JP2020092616A - モノアシルグリセロールリパーゼの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
また本発明は、枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されており、かつモノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、組換えバチルス属菌を提供する。
また本発明は、枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されたバチルス属菌に、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドを組み込むことを含む、組換えバチルス属菌の製造方法を提供する。
〔2〕好ましくは、培養物の上清から前記モノアシルグリセロールリパーゼを回収することをさらに含む、〔1〕記載の製造方法。
〔3〕好ましくは、前記バチルス属菌に、前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、〔1〕又は〔2〕記載の製造方法。
〔4〕前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが、
好ましくは、制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、タンパク質の分泌に関わる領域と連結されておらず、
より好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、
さらに好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、かつタンパク質の分泌に関わる領域と連結されていない、
〔3〕記載の製造方法。
〔5〕前記モノアシルグリセロールリパーゼが、
好ましくは、前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Bacterial Lipolytic Enzyme Family XVに属するモノアシルグリセロールリパーゼであり、
より好ましくは、該Family XVに属する、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼであり、
さらに好ましくは、配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであるか、配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドである、
〔1〕〜〔4〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔6〕好ましくは、前記枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌が、枯草菌aprE又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属菌である、〔1〕〜〔5〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔7〕好ましくは、前記aprEに相当する遺伝子が、aprE(BG10190)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつアルカリ側に至適pHを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、〔6〕記載の製造方法。
〔8〕前記バチルス属菌が、好ましくは、枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されたものである、
〔6〕又は〔7〕記載の製造方法。
〔9〕好ましくは、前記枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、及びaprXに相当する遺伝子が以下である、
eprに相当する遺伝子:epr(BG10561)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子;
wprAに相当する遺伝子:wprA(BG11846)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞壁結合型プロテアーゼ前駆体をコードする遺伝子;
mprに相当する遺伝子:mpr(BG10690)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外金属プロテアーゼをコードする遺伝子;
nprBに相当する遺伝子:nprB(BG10691)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外中性プロテアーゼBをコードする遺伝子;
bprに相当する遺伝子:bpr(BG10233)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつバシロペプチダーゼFをコードする遺伝子;
nprEに相当する遺伝子:nprE(BG10448)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外中性金属プロテアーゼをコードする遺伝子;
vprに相当する遺伝子:vpr(BG10591)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子;
aprXに相当する遺伝子:aprX(BG12567)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ菌体内セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、
〔8〕記載の製造方法。
〔10〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔1〕〜〔9〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔12〕前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが、
好ましくは、制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、タンパク質の分泌に関わる領域と連結されておらず、
より好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、
さらに好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、かつタンパク質の分泌に関わる領域と連結されていない、
〔11〕記載の組換えバチルス属菌。
〔13〕前記モノアシルグリセロールリパーゼが、
好ましくは、前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Bacterial Lipolytic Enzyme Family XVに属するモノアシルグリセロールリパーゼであり、
より好ましくは、該Family XVに属する、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼであり、
さらに好ましくは、配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであるか、配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドである、
〔11〕又は〔12〕記載の組換えバチルス属菌。
〔14〕好ましくは、枯草菌aprE又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている、〔11〕〜〔13〕のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌。
〔15〕好ましくは、前記aprEに相当する遺伝子が、aprE(BG10190)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつアルカリ側に至適pHを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、〔14〕記載の組換えバチルス属菌。
〔16〕好ましくは、枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されている、
〔14〕又は〔15〕記載の組換えバチルス属菌。
〔17〕好ましくは、前記枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、及びaprXに相当する遺伝子が以下である、
eprに相当する遺伝子:epr(BG10561)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子;
wprAに相当する遺伝子:wprA(BG11846)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞壁結合型プロテアーゼ前駆体をコードする遺伝子;
mprに相当する遺伝子:mpr(BG10690)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外金属プロテアーゼをコードする遺伝子;
nprBに相当する遺伝子:nprB(BG10691)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外中性プロテアーゼBをコードする遺伝子;
bprに相当する遺伝子:bpr(BG10233)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつバシロペプチダーゼFをコードする遺伝子;
nprEに相当する遺伝子:nprE(BG10448)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外中性金属プロテアーゼをコードする遺伝子;
vprに相当する遺伝子:vpr(BG10591)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子;
aprXに相当する遺伝子:aprX(BG12567)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ菌体内セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、
〔16〕記載の組換えバチルス属菌。
〔18〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔11〕〜〔17〕のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌。
〔20〕前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが、
好ましくは、制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、タンパク質の分泌に関わる領域と連結されておらず、
より好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、
さらに好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、かつタンパク質の分泌に関わる領域と連結されていない、
〔19〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔21〕前記モノアシルグリセロールリパーゼが、
好ましくは、前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Bacterial Lipolytic Enzyme Family XVに属するモノアシルグリセロールリパーゼであり、
より好ましくは、該Family XVに属する、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼであり、
さらに好ましくは、配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであるか、配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドである、
〔19〕又は〔20〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔22〕好ましくは、枯草菌aprE又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている、〔19〕〜〔21〕のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔23〕好ましくは、前記aprEに相当する遺伝子が、aprE(BG10190)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつアルカリ側に至適pHを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、〔22〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔24〕好ましくは、枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されている、
〔22〕又は〔23〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔25〕好ましくは、前記枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、及びaprXに相当する遺伝子が以下である、
eprに相当する遺伝子:epr(BG10561)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子;
wprAに相当する遺伝子:wprA(BG11846)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞壁結合型プロテアーゼ前駆体をコードする遺伝子;
mprに相当する遺伝子:mpr(BG10690)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外金属プロテアーゼをコードする遺伝子;
nprBに相当する遺伝子:nprB(BG10691)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外中性プロテアーゼBをコードする遺伝子;
bprに相当する遺伝子:bpr(BG10233)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつバシロペプチダーゼFをコードする遺伝子;
nprEに相当する遺伝子:nprE(BG10448)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ細胞外中性金属プロテアーゼをコードする遺伝子;
vprに相当する遺伝子:vpr(BG10591)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子;
aprXに相当する遺伝子:aprX(BG12567)とヌクレオチド配列において少なくとも90%の同一性を有し、かつ菌体内セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、
〔24〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔26〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔19〕〜〔25〕のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
適宜希釈した培養上清5μLを96穴アッセイプレート(IWAKI)の各ウェルに分注した。各ウェルに、さらに脱イオン水183μL、1M Tris−HCl(pH8.0)10μL、及び基質溶液2μLを分注し、反応を開始した。基質溶液には、4−Nitrophenyl octanoate(SIGMA−ALDRICH)を100mM含むジメチルスルホキシド(DMSO)溶液を用いた。40℃にて15分間反応させ、反応液の405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(TECAN)を用いて測定した。1Uは40℃で1分間に1μmolのpNAを遊離する酵素量と定義した。
(1)aprE欠失株の構築
(遺伝子欠失用プラスミドの構築)
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表3に示すaprEfw1とaprEUpr(配列番号27及び28)、及びaprEDNfとaprErv−repU(配列番号29及び30)の各プライマーセットを用いて、ゲノム上のaprE遺伝子の上流に隣接する0.6kb断片(A)、及び下流に隣接する0.5kb断片(B)をそれぞれ調製した。別途、プラスミドpC194(J.Bacteriol,150(2),815,1982)由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の上流にプラスミドpUB110(Plasmid,1986,15:93−103)由来のrepU遺伝子のプロモーター領域(Nucleic Acids Res,1989,17:4410)を連結した1.2kb断片(C)を調製した。断片(C)の調製では、まず、repUfwとrepUr−Cm(配列番号32及び33、表3)のプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて、repU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片(D)を調製した。さらにCmUf−repとCmrv1(配列番号34及び35、表3)のプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpC194を用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.8kb断片(E)調製した。次いで、断片(D)と(E)の混合物を鋳型とし、プライマーrepUfwとCmrv1を用いたSOE−PCRにより断片(C)を調製した。次に、得られた(A)、(B)及び(C)断片の混合物を鋳型とし、プライマーaprEfw2とCmrv2(配列番号31及び36、表3)を用いたSOE−PCRによって、(A)(B)(C)の順に断片を結合させ、2.2kbのDNA断片を得た。このDNA断片の末端を平滑化及び5’−リン酸化し、プラスミドpUC118(Methods Enzymol,1987,153:3−11)のSmaI制限酵素部位に挿入してaprE遺伝子欠失用プラスミドpUC118−CmrΔaprEを構築した。
構築したプラスミドpUC118−CmrΔaprEをコンピテントセル形質転換法(J Bacteriol,1967,93,1925−1937)によって枯草菌変異株trpC2(trpC2株)に導入した。aprE遺伝子上流領域又は下流領域の相当する領域間での1重交差の相同組換えによりプラスミドとゲノムDNAとが融合した形質転換株を、クロラムフェニコール耐性を指標に取得した。得られた形質転換株をLB培地に接種し、37℃にて2時間培養後、再度コンピテンス誘導操作を行い、導入したプラスミドとゲノム上に重複して存在するaprE遺伝子上流領域又は下流領域の間におけるゲノム内相同組換えを誘導した。プラスミド導入の際と異なる領域で相同組換えが起こった場合、aprE遺伝子、及びプラスミドに由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠失する。
(1)と同様の操作を繰り返すことにより、trpC2株からepr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、及びvprの各遺伝子を欠失させた遺伝子欠失株trpC2/Δepr、trpC2/ΔwprA、trpC2/Δmpr、trpC2/ΔnprB、trpC2/Δbpr、trpC2/ΔnprE、及びtrpC2/Δvprを取得した。各欠失株の作製に用いたプライマーの配列を表4〜5に、また各プライマーと(1)で用いたaprE遺伝子欠失用プライマーとの対応を表6に示す。
二重交差法によりaprX遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されたaprX遺伝子欠失株を構築した。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表7に示すaprX+5FとaprX+563R(配列番号72及び73)、及びaprX+775FとaprX+1320R(配列番号74及び75)の各プライマーセットを用いて、ゲノム上のaprX遺伝子の上流を含む5’末端側の558bp断片(F)、及び3’末端側の545bp断片(G)をそれぞれ調製した。別途、プラスミドpDG1727(Gene,167,335,1995)のBamHI及びXhoI制限酵素切断点よりスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、pBluescript II SK(+)(Stratagene)のBamHI及びXhoI制限酵素切断点に挿入し、プラスミドpBlueSPRを構築した。pBlueSPRのDNAを鋳型とし、PB−M13−20とPB−M13Rev(配列番号76及び77、表7)のプライマーセットを用いてスペクチノマイシン耐性遺伝子領域(H)を増幅した。(F)、(G)及び(H)断片の混合物を鋳型とし、aprX+5FとaprX+1320R(配列番号72及び75、表7)のプライマーセットを用いたSOE−PCR法により、(E)(H)(G)の順に結合したDNA断片を調製した。調製したDNA断片を用い、コンピテントセル形質転換法によるtrpC2株の形質転換を行い、次いでスペクチノマイシン(100μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってaprX遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認して、aprX遺伝子欠失株trpC2/ΔaprXを取得した。
(1)EstGtA2発現組換え枯草菌株の構築
実施例1で作製した遺伝子欠失株にモノアシルグリセロールリパーゼEstGtA2(配列番号1)をコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌株を構築した。枯草菌用にコドン至適化したEstGtA2をコードする遺伝子(配列番号7)をプラスミドpUC57に挿入したプラスミド(EstGtA2−pUC57)を、GenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。これを鋳型とし、プライマーEstGtA2−F及びプライマーEstGtA2−R(配列番号13及び14、表2)のプライマーセットを用いてPCRを行った。同様に、WO2006/068148A1の実施例7に記載のプラスミドpHY−S237を鋳型とし、プライマーpHY−S237−F及びpHY−S237−R(配列番号15及び16、表2)を使用してPCR反応を行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理を行った。得られた両断片を適量混合し、In−fusion法を用いてプラスミドを合成した(pHY−EstGtA2)。この際、セルラーゼS237の制御領域(転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域を含む領域、配列番号78)とEstGtA2の遺伝子が作動可能に連結するように設計した。得られたプラスミドをプロトプラスト形質転換法にてtrpC2株(対照)、及び実施例1で作製した遺伝子欠失株trpC2/ΔaprE、trpC2/Δepr、trpC2/ΔwprA、trpC2/Δmpr、trpC2/ΔnprB、trpC2/Δbpr、trpC2/ΔnprE、trpC2/Δvpr、及びtrpC2/ΔaprXに導入した。
(1)で得られた組換え枯草菌株を3mL/大試験管(φ18×180mm)のLB培地で30℃、15時間、250rpmで振盪培養した。得られた培養液0.02mLを20mL/500mL容ヒダ付三角フラスコ(バイオット)の2×L−マルトース培地に接種し、30℃で96時間、210rpmで振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離(8000rpm×30分)し、得られた上清からフィルター(0.45μm、PVDF、メルクミリポア製)によって菌体を除き、残った培養上清のリパーゼ活性を測定した。またSDS−PAGEにより、培養上清におけるEstGtA2の蓄積を確認した。SDS−PAGEでは、タンパク質のバンドはBio−Safe CBB G−250ステイン(Bio−Rad)を用いて確認した。
(1)MGLP発現組換え枯草菌株の構築
Bacterial Lipolytic Enzyme Family XVに属するMGLPであるH−257、stLP、CI220−6、CI220−10、及びCI220−12(配列番号2〜6)を発現する組換え枯草菌株を構築した。枯草菌用にコドン至適化した各MGLPをコードする遺伝子(配列番号8〜12)をプラスミドpUC57に挿入したプラスミド(H−257−pUC57、stLP−pUC57、CI220−6−pUC57、CI220−10−pUC57、及びCI220−12−pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。作製したプラスミドを鋳型として、表2に示すプライマーペアH257−F/R(配列番号17及び18)、stLP−F/R(配列番号19及び20)、CI220−6−F/R(配列番号21及び22)、CI220−10−F/R(配列番号23及び24)、及びCI220−12−F/R(配列番号25及び26)をそれぞれ用いてPCRを行った。同様に、プラスミドpHY−S237を鋳型とし、プライマーpHY−S237−F及びpHY−S237−R(配列番号15及び16)を使用してPCR反応を行った。実施例2(1)と同様に、PCR産物のDpnI処理し、In−fusion法を用いてプラスミドを合成し(pHY−H−257、pHY−stLP、pHY−CI220−6、pHY−CI220−10、及びpHY−CI220−12)、得られたプラスミドをプロトプラスト形質転換法にてtrpC2株及びtrpC2/ΔaprE株に導入した。
(1)で得られた組換え枯草菌株を1mLのLB培地で一夜、30℃で振盪培養した。得られた培養液0.003mLを3mLの2×L−マルトース培地に接種し、30℃で72時間振盪培養した。培養後、実施例2(2)と同様の手順で、培養上清を分離し、SDS−PAGEにより菌体外に生産されたMGLPの量を確認した。タンパク質のバンドはミニプロティアンTGX Stain−Freeゲル(Bio−Rad)により確認した。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
Claims (21)
- 枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌を培養してモノアシルグリセロールリパーゼを発現させることを含む、モノアシルグリセロールリパーゼの製造方法。
- 培養物の上清から前記モノアシルグリセロールリパーゼを回収することをさらに含む、請求項1記載の製造方法。
- 前記バチルス属菌に、前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、請求項1又は2記載の製造方法。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが制御領域と作動可能に連結されている、請求項3記載の製造方法。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Bacterial Lipolytic Enzyme Family XVに属するモノアシルグリセロールリパーゼである、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼである、請求項5記載の製造方法。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌が、枯草菌aprE又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属菌である、請求項1〜8のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記バチルス属菌が、枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されたものである、請求項9記載の製造方法。
- 前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、請求項1〜10のいずれか1項記載の製造方法。
- 枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されており、かつモノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、組換えバチルス属菌。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが制御領域と作動可能に連結されている、請求項12記載の組換えバチルス属菌。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Bacterial Lipolytic Enzyme Family XVに属するモノアシルグリセロールリパーゼである、請求項12又は13記載の組換えバチルス属菌。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、バチルス属菌又はゲオバチルス属由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼである、請求項14記載の組換えバチルス属菌。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号1及び2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項12〜15のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌。
- 前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号3〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項12〜15のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌。
- 枯草菌aprE又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている、請求項12〜17のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌。
- 枯草菌epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されている、請求項18記載の組換えバチルス属菌。
- 前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、請求項12〜19のいずれか1項記載の組換えバチルス属菌。
- 枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されたバチルス属菌に、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドを組み込むことを含むか、又は、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドを組み込んだバチルス属菌において枯草菌AprE又はこれに相当するプロテアーゼの活性を低減させることを含む、組換えバチルス属菌の製造方法。
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