CN101084302A - 重组微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可提高蛋白质和多肽的生产率的宿主微生物，向其中导入编码蛋白质和多肽的基因得到的重组微生物，使用该重组微生物的蛋白质和多肽的制造方法。本发明使用已经使枯草杆菌的aprX基因或与该基因相当的基因缺失或失活的微生物作为宿主，再导入有编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物，以及使用该重组微生物的蛋白质和多肽的制造方法。

Description

重组微生物
技术领域
本发明涉及可有效用于蛋白质或多肽生产的微生物，和该蛋白质或多肽的生产方法。
背景技术
利用微生物进行有用物质的工业生产，以酒精饮料，豆酱、酱油等食品类为代表，涵盖氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生物质、糖质、脂质、蛋白质等多个种类，且其用途也扩展到食品、医药，洗剂、化妆品等日用品，或各种化工品原料的范围广泛的多个领域。
在这种利用微生物进行有用物质的工业生产中，提高其生产率是重要课题之一，其方案为采用突变等遗传学方法进行生产菌的培育。尤其是最近，随着微生物遗传学、生物技术学的发展，使用基因重组技术等，以更高的效率进行生产菌的育种，用于基因重组的宿主微生物的开发也得到发展。例如，开发出枯草杆菌( Bacillus subtilis)MarburgNo.168系统株等作为宿主微生物被认为安全优质的微生物株进一步施加改良的株。
但是，微生物原本就有用于应对自然界中的环境变化的各种各样的基因组，在使用受限的生产培养基的蛋白质等的工业生产中，处于未必高效的状态。尤其是微生物具有分解蛋白质而作为氮源和碳源利用的多种蛋白质分解酶，它们将目标蛋白质等分解，对外来蛋白质等的生产造成极大障碍。
很早以前就有试图通过使这类蛋白分解酶(蛋白酶、肽酶)的基因缺失，避免生产的目标蛋白质分解的技术，尤其是枯草杆菌，已知有报告例(参照非专利文献4)记载了以编码主要的细胞外碱性蛋白酶AprE、或中性蛋白酶NprE的基因、或这两类基因的缺失(参照非专利文献1、2、3)为代表的共计8类(参照后述表1)的细胞外或细胞壁结合型蛋白酶、肽酶的基因，其基因缺失微生物，以及这8类的蛋白酶、肽酶的基因全部缺失的枯草杆株。然而，通过本发明人等的分析，确认了这8类蛋白质分解酶基因缺失的微生物株在培养液中也具备蛋白质分解酶的活性，并认识到这会引起目标蛋白质的分解。因此，有采用特定的作为原因的蛋白质分解酶及其基因的需求。
有报告(参照非专利文献5)表明，枯草杆菌的 aprX基因编码推定菌体内的丝氨酸蛋白酶AprX，但对该AprX存在于培养基中，分泌生产有效酶、蛋白质时，将该酶、蛋白质分解，导致其收量降低的内容完全没有说明。
专利文献1：日本专利第288909号公报
专利文献2：日本专利第3210315号公报
专利文献3：日本特表2001-527401号公报
非专利文献1：J.Bacteriol.，158，411，(1984)
非专利文献2：J.Bacteriol.，160，15，(1984)
非专利文献3：J.Bacteriol.，160，442，(1984)
非专利文献4：Appl.Environ.Microbiol.，68，3261，(2002)
非专利文献5：Microbiology，145，3121-3127，(1999)
发明内容
本发明涉及使用已经使枯草杆菌的 aprX基因或与该基因相当的基因缺失或失活的微生物作为宿主，并向其中导入有编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物。
本发明还提供使用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。
附图说明
图1为利用SOE-PCR进行基因缺失导入用的DNA片段的调制，以及使用该DNA片段使靶基因缺失(与耐药性基因取代)的方法的示意图。
图2为利用SOE-PCR进行基因缺失用的DNA片段的调制，使用该DNA片段的基因缺失导入用质粒的构建，以及使用该质粒的靶基因的缺失方法的示意图。
图3为采用蛋白酶酶谱对 aprX缺失株和蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)，以及作为对照的枯草杆菌的野生型168株和蛋白酶基因8重缺失株(Kao8株)的培养上清组分的蛋白酶活性进行研究的结果。
图4为使用抗PreS2抗体，采用免疫印迹(Western Blot)法对蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)，以及作为对照的蛋白酶基因8重缺失株(Kao8株)的淀粉酶-PreS2融合蛋白质的生产量进行研究的结果。
图5为使用抗PreS2抗体，采用免疫印迹法对蛋白酶基因3重缺失株(Kao3株)，以及作为对照的枯草杆菌的野生型168株的淀粉酶-PreS2融合蛋白质的生产量进行研究的结果。
具体实施方式
本发明提供一种重组微生物，特别是制造通过降低蛋白质分解酶的生产量，可提高蛋白质或多肽的生产率的宿主微生物，向该宿主微生物导入编码蛋白质或多肽的基因得到的重组微生物，并且提供使用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。
本发明人等在研究了使用微生物生产有效蛋白质或多肽时起到不必要或有害作用的蛋白质分解酶之后发现，枯草杆菌的推定菌体内丝氨酸蛋白酶AprX存在于培养基中，在分泌生产有效酶、蛋白质时，将该酶、蛋白质分解，降低了其收量。而且发现，将枯草杆菌的 aprX基因缺失或失活的微生物株用作宿主微生物，可大幅度避免外来的有效酶和蛋白质的分解，可高效生产酶和蛋白质。
使用本发明的重组微生物，就可以避免目标蛋白质和多肽的分解，高效大量地生产目标蛋白质和多肽。
在本发明中，氨基酸序列和碱基序列的同一性按照Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算。更具体而言，使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Software开发)的同源性分析(Search homology)程序，以Unit size to compare(ktup)为2进行分析，计算而得。
用于构建本发明微生物的宿主微生物(下文也称为“亲本微生物”)优选为具有枯草杆菌的 aprX基因(Nature，390，249-256，(1997)，及JAFAN：Japan Functional Analysis Network for  Bacillus subtilis(BSORF DB，http://bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)中的基因编号BG12567)或与该基因相当的基因的微生物，且其既可以是野生型宿主微生物，也可以是实施了变异的宿主微生物。具体可举出枯草杆菌等芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)细菌、或酵母等，其中优选为芽孢杆菌属细菌。另外，为明确所有基因组信息，确立遗传工程、基因工程技术，以及因具有在蛋白质和菌体外分泌生产的能力，特别优选为枯草杆菌。
本发明中作为缺失或失活对象的基因，为报告表明编码枯草杆菌的推定菌体内丝氨酸蛋白酶AprX的 aprX基因(Microbiology，145，3121，(1999))，基因编号BG12567(Nature，390，249-256，(1997)及JAFAN：Japan Functional Analysis Network for  Bacillus subtilis(BSORF DB，http://bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)、或与该基因相当的基因。
与 aprX基因相当的基因可举出具有与枯草杆菌的 aprX基因相同功能的，或碱基序列具有与 aprX基因70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的，来自其它微生物，优选为来自芽孢杆菌属细菌的基因，具体可举出耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)的BH1930基因( aprX基因)、 Oceanobacillus iheyensis的OB2375基因等。
在本发明中，也可通过在上述基因内插入其它DNA片段或向该基因转录、翻译起始控制区域施加变异等方法使靶基因失活达到本发明的目的，更优选为使靶基因物理性缺失的方法。
另外，缺失或失活的基因除了 aprX基因或与 aprX基因相当的基因之外，还可组合编码已知向细胞外分泌或与细胞表层结合的其它蛋白酶类的1个以上的基因缺失。且在本发明的微生物的构建时，还可组合细胞内的蛋白酶或蛋白酶之外的基因组的缺失或失活，有望在提高生产率方面有更大的效果。表1记载了枯草杆菌的 aprX基因或与该aprX基因相当的基因以外的编码在细胞外分泌或与细胞表层结合的蛋白酶的基因，可以期待通过与 aprX基因与 aprX基因相当的基因组合，使其缺欠或失活的效果的基因。在此情况下，除 aprX基因之外，优选使选自 aprE、 nprB、 nprE、 bpr、 vpr、 mpr、 epr和 wprA各个基因或与该基因相当的9种基因中的1种以上的基因的缺失或失活。且更优选使除 aprX基因之外，分别编码作为主要的细胞外碱性蛋白酶的AprE和中性蛋白酶NprE的 aprE和 nprE基因，或与该基因相当的3种基因的缺失或失活，特别优选使除 aprX基因之外， aprE、 nprB、 nprE、 bpr、vpr、 mpr、 epr、 wprA各个基因的全部或相当于该基因的9种基因全部缺失或失活。
表1
基因名称  基因编号 基因功能等
aprE  BG10190 丝氨酸碱基蛋白酶(subtilisin E)
nprB  BG10691 细胞外中性蛋白酶B
nprE  BG10448 细胞外中性金属蛋白酶
mpr  BG10690 细胞外金属蛋白酶
bpr  BG10233 杆菌肽酶F
epr  BG10561 小细胞外丝氨酸蛋白酶
vpr  BG10591 小细胞外丝氨酸蛋白酶
wprA  BG11846 细胞壁结合型蛋白酶前体(CWBP23，CWBP52)
基因组的缺失或失活的顺序，除按照计划使 aprX基因或与 aprX基因相当的基因，以及表1所示的蛋白酶基因缺失或失活的方法之外，还可以在随机地使基因缺失或失活变异之后，通过适当的方法，对蛋白质生产率进行评价和对基因进行分析，这也能够使靶基因组缺失或失活。
靶基因的缺失或失活可采用例如同源重组方法。即，采用PCR等方法，构建利用碱基取代或碱基插入等导入失活变异的靶基因，或包括靶基因的外侧区域但不包括靶基因的直链状DNA片段等，将其导入亲本微生物细胞内，在亲本微生物基因组的靶基因变异部位的外侧两处区域，或在靶基因外侧两处区域引起两次交叉的同源重组，就可以与使基因组上的靶基因缺失或失活的基因片段进行取代。或者，将含有一部分靶基因的DNA片段克隆在适当的质粒上得到的环状重组质粒导入亲本微生物细胞内，利用靶基因的一部分区域中的同源重组，分割亲本微生物基因组上的靶基因，也可以实现失活。
尤其是在用于构建本发明微生物的亲本微生物采用枯草杆菌的情况下，已有几个报告(Mol.Gen.Genet.，223，268(1990)等)举例说明了利用同源重组，使靶基因缺失或失活的方法，通过反复使用该方法，可得到本发明的宿主微生物。
另外，针对随机基因的缺失或失活，还可采用随机克隆的DNA片段，引发与上述方法同样的同源重组的方法，或向亲本微生物照射γ射线等进行实施。
下面更具体地说明了采用利用SOE(重叠延伸拼接法：splicing byoverlap extension)-PCR法(Gene，77，61，(1989))调制的缺失导入用DNA片段的二重交叉法的缺失方法，但本发明的基因缺失方法不限于下述方法。
本发明所使用的缺失导入用DNA片段为，在与缺失对象基因的上游相邻的约0.2～3kb片段，和与下游相邻的同样约0.2～3kb的片段之间，插入了耐药性标记基因片段的片段。首先，利用第一次的PCR，调制缺失对象基因的上游片段和下游片段，以及耐药性标记基因片段三种片段，此时使用例如，设计成上游片段的下游末端附加耐药性标记基因的上游侧10～30碱基对序列，而下游片段的上游末端附加耐药性标记基因的下游侧10～30碱基对序列的引物(图1)。
然后，以第一次调制的三种PCR片段为模版，使用上游片段的上游侧引物与下游片段的下游侧引物，进行第二次的PCR，由此得到在附加于上游片段的下游末端和下游片段的上游末端的耐药性标记基因中，与耐药性标记基因片段发生退火，PCR放大，结果，就可得到在上游侧片段与下游侧片段之间插入了耐药性标记基因的DNA片段(图1)。
在耐药性标记基因使用耐大观霉素基因的情况下，采用例如与表2所示的引物组适当的模版DNA，使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒制造)等普通PCR用酶试剂盒等，按照已出版书籍(PCR Protocols.CurrentMethods and Applications，Edited by B.A.White，Humana Press，pp251(1993)，Gene，77，61，(1989)等)所示的常规条件，实施SOE-PCR，得到各基因缺失导入用DNA片段。
当采用感受态细胞(Competent Cell)转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))等将如上所述得到的缺失导入用DNA片段引入细胞内，则在具有同一性的缺失对象基因的上游和下游的相同区域，在细胞内产生基因重组，可通过耐药性标记的选择，分离靶基因取代为耐药性基因的细胞(图1)。即，在导入使用表2所示引物组调制的缺失导入用DNA片段的情况下，可利用以基因组为模版的PCR等方法，确认含有大观霉素的琼脂培养基上繁殖的菌落分离，目标基因缺失，取代为耐大观霉素基因。
另外，作为本发明中的含有 aprX基因或与 aprX基因相当的基因的蛋白酶基因的缺失方法，也可采用使用插入有通过SOE-PCR法调制的缺失导入用DNA片段的缺失导入用质粒的2阶段的一重交叉法。以下，针对该方法进行说明。
本发明中使用的缺失导入用DNA片段为，在与缺失对象基因的上游相邻的约0.2～3kb片段，和与下游相邻的同样约0.2～3kb的片段结合的DNA片段。还可使用该DNA片段的下游或上游与耐氯霉素基因等耐药性标记基因片段连接的DNA片段。首先，利用第一次的PCR，调制缺失对象基因的上游片段和下游片段，和根据需要调制的耐药性标记基因片段三种片段，此时，使用附加有作为连接对象的DNA片段末端10～30碱基对序列的引物。例如，在上游片段、下游片段和耐药性标记基因片段连接的情况下，也可以使用设计成使上游片段的下游末端附加有下游片断的上游侧10～30碱基对序列、或使下游片断的下游末端附加有耐药性标记基因片段的上游侧10～30碱基对序列的引物(图2)。
然后，将第一次调制的各PCR片段混合，制成模版，在作为靶的连接片段中，使用分别形成最上游侧和最下游侧的一对引物，进行第二次的PCR，可调制目的的缺失导入用DNA片段。具体而言，例如，在上游片段、下游片段和耐药性标记基因片段连接的情况下，使用上游片段的上游侧引物和耐药性标记基因片段的下游侧引物，进行第二次PCR，在与上游片段的下游末端附加的下游片断相同的序列中，或与耐药性标记基因片段相同的序列中，产生退火，PCR增幅的结果，得到上游侧片段、下游侧片段和耐药性标记基因片段连接的缺失导入用DNA片段(图2)。
另外，通过将按照上述方法等得到的缺失导入用DNA片段插入使用通常的限制酶和DNA连接酶在宿主菌内没有放大的质粒DNA，或温度感受性质粒等可轻易除去的质粒DNA中，构建缺失导入用质粒。宿主菌内没有放大的质粒DNA例子可以举出，在例如以枯草杆菌为宿主的情况下，为pUC18、pUC118、pBR322等，但也并不限于此。
然后，按照感受态细胞转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))等实施缺失导入用质粒的宿主菌的转化，利用插入有质粒的上游片段或下游片段与基因组上相同区域间的1重交叉的同源重组，得到缺失导入用质粒融合在宿主菌基因组DNA内的转化体(图2)。转化体的选择利用缺失导入用质粒的耐氯霉素基因等的标记基因的耐药性作为指标进行即可。
在如上所述得到的转化体的基因组上，在 aprX基因或与 aprX基因相当的基因等应缺失基因的上游区域及下游区域的序列中，来自宿主菌基因组和来自缺失导入用质粒的序列重复存在。在该上游区域或下游区域中，在与获得转化体时同源重组区域不同的区域，引发基因组内同源重组，与来自含有耐药性标记基因的缺失导入用质粒的区域一起，产生 aprX基因或与 aprX基因相当的基因等应缺失靶基因的缺失(图2)。引发基因组内同源重组的方法可举出例如感受态细胞衍生方法(J.Bacteriol.93，1925(1967))，仅用普通的培养基，在培养中，也可以自然引发同源重组。符合目标的引起基因组内同源重组的株，同时发生耐药性标记基因缺失，失去了耐药性，因此可从药剂感受性株中选择。可从这些株中提取基因组DNA，利用PCR法等，确认靶基因的缺失。
发明人认为，在选择目标缺失株时，基因组内的同源重组在10-4左右的稍低频率下产生，因此不易直接从耐药性选择感受性变化的株。因此，为高效取得靶缺失株，优选实施提高药剂感受性株的存活比例等工作。药剂感受性株的浓缩方法可举出，例如利用氨苄西林等青霉素系抗生物质对繁殖细胞有杀菌的作用，另一方面，对非繁殖细胞不发生作用的浓缩法(Methods in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLabs，(1970))等。在利用氨苄西林等进行浓缩的情况下，需要将例如具有耐氯霉素等对宿主细胞具有制菌作用的药剂的基因用作缺失导入用质粒的耐药性标记基因。在该含有适量制菌作用的药剂的适当的培养基中，可繁殖保持该耐药性基因的耐性株，该耐药性基因缺失的感受株既不繁殖，也不死亡。在该条件下，当添加适当浓度的氨苄西林等青霉素系抗生物质进行培养时，一方面，预计使其繁殖的耐性株死亡，而另一方面，感受性株未受到氨苄西林等的作用，结果，就提高了感受性株的存活比例。将实施了如上所述浓缩操作的培养液涂敷在适当的琼脂培养基上，进行培养，用复制法等确认出现的菌落是否存在对标记药剂的耐药性，就可选择高效的感受株。
通过将编码靶蛋白质或多肽的基因导入含有1个以上按照如上所述的方法构建的枯草杆菌的 aprX基因或与该基因相当的基因的使蛋白酶基因缺失或失活的宿主微生物变异株，就可得到本发明的重组微生物。
使用本发明的微生物生产的目标蛋白质或多肽可举出例如洗剂、食品、纤维、饲料、化工品、医疗、诊断等各种产业用酶、生理活性因子等蛋白质和多肽。另外，根据产业用酶的功能，包括氧化还原酶(Oxidoreductase)、转移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂合酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、合成酶(Ligase/Synthetase)等，优选为纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶的基因。具体可举出属于多糖水解酶的分类(Biochem.J.，280，309(1991))中族一5的纤维素酶。其中，可举出来自微生物的，尤其是芽孢杆菌属的细菌的纤维素酶。更具体例可举出来自由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶，具有该氨基酸序列中的1个或多个氨基酸缺失、取代或附加的氨基酸序列的线性纤维素酶，另外，还可举出具有与该氨基酸序列70％、优选为80％、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的氨基酸序列的纤维素酶。
此外，α-淀粉酶的具体例可举出来自微生物的α-淀粉酶，特别优选为来自芽孢杆菌属的液化型淀粉酶。更具体例可举出来自具有由序列号61所示的氨基酸序列构成的芽孢杆菌属的碱性淀粉酶，具有与该氨基酸序列70％、优选为80％、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的氨基酸序列构成的淀粉酶。另外，氨基酸序列的同一性按照Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算。而蛋白酶的具体例可举出来自微生物的，尤其是来自芽孢杆菌属细菌的丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等。
另外，按照本发明生产的蛋白质可举出来自人类等高等生物的生理活性蛋白质、酶等。优选例可举出干扰素α、干扰素β、生长激素、唾液腺淀粉酶等。另外，构成生理活性蛋白质等的一部分结构域等也可以表达，例如，可举出人类C型肝炎病毒抗体的抗原识别结构域PreS2等。
另外，靶蛋白质或多肽基因优选为，按照适当的形态，连接选自其上游的有关该基因的转录、翻译、分泌的控制区域，即，选自包含启动字和转录起始点的转录起始控制区域、包含核糖体连接部位和起始密码子的翻译起始控制区域和分泌信号肽区域中的一个以上的区域。特别是优选由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域构成的3个区域连接。更优选分泌信号肽区域为来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因，转录起始控制区域和翻译起始控制区域为该纤维素酶基因的上游0.6～1kb区域，按照适当的形态，与靶蛋白质或多肽基因连接。例如，日本特开2000-210081号公报、日本特开平4-190793号公报等所述的芽孢杆菌属细菌，即来自KSM-S237株(2003年4月14日，
Figure A20058004386800131
日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号FERM BP-7875)、KSM-64株(2003年4月14日，
Figure A20058004386800132
日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号FERM BP-2886)的纤维素酶基因的转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号肽区域与靶蛋白质或多肽的结构基因按照适当形态连接。更具体而言，优选为由序列号1所示的碱基序列的碱基编号1～659的碱基序列，由序列号3所示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基编号1～696的碱基序列，或相对于该碱基序列具有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的碱基序列构成的DNA片段，或由上述任意碱基序列的一部分缺失的碱基序列构成的DNA片段，与靶蛋白质或多肽的结构基因适当连接。另外，其中，尽管由上述碱基序列的一部分缺失的碱基序列构成的DNA片段意为，上述碱基序列的一部分缺失，但仍保持着基因的转录、翻译、分泌相关功能的DNA片段。
通过将含有上述靶蛋白质或多肽基因的DNA片断与适当的质粒载体连接的重组质粒利用普通的转化法导入宿主微生物细胞中，就可得到本发明的重组微生物。并且，使用该DNA片段与宿主微生物基因组适合的相同区域连接的DNA片段，直接导入宿主微生物基因组，也可以得到本发明的重组微生物。
本发明的使用重组微生物的靶蛋白质或多肽的生产可通过将该株在含有同化性碳源、氮源、其它必需组分的培养基中接种，用通常的微生物培养法进行培养，在培养完毕后，采集、精制蛋白质或多肽而进行。对培养基的成分、组成等没有特别限定，优选使用含有麦芽糖或麦芽低聚糖作为碳源的培养基，这样可达到更好的结果。
综上，可使用使表1所示的任意枯草杆菌的基因，或选自与该基因相当的基因的1个以上的基因的缺失或失活的宿主微生物变异株，以及使用该变异株构建重组微生物，使用上述原料时，可高效生产有用的蛋白质或多肽。
实施例
在下述实施例中，具体说明包括枯草杆菌的 aprX基因(BG12567)的共计9种蛋白水解酶基因缺失的微生物的构建，以及将该微生物用作宿主的纤维素酶生产或人体B型肝炎病毒抗体的抗原识别结构域PreS2的生产。并具体说明除编码主要的两种细胞外蛋白酶的aprE基因(BG10190)和 nprE基因(BG10448)之外，还包括 aprX基因(BG12567)的合计三种蛋白酶基因缺失的微生物的构建、以及将该微生物用作宿主的人体B型肝炎病毒抗体的抗原识别结构域PreS2的生产。
表2-1
引物 碱基序列   序列号
eprfw1 CTCCGGCAGAAAGGGCAT   5
eprUPr CGTTCAGCCGTACAACAAGTTTGCAAGACATG   6
eprDNf AACTTGTTGTACGGCTGAACGCCGTCAAACC   7
eprrv-repU CTGATCTCGACTTCGTTCAGACGGGTCGTACAATGGCTG   8
repUfw GAACGAAGTCGAGATCAG   9
Cmrv1 GCTGTAATATAAAAACCTTCT   10
eprfw2 CGACACCATAGCTTTCTG   11
Cmrv2 AACTAACGGGGCAGGTTA   12
repUr-CmU AGAATCAATCCCATGGTCTCACTTTTCCACTTTTTGTCTTG   13
CmUf-repU GTGAGACCATGGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCAGACAAG   14
wprAfw1 GGGTAATTTATCTGATAGGG   15
wprAUPr CTTTTGCTTCCCACAACCGAGCTGAATTTTCTG   16
wprADNf CTCGGTTGTGGGAAGCAAAAGTTGTTGTTGAAAA   17
wprArv-repU CTGATCTCGACTTCGTTCATCCTCATTGAAGACGGCATC   18
wprAfw2 GGAACATATATGACACACCT   19
mprfw1 TGTTTGGTGTTGAGCTGTT   20
mprUPr TTCGTGTGAATCCATTGTTTTCTGAATCTTGGAA   21
mprDNf GAAAACAATGGATTCACACGAACGGAGGATCGT   22
mprrv-repU CTGATCTCGACTTCGTTCCTCGTAAGAAAAAATACCTATTTC   23
mprfw2 CCTTGCGAAAGATAGGGTA   24
nprBfw1 TTTTTAGCAGTGGTGCTC   25
nprBUPr CATACGCCTTCAGTAATAGAGATGTCTTGGTC   26
nprBDNf CTCTATTACTGAAGGCGTATGAGGCTGTCGGC   27
nprBrv-repU CTGATCTCGACTTCGTTCTTCCAAATGCGCTTCATTAGGA   28
nprBfw2 CTTTTGAGCCCGTTCCTC   29
bprfw1 TGAGATTGTGGTGACAGTG   30
bprUPr TTAAGTTTTCCGCTGATGAGTCTGTTTTTCGTT   31
bprDNf GACTCATCAGCGGAAAACTTAATATGAACACAGAA   32
bprrv-repU CTGATCTCGACTTCGTTCGTAATCATGACACCGTTTTGAAC   33
bprfw2 ATTGCAACCGGCTTTATCG   34
nprEfw1 TTTTGAAGACGTTCGGCGA   35
nprEUPr ATTGTCTGTTGCTGAAGCAGCCTGGAATGCTGTT   36
nprEDNf CAGGCTGCTTCAGCAACAGACAATTTCTTACCTA   37
nprErv-repU CTGATCTCGACTTCGTTCCCTCTCTTAAGTAAGCGCTG   38
表2-2
nprEfw2 TCTCTTTGTTGAAAAACGATA     39
vprfw1 AAAAACATCCCTCCGCTTC     40
vprUPr TCTTCGGTCAATACAAGCAGAAAGCGAATGAT     41
vprDNf TCTGCTTGTATTGACCGAAGAACCTTTCACTG     42
vprrv-repU CTGATCTCGACTTCGTTCTGCTCGGCTCATCTGGAGAAA     43
vprfw2 TTTTTGGCAGGCAGCCTT     44
aprEfw1 CTGTTTATTATGGGCCACGAA     45
aprEUPr GATCAGCTTGGGGTTAATCAACGTACAAGCAG     46
aprEDNf TGATTAACCCCAAGCTGATCCACAATTTTTTGC     47
aprErv-repu CTGATCTCGACTTCGTTCTGATTTTCCAAACGAGCTTTC     48
aprEfw2 ATGGGCCATTATGTCATGAAG     49
aprX+5F TTGGGTACTCTATGGTAC     50
aprX+563R CACTGGCCGTCGTTTTACCCATGACCATTATCATCG     51
aprX+775F CATGGTCATAGCTGTTTCCTTATGAGCATGTCGCTCG     52
aprX+1320R GGGAACGGAATTTTCTGC     53
PB-M13-20 GTAAAACGACGGC CAGTG     54
PB-M13Rev GGAAACAGCTATGACCATG     55
aprXfw1 TTCTTTATCATCCTCATGG     56
aprXUPr TACAAATGGTGAACGCAGAAAATTCCGTTC     57
aprXDNf TTTTCTGCGTTCACCATTTGTACCATAGAG     58
aprXrv-repu CTGATCTCGACTTCGTTCTAACAACCTCACTTGGCAA     59
aprXfw2 ATAGATCGGCGCCTGAAA     60
表3
  epr基因缺失用  wprA基因缺失用   mpr基因缺失用  nprB基因缺失用   bpr基因缺失用  nprE基因缺失用   vpr基因缺失用  aprE基因缺失用   aprX基因缺失用
  eprfw1  wprAfw1   mprfw1  nprBfw1   bprfw1  nprEfw1   vprfw1  aprEfw1   aprXfw1
  eprUPr  wprAUPr   mprUPr  nprBUPr   bprUPr  nprEUPr   vprUPr  aprEUPr   aprXUPr
  eprDNf  wprADNf   mprDNf  nprBDNf   bprDNf  nprEDNf   vprDNf  aprEDNf   aprXDNf
  eprrv-repU  wprArv-repU   mprrv-repU  nprBrv-repU   bprrv-repU  nprErv-repU   vprrv-repU  aprErv-repu   aprXrv-repu
  eprfw2  wprAfw2   mprfw2  nprBlw2   bprfw2  nprEfw2   vprfw2  aprEfw2   aprXfw2
  Cmrv2  Cmrv2   Cmrv2  C1mrv2   Cmrv2  Cmrv2   Cmrv2  Cmrv2   Cmrv2
  repUfw  repUfw   repUfw  repUfw   repUfw  repUfw   repUfw  repUfw   repUfw
  Cmrv1  Cmrv1   Cmrv1  Cmrv1   Cmrv1  Cmrv1   Cmrv1  Cmrv1   Cmrv1
  repUr-CmU  repUr-CmU   repUr-CmU  repUr-CmU   repUr-CmU  repUr-CmU   repUr-CmU  repUr-CmU   repUr-CmU
  CmUf-repU  CmUf-repU   CmUf-repU  CmUf-repU   CmUf-repU  CmUf-repU   CmUf-repU  CmUf-repU   CmUf-repU
实施例1 epr基因缺失用质粒的构筑
以从枯草杆菌168株中提取出的基因组DNA为模版，使用表2所示的eprfw1和eprUpr，以及eprDNf和eprrv-rep各引物组，分别调制基因组上与 epr基因的上游相邻的0.6kb片段(A)和与下游相邻的0.5kb片段(B)。并调制来自其它质粒pC194(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))的耐氯霉素基因的上游与来自质粒pUB110(Plasmid 15，93(1986))的repU基因的启动子区域连接的1.2kb片段(C)。然后，将得到的(A)、(B)、(C)三片段混合，作为模版，使用表2的引物eprfw2和Cmrv2，进行SOE-PCR，按照(A)(B)(C)的顺序将这样的3个片段连接，得到2.2kb的DNA片段(参照图2)。对该DNA片段的末端进行平滑化和5′-磷酸化处理，插入质粒pUC118(Methods Enzymol.153，3(1987))的 Smal限制酶部位，构建 epr基因缺失用质粒pUC118-CmrΔepr。并且，上述1.2kb片段(C)如下进行调制：将使用repUfw和repUr-Cm的引物对(表2)和作为模版的质粒pUB110调制的含有 repU基因启动子区域的0.4kb片段(D)，和使用CmUf-rep和Cmrv1的引物对(表2)和作为模版的质粒pC194调制的含有耐氯霉素基因的0.8kb片段(E)混合，作为模版，使用表2所示的引物repUfw和Cmrv1，进行SOE-PCR而调制。
实施例2使用缺失用质粒的 epr基因缺失株的构建
采用感受态细胞转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))，将实施例1中构建的 epr基因缺失用质粒pUC118-CmrΔepr导入枯草杆菌168株，取得在与 epr基因上游区域、或下游区域相当的区域之间利用1重交叉的同源重组而与基因组DNA融合的转化株，该转化株具有耐氯霉素基指标。将所得的转化株在LB培养基上接种，在37℃下培养两小时后，再次进行感受态细胞诱导操作，由此，诱导在基因组上重复存在的 epr基因上有区域、或下游区域之间的基因内同源重组。如图2所示，在与质粒导入时不同的区域进行同源重组的情况下，伴随来自质粒的耐氯霉素基因和pUC118载体区域的脱落， epr基因缺失。接着，为了提高成为氯霉素感受性株的存在比例，以以下要领进行氨苄西林浓缩操作。在包括感受态细胞诱导后的培养液最终浓度5ppm的氯霉素和最终浓度为100ppm的氨苄西林钠的1mL的LB培养基中，接种使得在600nm中的浓度(OD600)为0.003。在37℃下培养5小时后，添加10μL的10,000ppm的氨苄西林钠水溶液，在进行3小时的培养。培养结束后，在2％的氯化钠水溶液中对菌体进行离心清洗，之后悬浊于1mL的2％的氯化钠水溶液，将100μL的悬浊液涂抹在LB琼脂培养基上。在37℃下进行约15小时的孵化，在培育的株中，选择伴随质粒区域的脱落形成氯霉素感受性的株。以选择的株的基因组DNA为模版，使用表2所示的引物eprfw2和eprrv-rep，进行PCR，进行 epr基因缺失的确认，取得 epr基因缺失株。
实施例3蛋白酶基因8重缺失株的构建
对于 epr基因缺失株，进行与与 epr基因缺失同样的 wprA基因缺失作为进一步的缺失。即，与实施例1同样，构建 wprA基因缺失用质粒pUC118-CmrΔwprA，通过向基因组DNA导入构建的质粒以及此后的基因组内同源重组，取得由wprA基因的缺失得到的 epr基因和 wprA基因的双重缺失株。此后，反复实施同样的操作，依次使 mpr、 nprB、bpr、 nprE、 vpr、 aprE各个基因缺失，最终构建8种蛋白酶基因缺失的蛋白酶8重缺失株，将其命名为Kao8株。实施各缺失时所用的引物序列如表2所示，且各引物与实施例1所示的 epr基因缺失中使用的引物的对应关系如表3所示。
实施例4  aprX基因缺失株的构建(耐大观霉素基因的取代)
根据使用按照SOE(splicing by overlap extension)-PCR(Gene，77，61，(1989))调制的缺失导入用DNA片段的二重交叉法，构建 aprX基因缺失株。首先，使用表2所示的aprX+5F和aprX+563R，以及aprX+775F和aprX+1320R的各引物组，以由枯草杆菌168株提取的基因组DNA为模版，分别调制含有 aprX基因上游的5′末端侧的558bp片段(F)和3′末端侧545bp片段(G)。另一方面，由质粒pDG1727(Gene，167，335，(1995))的BamHI和XhoI限制酶切断点，切出耐大观霉素性基因区域，在pBluescript II SK(+)(Stratagene)上插入 BamHI和 XhoI限制酶切断点，构建pBlueSPR。以PBlueSPR的DNA为模版，使用PB-M13-20、PB-M13Rev(表1)的引物组，扩大耐大观霉素性基因的区域(H)。然后，以(F)、(G)和(H)的DNA片段为模版，使用aprX+5F、aprX+1320R引物组，按照SOE-PCR法，调制按照(E)、(H)、(G)顺序连接的DNA片段。使用调制的DNA片段，进行按照感受态细胞转化法的枯草杆菌168株的转化，将在含有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基上繁殖的菌落作为转化体分离。提取所得的转化体的基因组，确认由PCR使 aprX基因缺失，取代为耐大观霉素基因。如上所述，构建枯草杆菌的a prX基因缺失株，命名为ΔaprX(Sp)株。
实施例5包括 aprX基因缺失的蛋白酶基因9重缺失株的构建
使用按照实施例4所示的(E)(H)(G)顺序连接的DNA片段，按照感受态细胞转化法进行蛋白酶基因8重缺失株(实施例3，Kao8株)的转化，将在含有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基上繁殖的菌落作为转化体分离。提取所得的转化体的基因组，确认由PCR使 aprX基因缺失，取代为耐大观霉素基因。如上所述，施加枯草杆菌的 aprE、 nprB、 nprE、 bpr、 vpr、 mpr、 epr和 wprA的8基因的多重缺失，构建 aprX基因缺失的株，将其命名为Kao9株。
实施例6包括 aprX基因缺失的蛋白酶基因9重缺失株的蛋白酶酶谱分析
将实施例1～5所得的各基因缺失株和作为对照的枯草杆菌168株培养100小时后，以10,000rpm的转速，对培养液实施5分钟的离心处理，将其上清溶解形成1×样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，5％2-巯基乙醇，2％SDS，5％蔗糖，0.002％BPB(Bromophenolblue))，形成蛋白酶酶谱的样品。在避免样品煮沸，实施含有0.1％明胶的12％SDS-PAGE之后，在Renaturaion buffer(2.5％Triton X-100)中，在室温下振荡30分钟，再于Zymogram Developing buffer(50mMTris-HCl(pH8.5)、200mM NaCl、5mM CaCl2、0.02％Brij35)下，在室温下振荡30分钟。在再次替换为Zymogram Developing buffer之后，在37℃下，进行12小时孵化后，用CBB(对考马斯亮蓝染色液)对凝胶染色。按照上述方法对蛋白酶进行酶谱分析(图3)。结果可知，即使在8重缺失株(Kao8株)中，也可以检测出蛋白酶活性带， aprX基因缺失株中，本带消失，Kao8株中残留的蛋白酶活性为AprX。另外，含有 aprX基因的蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)未检测出蛋白酶活性带。
实施例7碱性纤维素酶的生产
用原生质体转化法，将来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-S237株的碱性纤维素酶基因(日本特开2000-210081号公报，序列号1)片段(3.1kb)插入穿梭载体pHY300PLK的 BamHI限制酶切断点的重组质粒pHY-S237，导入实施例1～5中得到的各基因缺失株和作为对照的枯草杆菌1 68株。在5mL的LB培养基中，以一夜的时间，在30℃下，对如上所述得到的株进行振荡培养，再将该培养液0.03mL在30mL的2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨，1％酵母提取液，1％NaCl，7.5％麦芽糖，7.5ppm硫酸锰4-5水合物，15ppm四环素)中接种，在30℃下，进行4天的振荡培养。培养之后，测量采用离心分离除去了菌体的培养液上清的碱性纤维素酶的活性，求得通过培养在菌体外分泌生产的碱性纤维素酶量。结果如表4所示，无论是在使用 aprX基因缺失株ΔaprX(Sp)株的情况下，还是在使用蛋白酶基因多重缺失株(Kao9株)的情况下，与对照的168型(野生型)的情况相比，都可实现碱性纤维素酶的高分泌生产。
表4
  菌株名    缺失蛋白酶基因     碱基纤维素酶分泌生产量(相对值)
  Kao9株     aprE  nprB  nprE  bpr  vpr  mpr  epr  wprA  aprX     113
  ΔaprX(Sp)     aprX     108
  168株    无     100
实施例8利用Kao8株和Kao9株的人体B型肝炎病毒抗原识别PreS2结构域的生产
利用通常的感受态细胞转化法，将在编码来自枯草杆菌的淀粉酶基因的N末侧522氨基酸的区域的下游插入了连接人体B型肝炎病毒抗原认识PreS2结构域片段的DNA片段(165bp)的重组质粒pTUBE52-preS2(Appl.Microbiol.Biotechnol.，40，341(1993))导入实施例3和5所得Kao8株和Kao9株。在一夜内，在30℃下，对所得转化株进行振荡培养，再将该培养液0.03mL在30mL的2×L一麦芽糖培养基(2％胰胨，1％酵母提取液，1％NaCl，7.5％麦芽糖，7.5ppm硫酸锰4-5水合物，15ppm四环素)中接种，在30℃下，进行100小时的振荡培养。培养之后，采用使用抗PreS2抗体(株式会社特殊免疫研究所)的免疫印迹分析(Western Blot)，求取采用离心分离除去了菌体的培养液上清中的淀粉酶-PreS2蛋白质量。首先，将培养上清溶解形成1×样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，5％2-巯基乙醇，2％SDS，5％蔗糖，0.002％BPB(Bromophenol blue))，进行10％SDS-PAGE之后，在PVDF(polyvinyl difluoridine membrane：Immobilon；0.45μm pore size；Millipore)上形成印迹。一次抗体使用抗preS2抗体(Hyb-5520：株式会社特殊免疫研究所)。二次抗体使用过氧化物酶标记抗鼠IgG抗体(Amersham Pharmacia biotech)。并利用ECL Plus Western blotting reagent pack(RPN2124；AmershamPharmacia biotech)检测。结果，如图4所示，蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)与8重缺失株(Kao8株)相比，可检测出明显强效的淀粉酶-PreS2带，确认因 aprX的缺失大幅度提高了淀粉酶-PreS2的生产率。
实施例9 aprE、 nprE、 aprX三基因缺失的株的构建
进行除主要的两个编码细胞外蛋白酶的 aprE基因和 nprE基因之外，还包括 aprX基因的共计3种蛋白酶缺失的微生物的构建。与实施例1和2同样，构建 aprE基因缺失用质粒pUC118-CmrΔaprE，利用向枯草杆菌168株基因组DNA导入构建的质粒，和随后的基因组内同源重组带来的 aprE基因的缺失，得到 aprE基因的单独缺失株。然后，与实施例3同样，构建 aprE、 nprE和 aprX基因缺失的蛋白酶基因3重缺失株，命名为Kao3株。另外，在构建Kao3株种中，使aprX基因缺失时所用的引物与其它蛋白酶基因缺失时所用的引物的对应关系如表3所示。
实施例10利用Kao3株的人体B型肝炎病毒抗原识别PreS2结构域的生产
与实施例8同样，采用通常的感受态细胞转化法，将淀粉酶-PreS2生产用质粒pRUBE52-preS2导入实施例9所得的Kao3株以及用作对照的枯草杆菌168株。在一夜中，在30℃下，对所得的转化株进行振荡培养，并将该培养液0.03mL在30rnL的2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨，1％酵母提取液，1％NaCl，7.5％麦芽糖，7.5ppm硫酸锰4-5水合物，15ppm四环素)中接种，在30℃下，进行25小时的振荡培养。培养之后，采用使用抗PreS2抗体(株式会社特殊免疫研究所)的免疫印迹分析，求取采用离心分离除去了菌体的培养液上清中的淀粉酶-PreS2蛋白质量。如图5所示，在对照的168株(野生株)的情况下没有确认的淀粉酶-PreS2带在蛋白酶基因3重缺失株中被检测出来，确认提高了淀粉酶-PreS2的生产率。
序列表
<110>花王株式会社
国立大学法人信州大学
<120>重组微生物
<130>KS0868
<150>JP 2004-368166
<151>2004-12-20
<160>61
<170>PatentIn Ver.3.1
<210>1
<211>3150
<212>DNA
<213>芽孢杆菌KSM-S237
<220>
<221>CDS
<222>(573)..(3044)
<223>
<220>
<221>sig_peptide
<222>(573)..(659)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(660)..()
<223>
<400>1
gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa   60
taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt  120
gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac  180
gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata   240
aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa   300
tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat   360
gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta   420
gtaataatat agataactta taagttgttg agaagcagga gagcatctgg gttactcaca   480
agttttttta aaactttaac gaaagcactt tcggtaatgc ttatgaattt agctatttga   540
ttcaattact ttaaaaatat ttaggaggta at atg atg tta aga aag aaa aca     593
                                    Met Met Leu Arg Lys Lys Thr
                                                    -25
aag cag ttg att tct tcc att ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta     641
Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu
        -20                 -15                 -10
ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt     689
Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe
    -5              -1  1               5                   10
aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc     737
Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly
                15                  20                  25
gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga caa atg aca tta gta gat caa     785
Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln
            30                  35                  40
cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga atg agt aca cac gga tta cag     833
His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln
        45                  50                  55
tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac gca tac aaa gct ctt tct aac     881
Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn
    60                  65                  70
gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt gct atg tat gta ggt gaa aat     929
Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn
75                  80                  85                  90
ggg tac gct aca aac cct gag tta atc aaa caa aga gtg att gat gga      977
Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly
                95                  100                 105
att gag tta gcg att gaa aat gac atg tat gtt att gtt gac tgg cat     1025
Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His
            110                 115                 120
gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat cct gtt tat gca ggt gct aaa     1073
Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys
        125                 130                 135
gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta tac cct aat aat cca cac att     1121
Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile
    140                 145                 150
att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca     1169
Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala
155                 160                165                  170
ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct     1217
Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala
                175                 180                 185
gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac     1265
Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn
            190                 195                 200
att atc att gtt ggt agt cca aac tgg agt cag cgt ccg gac tta gca     1313
Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala
        205                 210                 215
gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cacttc      1361
Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe
    220                 225                 230
tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act     1409
Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr
235                 240                 245                 250
cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta     1457
Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu
                255                 260                 265
gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca gag tgg gga acg agt caa gct    1505
Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala
            270                 275                 280
agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gaa    1553
Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu
        285                 290                 295
ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat    1601
Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn
    300                 305                 310
aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct    1649
Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser
315                 320                 325                 330
aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca gat cat gtg tgg gca cca gaa    1697
Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro Asp His Val Trp Ala Pro Glu
                335                 340                 345
gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg    1745
Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val
            350                 355                 360
aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac    1793
Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp
        365                 370                 375
ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt gga gtg aat tcg gat tct cca    1841
Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro
    380                 385                 390
aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat gaa aac aac act ttg aaa gtt    1889
Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val
395                 400                 405                 410
tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt tca gat ggc aac ttc tgg gct    1937
Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala
                415                 420                 425
aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg gga aaa agt gtt gat att tta    1985
Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu
            430                 435                 440
ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt att gtt gat gaa cca acg acg     2033
Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr
        445                 450                 455
gta gct att gcg gcg att cca caa agt agt aaa agt gga tgg gca aat     2081
Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn
    460                 465                 470
cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg gaa gat ttt gtc cag caa acg     2129
Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr
475                 480                485                  490
gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca att aca gga gaa gat gct cct     2177
Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro
                495                 500                 505
aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa gaa gat aac aat atg aac aac     2225
Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn
            510                 515                 520
atc att ctg ttc gtg gga act gat gca gct gac gtt att tac tta gat     2273
Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp
        525                 530                 535
aac att aaa gta att gga aca gaa gtt gaa att cca gtt gtt cat gat     2321
Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp
    540                 545                 550
cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct gtt ttt gaa gac ggt aca cgt     2369
Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg
555                 560                 565                 570
caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct ggt gtg aaa aca gct tta aca     2417
Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr
                575                 580                 585
att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg tta tca tgg gaa ttt gga tat     2465
Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr
            590                 595                 600
cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg gca aca gct cca cgt tta gat     2513
Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp
        605                 610                 615
ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt gag aat gat tat gta gct ttt    2561
Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe
    620                 625                 630
gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca aca gaa ggc gca atg aat atc    2609
Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile
635                 640                 645                 650
aat tta gta ttc cag cca cct act aac ggg tat tgg gta caa gca cca    2657
Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro
                655                 660                 665
aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa tta gag gaa gcg aat caa gta    2705
Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val
            670                 675                 680
aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa att aac gta aga gat att aca    2753
Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr
        685                 690                 695
aac att caa gat gac acg tta cta cgt aac atg atg atc att ttt gca    2801
Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala
    700                 705                 710
gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga gtc ttt gta gat aat gtt cgt    2849
Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg
715                 720                 725                 730
ttt gag ggg gct gct act act gag ccg gtt gaa cca gag cca gtt gat    2897
Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp
                735                 740                 745
cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat gag aag gaa gcg aaa aaa gaa    2945
Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu
            750                 755                 760
caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa gaa gca gta aaa gaa gaa aag    2993
Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys
        765                 770                 775
aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca gtc aaa aat gag gct aag aaa    3041
Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys
    780                 785                 790
aaa taatctatta aactagttat agggttatct aaaggtctga tgtagatctt       3094
Lys
795
ttagataacc tttttcttgc ataactggac acagagttgt tattaaagaa agtaag    3150
<210>2
<211>824
<212>PRT
<213>芽孢杆菌KSM-S237
<400>2
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
                -25                 -20                 -15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly
            -10                 -5              -1  1
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
     5                  10                  15
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
20                  25                  30                  35
Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
                40                  45                  50
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
            55                  60                  65
Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu
        70                  75                  80
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile
    85                  90                  95
Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
100                 105                 110                 115
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
                120                 125                 130
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu
            135                 140                 145
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        150                 155                 160
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    165                 170                 175
Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys
180                 185                 190                 195
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
                200                 205                 210
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            215                 220                 225
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        230                 235                 240
Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    245                 250                 255
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
260                 265                 270                 275
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
                280                 285                 290
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            295                 300                 305
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        310                 315                 320
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
    325                 330                 335
Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
340                 345                 350                 355
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
                360             365                     370
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            375             380                     385
Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn
        390             395                     400
Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
    405             410                     415
Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
420             425                     430                 435
Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val
            440                     445                 450
Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser
            455                 460                 465
Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala
        470                 475                 480
Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr
    485                 490                 495
Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu
500                 505                 510                 515
Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala
                520                 525                 530
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
            535                 540                 545
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        550                 555                 560
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580                 585                 590                 595
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
                600                 605                 610
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
            615                 620                 625
Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
        630                 635                 640
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
    645                 650                 655
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
660                 665                 670                 675
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
                680                 685                 690
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
            695                 700                 705
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
        710                 715                 720
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
    725                 730                 735
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
740                 745                 750                 755
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
                760                 765                 770
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
            775                 780                 785
Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys
        790                 795
<210>3
<211>3332
<212>DNA
<213>芽孢杆菌KSM-64
<220>
<221>CDS
<222>(610)..(3075)
<223>
<220>
<221>sig_peptide
<222>(610)..(696)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(697)..()
<223>
<400>3
agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg    60
cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt   120
cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca   180
acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta   240
tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc   300
tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa   360
atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc   420
tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat   480
aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga   540
aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta   600
ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att   651
         Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile
                             -25                 -20
ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg aca gct ctt gca gca     699
Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala
-15             -10                     -5              -1  1
gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac     747
Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp
            5                   10                  15
aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc     795
Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val
        20                  25                  30
gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta     843
Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu
    35                  40                  45
cgt gga atg agt aca cac gga tta caa tgg ttt cct gag atc ttg aat     891
Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn
50                  55                  60                  65
gat aac gca tac aaa gct ctt gct aac gat tgg gaa tca aat atg att     939
Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile
                70                  75                  80
cgt cta gct atg tat gtc ggt gaa aat ggc tat gct tca aat cca gag     987
Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu
            85                  90                  95
tta att aaa agc aga gtc att aaa gga ata gat ctt gct att gaa aat    1035
Leu Ile Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn
        100                 105                 110
gac atg tat gtc atc gtt gat tgg cat gta cat gca cct ggt gat cct    1083
Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro
    115                 120                 125
aga gat ccc gtt tac gct gga gca gaa gat ttc ttt aga gat att gca    1131
Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala
130                 135                 140                 145
gca tta tat cct aac aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag    1179
Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu
                    150             155                 160
cca agt agt aac aat aat ggt gga gct ggg att cca aat aat gaa gaa    1227
Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu
                165             170                 175
ggt tgg aat gcg gta aaa gaa tac gct gat cca att gta gaa atg tta    1275
Gly Trp Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu
        180                 185                 190
cgt gat agc ggg aac gca gat gac aat att atc att gtg ggt agt cca    1323
Arg Asp Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro
    195                 200                 205
aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat gat    1371
Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp
210                 215                 220                 225
cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct    1419
His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala
                230                 235                 240
tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac    1467
Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn
            245                 250                 255
gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta ttt    1515
Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe
        260                 265                 270
gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct tac    1563
Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr
    275                 280                 285
ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att    1611
Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile
290                 295                 300                 305
agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca    1659
Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala
                310                 315                 320
ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac cca    1707
Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro
            325                 330                 335
ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa     1755
Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu
        340                 345                 350
tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt     1803
Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg
    355                 360                 365
aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa     1851
Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln
370                 375                 380                 385
gga ttt gga gtg aat gga gat tct cca gtt gaa gat gta gtt att gag     1899
Gly Phe Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu
                390                 395                 400
aat gaa gcg ggc gct tta aaa ctt tca gga tta gat gca agt aat gat     1947
Asn Glu Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp
            405                 410                 415
gtt tct gaa ggt aat tac tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc gac ggt     1995
Val Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly
        420                 425                 430
tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gaa aaa ctt act atg gat     2043
Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp
    435                 440                 445
gtg att gtt gat gag ccg acc acg gta tca att gct gca att cca caa     2091
Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln
450                 455                 460                 465
ggg cca tca gcc aat tgg gtt aat cca aat cgt gca att aag gtt gag     2139
Gly Pro Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu
                470                 475                 480
cca act aat ttc gta ccg tta gga gat aag ttt aaa gcg gaa tta act     2187
Pro Thr Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr
            485                 490                 495
ata act tca gct gac tct cca tcg tta gaa gct att gcg atg cat gct     2235
Ile Thr Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala
        500                 505                 510
gaa aat aac aac atc aac aac atc att ctt ttt gta gga act gaa ggt    2283
Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly
    515                 520                 525
gct gat gtt atc tat tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt    2331
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
530                 535                 540                 545
gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct    2379
Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
                550                 555                 560
gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct    2427
Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
            565                 570                 575
ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg    2475
Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
        580                 585                 590
tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg    2523
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
    595                 600                 605
gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt    2571
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
610                 615                 620                 625
gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca    2619
Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
                630                  635                640
aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac    2667
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
            645                 650                 655
ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa    2715
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
        660                 665                 670
tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa    2763
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
    675                 680                 685
att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt     2811
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
690                 695                 700                 705
aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga     2859
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
                710                 715                 720
gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg     2907
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
            725                 730                 735
gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg cct gtc gat     2955
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
        740                 745                 750
gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa     3003
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
    755                 760                 765
gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca     3051
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
770                 775                 780                 785
atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctaata aactagttat agggttatct    3105
Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys
                790
aaaggtctga tgcagatctt ttagataacc tttttttgca taactggaca tagaatggtt   3165
attaaagaaa gcaaggtgtt tatacgatat taaaaaggta gcgattttaa attgaaacct   3225
ttaataatgt cttgtgatag aatgatgaag taatttaaga gggggaaacg aagtgaaaac   3285
ggaaatttct agtagaagaa aaacagacca agaaatactg caagctt                 3332
<210>4
<211>822
<212>PRT
<213>芽孢杆菌KSM-64
<400>4
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
                -25                 -20                 -15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly
            -10                 -5              -1  1
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
    5                   10                  15
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
20                  25                  30                  35
Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
                40                  45                  50
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
            55                  60                  65
Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile Arg Leu
        70                  75                  80
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu Leu Ile
    85                  90                  95
Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
100                 105                 110                 115
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
                120                 125                 130
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu
            135                 140                 145
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        150                 155                 160
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    165                 170                 175
Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp
180                 185                 190                 195
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
                200                 205                 210
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            215                 220                 225
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        230                  235                240
Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    245                 250                 255
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
260                 265                 270                 275
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
                280                 285                 290
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            295                 300                 305
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        310                 315                 320
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro
    325                 330                 335
Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
340                 345                 350                 355
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
                360                 365                 370
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            375                 380                 385
Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu Asn Glu
        390                 395                 400
Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp Val Ser
    405                 410                 415
Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly Trp Gly
420                 425                 430                 435
Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile
                440                 445                 450
Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly Pro
            455                 460                 465
Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu Pro Thr
        470                 475                 480
Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr Ile Thr
    485                 490                 495
Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala Glu Asn
500                 505                 510                 515
Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly Ala Asp
                520                 525                 530
Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile
            535                 540                 545
Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe
        550                 555                 560
Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val
    565                 570                 575
Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser
580                 585                 590                 595
Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr
                600                 605                 610
Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn
            615                 620                 625
Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu
        630                 635                 640
Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr
    645                 650                 655
Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu
660                 665                 670                 675
Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn
                680                 685                 690
Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met
            695                 700                 705
Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe
        710                 715                 720
Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu
    725                 730                 735
Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys
740                 745                 750                 755
Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala
                760                 765                 770
Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ile Lys
            775                 780                 785
Asn Glu Ala Thr Lys Lys
        790
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌epr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>5
ctccggcaga aagggcat 18
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因epr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>6
cgttcagccg tacaacaagt ttgcaagaca tg 32
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因epr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>7
aacttgttgt acggctgaac gccgtcaaac c31
<210>8
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因epr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>8
ctgatctcga cttcgttcag acgggtcgta caatggctg 39
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>9
gaacgaagtc gagatcag 18
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pC194的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>10
gctgtaatat aaaaaccttc t 21
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因epr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>11
cgacaccata gctttctg 18
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pC194的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>12
aactaacggg gcaggtta 18
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pC194的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>13
agaatcaatc ccatggtctc acttttccac tttttgtctt g 41
<210>14
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据质粒pC194的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>14
gtgagaccat gggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa g 41
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>15
gggtaattta tctgataggg 20
<210>16
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>16
cttttgcttc ccacaaccga gctgaatttt ctg 33
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>17
ctcggttgtg ggaagcaaaa gttgttgttg aaaa 34
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因wprA的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>18
ctgatctcga cttcgttcat cctcattgaa gacggcatc 39
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>19
ggaacatata tgacacacct 20
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>20
tgtttggtgt tgagctgtt 19
<210>21
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>21
ttcgtgtgaa tccattgttt tctgaatctt ggaa 34
<210>22
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>22
gaaaacaatg gattcacacg aacggaggat cgt 33
<210>23
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因mpr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>23
ctgatctcga cttcgttcct cgtaagaaaa aatacctatt tc 42
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>24
ccttgcgaaa gatagggta 19
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>25
tttttagcag tggtgctc 18
<210>26
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>26
catacgcctt cagtaataga gatgtcttgg tc 32
<210>27
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>27
ctctattact gaaggcgtat gaggctgtcg gc 32
<210>28
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因nprB的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>28
ctgatctcga cttcgttctt ccaaatgcgc ttcattagga 40
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>29
cttttgagcc cgttcctc 18
<210>30
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>30
tgagattgtg gtgacagtg 19
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>31
ttaagttttc cgctgatgag tctgtttttc gtt 33
<210>32
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>32
gactcatcag cggaaaactt aatatgaaca cagaa 35
<210>33
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因bpr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>33
ctgatctcga cttcgttcgt aatcatgaca ccgttttgaa c 41
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>34
attgcaaccg gctttatcg 19
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>35
ttttgaagac gttcggcga 19
<210>36
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>36
attgtctgtt gctgaagcag cctggaatgc tgtt 34
<210>37
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>37
caggctgctt cagcaacaga caatttctta ccta 34
<210>38
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因nprE的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>38
ctgatctcga cttcgttccc tctcttaagt aagcgctg 38
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>39
tctctttgtt gaaaaacgat a 21
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>40
aaaaacatcc ctccgcttc 19
<210>41
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>41
tcttcggtca atacaagcag aaagcgaatg at 32
<210>42
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>42
tctgcttgta ttgaccgaag aacctttcac tg 32
<210>43
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因vpr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>43
ctgatctcga cttcgttctg ctcggctcat ctggagaaa 39
<210>44
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>44
tttttggcag gcagcctt 18
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>45
ctgtttatta tgggccacga a 21
<210>46
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>46
gatcagcttg gggttaatca acgtacaagc ag 32
<210>47
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸.
<400>47
tgattaaccc caagctgatc cacaattttt tgc 33
<210>48
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因aprE的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>48
ctgatctcga cttcgttctg attttccaaa cgagctttc 39
<210>49
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>49
atgggccatt atgtcatgaa g 21
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>50
ttgggtactc tatggtac 18
<210>51
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因aprX的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pBluescript II SK(+)的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>51
cactggccgt cgttttaccc atgaccatta tcatcg 36
<210>52
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>52
catggtcata gctgtttcct tatgagcatg tcgctcg 37
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR反义引物的寡核苷酸，其3’-位根据枯草杆菌基因aprX的3’-侧区的核苷酸序列设计，其5’-位根据质粒pBluescript II SK(+)的核苷酸序列设计的
<400>53
gggaacggaa ttttctgc 18
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pBl uescript II SK(+)的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>54
gtaaaacgac ggccagtg 18
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pBluescript II SK(+)的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>55
ggaaacagct atgaccatg 19
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>56
ttctttatca tcctcatgg 19
<210>57
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>57
tacaaatggt gaacgcagaa aattccgttc 30
<210>58
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>58
ttttctgcgt tcaccatttg taccatagag 30
<210>59
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因aprX的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>59
ctgatctcga cttcgttcta acaacctcac ttggcaa 37
<210>60
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸
<400>60
atagatcggc gcctgaaa 18
<210>61
<211>480
<212>PRT
<213>芽孢杆菌KSM-K38
<400>61
Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu
   1               5                  10                  15
Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu
             20                  25                  30
Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
         35                  40                  45
Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
     50                  55                  60
Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
 65                  70                  75                  80
Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn
                 85                  90                  95
Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp
        115                 120                 125
Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser
    130                 135                 140
Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe
145                 150                 155                160
Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg
                165                 170                 175
Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn
            180                 185                 190
Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val
        195                 200                 205
Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp
    210                 215                 220
Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr
225                 230                 235                 240
Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu
                245                 250                 255
Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe
            260                 265                 270
Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu
        275                 280                 285
Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met
    290                 295                 300
Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala
305                 310                 315                 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu
                325                 330                 335
Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu
            340                 345                 350
Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly
        355                 360                 365
Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu
    370                 375                 380
Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg
                405                 410                 415
Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser
            420                 425                 430
Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp
        435                 440                 445
Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp
    450                 455                 460
Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln
465                 470                 475                 480

Claims (11)

1.一种重组微生物，其特征在于，使用已经使枯草杆菌的 aprX基因或与该基因相当的基因缺失或失活的微生物作为宿主，向其中导入有编码异种蛋白质或多肽的基因。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，还使用已经使不同于枯草杆菌的 aprX基因或与该基因相当的基因的、编码蛋白酶的1种以上的基因缺失或失活的微生物作为宿主。
3.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述不同于枯草杆菌的 aprX基因或与该 aprX基因相当的基因的编码蛋白酶的基因为选自枯草杆菌的 aprE、 nprB、 nprE、 bpr、 vpr、 mpr、 epr和 wprA的各个基因以及与该基因相当的基因。
4.如权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，使用已经使枯草杆菌的 aprX、 aprE和 nprE的各个基因全部或者与该基因相当的3种基因全部缺失或失活的微生物作为宿主。
5.如权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，使用已经使枯草杆菌的 aprX、 aprE、 nprB、 nprE、 bpr、 vpr、 mpr、和 wprA的各个基因全部或者与该基因相当的9种基因全部缺失或失活的微生物作为宿主。
6.如权利要求1～5中任一项所述的微生物，其特征在于，微生物为枯草杆菌或其它芽孢杆菌属细菌。
7.如权利要求1～6中任一项所述的重组微生物，其特征在于，在编码异种蛋白质或多肽的基因的上游，连接有选自转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域中的一个以上的区域。
8.如权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，其为由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域构成的三个区域连接的重组微生物。
9.如权利要求7或8所述的重组微生物，其特征在于，分泌信号区域是来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因的区域，转录起始控制区域和翻译起始控制区域是来自该纤维素酶基因的上游0.6～1kb区域的区域。
10.如权利要求8所述的重组微生物，其特征在于，由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域构成的三个区域，是由序列号1表示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基编号为1～659的碱基序列、由序列号3表示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基编号为1～696的碱基序列、或者与该碱基序列的任一个具有70％以上同一性的碱基序列构成的DNA片段，或者由该碱基序列的一部分缺失的碱基序列构成的DNA片段。
11.一种蛋白质或多肽的制造方法，其特征在于，使用权利要求1～10中任一项所述的重组微生物。
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