JP5161507B2 - 微生物株及び目的物質の製造方法 - Google Patents
微生物株及び目的物質の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5161507B2 JP5161507B2 JP2007204413A JP2007204413A JP5161507B2 JP 5161507 B2 JP5161507 B2 JP 5161507B2 JP 2007204413 A JP2007204413 A JP 2007204413A JP 2007204413 A JP2007204413 A JP 2007204413A JP 5161507 B2 JP5161507 B2 JP 5161507B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- region
- strain
- bacillus subtilis
- nuclease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(a)配列番号1で示される塩基配列における塩基番号1〜659の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号3で示される塩基配列における塩基番号1〜696の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(c)上記(a)又は(b)のポリヌクレオチドと70%以上の同一性を有するポリヌクレオチド
(d)上記(a)又は(b)のポリヌクレオチドにおいて、1又は数個の塩基が欠失、置換、負荷又は挿入されたポリヌクレオチド
本発明に係る微生物株は、野生型と比較して枯草菌が有するヌクレアーゼ関連遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子(以下、これらを纏めてヌクレアーゼ関連遺伝子と称する)のうち少なくとも1以上が欠失又は不活性化しているといった技術的特徴を有している。ここで、本発明に係る微生物株は、遺伝子組み換え法によって野生型の微生物からヌクレアーゼ関連遺伝子を欠失又は不活性化させた組換え株と、遺伝子組み換え法によらず上記ヌクレアーゼ関連遺伝子を欠失又は不活性化している自然発生的な変異体とを含む意味である。
本実施例では、枯草菌168株からaddA遺伝子、addB遺伝子、sbcD遺伝子、xseA遺伝子、xseB遺伝子、yncB遺伝子、yorK遺伝子或いはyokF遺伝子を欠失した枯草菌株を、以下のようにして作製した。以下の手順において使用するプライマー名及びその塩基配列を表2に纏めて示した。
本実施例では、枯草菌MGB874株からaddA遺伝子、addB遺伝子、sbcD遺伝子、xseA遺伝子或いはxseB遺伝子を欠失した枯草菌株を作製した。詳細には、実施例1と同様にして欠失目的の遺伝子を欠失させるためのDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌MGB874株の形質転換を行い、同様な薬剤耐性を指標として形質転換体を分離し、PCRによって欠失目的の遺伝子が欠失され薬剤耐性遺伝子に置換していることを確認した。
以上、本実施例2において、枯草菌MGB874株からaddA遺伝子、addB遺伝子、sbcD遺伝子、xseA遺伝子或いはxseB遺伝子を欠失した枯草菌株を作製することができた。
実施例1にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌168株に、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)をコードするDNA断片(3.1kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を、プロトプラスト形質転換法によってそれぞれ導入した。これによって得られた菌株を10mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、細胞の密度として培養液のOD600を測定し、次に、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量、及び、細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量を求めた。結果を表3に示す。
実施例2にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照としてMGB874株に、実施例3と同様にして組換えプラスミドpHY−S237を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を実施例3と同様の方法で培養し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量及び細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量を求めた。結果を表4に示す。
74株の場合と比較して高いアルカリセルラーゼ分泌生産量が認められた。
Claims (3)
- addA遺伝子、addB遺伝子、sbcD遺伝子、xseA遺伝子、xseB遺伝子及びnucB遺伝子のうち少なくとも1以上の内在性のヌクレアーゼ関連遺伝子が欠失又は不活性化され、且つ目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有するか、又は目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有するベクターを有する、分泌生産性が向上した枯草菌(Bacillus subtilis)168株であって、
上記目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流には、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域が結合されており、該分泌用シグナル領域はバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来であり、該転写開始制御領域及び該翻訳開始制御領域は当該セルラーゼ遺伝子の上流領域由来であり、該転写開始制御領域、該翻訳開始制御領域及び該分泌シグナル領域から成る領域が、以下の(a)、(b)又は(c)のポリヌクレオチドである、前記枯草菌168株。
(a) 配列番号1で示される塩基配列における塩基番号1〜659の塩基配列から成るポリヌクレオチド
(b) 配列番号3で示される塩基配列における塩基番号1〜696の塩基配列から成るポリヌクレオチド
(c) 上記(a)又は(b)のポリヌクレオチドと90%以上の同一性を有するポリヌクレオチド - 上記分泌生産性は、細胞あたりの生産量又は分泌生産総量であることを特徴とする、請求項1記載の枯草菌168株。
- 請求項1又は2記載の枯草菌168株を培養し、菌体外に上記目的のタンパク質又はポリペプチドを生産することを特徴とする、タンパク質又はポリペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007204413A JP5161507B2 (ja) | 2007-08-06 | 2007-08-06 | 微生物株及び目的物質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007204413A JP5161507B2 (ja) | 2007-08-06 | 2007-08-06 | 微生物株及び目的物質の製造方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009038980A JP2009038980A (ja) | 2009-02-26 |
JP2009038980A5 JP2009038980A5 (ja) | 2010-07-22 |
JP5161507B2 true JP5161507B2 (ja) | 2013-03-13 |
Family
ID=40440440
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007204413A Expired - Fee Related JP5161507B2 (ja) | 2007-08-06 | 2007-08-06 | 微生物株及び目的物質の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5161507B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5828634B2 (ja) * | 2010-12-24 | 2015-12-09 | 花王株式会社 | 組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4485341B2 (ja) * | 2004-12-20 | 2010-06-23 | 花王株式会社 | 組換え微生物 |
-
2007
- 2007-08-06 JP JP2007204413A patent/JP5161507B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009038980A (ja) | 2009-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4955358B2 (ja) | 新規枯草菌変異株 | |
JP2006296268A (ja) | 組換え微生物 | |
JP4336184B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5294666B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4915728B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP2005137308A (ja) | 組換え微生物 | |
JP5513759B2 (ja) | タンパク質又はポリペプチドの生産方法 | |
AU2010308865B2 (en) | Modified promoter | |
JP4832153B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4509743B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5161507B2 (ja) | 微生物株及び目的物質の製造方法 | |
JP2006345860A (ja) | 組換えバチルス属細菌 | |
EP1680502B1 (en) | Recombinant microorganism | |
JP4676847B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4676848B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4839169B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4643999B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP2005295830A (ja) | 宿主微生物 | |
JP5829802B2 (ja) | 組換え枯草菌 | |
JP4861659B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP2009034067A (ja) | 組換え微生物 | |
JP4842750B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4463871B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5474448B2 (ja) | 変異バチルス属細菌 | |
JP4842751B2 (ja) | 組換え微生物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100608 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100608 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120807 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121005 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121204 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121214 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151221 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |