CN117660420A - 一种微小杆菌凝乳酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物酶技术领域，具体涉及一种微小杆菌凝乳酶及其应用。本发明所提供的微小杆菌P6发酵所产生的凝乳酶具有良好的凝乳活性，其凝乳活力MCA为330.2±7.23SU/mL；本发明提供的微小杆菌凝乳酶具有较高的MCA/PA值（21.43）和较低的PA值（15.41U/mL），能保证奶酪产量的同时不会造成底物的过度水解产生苦味肽，因此，本发明凝乳酶具有很好的适用性和潜在应用价值；此外，本发明提供的微小杆菌凝乳酶水解牛奶酪蛋白能产生抗氧化肽，当水解物浓度为200µg/mL时，DPPH自由基清除活性为75.32%，同样浓度的维生素C的DPPH自由基清除活性为90%，这为乳源活性肽的酶法制备提供了新途径。
Description
技术领域
本发明属于微生物酶技术领域，具体涉及一种微小杆菌凝乳酶及其在水解牛奶酪蛋白产生抗氧化肽中的应用。
背景技术
凝乳酶(chymosin,milk-clotting enzymes,MCEs,EC 3.4.23.4)是食品工业，尤其是乳制品加工行业中的常用酶制剂。在奶酪制作过程中，凝乳酶可以水解κ-酪蛋白中的特定肽键(Phe105-Met106)而将乳液中的酪蛋白从溶解状态转变为凝胶状态，从而形成奶酪的基本结构，有助于形成奶酪的特定口感和质地。此外，凝乳酶也被用于健康产品中，如营养补充剂和消化酶产品，用于改善消化和吸收。
凝乳酶最初主要来源于新生的哺乳动物，尤其是牛犊的胃液，牛犊胃中产生的酶可以帮助他们消化乳蛋白，这些酶被提取出来用于制作凝乳酶。然而，牛犊胃来源的凝乳酶产量低，仅满足世界乳凝剂需求量的20-30％；此外，出于不愿消费用动物源凝乳酶的奶酪消费者，促使市场越来越倾向于凝乳酶供应的多样化。现阶段，商业化的凝乳酶通常通过微生物发酵生产，利用一些特殊的微生物(如某些细菌或酵母)发酵或经遗传工程改造的微生物能够发酵生产凝乳酶。这种方法比从动物胃液中提取的凝乳酶产量更大、成本更低、酶作业的适应性更强，可以更有效地大规模生产凝乳酶。目前，由Rhizomucor miehei和Rhizomucor pusillus丝状真菌产生的凝乳酶是目前应用最广泛的商业酶制剂。
凝乳酶的凝乳活性(milk-clotting activity,MCA)与其蛋白水解活性(proteaseactivity,PA)比值是评价凝乳酶适用性的关键。当凝乳酶的PA高时酶对蛋白底物的过度水解会产生苦味肽，影响奶酪口感。因此理想的凝乳酶应具有较高的MCA/PA比值，该比值是评价凝乳酶适用性的关键指标之一。
牛奶酪蛋白被凝乳酶、天然牛奶蛋白酶和乳酸菌的内肽酶水解会产生功能肽，是胃肠道、激素、免疫、神经和营养反应的潜在生理调节剂。目前已从不同乳源制品中筛选出多种活性肽，如具有阿片肽活性的α-酪啡肽、β-酪啡肽、γ-酪啡肽(Nutr.Rev.2012,70(4):241-255)，具有降血压活性的血管紧张素转换酶抑制肽(Int.Dairy J.2007,17(5):481-487)等。芬兰维利奥(Valio)有限公司乳制品Evolus通过在牛奶中加入特定的乳酸菌发酵，产生降血压肽IPP和VPP达到降低血压的目的。近年来中国乳业发展迅速，但国内乳源活性肽行业依然存在许多空白。现阶段我国的乳制品活性肽还是主要依赖进口，产业化生产不足，高品质的功能性乳制品基本上被国外企业垄断，亟需自主创新。
细菌源凝乳酶通常具有较低的MCA/PA值及较高的PA值，导致奶酪产量降低，同时容易产生苦味肽，限制了其应用。然而与真菌相比，细菌具有更大的生物多样性和酶多样性，不同的细菌产生的凝乳酶会有不同的凝乳特点、不同的温度和pH敏感性、不同的酶切位点等酶学特征，会影响其在食品工业中的使用。为了扩大凝乳酶的应用，亟需寻找新型的凝乳酶产生菌和凝乳酶，研究凝乳酶的酶学性质，评估其应用潜力，丰富菌株资源库和酶资源库。
发明内容
针对目前研究现状和产业需求，本发明提供了一种微小杆菌P6产生的凝乳酶及其应用。
本发明所提供的一种微小杆菌凝乳酶，是通过微小杆菌P6发酵所产生的；所述的微小杆菌P6于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.24453，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：微小杆菌Exiguobacterium sp。
上述的微小杆菌凝乳酶的制备方法如下：将微小杆菌P6种子液按2％体积比接种量接入培养基中，25℃，180r/min培养48h后，在4℃，11000r/min离心10min去菌体得到粗酶液，然后利用质量分数为40～70％的硫酸铵梯度沉淀和SP Sepharose fast-flow离子交换层析对粗酶液进行纯化，所述的培养基的成分为：羽毛15g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，KH2PO4 0.4g/L，MgCl2·7H2O 0.1g/L，CaCl2 0.06g/L。
并且，所述的微小杆菌凝乳酶的使用方法如下：将微小杆菌凝乳酶加入8～12％(w/v)脱脂奶中，脱脂奶含0.01±0.002mol/L CaCl2，酶与底物体积比1:10～1:100，在34～36℃凝乳5～40min。
微小杆菌凝乳酶在牛乳凝结中的应用，同样落入本发明所保护的技术范围中，所述的凝乳酶水解牛奶酪蛋白能产生抗氧化肽。
本发明的有益效果在于：
(1)微小杆菌凝乳酶具有较高的凝乳活力，所述的凝乳酶在15min即能使5mL脱脂奶粉完全凝固，计算得凝乳酶凝乳活力为330.2±7.23SU/mL。目前未见微小杆菌属细菌产生凝乳酶的报道及应用。
(2)理想的凝乳酶应具有较高的MCA/PA比值，该比值是评价凝乳酶适用性的关键指标之一。本发明提供的微小杆菌凝乳酶具有较高的MCA/PA值(21.43)和较低的PA值(15.41U/mL)，能保证奶酪产量的同时不会造成底物的过度水解产生苦味肽，因此本发明凝乳酶具有很好的适用性和潜在应用价值。
(3)微小杆菌凝乳酶水解牛奶酪蛋白会产生抗氧化肽，当水解物浓度为200μg/mL时，DPPH自由基清除活性为75.32％，同样浓度的维生素C的DPPH自由基清除活性为90％。本发明为乳源活性肽的酶法制备提供了新途径。
附图说明
图1为本发明实施例1微小杆菌胞外蛋白酶的酶谱(Zymography)；泳道1为硫酸铵沉淀后的酶液，泳道2和3为离子交换层析纯化后的酶液；
图2为本发明实施例2微小杆菌凝乳酶的凝乳特性；
图3为本发明实施例3微小杆菌凝乳酶水解牛奶酪蛋白产生的水解产物的DPPH自由基清除活力。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
实施例1微小杆菌凝乳酶的制备
按照ZL202210343514.1方法，将微小杆菌P6种子液按2％接种量接入培养基(羽毛15，NaCl 0.5，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.4，MgCl2·7H2O 0.1，CaCl2 0.06，g/L)，25℃，180r/min培养48h后，在4℃，11000r/min离心10min去菌体得到粗酶液。按照ZL201610289190.2披露的方法略作修改，利用质量分数40-70％硫酸铵梯度沉淀和离子交换层析SP Sepharosefast-flow对酶液进行部分纯化。
蛋白酶酶谱(zymography)按照Liu(Applied Biochemistry Biotechnology,2015,175:489-501.)和专利“一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法”(ZL201310018497.5)的方法：按照《蛋白质技术手册》(汪家政，范明，科学出版社，2000)配制10％分离胶浓度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，取10μL凝乳酶，加入3μL未变性的载体样品缓冲液，混合均匀，在150V冰浴中进行垂直板型不连续电泳，电泳完成后，将凝胶浸泡在2.50％ Triton X-100溶液中，在摇床中洗脱15分钟(重复三次，直到SDS被清除干净)，用ddH2O冲洗凝胶后，将胶浸没在0.50％(w/v)酪蛋白溶液中，37℃，100rpm孵育1h。凝胶用ddH2O冲洗，用考马斯亮蓝染色液染色，用脱色液脱色至条状清晰。
酶谱的负染条带表明微小杆菌胞外蛋白酶对底物的水解能力，部分纯化后的酶在酶谱上显示单条负染条带(图1)。
实施例2微小杆菌凝乳酶的凝乳酶活力及蛋白酶活力测定
凝乳能力测定(milk-clotting activity,MCA)，采用Kei Arima(Methods inEnzymology,1970,19:446-459.)方法稍作修改：将脱脂奶粉溶解在0.01mol/L的CaCl2溶液中制成10％(w/v)脱脂乳溶液，室温静置30min后量取5mL分装到小试管中，于35℃预热5min，取同样35℃预热5min的酶液0.5mL加入到装有5mL的10％脱脂乳溶液小试管中，摇匀后开始计时，每5min观察一次，当出现絮状沉淀时停止。以索氏单位(Soxhlet Unit，SU/mL)表示MCA单位，其中1SU是在35℃，40分钟内使1mL牛奶凝固的酶量。
Vs：底物体积(mL)，t：凝乳时间(s)，VE：酶体积(mL)，n：酶稀释倍数。
蛋白酶的活力测定按照《酶制剂工业》(张树政，科学出版社，1984)方法略加修改：100μL酶液中加入100μL 2％(w/v)酪蛋白底物，在35℃反应10min后加入200μL 0.4mol/L三氯乙酸终止反应；8000g离心10min后取上清100μL，加入500μL 0.4mol/L Na2CO3和100μLFolin试剂在40℃显色20min后在660nm读取吸光值。每分钟660nm吸光值升高0.1定义为1个酶活单位U(U/mL)。
经测定，在该实验条件下，微小杆菌凝乳酶在15min即能使5mL脱脂奶粉完全凝固(图2)，计算得凝乳酶MCA＝330.2±7.23SU/mL。
微小杆菌P6受培养基中难降解的蛋白底物羽毛的诱导，能够产生角蛋白酶降解畜禽废弃物(授权专利ZL202210343514.1)，当培养基中不含羽毛角蛋白时，菌株产酶量降低，说明该酶是诱导酶。以可溶性蛋白底物：酪蛋白为底物测定蛋白酶酶活时，该酶蛋白酶酶活力较低，为15.41±0.5U/mL，其MCA/PA值为21.43。
已报道的来自地衣芽孢杆菌的凝乳酶MCA/PA值为9.2(J.Agric.Food Chem.2019,67,13684-13693)，来自枯草芽孢杆菌的凝乳酶MCA/PA值133.41±3.53(J.Agric.FoodChem.2021,69,2784-2792)，来自贝莱斯芽孢杆菌的凝乳酶MCA/PA值9.2(AMBExpress.2022Nov 26；12(1):149)，不同研究对蛋白酶酶活的测定方法和酶活单位定义不同，导致不同研究的PA值和MCA/PA值很难相互比较，须佐以其他实验手段证明凝乳酶的优异性。
本发明首次披露了一株微小杆菌产生的凝乳酶的MCA为330.2±7.23SU/mL，PA为15.41±0.5U/mL，MCA/PA值为21.43。
实施例3凝乳酶水解产物的抗氧化活性测定
奶酪蛋白肽的提取：10g奶酪在100mL含20％乙醇的水中均质。6000r/min离心5分钟去除脂肪，10000r/min离心30min获得上清，上清通过0.22μm膜(Millipore,USA)过滤，利用旋转蒸发去掉乙醇，样品提取物冻干备用。
DPPH自由基清除活性测定：取不同质量分数的水解液20μL与DPPH溶液(100μL,0.1mM,95％乙醇)混合后，室温静置1h后在517nm测定溶液吸光度。利用蒸馏水代替水解液作为空白对照，200μg/mL维生素C作为阳性对照(Shimada K et al.,J Agric Food Chem,1992,40(6):945-948)。
当水解物浓度为50μg/mL时，DPPH自由基清除活性为35.26％；当水解物浓度为100μg/mL时，DPPH自由基清除活性为60％；当水解物浓度为200μg/mL时，DPPH自由基清除活性为75.32％，同样浓度的维生素C的DPPH自由基清除活性为90％(图3)。
可见，本发明的微小杆菌凝乳酶水解牛奶酪蛋白能产生抗氧化肽，水解物具有较高的DPPH自由基清除活性，这为乳源活性肽的酶法制备提供了新途径。
Claims (6)
1.一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶是通过微小杆菌P6发酵所产生的；所述的微小杆菌P6于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.24453，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：微小杆菌Exiguobacterium sp。
2.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶的制备方法如下：将微小杆菌P6种子液按2%体积比接种量接入培养基中，25ºC，180 r/min培养48 h后，在4ºC，11000 r/min离心10 min去菌体得到粗酶液，然后利用质量分数为40~70%的硫酸铵梯度沉淀和SP Sepharose fast-flow离子交换层析对粗酶液进行纯化，所述的培养基的成分为：羽毛15 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，KH2PO4 0.4 g/L，MgCl2·7H2O0.1 g/L，CaCl2 0.06 g/L。
3.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶的凝乳活力为330.2 ± 7.23 SU/mL。
4.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶的使用方法如下：将微小杆菌凝乳酶加入8~12%（w/v）脱脂奶中，脱脂奶含0.01 ± 0.002mol/LCaCl2，酶与底物体积比1:10~1:100，在34~36℃凝乳5~40min。
5.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，凝乳酶的蛋白酶活力为15.41 ± 0.5 U/mL，凝乳活力与蛋白酶活力的比值为21.43，能保证奶酪产量，同时不会造成底物的过度水解产生苦味肽。
6.微小杆菌凝乳酶在牛乳凝结中的应用，其特征在于，所述的凝乳酶水解牛奶酪蛋白能产生抗氧化肽。
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