccaaaaaatgtactgtttcaatactcaacgatcaatgcactcatgcttggacagtttgaaggggacttgactttgaaagacctgaagctgcgaggcgatatggggcttggtaccatcaatgatctcgatggagagatgattcagatgggtacaaaattctaccagatcgacagcaccggaaaattatcggagctgccagaaagtgtgaaaactccatttgcggttactacacatttcgagccgaaagaaaaaactacattaaccaatgtgcaagattacaatcaattaacaaaaatgcttgaggagaaatttgaaaacaagaacgtcttttatgccgtaaagctgaccggtacttttaagatggtaaaggctagaacagttccaaaacaaaccagaccttatccgcagctgactgaagtaaccaaaaaacaatccgagtttgaatttaaaaatgttaagggaaccctgattggcttctatacgccaaattatgcagcagccctgaatgttcccggattccatctccacttcatcacagaggataaaacaagtggcggacacgtattaaatctgcaatttgacaacgcgaatctggaaatttctccgatccatgagtttgatgttcaattgccgcacacagatgattttgcccactctgatctgacacaagttactactagccaagtacaccaagctgagtcagaaagaaaa
从质粒pBN-aldB表达的aldB前体蛋白质的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:5中
vrskklwisllfaltliftmafsnmsaqaATTATVPAPPAKQESKPAVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDYNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERK
实例2-乙酰乳酸脱羧酶aldB的异源表达
来自短短芽孢杆菌菌株的aldB基因编码乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)，并在枯草芽孢杆菌中，使用由枯草芽孢杆菌aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列、成熟aldB和BPN’终止子组成的整合表达盒产生。将该盒相对于表达盒以头对头方向克隆，并且通过同源重组将aldB表达盒引入枯草芽孢杆菌中。
含有aldB基因(RIHI-aldB)的载体的图显示于图2中。
为了引入aldB，将含有aldB表达盒的枯草芽孢杆菌菌株转化体在15ml福尔肯管中在具有300ppmβ-氯-D-丙氨酸(CDA)的TSB(肉汤)中培养5小时，并将300μl的此预培养物添加至500mL烧瓶中，所述烧瓶中装有补充有300ppm CDA和50μM Zn2+的30mL的培养基(如下所述)。随着在180rpm下的持续转动混合，将这些烧瓶在33℃下孵育24小时、48小时和72小时。通过在锥形管中以14500rpm离心20分钟来收获培养物。将培养上清液用于蛋白质测定和分析。培养基是基于MOPs缓冲液的富集的半定义培养基，以尿素为主要氮源、玛尔特灵(麦芽糊精和玉米糖浆固体)为主要碳源。
实例3-蛋白质测定方法
通过标准无污渍成像仪(Stain Free Imager Criterion)进行蛋白质测定
使用Gel DocTMEZ成像系统通过SDS-PAGE凝胶和光密度法量化蛋白质。测定中使用的试剂：浓缩的(2x)Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(Bio-Rad)，目录#161-0737)；26孔XT4％-12％Bis-Tris凝胶(伯乐公司(Bio-Rad)，目录#345-0125)；蛋白质标记“精密加蛋白质标准(Precision Plus Protein Standards)”(伯乐公司(Bio-Rad)，目录#161-0363)；蛋白质标准BSA(赛默科技公司(Thermo Scientific)，目录#23208)和SimplyBlue Safestain(英杰公司(Invitrogen)，目录#LC 6060)。如下进行测定：在96孔PCR板中，将50μl稀释的酶样品与含有2.7mg DTT的50μL样品缓冲液混合。将该板用来自伯乐公司(Bio-Rad)的Microseal‘B’膜密封并放入PCR机器中加热至70℃持续10分钟。之后，通过运行缓冲液填充腔室，设置凝胶盒。然后将10μL的每个样品和标准品(0.125-1.00mg/ml BSA)加载在凝胶上，并加5μL的标记物。之后，将电泳在200V下运行45min。电泳后，将凝胶在水中漂洗3次5min，然后在Safestain中染色过夜，并最后在水中脱色。然后，将凝胶转移到成像仪中。使用成像实验室(Image Lab)软件来计算每个条带的强度。通过已知标准样品的蛋白的量，可以制作校准曲线。可以通过条带强度和校准曲线来确定样品的量。使用蛋白质定量方法制备用于随后实例中所示的测定的aldB乙酰乳酸脱羧酶的样品。
通过MS-N和C末端氨基酸测定进行的AldB序列鉴定
在准备序列确认时，通过随后描述的LC-MS/MS分析分离的aldB截短变体的SDS-PAGE凝胶。在准备序列确认(包括N-和C-末端测定)时，对来自aldB发酵样品的SDS-PAGE凝胶的蛋白条带进行一系列化学处理。在各个步骤之间，分别使用Milli-Q水，50w/w％乙醇和无水乙醇洗涤并收缩凝胶片。通过DTT/碘乙酰胺处理将蛋白质还原/烷基化。进行了胍基化步骤将赖氨酸转化为高精氨酸以保护赖氨酸侧链免于乙酰化。使用磺基-NHS-乙酸酯(磺基琥珀酰亚胺乙酸酯)的乙酰化反应仅修饰蛋白质N-末端残基。用含有40v/v％18O水:60v/v％16O水的缓冲液和用于蛋白质消化的蛋白水解酶(胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶)将凝胶片溶胀。除了将保留天然16O的羧基末端之外，得到的肽将含有18O和16O的混合物，这将从肽的同位素模式中显而易见。源自蛋白质N-末端的肽将显示为唯一的乙酰化的肽。在消化之后，使用5w/w％甲酸和乙腈从凝胶片中提取这些肽，然后冻干并重新溶解在0.1w/w％TFA中。使用普罗克松(Proxeon)纳米LC系统，然后使用LTQ轨道阱(Orbitrap)(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)高分辨率质谱仪分离(C18柱)并分析消化产物，并且从肽的MS/MS片段谱和肽的同位素模式推导出氨基酸序列(使用Xcalibur 2.0SR2软件)。
基于此分析，通过如以上描述的乙酰化和18O-标记方法，确认分离的全长蛋白质的N-末端以A[25]开始(根据SEQ NO.2)，并且确认分离的全长蛋白质的C-末端在位置K[285]结束(根据SEQ NO.2)(见表1)。成熟aldB的N-末端位置A[25]对应于由Signal P 3.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)确定的基因转录的预测信号肽切割，所述程序设置为SignalP-NN系统，(Emanuelsson等人，(2007)，Nature Protocols[自然实验手册]，2:953-971)。进一步鉴定不同的N-和C-末端截短变体，并且根据SEQ NO.2，它们各自的N-和C-末端位置在表1中给出。
表1 aldB变体的经鉴定的N-和C-末端位置。
实例4-活性测定方法
α-乙酰乳酸脱羧酶的分光光度法测定
α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)催化α-乙酰乳酸脱羧为乙偶姻。反应产物乙偶姻能通过比色测定量。与α-萘酚和肌酸混合的乙偶姻形成在OD522nm吸收的特征性红色。基于OD522nm和乙偶姻校准曲线来计算ALDC活性。如以下进行该测定：通过将100μL乙基-2-乙酰氧基-2-甲基乙酰乙酸乙酯(西格玛公司(Sigma)，目录#220396)与3.6ml 0.5M NaOH在10℃下持续10min混合，制备20mM乙酰乳酸底物。添加20ml 50mM MES pH 6.0，用50mM MES pH 6.0将pH调节至pH 6.0并将体积调节至25ml。将80μL 20mM乙酰乳酸底物与稀释在50mM MES(pH6.0)、0.6M NaCl、0.05％BRIJ 35和0.01％BSA中的20μL酶样品混合。将该底物/酶混合物在30℃下孵育10min。然后，将16μL底物/酶混合物转移至200μL 1M NaOH、1.0％α-萘酚(西格玛公司(Sigma)，目录#33420)和0.1％肌酸(西格玛公司(Sigma)，目录#C3630)中。将该底物/酶/颜色试剂混合物在30℃下孵育20min，并然后读数OD522nm。将一个单位的ALDC活性定义为在测定条件下产生1μmol乙偶姻/分钟的酶的量。
实例5-来自枯草芽孢杆菌的各种蛋白酶缺失菌株中aldB的表达分析
为了鉴定合适用于枯草芽孢杆菌中aldB基因的重组蛋白表达的宿主，测试了具有不同数量的蛋白酶基因敲除的三种不同菌株(2-缺失、5-缺失和7-缺失)。如在此使用的，术语“敲除”是指，与其中基因未敲除和/或没有或减少的量的由该基因编码的多肽的亲本菌株相比，基因的失活使得没有基因的表达或只有减少的基因的表达。基因可以通过例如基因或其部分或者调节元件(如启动子)的缺失或通过将序列插入到基因或调节元件(如启动子)的至少部分中而失活。如在此使用的，术语“2-缺失”是指其中已经敲除2个蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌。如在此使用的，术语“5-缺失”是指其中已经敲除5个蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌。如在此使用的，术语“7-缺失”是指其中已经敲除7个蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌。如在此使用的，“5-缺失”菌株衍生自“2-缺失”菌株；因此，5-缺失菌株具有与在“2-缺失”中删除的基因相同的2个删除的蛋白酶基因和3个其他的删除的蛋白酶。如在此使用的，“7-缺失”菌株衍生自“5-缺失”菌株；因此，7-缺失菌株具有与在“5-缺失”中删除的5个基因相同的基因和2个其他的删除的蛋白酶基因(即vpr和wprA)。可以被敲除的蛋白酶基因的实例包括编码vpr、wprA、Epr、IspA、Bpr、NprE、AprE、ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD的基因。术语“敲除”可以与术语“破坏”或“缺失”互换使用。将基因[根据SEQ NO.4]插入pBN-ssoU表达载体中，经过如实例1中描述的时间取出样品。将发酵样品在样品缓冲液中冷冻以限制进一步的潜在降解，并且通过使用考马斯染色的标准SDS-PAGE分析统计分析所有样品，这是由于在aldB中不存在芳香残基(还参见实例3)。样品分别发酵24小时、48小时和72小时后，在图3中显示了2-、5-和7-缺失蛋白酶菌株中的aldB表达的SDS-page。标记为全长aldB(凝胶上，大约35kDa)或其截短变体(凝胶上，28kDa-35kDa)的条带在凝胶上标出。通过如描述在实例3中的方法中的MS序列鉴定aldB变体。在发酵期间，观察到在2-缺失蛋白酶菌株中的aldB表达显著降解并且没有可检出的全长蛋白质，并且截短产物的分子大小为28kDa和30kDa。在5-缺失菌株中也观察到AldB截短产物，然而在发酵开始时(24和48小时)存在全长蛋白质，并且与来自2-缺失菌株的截短产物相比，截短产物更大(凝胶上，32kDa-35kDa)。在5-缺失菌株的发酵期间，从24hr到72hr，似乎在进行从全长蛋白质到两种主要截短产物的转化。在7-缺失蛋白酶菌株中，aldB的表达仅产生可见的全长aldB蛋白质，在整个发酵过程中没有可检出的截短产物。
如在(实例4)中描述的从发酵样品中确定ALDC活性，并如表2中显示。在48小时后活性显示出峰值，其后在2-和5-缺失菌株中在72小时减少。在7-缺失菌株中的aldB表达的整个发酵过程中活性都在增加。在72小时之后5-缺失菌株产生最高活性(658U/mL)，随后是7-缺失菌株(538U/mL)和2-缺失菌株(61U/mL)。
表2不同发酵时间之后，枯草芽孢杆菌2-、5-、和7-缺失蛋白酶菌株中表达的aldB的ALDC活性。
使用具有牛血清白蛋白作为标准的Criterion软件(Image LabTM软件，BIO-RAD)定量所表达的aldB蛋白质的浓度，并将aldB蛋白的浓度计算为全长和截短产物的总和(在表3中显示)。AldB蛋白在2-和5-缺失中直至发酵48小时增加，而在7-缺失菌株中在整个发酵过程增加并在72小时发酵后最高。发酵72小时后，aldB浓度为分别为2-缺失菌株中0.32mg/mL，5-缺失菌株中1.09mg/mL，并且7-缺失菌株中0.68mg/mL。
表3不同发酵时间之后，枯草芽孢杆菌2-、5-、和7-缺失蛋白酶菌株中表达的aldB蛋白质的浓度。通过标准SDS-PAGE分析确定蛋白质浓度。
计算具体的ALDC活性，并显示在表4中。所有菌株的比活性随着发酵时间的推移而下降。对于所有时间点，与5-和2-缺失菌株相比，7-缺失菌株的观察到的比活性最高。发酵72小时后，2-、5-和7-缺失菌株的ALDC比活性为188U/mg、602U/mg和796U/mg。
表4不同发酵时间之后，枯草芽孢杆菌2-、5-、和7-缺失蛋白酶菌株中表达的aldB的ALDC比活性。
从5-缺失菌株发酵开始时和7-缺失菌株的材料中观察到的高比活性(≥800U/mg)与样品中全长蛋白质的相对丰度相关(见表4)，并明显地表明aldB截短产物构成较低效率的aldB酶变体。这表明在7-缺失菌株、胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和细胞壁蛋白酶(wprA)中缺失的另外2个蛋白酶在aldB酶的表达中起重要作用。
表5通过标准SDS-PAGE分析确定样品中总aldB蛋白质中全长aldB蛋白质的百分比。
实例6-2-、5-和7-缺失芽孢杆菌菌株发酵物的蛋白酶点板测定
酪蛋白点板测定的原理遵循通过酪蛋白板上的光环形成的蛋白酶活性/水解。
缓冲液：100mM Mcllwaine，pH 6.0(称取22.48g Na2HPO4.2H2O和7.74g C6H8O7.H2O并溶解在1000ml ddH2O中)和0,1M乙酸钠缓冲液pH5,60(7,46g乙酸钠(无水)溶解在800mldest.H2O中，用乙酸将pH调节至5,60，将其补充至1000ml，并如果需要调节pH)。
平板：将2％酪蛋白和2％琼脂糖(分别地)悬浮在McIlwaine缓冲液中，并将两个溶液在微波箱中加热大约5min。将其温柔地混合在一起(当温度大约70℃时)。向培养皿中倾倒大约20ml-30ml，并保持冷却。
在凝胶上打出1mm内径的小孔，并将5μl的酶溶液转移到孔中，将板在40℃下孵育。酪蛋白凝胶中光环的形成是时间的函数。将一个带有缓冲液的空白添加至一个孔中，用于比较。使用来自枯草芽孢杆菌nprE的中性蛋白酶(EC.3.4.24.28)作为阳性对照。将1g nprE(Veron W)样品稀释在10ml 0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.6)中，并混合持续10分钟。然后在Whatman GF/A上将样品过滤，并将5μl的nprE酶溶液转移至该板上。
在40℃下，来自2-、5-和7-缺失菌株的具有aldB的酪蛋白点板孵育2天后的结果示于图4中。对于阳性对照和来自2-缺失菌株的aldB可以看到清楚的光环形成。对于来自5-和7-缺失菌株的aldB，分别可以看到非常微弱的光环形成和无光环形成。
孵育10天后的结果显示，2-缺失菌株的光环形成增加，5-缺失菌株具有小光环，并且7-缺失菌株没有光环。这清楚地表明了2-缺失菌株发酵中蛋白酶活性最高，并且5-和7-缺失菌株发酵中蛋白酶敲除依序降低(如预期的那样)。
实例7-通过使用aldB在啤酒发酵期间减少二乙酰和2,3-戊二酮
此分析的目的是测试在14℃下7天发酵期间不同乙酰乳酸脱羧酶变体能够减少二乙酰和2,3-戊二酮(连二酮，VDK)的显现的能力。
纯麦芽酿造分析
将1100g Munton氏轻麦芽糖提取物(Munton's Light Malt Extract)(批号XB35189，到期日2014年5月24)提取物溶解在3000ml温自来水(45℃)中。将此浆液搅拌约10min直到液体匀质，用2.5M硫酸将pH调节至5.2。向此浆液中添加10微丸的16,0％含量的来自Hopfenveredlung,St.Johann:Alpha(EBC 7.7 0具体HPLC分析01.10.2013)的苦啤酒花(Bitter hops)，并然后分装在500mL蓝盖瓶中，并煮沸1小时以确保蛋白质沉淀并避免潜在的微生物污染。最终的麦芽汁具有1048的初始比重(即12柏拉图(°Plato))。将200g的过滤的麦芽汁添加至500ml锥形瓶(发酵容器；FV)中，然后冷却至13℃。向每个锥形瓶中给予0.5％W34/70(唯森啤酒(Weihenstephan))新鲜产生的酵母(1.0g酵母/200g麦芽汁)。将这些酶类似于ALDC活性给予(0.04U/mL麦芽汁，8ALDC单位/200g麦芽汁)。没有酶的对照发酵接受相当于酶样品的量的去离子水。
麦芽汁样品在标准化的实验室条件下，在14℃下在500ml锥形瓶中发酵，并在回转式培养箱中在150rpm下温和地搅拌，进行发酵。经24小时，重量减轻量小于0.25g时，将发酵温度降至7℃。总共8天后停止发酵。每天两次取出14ml样品用于二乙酰和2,3-戊二酮分析，优选地两次之间间隔11至14小时；在发酵结束时，每天仅取出1个样品。在取出之前，允许酵母静置并将每个样品在10℃下冷却10分钟，然后在8℃下在4000rpm下离心10分钟以沉淀任何残留的酵母。从酵母中分离上清液，向用于GC分析的样品中添加0.5g NaCl/ml的样品。在通过气相色谱质谱检测(GCMS)进行二乙酰和2,3-戊二酮分析之前，将此浆液转移到顶空小瓶中并在65℃下加热处理30分钟。
在安捷伦(Agilent)6890N/5973N GC(具有CombiPAL顶空自动进样器和MSChemStation获取和分析软件)上进行分析。在将样品上方的500μl的气相注入J&W 122-0763 DB-1701柱(60m x 0.25mmID x 1μm)中之前，将这些样品在70℃下平衡10分钟。注入温度是260℃，并将系统以2ml/min的恒定氦气流运行。烘箱温度是：50℃(2min)、160℃(20℃/min)、220℃(40℃/min)保持2min。以5:1的所选择离子的分流比用500μL进行MS检测。所有样品都以一式两份的方式运行，并且使用添加有二乙酰或2,3-戊二酮的自来水制备标准品。
化合物的浓度计算为
其中，
RF是乙酸的响应因子
面积是乙酸的GC-面积
Ws是使用的样品的量(以mL计)
二乙酰定量的极限是0.016mg/L，并且2,3-戊二酮定量的极限是0.012mg/L。
为了检查添加ALDC酶是否不影响真正发酵度(RDF)和以体积计的所产生的酒精：使用Anton Paar(DMA 5000)遵循标准酿造说明(Standard Instruction Brewing)23.8580-B28测量RDF，并通过标准酿造说明23.8580-B28测量酒精。
真正发酵度(RDF)值可以根据以下方程式计算：
其中：RE＝真正提取物＝(0.1808×°P初始)+(0.8192×°P最终)，°P初始是发酵之前的标准麦芽汁的比重，并且°P最终是以柏拉图度表示的发酵的麦芽汁的比重。
在本上下文中，真正发酵度(RDF)从比重和乙醇浓度确定。
使用Beer Alcolyzer Plus和DMA 5000密度计(都来自与Anton Paar，Gratz，澳大利亚)针对发酵的样品测定比重和乙醇浓度。基于这些测量，真正发酵度(RDF)值根据以下方程式计算：
其中：E(r)是以柏拉图度(°P)计的真正提取物，并且OE是以柏拉图度计的初始提取物。
通过分别添加来自枯草芽孢杆菌2-缺失、5-缺失和7-缺失菌株研究在14℃下在7天发酵期间减少二乙酰和2,3-戊二酮(连二酮，VDK)的显现的能力。进行三次分开的发酵，并如以上描述的进行VDK显现分析。用酶的发酵总是与没有添加任何酶的对照进行比较。为了比较，将计算的VDK含量(定义为二乙酰和2,3戊二酮的总和)归一化为对于没有酶的对照样品获得的最高值(观察到绝对最大值从1.48mg VDK/L变为2.76mg VDK/L)，并且这些结果显示在图5中。与对照相比，所有三种aldB酶均在发酵期间降低了VDK的显现。然而，通过检查大约40小时后形成的峰值VDK，我们清楚这些酶表现不同。对于来自2-、5-和7-缺失菌株的aldB，分别观察到22.0％、25.6％和62.7％的形成的峰值VDK的相对降低。此外，用来自2-、5-和7-缺失菌株的aldB发酵，观察到使VDK水平低于0.1mg/mL的二乙酰的风味临界值所需的发酵时间分别为大约138小时、163小时和97小时。总之，在啤酒发酵期间，就VDK降低而言，7-缺失菌株中产生的aldB的ALDC性能似乎最高，5-和2-缺失菌株的aldB的ALDC性能较低。
虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见的是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下，许多变化、改变和替换将是本领域的技术人员能想到的。应该理解的是，在此说明的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实施本发明。旨在按照以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也包括在本发明的范围内。

Claims (49)

1.一种用于生产乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的方法，所述方法包括：
A i)提供包含遗传改变的芽孢杆菌属(Bacillus)宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和/或细胞壁蛋白酶(wprA)，其中用与启动子有效组合的编码异源ALDC酶的核酸转化所述宿主细胞；以及
ii)在适合于产生所述异源ALDC酶的条件下培养所述宿主细胞，使得产生所述异源ALDC酶；或者
B i)提供包含遗传改变的芽孢杆菌属宿主细胞，与亲本细胞相比，所述遗传改变导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和/或细胞壁蛋白酶(wprA)，其中用核酸转化所述宿主细胞，与亲本细胞相比，所述核酸导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列；以及
ii)在适合于产生ALDC酶的条件下培养所述宿主细胞，使得产生ALDC酶。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括回收所产生的ALDC酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞还缺乏内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞还缺乏内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和/或内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞缺乏中性金属蛋白酶(NprE)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还缺乏内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还缺乏内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞还缺乏内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主还具有减少的量的一种或多种另外的蛋白酶，所述蛋白酶选自：ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述遗传改变包含亲本细胞中存在的基因的破坏。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述破坏是全部或部分基因的缺失的结果。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述基因的破坏是包含所述基因的基因组DNA的部分缺失的结果。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述基因的破坏是诱变的结果。
15.如权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述基因的破坏是使用位点特异性重组进行的。
16.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其中与在所述基因的遗传基因座处引入选择性标志组合，以进行所述基因的破坏。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)、乳酸乳球菌DX(Lactococcus lactis DX)、或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶来自短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
20.一种芽孢杆菌属宿主细胞，其包含核酸，所述核酸与启动子有效组合以编码异源ALDC酶，其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和细胞壁蛋白酶(wprA)的遗传改变；或者一种芽孢杆菌属宿主细胞，其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶(vpr)和/或细胞壁蛋白酶(wprA)的遗传改变，并且其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列的核酸。
21.如权利要求20所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
22.如权利要求20或21所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。
23.如权利要求20-22中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、和/或内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。
24.如权利要求20-23中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的中性金属蛋白酶(NprE)。
25.如权利要求20至24中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主细胞还具有减少的量的内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)。
26.如权利要求20至25中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主细胞还具有减少的量的内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)。
27.如权利要求20至26中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主细胞还具有减少的量的内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)。
28.如权利要求20至27中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述宿主还具有减少的量的一种或多种另外的蛋白酶，所述蛋白酶选自：ampS、aprX、bpf、clpCP、clpEP、clpXP、codWX、lonA、lonB、nprB、map、mlpA、mpr、pepT、pepF、dppA、yqyE、tepA、yfiT、yflG、ymfF、ypwA、yrrN、yrrO和ywaD。
29.如权利要求20至28中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶来自干酪乳杆菌、乙酰短杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、乳酸乳球菌DX、或地衣芽孢杆菌。
30.如权利要求20至29中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶来自短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
31.如权利要求20至30中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8的任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列或其任何功能片段。
32.一种芽孢杆菌属宿主细胞，其包含核酸，所述核酸与启动子有效组合以编码异源ALDC酶，其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶和/或细胞壁蛋白酶和/或中性金属蛋白酶的遗传改变，所述蛋白酶能够剪切来自所述ALDC酶的C-末端的序列；或者一种芽孢杆菌属宿主细胞，其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的内源胞外丝氨酸蛋白酶和/或细胞壁蛋白酶和/或中性金属蛋白酶的遗传改变，所述蛋白酶能够剪切ALDC酶的C-末端的序列，并且其中所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列的核酸。
33.如权利要求32所述的宿主细胞，其中所述ALDC酶是短芽孢杆菌AldB并且所述蛋白酶能够剪切来自所述ALDC酶的所述C-末端的序列QVHQAESERK。
34.如权利要求32或33所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
35.一种芽孢杆菌属宿主细胞，其包含核酸，所述核酸与启动子有效组合以编码异源ALDC酶，其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的至少一种蛋白酶的遗传改变，其中所述蛋白酶能够切割所述ALDC酶的C-末端和/或N-末端；或者一种芽孢杆菌属宿主细胞，其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞产生减少的量的蛋白酶的遗传改变，其中所述蛋白酶能够切割所述ALDC酶的C-末端和/或N-末端，并且其中与亲本细胞相比，所述宿主细胞包含导致所述宿主细胞过量表达编码ALDC酶的内源核酸序列的核酸。
36.如权利要求35所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
37.如权利要求35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ IDNo:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的C-末端位置275处进行切割。
38.如权利要求35或36所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ IDNo:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的C-末端位置276处进行切割。
39.如权利要求35至38中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置37处进行切割。
40.如权利要求35至38中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置38处进行切割。
41.如权利要求35、37或38中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置39处进行切割。
42.如权利要求35至38中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置40处进行切割。
43.如权利要求35至38中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置42处进行切割。
44.如权利要求35至38中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置43处进行切割。
45.如权利要求36至38中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶能够在SEQ ID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7的相应的N-末端位置39处进行切割。
46.如权利要求35至45中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中ALDC酶包含与SEQID No:5、SEQ ID No:2或SEQ ID NO 7具有至少80％同源性的氨基酸序列。
47.如权利要求35至46中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述ALDC酶是短芽孢杆菌AldB，并且所述蛋白酶能够对来自所述ALDC酶的所述C-末端的序列QVHQAESERK进行切割。
48.如权利要求35至47中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶是中性金属蛋白酶。
49.如权利要求35至48中任一项所述的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述蛋白酶是嗜热菌蛋白酶。
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