CN101395264A - 重组微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纤维素酶的生产率提高且在纤维素酶的工业生产中有用的微生物、以及利用该微生物制造纤维素酶的方法。一种重组微生物，其中，在进行基因构建，使枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因过量表达而获得的微生物中，导入编码纤维素酶的基因。
Description
技术领域
本发明涉及在纤维素酶的生产中使用的重组微生物和使用该重组微生物的纤维素酶制造方法。
背景技术
纤维素是植物细胞壁的主要成分，其为有效地利用在衣料、纸张、建筑材料等中的生物质中的具有代表性的成分。另外，作为生物质的有效利用方法，一直以来尝试使用分解纤维素的酶转换为糖类、或进一步转换为能量物质的方法。另外，在由掘越发现来自嗜碱性杆菌属细菌的碱性纤维素酶以来(例如，参照专利文献1、非专利文献1)，一直难以实现的将纤维素酶应用在衣料用重质洗涤剂成为可能，实现嗜碱性杆菌属细菌生产的碱性纤维素酶向衣料用洗涤剂中的配合(例如，参照专利文献2～4)。
近年，随着基因工程的发展，由微生物产生的有用物质的工业化生产正在扩大，洗涤剂用酶的生产也由基因重组向大量生产发展。在这种由微生物产生的有用物质的工业生产中，提高其生产率是重要课题之一。作为解决该课题的方法，正在进展由突变等遗传学方法进行的生产菌的育种、适合基因重组的宿主微生物的开发。
另一方面，在以枯草杆菌为首的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌和包括这些菌的革兰氏阳性菌、进而在大肠菌等革兰氏阴性菌中，细胞内合成的蛋白质(未成熟的分泌蛋白质)向细胞外的输送主要经过称为Sec通路的运输系统进行。枯草杆菌中的Sec通路通过承担将分泌蛋白质向细胞外挤出的马达作用的SecA、另外的构成分泌蛋白质通过的输送通道的主要部分的SecY、SecE、SecG 3种蛋白质、此外的作为输送通道辅助因子的SecDF等，承担其功能。
其中，关于能够过量表达编码SecG蛋白质的secG基因的表达载体(专利文献5)、通过改变secG基因的核糖体结合部位而改变secG基因的表达的革兰氏阳性菌(专利文献6)已经有报告，报告显示，在异种蛋白质生产时，破坏了secG基因的枯草杆菌的生长发育受到阻碍等。还有报告，在大肠菌中，secY基因的突变阻碍在低温下的生长发育和蛋白质分泌(非专利文献2)。
但是，至今尚没有报告显示通过secG基因、secY基因在活菌内过量表达来提高目的蛋白质的分泌生产率的数据，另外，关于其它的Sec通路相关基因的过量表达对目的蛋白质的分泌生产带来怎样的影响，至今也没有得到充分的见解。
专利文献1：日本特公昭50—28515号公报
专利文献2：日本特公昭60—23158号公报
专利文献3：日本特公平6—030578号公报
专利文献4：美国专利第4945053号公报
专利文献5：日本特表2001—510046号公报
专利文献2：美国专利申请公开第2003/0157642号说明书
非专利文献1：Horikoshi & Akiba，Alkalophilic Microorganisms，Springer，Berlin(1982)
非专利文献2：Cell，32，：789(1983)
发明内容
本发明涉及一种重组微生物，其中，在进行基因构建，使枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因过量表达而获得的微生物中，导入编码纤维素酶的基因。
另外，本发明涉及一种使用该重组微生物的纤维素酶的制造方法。
附图说明
图1是示意地表示使用通过SOE-PCR法调制的结合核酸片段的基因导入的图。
图2是示意地表示通过SOE-PCR法调制连接有spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合区域的secY基因导入用DNA片段、以及使用该DNA片段将基因导入染色体中的方法的一个例子的图。
图3是示意地表示通过SOE-PCR法调制基因导入用DNA片段以及使用该DNA片段将基因导入染色体中的方法的一个例子的图，其中，该基因导入用DNA片段在secY基因下游连接有secE基因，使得secE基因与导入amyE基因部位的secY基因共同被转录。
具体实施方式
本发明涉及提供一种纤维素酶的生产率提高且在纤维素酶的工业化生产中有用的微生物，并提供一种利用该微生物的纤维素酶的制造方法。
本发明的发明人在微生物基因组上被编码的各种基因中，探索了对有用的蛋白质或多肽的生产带来影响的基因后发现，过量表达编码枯草杆菌分泌装置的主要构成因子的secY基因的微生物，对提高纤维素酶的生产率特别有用。
本发明的重组微生物是在纤维素酶的生产中特别有用的微生物，通过使用该微生物，能够实现纤维素酶生产率的提高。
在本发明中，转录起始控制区域是包含启动子和转录起始点的区域，核糖体结合部位是相当于与起始密码子共同形成翻译起始控制区域的Shine-Dalgarno(SD)序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463(1974))的部位。
在本发明中，所谓基因的上游、下游，不是从复制起始点起的位置，所谓上游，表示与作为对象而着眼的基因或区域的5’侧连接的区域，另一方面，所谓下游，表示与作为对象而着眼的基因或区域的3’侧连接的区域。
在本发明中，氨基酸序列和碱基序列的同一性，由Lipman-Pearson法(Science，227,1435，(1985))计算。具体而言，使用基因信息处理软件Genetyx-Win(软件开发)的同源性分析(Search homology)程序，使Unit size to compare(ktup)为2进行分析，由此算出。
作为用于构建本发明微生物的亲本微生物，只要是具有枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因的微生物即可，该微生物既可以是野生型的，也可以是进行过突变的。具体而言，可以列举芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、梭菌(Clostridium)属细菌或酵母等，其中，优选芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。从全基因组信息被了解清楚、基因工程、基因组工程技术被确立的方面以及从具有向菌体外分泌生产蛋白质的能力的方面出发，特别优选枯草杆菌(Bacillus subtilis)。
在本说明书中记载的枯草杆菌各基因和基因区域的名称根据在Nature，390,249-256(1997)中的报告、在JAFAN：Japan FunctionalAnalysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)中被网上公开(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)的枯草杆菌基因组数据而记载。
本发明的枯草杆菌secY基因，指的是由序列编号1所示的碱基序列构成的基因。所谓相当于枯草杆菌secY基因的基因，指的是与枯草杆菌secY基因实质上具有同样功能的基因，例如，可以列举在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、碳疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或iheyensis海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)等中，主要通过基因组分析而确定的各secY基因和编码secY蛋白质的基因。另外，也有如碳疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)这样的确定了两种该基因的细菌。另外，作为相当于枯草杆菌secY基因的基因，可以列举以下(1)～(4)的任意一种基因。
(1)由与序列编号1所示的碱基序列具有90％以上、优选95％以上、更优选99％以上同一性的碱基序列构成，并且由编码与序列编号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等价的蛋白质的DNA构成的基因。
(2)由与序列编号1所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交、并且编码与序列编号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等价的蛋白质的DNA构成的基因。另外，在这里，作为“严格条件”，例如，可以列举Molecular Cloning—A LABORATORYMANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook，David W.Russell.，ColdSpring Harbor Laboratory Press]中记载的方法，例如，可以列举在含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt和100mg/ml鲱鱼精子DNA的溶液中，在65℃、恒温8～16小时下与探针共同杂交的条件。
(3)由编码与序列编号2所示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选99％以上的同一性的氨基酸序列构成、并且与由序列编号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等价的蛋白质的DNA构成的基因。
(4)由编码序列编号2所示的氨基酸序列中1个或2个以上氨基酸缺失、取代或添加而得到的氨基酸序列构成、并且与由序列编号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等价的蛋白质的DNA构成的基因。另外，在这里，序列编号2所示的氨基酸序列中1个或2个以上氨基酸缺失、取代或添加而得到的氨基酸序列中，包含1个或数个、优选1～10个氨基酸缺失、取代或添加而得到的氨基酸序列，在添加中，包括向两个末端添加1个～数个氨基酸。
另外，所谓与序列编号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等价的蛋白质，指的是与secY基因所编码的蛋白质实质上具有相同的功能、能够构成分泌蛋白质通过的输送通道的主要部分的蛋白质。
作为使枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因过量表达的手段，例如，可以列举将在微生物中具有功能的转录起始控制区域、或转录起始控制区域和核糖体结合部位导入枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因在基因组上的上游、或者导入枯草杆菌secY基因或含有该基因的基因组上的操纵子的先头基因的上游，或者，导入将在微生物中具有功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位与枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因的上游连接而得到的基因片段。
在这里，作为在微生物中具有功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位，只要是在作为宿主的微生物中发挥功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位，则没有特别限定，例如，优选位于枯草杆菌spoVG基因或aprE基因或者相当于这些基因的基因上游的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位，特别优选位于枯草杆菌spoVG基因或相当于该基因的基因上游的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位。
作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区域，可以列举根据JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORFDB)的网上公开(http://bacillus.genome.ad.jp/，2004年3月10日更新)，作为基因编号BG101126公开的控制spoVG基因转录的区域。更具体而言，可以列举由序列编号7的碱基序号38～210所示的碱基序列构成的DNA，或者由与该序列相同的碱基序列构成的、具有作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区域的功能的DNA。另外，作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位，可以列举由序列编号7的碱基序号38～230所示的碱基序列构成的DNA、或由与该序列相同的碱基序列构成、具有作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位的功能的DNA。
作为与序列编号7的碱基序号38～210所示的碱基序列、碱基序号38～230所示的碱基序列相同的碱基序列，例如，可以列举(A)由与序列编号7的碱基序号38～210或碱基序号38～230所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的DNA构成的碱基序列，(B)与序列编号7的碱基序号38～210或碱基序号38～230所示的碱基序列具有90％以上、优选95％以上、更优选99％以上的同一性的碱基序列等。
另外，在这里，作为“严格条件”，可以列举和上述同样的条件。
另外，所谓具有作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区域、或转录起始控制区域和核糖体结合部位的功能，指的是在导入枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因的上游、或者导入枯草杆菌secY基因或含有该基因的基因组上的操纵子的先头基因(在枯草杆菌中为rpsJ基因)的上游时，过量表达secY基因或相当于该基因的基因，从而提高目的蛋白质或多肽的生产率，而且，其提高程度和将枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位导入枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因上游、或者导入枯草杆菌secY基因或含有该基因的基因组上的操纵子的先头基因(在枯草杆菌中为rpsJ基因)的上游时的提高程度同等。
在将该转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位向secY基因或相当于该基因的基因在基因组上的上游、或者枯草杆菌secY基因或含有该基因的基因组上的操纵子的先头基因(在枯草杆菌中为rpsJ基因)的上游导入时，除了将枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因、或者枯草杆菌secY基因或含有该基因的基因组上的操纵子的本来的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的一部分或全部取代以外，也包括残留或插入本来的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的情况。
对该转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的取代，例如，能够使用采用同源重组的公知方法进行。即，首先，采用SOE(splicing by overlap extension)—PCR法(Gene，77，61.1989)等公知的方法，使含有包含secY基因的操纵子本来的转录起始控制区域的上游区域的DNA片段和耐药性基因片段结合在包含这样的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的DNA片段上游，另一方面，使作为包含secY基因的操纵子的先头基因rpsJ基因的翻译起始控制区域和结构基因区域的一部分或全部、或rpsJ基因的结构基因区域的一部分或全部的DNA片段结合在下游。这样，得到以下述顺序结合的DNA片段：含有包含secY基因的操纵子本来的转录起始控制区域的上游区域的DNA片段、耐药性基因片段、含有该转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的DNA片段、含有rpsJ基因的翻译起始控制区域和结构基因区域的一部分或全部、或rpsJ基因的结构基因区域的一部分或全部的DNA片段。接着，采用公知方法使这样的DNA片段被摄入到亲本微生物细胞内，由此，在亲本微生物基因组上的两处，即，包含secY基因的操纵子本来的转录起始控制区域的上游区域、以及包含rpsJ基因的翻译起始控制区域和结构基因区域的一部分或全部、或rpsJ基因的结构基因区域的一部分或全部区域，发生双交换同源重组。其结果为，能够以上述抗药基因作为指标，分离本来的转录起始控制区域、或转录起始控制区域和核糖体结合部位被该转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位取代而得到的转化体。由此，向基因组上的包含secY基因的操纵子上游导入的该转录起始控制区域、或转录起始控制区域和核糖体结合部位被遗传性稳定地保持。另外，作为将导入用DNA片段导入宿主微生物中的具体方法，可以列举感受态细胞转化方法(J.Bacterial.93，1925(1967))、原生质体转化法(Mol.Gen.Genet.168,111(1979))或电穿孔法(FEMS Microbiol.Lett，55,135(1990))等，特别优选感受态细胞转化方法。
特别是使用枯草杆菌作为本发明微生物的宿主时，从包含secY基因的操纵子本来的转录起始控制区域、或转录起始控制区域和核糖体结合部位向该转录起始控制区域、或转录起始控制区域和核糖体结合部位的同源重组所引起的取代，能够利用在Mol.Gen.Genet.223,268(1990)中记载的方法等进行。
另外，该转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的插入，如果适当选择在想插入的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的两个末端上添加的DNA片段的序列，就能够通过与上述取代方法同样的方法进行。例如，在这样的转录起始控制区域的上游，使含有包括secY基因的操纵子本来的转录起始控制区域的上游区域的DNA片段与耐药性基因片段结合，在下游使包含一部分或全部本来的转录起始控制区域的DNA片段结合。这样，得到依次结合有下述片段的DNA片段：含有包括secY基因的操纵子本来的转录起始控制区域的上游区域的DNA片段、耐药性基因片段、包含该转录起始控制区域、一部分或全部本来的转录起始控制区域的DNA片段。接着，在宿主微生物中插入这样的DNA片段后，能够以耐药性基因为指标分离转化体。在这样分离而得到的转化体的基因组上，包含secY基因的操纵子本来的转录起始控制区域和该转录起始控制区域以相互没有间隔的相邻连接的状态被稳定保持。或者，调制在这样的转录起始控制区域的上游结合包含secY基因的上游区域的DNA片段和耐药性基因片段、在下游结合包含一部分或全部secY基因的DNA片段而得到的DNA片段并使用，由此以该转录起始控制区域被导入secY基因正上游的状态被稳定地保持。
在本发明中，所谓在微生物中具有功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位被导入的基因组上的上游，只要是包含secY基因的操纵子的先头基因rpsJ基因的起始密码子的上游侧，或者只要是secY基因的起始密码子的上游侧，则没有特别的限定，但优选为相邻连接的2000碱基对以内的区域，更优选为500碱基对以内的区域，进一步优选为100碱基对以内的区域，特别优选为50碱基对以内的区域。
将本发明中的该转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位与secY基因或相当于该基因的基因的上游连接而得到的基因片段的导入，能够使用通过限制性内切酶法、SOE(splicing by overlapextension：重叠区扩增基因拼接法)—PCR(Gene，77，61.1989)法等公知的方法，连接以枯草杆菌或其它微生物的基因组为模板、通过PCR法等公知的克隆方法得到的该转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的片段、和secY基因或相当于该基因的基因的片段而得到的基因片段进行。这样的片段能够通过使以公知的转化法导入细胞内的核酸片段和染色体之间进行同源重组而导入染色体上。
导入的secY基因或相当于该基因的基因碱基序列，只要是secY基因或相当于该基因的基因的碱基序列，可以是和该微生物本来具有的secY基因或相当于该基因的基因的碱基序列不一致的碱基序列。另外，导入的枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位等，只要是在微生物中发挥功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的碱基序列，可以是和该微生物本来具有的碱基序列不一致的碱基序列。作为将核酸片段导入宿主的方法，可以列举感受态细胞转化方法、原生质体转化法或电穿孔法等，特别优选感受态细胞转化方法。
另外，这样的片段能够通过质粒等载体导入细胞质中。另外，如在后述实施例中所示的那样，由于这样的片段每1个菌体导入1个拷贝就对目的蛋白质或多肽的生产发挥充分的效果，所以，在由质粒导入时，即使在生产培养中一部分质粒脱落，也不易受到其影响。
另外，作为在宿主中发生导入的染色体区域，优选是非必须基因的内部或非必须基因上游的非基因区域的内部，例如，可以列举aprE基因、sacB基因、nprE基因、amyE基因、ybxG基因的内部、或该基因上游的非基因区域内部，但优选amyE基因的内部、或ybxG基因上游的非基因区域的内部。在这里，非必须基因的含义是即使被破坏，至少在某种条件下，宿主仍然能够生存的基因。另外，在导入时，即使伴有非必须基因、或非必须基因上游的非基因区域一部分或全部缺失，也不产生任何问题。
在本发明中，在不影响纤维素酶生产率提高的范围内，除过量表达上述枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因以外，既可以进行枯草杆菌的Sec通路相关的其它基因、例如secE基因等的过量表达，也可以同时进行Sec通路以外的功能相关基因的过量表达或者1个或2个以上基因的失活、缺失。另外，在基因的失活、缺失中，除该基因中的全部或一部分碱基取代、缺失以外，还包含向该基因中插入碱基。
以下，进一步具体地说明将使用由SOE(splicing by overlapextension：重叠区扩增基因拼接法)—PCR(Gene，77，61.1989)法调制的DNA片段而得到的spoVG基因的转录起始控制区域、或转录起始控制区域和核糖体结合部位，通过与连接在secY基因上游的基因片段进行双交换而导入宿主基因组上的方法，但本发明中的导入方法不限定于下述方法。
在本方法中使用的导入用DNA片段，是与宿主基因组上的导入部位上游相邻连接的约0.1～3、优选0.4～3kb的片段(以下称为片段(1))和与下游相邻连接的约0.1～3、优选0.4～3kb的片段(以下称为片段(2))之间，依次插入有包含该spoVG基因的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的片段(以下称为片段(3))、secY基因片段(以下称为片段(4))和抗氯霉素基因等抗药性标记基因片段(以下称为片段(5))的DNA片段。首先，通过第一次PCR，调制片段(1)～片段(5)的5个片段。此时，例如，使用以下述方式设计的引物：在片段(1)的下游末端添加片段(3)的上游侧10～30碱基对序列、在片段(4)的上游末端添加片段(3)的下游侧10～30碱基对序列、在片段(4)的下游末端添加片段(5)的上游侧10～30碱基对序列、进而在片段(2)的上游侧添加片段(5)的下游侧10～30碱基对序列(图1)。
接着，以第一次中调制的5种PCR片段作为模板，使用片段(1)上游侧引物和片段(2)下游侧引物，进行第二次PCR。由此，在片段(1)下游末端所添加的片段(3)的序列与片段(3)发生退火，同样，在片段(4)上游末端所添加的片段(3)的序列与片段(3)发生退火，在片段(4)下游末端所添加的片段(5)的序列与片段(5)发生退火，在片段(2)上游末端所添加的片段(5)的序列与片段(5)发生退火，所以，PCR扩增的结果，能够得到以(1)(3)(4)(5)(2)的顺序结合有片段(1)～片段(5)的5个片段的DNA片段(图1)。
在这里进行的PCR反应，可以使用表1所示的引物组合，使用Pyrobest DNA多聚酶(宝酒造)等一般的PCR用酶试剂盒等，根据著述(PCR Protocols.Current Methods and Applications，Edited byB.A.White，Humana Press pp251，1993，Gene，77，61，1989)等所示的通常条件进行。
如果将这样所得到的导入用DNA片段通过感受态法等导入细胞内，则在具有同一性的基因组上导入部位的上游和下游的相同区域，发生细胞内的基因重组，通过以抗药性标记进行的选择，能够分离导入有在secY基因上游连接有spoVG基因的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位的基因片段的细胞。以抗药性标记进行的选择，例如，可以通过分离在含有氯霉素的琼脂培养基上生长的菌落，然后通过以基因组为模板的PCR法等，选择被确认导入基因组上的细胞而进行。另外，上述抗药性标记基因只要是在使用一般采用的抗生物质进行的选择中能够利用的基因，则没有特别限定，除抗氯霉素基因以外，可以列举抗红霉素基因、抗新霉素基因、抗大观霉素基因、抗四环素基因和抗灭瘟素S基因等抗药性标记基因。
本发明的微生物，能够通过将编码目的纤维素酶基因导入这样制作的微生物中而制作。另外，在这里，编码纤维素酶的基因的含义不仅包括该微生物本来具有的基因，而且包括该微生物本来没有的基因，即外来基因。
作为本发明中的纤维素酶，可以列举在多糖水解酶的分类(Biochem.J.，280,309，1991)中属于家族—5的纤维素酶，其中，可以列举来自微生物、特别是来自Bacillus属细菌的纤维素酶。例如，可以列举来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-64株(FERM BP-2886)的纤维素酶，作为更适合的例子，可以列举由序列编号4的氨基酸序号1～795的氨基酸序列构成的来自Bacillus属细菌的碱性纤维素酶、或由序列编号6的氨基酸序号1～793的氨基酸序列构成的来自Bacillus属细菌的碱性纤维素酶、或与该氨基酸序列具有70％、优选80％、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同一性的氨基酸序列构成的纤维素酶。
应该导入本发明的微生物中的纤维素酶基因，希望在其上游以适当形式结合与该基因的转录、翻译、分泌相关的控制区域，即，选自包含启动子和转录起始点的转录起始控制区域、包含核糖体结合部位和起始密码子的翻译起始控制区域、以及分泌信号肽区域的1个以上的区域。特别优选结合由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号肽区域构成的三区域，更希望分泌信号肽区域来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因，转录起始控制区域和翻译起始控制区域为该纤维素酶基因的上游0.6～1kb区域，与目的纤维素酶基因适当地结合。例如，希望来自在日本特开2000—210081号公报、日本特开平4—190793号公报等中记载的Bacillus属细菌，即KSM-S237株(FERMBP-7875)、KSM-64株(FERM BP-2886)的纤维素酶基因和该纤维素酶基因的转录起始控制区域、翻译起始控制区域及分泌信号肽区域，与纤维素酶的结构基因适当地结合。更具体而言，希望序列编号3所示的碱基序列的碱基序号1～659的碱基序列、或序列编号5所示的碱基序列的碱基序号1～696的碱基序列、或者由相对该碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同一性的碱基序列构成的DNA片段、或由上述任意一个碱基序列的一部分缺失、取代或添加而得到的碱基序列构成的DNA片段，与纤维素酶的结构基因适当地结合。另外，在这里，所谓由上述碱基序列的一部分缺失、取代或添加而得到的碱基序列构成的DNA片段，意指上述碱基序列的一部分缺失、取代或添加，但仍然保持着与基因的转录、翻译、分泌相关的功能的DNA片段。
这样的编码目的纤维素酶的基因的导入，例如，能够通过(1)通过载体导入、(2)通过向基因组的插入而进行。在(1)通过载体导入的情况下，通过感受态细胞转化方法、原生质体转化法或电穿孔法等适当的转化法导入载体即可，该载体含有在其上游以适当形式结合有“与该基因的转录、翻译、分泌相关的控制区域，即，选自包含启动子和转录起始点的转录起始控制区域、包含核糖体结合部位和起始密码子的翻译起始控制区域、和分泌信号肽区域的1个以上的区域”的编码目的蛋白质或目的多肽的基因。在这里，作为载体，只要是用于将目的基因导入宿主中，使其增殖、表达的适当的载体核酸分子，则没有特别的限定，不仅可以例举质粒，还可以列举例如YAC、BAC等人工染色体、使用转座子的载体、粘粒，作为质粒，例如，可以列举pUB110、pHY300PLK。
另外，(2)向基因组的插入，例如可以使用利用同源重组的方法。即，使编码纤维素酶的基因上结合有引起导入的染色体区域的一部分而得到的DNA片段被摄入到微生物细胞内，通过引起在该染色体区域的一部分区域中的同源重组而能够组合入基因组中。在这里，作为引起导入的染色体区域，没有特别的限制，但优选非必须基因区域或非必须基因区域上游的非基因区域。
这样制作的微生物在纤维素酶的生产中特别有用，是目的纤维素酶生产率高的微生物。
使用本发明的重组微生物进行的纤维素酶的生产，可以通过将该菌株接种在含有同化性的碳源、氮源、其它必须成分的培养基中，以通常的微生物培养法培养，培养结束后，提取、精制蛋白质或多肽而进行。
实施例
在以下实施例中，用于DNA片段扩增的多聚酶链式反应(PCR)中，使用GeneAmp PCR System(Applied Biosystems)，使用PyrobestDNA Polymerase(Takara Bio)和附属的试剂类进行DNA扩增。PCR的反应液组成为：添加适当稀释的模板DNA 1μL、正义引物与反义引物各20pmol和Pyrobest DNA Polymerase 2.5U，使反应液总量为50μL。PCR的反应条件为：将98℃ 10秒钟、55℃ 30秒钟和72℃ 1～5分钟(根据目的扩增产物调整。基准是每1kb为1分钟)的三阶段温度变化反复30次后，72℃反应5分钟，由此而进行。
另外，以下实施例中的各基因和基因区域的名称在Nature，390，249-256，(1997)中报告，基于在JAFAN：Japan Functional AnalysisNetwork for Bacillus subtilis(BSORF DB)中被网上公开(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)的枯草杆菌基因组数据而记载。
枯草杆菌的转化如下进行。
即，在SPI培养基(0.20％硫酸铵、1.40％磷酸氢二钾、0.60％磷酸二氢钾、0.10％柠檬酸三钠二水合物、0.50％葡萄糖、0.02％酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.25μM氯化锰、50μg/ml色氨酸)中，以37℃振荡培养枯草杆菌株，直到生长度(OD600)值达到1左右。振荡培养后，将培养液的一部分接种在9倍量的SPII培养基(0.20％硫酸铵、1.40％磷酸氢二钾、0.60％磷酸二氢钾、0.10％柠檬酸三钠二水合物、0.50％葡萄糖、0.01％酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.40μM氯化锰、5μg/ml色氨酸)中，再进行振荡培养，直至生长度(OD600)值达到0.4左右，由此调制枯草杆菌株的感受态细胞。接着，在100μL已调制的感受态细胞悬浊液(SPII培养基中的培养液)中添加5μL含有各种DNA片段的溶液(SOE-PCR的反应液等)，以37℃振荡培养1小时后，将全部量涂抹在含有适当药剂的LB琼脂培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％琼脂)上。在37℃静置培养后，将生长的菌落作为转化体分离。提取得到的转化体的基因组，将其作为模板，通过PCR确认达到目的基因组结构的改变。
实施例1 secY基因过量表达株的构建
如下进行过量表达secY基因突变株的构建(参照图2)。以从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，使用在表1中所示的PVG-FW和PVG-R、及secY/PVG-F和secY/Cm-R的引物组合，通过PCR扩增包含spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位的0.2kb片段(A)、和包含secY基因的1.3kb片段(B)。另外，以质粒pC194(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))作为模板，使用在表1中所示的catf和catr的引物组合，通过PCR扩增包含抗氯霉素(Cm)基因的0.9kb片段(C)。接着，混合得到的(A)(B)(C)3片段作为模板，使用在表1中所示的PVG-FW2和catr2的引物组合进行SOE-PCR，由此使3片段以(A)(B)(C)的顺序结合，得到在secY基因的上游连接有spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位(以secY基因的起始密码子位于spoVG基因的起始密码子的位置的方式连接)，且在其下游结合有抗Cm基因的2.2kb的DNA片段(D)。接着，以从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，使用在表1中所示的amyEfw2和amyE/PVG2-R、及amyE/Cm2-F和amyErv2的引物组合，通过PCR扩增包含amyE基因的5’侧区域的1.0kb片段(E)、和包含amyE基因的3’侧区域的1.0kb片段(F)。接着，混合得到的(E)(F)(D)3片段作为模板，使用在表1中所示的amyEfw1和amyErv1的引物组合进行SOE-PCR，由此使3片段以(E)(D)(F)的顺序结合，得到在spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位的下游连接有secY基因、且在其下游结合有抗氯霉素基因的2.2kb的DNA片段被插入到amyE基因中央而得到的总碱基长4.2kb的DNA片段(G)。使用得到的4.2kb的DNA片段(G)，通过感受态细胞法转化枯草杆菌168株，将在含有氯霉素(10μg/mL)的LB琼脂培养基上生长的菌落作为转化体分离。以从得到的转化体提取的基因组DNA作为模板，使用在表1中所示的amyEfw2和secY/Cm-R、及secY/PVG-F和amyErv2的引物组合进行PCR，由此确认2.5kb和3.1kb的DNA片段的扩增，确认在枯草杆菌168株基因组上的amyE基因部位插入了在spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位的下游连接有secY基因的DNA片段。将这样得到的菌株命名为secY-K株。
[表1]
| 引物名 | 序列(5′-3′) | 序列编号 |
| PVG-FW | GTTAGTCGAGATCGAAGTTA | 8 |
| PVG-R | AGTAGTTCACCACCTTTTCC | 9 |
| secY/PVG-F | GGAAAAGCTGGTGAACTACTATGTTGTTTAAAACAATCTCCAA | 10 |
| secY/Cm-R | ATGGGTGCTTTAGTTGAAGACTAGTTTTTCATAAATCCAC | 11 |
| catf | CAACTAAAGCACCCATTAG | 12 |
| Catr | CTTCAACTAACGGGGCAG | 13 |
| PVG-FW2 | TAAGAAAAGTGATTCTGGGA | 14 |
| catr2 | CTCATATTATAAAAGCCAGTC | 15 |
| amyEfw2 | GGAGTGTCAAGAATGTTTGC | 16 |
| amyE/PVG2-R | TCCCAGAATCACTTTTCTTAATCATCGCTCATCCATGTCG | 17 |
| amyE/Cm2-F | GACTGGCTTTTATAATATGAGGTTTAGGCTGGGCGGTGATA | 18 |
| amyErv2 | TCAATGGGGAAGAGAACC | 19 |
| amyEfw1 | TCAAAACCTCTTTACTGCCG | 20 |
| amyErv1 | CACGTAATCAAAGCCAGGCT | 21 |
| 237UB1 | TTGCGGATCCAACAGGCTTATATTTAGAGGAAATTTC | 22 |
| 237DB1 | TTGCGGATCCAACAACTCTGTGTCCAGTTATGCAAG | 23 |
| secE/Y-F2 | GTGGATTTATGAAAAACTAGTTGTGGAGGTCTTTTACATG | 24 |
| secE/Ne-R | TATTTTATAAACTCATTCCCCATTATTCAACTATTAAACG | 25 |
| amyE/Nm-F | TGACCTCTAATAATTGTTAAGTTTAGGCTGGGCGGTGATA | 26 |
| rneof | GCGAATGAGTTTATAAAAT | 27 |
| repUr-Nm | TTCCTAAGCATCATGGTCTCACTTTTCCACTTTTTGTCTTG | 28 |
| NmUf-rep | GTGAGACCATGATGCTTAGGAAGACGAGTTATTAATAGC | 29 |
| Nmr | TTAACAATTATTAGAGGTCA | 30 |
| secY-F2 | TTGTTTAAAACAATCTCCAA | 31 |
| secG/PVCf | GGAAAAGGTGGTGAACTACTTGAGTCTGGAGGTGTATGGG | 32 |
| secG/Ne-R | TATTTTATAAACTCATTCCCCCCTATAGGATATAAGCAAG | 33 |
| S237ppp-F2(BamHI) | CCCGGATCCAACAGGCTTATATTTA | 34 |
| S237ppp-R2(ALAA) | TTCAATCCATCTGCTGCAAGAGCTGCCGG | 35 |
| K38matu-F2(ALAA) | GCTCTTGCAGCAGATGGATTGAACGGTACG | 36 |
| SP64K38-R(Xbal) | TTGGTCTAGACCCCAAGCTTCAAAGTCGTA | 37 |
实施例2 碱性纤维素酶分泌生产评价
由实施例1得到的secY-株和作为对照的枯草杆菌168株的异种蛋白质生产率评价，以由序列编号4所示的氨基酸序列构成的来自芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶的生产率作为指标，如下地进行。即，使用在表1中所示的237UB1和237DB1的引物组合，扩增来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因(日本特开2000—210081号公报)片段(3.1kb)，然后以BamHI限制性内切酶进行处理，插入在穿梭载体pHY300PLK的BamH I限制性酶切位点，将由此得到的重组质粒pHY-S237通过原生质体转化法导入各菌株中。将由此得到的重组菌株在10mL的LB培养基中以37℃进行振荡培养一夜，再将0.05mL该培养液接种在50mL的2×L—麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4～5水合物、15ppm四环素)中，在30℃进行3日振荡培养。测定由离心分离除去菌体的培养液上清的碱性纤维素酶活性，求出通过培养而向菌体外分泌生产的碱性纤维素酶量。
关于纤维素酶活性测定，在以1/7.5M磷酸缓冲液(pH7.4，和光纯药)适当稀释的样品溶液50μL中加入50μL的0.4mM对硝基苯基-β-D-纤维三糖甙(p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside)(生化学工业)并混合，通过在420nm的吸光度(OD420nm)变化来定量在30℃进行反应时游离的对硝基苯酚的量。以在1分钟使1μmol对硝基苯酚游离的酶量作为1U。
碱性纤维素酶活性测定的结果，如在表2中所示的那样，当使用secY-K株作为宿主时，与使用对照的168株(野生型)时比较，能够确认高的碱性纤维素酶的分泌生产。推测这是由于在secY-K株中，secY基因的表达比野生株高，从而使作为分泌装置的secY蛋白质量增加，因而纤维素酶的分泌效率提高的结果。
[表2]
| 菌株名称 | 过量表达基因 | 碱性纤维素酶分泌生产量(相对值) |
| secY-K 株 | secY | 117 |
| 168 株 | 无 | 100 |
比较例1 其它的sec基因过量表达株的构建—1
如下进行将secY和secE基因共同过量表达的菌株的构建(参照图3)。即，以从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，使用在表1中所示的secE/Y-F2和secE/Ne-R、secY/PVG-F和secY/Cm-R、及amyE/Nm-F和amyErv2的引物组合，通过PCR扩增包含secE基因和其核糖体结合部位的0.2kb片段(H)、包含secY基因的1.3kb片段(I)和包含amyE基因的3’侧区域的1.0kb片段(J)。另外，将使用在表1中所示的rneof和repUr-Nm的引物组合以及作为模板的质粒pUB110(Plasmid 15，93(1986))调制的含有repU基因启动子区域的0.4kb片段、与使用在表1中所示的NmUf-rep和Nmr的引物组合以及作为模板的质粒pUB110调制的含有抗新霉素基因的结构基因区域的0.8kb片段混合作为模板，使用在表1中所示的引物rneof和Nmr的引物组合进行SOE-PCR，由此调制1.2kb的抗新霉素盒片段(K)。接着，混合得到的(H)(I)(J)(K)4个片段作为模板，使用在表1中所示的secY-F2和amyErv1的引物组合进行SOE-PCR，由此使4片段以(I)(H)(K)(J)的顺序结合，得到在secY基因的下游连接伴有核糖体结合部位的secE基因、且在其下游连接有抗新霉素盒与amyE基因的3’侧区域而得到的总碱基长3.7kb的DNA片段(L)。使用得到的3.7kb的DNA片段(L)，通过感受态细胞法转化在实施例1中构建的secY-K株，将在含有新霉素(10μg/mL)的LB琼脂培养基上生长的菌落作为转化体分离。以从得到的转化体提取的基因组DNA作为模板，使用在表1中所示的amyEfw2和secE/Ne-R、及secE/Y-F2和amyErv2的引物组合进行PCR，由此确认2.6kb和2.4kb的DNA片段的扩增，确认在枯草杆菌168株基因组上的amyE基因部位插入了在spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位的下游连接secY基因、且其下游连接有secE基因的DNA片段。另外，在secY基因与secE基因之间不存在转录终止部位，认为secE基因和secY基因作为同一转录单位，通过spoVG基因转录起始控制区域的功能而被转录。将这样得到的菌株命名为secYE-K株。另外，采用和实施例1的方法同样的方法，制成在枯草杆菌168株基因组上的amyE基因部位插入了在spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合部位的下游连接有secG基因的DNA片段的secG-K株。在secG-K株的构建中使用在表1中所示的引物，在表3中表示各自的引物和secY-K株的构建中使用的引物的对应的关系。
[表3]
比较例2 碱性纤维素酶分泌生产评价
比较例1 中构建的菌株的碱性纤维素酶分泌生产率评价采用和实施例2同样的方法进行。作为对照，也对枯草杆菌168株和实施例1中构建的secY-K株进行评价。
其结果如在表4中所示的那样，过量表达secG基因的secG-K株的纤维素酶生产率虽然比野生株168株稍有增高，但是不及secY-K株的生产率。另外，与secY基因同时过量表达secE基因的secYE-K株的纤维素酶生产率和secY-K株是同等的，不能确认过量表达secE基因的效果。即，可知在构成分泌蛋白质的输送通道主要部分的secY、secE、secG的3种蛋白质中，特别是使secY蛋白质增加，在纤维素酶的分泌效率提高中是有效的。
[表4]
| 菌株名称 | 过量表达基因 | 碱性纤维素酶分泌生产量(相对值) |
| secG-K株 | secG | 108 |
| secYE-K株 | secY和secE | 115 |
| secY-K株 | secY | 117 |
| 168株 | 无 | 100 |
比较例3 碱性淀粉酶分泌生产评价
在实施例1中构建的SecY-K株和在比较例1中构建的secG-K菌株的碱性淀粉酶分泌生产率评价如下进行。即，以从芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-K38株(FERM BP-6946)提取的基因组DNA作为模板，使用K38matu-F2(ALAA)和SP64K38-R(Xba I)的引物组合进行PCR，扩增编码碱性淀粉酶(Appl.Environ.Microbiol.，67，1744(2001))的1.5kb的DNA片段。另外，将从芽孢杆菌属(Bacillussp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)提取的基因组DNA作为模板，使用S237ppp-F2(BamH I)和S237ppp-R2(ALAA)的引物组合进行PCR，扩增包含碱性纤维素酶基因(日本特开2000—210081号公报)的启动子区域和编码分泌信号序列的区域的0.6kb的DNA片段。接着，混合得到的2个片段作为模板，使用S237ppp-F2(BamH I)和SP64K38-R(Xba I)的引物组合进行SOE-PCR，由此得到在碱性纤维素酶基因的启动子区域和编码分泌信号序列的区域下游连接有碱性淀粉酶基因的2.1kb的DNA片段。将得到的2.1kb的DNA片段插入到穿梭载体pHY300PLK(Yakult)的BamH I—Xba I限制性酶切位点，构建碱性淀粉酶生产率评价用质粒pHYK38(S237ps)。
通过原生质体转化法将构建的载体pHYK38(S237ps)导入各菌株中。作为对照，对枯草杆菌168株也导入质粒。在和上述实施例2同样的条件下，将由此得到的重组菌株振荡培养5日。培养后，测定由离心分离除去菌体的培养液上清的碱性淀粉酶活性，求出通过培养向菌体外分泌生产的碱性淀粉酶的量。培养液上清中的淀粉酶的活性测定使用LIQI TECHAmy EPS(Roche Diagnostics公司)。即，在以1％NaCl—1/7.5M磷酸缓冲液(pH7.4，和光纯药工业)适当稀释的样品溶液50μL中，加入100μL的R1-R2混合液(R1(偶联酶)∶R2(淀粉酶底物)＝5∶1(Vol.))并混合，通过在405nm的吸光度(OD405nm)变化来定量在30℃进行反应时游离的对硝基苯酚量。以在1分钟使1μmol的对硝基苯酚游离的酶量作为1U。
[表5]
| 菌株名称 | 过量表达基因 | 碱性纤维素酶分泌生产量(相对值) |
| secG-K株 | secG | 94 |
| secY-K株 | secY | 61 |
| 168株 | 无 | 100 |
其结果如表5表示的那样，过量表达secG基因的secG-K株的淀粉酶生产率比野生株168株稍低，但secY-K株的淀粉酶生产率与野生株比较，有显著下降。即，可知secY蛋白质的增加反而对淀粉酶生产率带来不良影响，提示secY基因的过量表达特别有助于纤维素酶生产率的提高。
在表6中表示本发明相关的基因、基因序号及功能。
[表6]
| 基因名称 | 基因序号 | 功能 |
| secY | BG10445 | 前蛋白移位酶SecY亚单位 |
| spoVG | BG10112 | 孢子形成V期蛋白质G(孢子皮层合成) |
| amyE | BG10473 | α—淀粉酶 |
| secG | BG14067 | 前蛋白移位酶SecG亚单位 |
| secE | BG10161 | 前蛋白移位酶SecE亚单位 |
| spsJ | BG19008 | 30S核糖体蛋白质S10 |
| ybxG | BG11505 | 推断氨基酸运载体 |
| aprE | BG10190 | 碱性丝氨酸蛋白酶 |
| sacB | BG10388 | 果聚糖蔗糖酶 |
| nprE | BG10448 | 细胞外中性金属蛋白酶 |
另外，这些各种基因的名称、序号和功能等由Kunst等报告(Nature，390，249-256，1997)，基于在JAFAN：Japan Functional Analysis Networkfor Bacillus subtilis(BSORF DB)被网上公开(http://bacillus.genome.ad.jp/，2004年3月10日更新)的枯草杆菌基因组而记载。
比较例4 其它的sec基因表达强化株的构建—2
同时强化secY基因和secG基因表达的菌株构建采用和比较例1同样的方法进行。即，在secYE-K株的构建中使用的引物中，由表7中所示的secG/Y-F2代替secE/Y-F2，且由表7中所示的secG/Ne-R代替secE/Ne-R，构建secYG-K株。
另外，通过和实施例1的方法同样的方法，制成在枯草杆菌168株基因组上的amyE基因部位插入了在spoVG基因的转录起始控制区域和核糖核结合部位的下游连接有secE基因而得到的DNA片段的secE-K株。在secE-K株的构建中，在secY-K株的构建中使用的引物中，由表7中所示的secE/PVG-F代替secY/PVG-F，且由表7中所示的secE/Cm-R代替secY/Cm-R。
构建的上述菌株的碱性纤维素酶分泌生产率评价采用和实施例2同样的方法进行。作为对照，对枯草杆菌168株和实施例1中构建的secY-K株也进行评价。
[表7]
| 引物名 | 序列(5′-3′) | 序列编号 |
| secG/Y-F2 | GTGGATTTATGAAAAACTAGTGAGTCTGGAGGTGTATGGG | 38 |
| secG/Ne-R | TATTTTATAAACTCATTCCCCCCTATAGGATATAAGCAAG | 39 |
| secE/PVG-F | GGAAAAGGTGGTGAACTACTATGCGTATTATGAAATTCTTTAAAGATG | 40 |
| secE/Cm-R | ATGGGTGCTTTAGTTGAAGATTATTCAACTATTAAACGAATTAATTGA | 41 |
其结果如表8所示的那样，同时强化secY基因和secG基因的表达的secYG-K株的纤维素酶生产率与secY-K株是同等的，不能确认强化表达secG基因的效果。另外，如表9中所示的那样，强化了secE基因的表达的secE-K株的纤维素酶生产率虽然比野生株168株稍高，但不及secY-K株的生产率。即，可知在构成分泌蛋白质输送通道的主要部分的secY、secE、secG这3种蛋白质中，特别是增加secY蛋白质在纤维素酶的分泌效率的提高中是有效的。
[表8]
| 菌株名称 | 强化基因 | 碱性纤维素酶分泌生产量(相对值) |
| secYG-K株 | secY和secG | 118 |
| secY-K株 | secY | 118 |
| 168株 | 无 | 100 |
[表9]
| 菌株名称 | 强化基因 | 碱性纤维素酶分泌生产量(相对值) |
| secE-K株 | secE | 105 |
| secY-K株 | secY | 113 |
| 168株 | 无 | 100 |
比较例5 碱性蛋白酶分泌生产评价
在实施例1中构建的secY-K株的碱性蛋白酶生产率评价如下进行。作为对照，对枯草杆菌168株也进行评价。即，以从克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16株(FERM BP-3376)提取的基因组DNA作为模板，使用在表10中所示的S237pKAPpp-F和KAPter-R(BgIII)的引物组合进行PCR，扩增具有序列编号42所示的氨基酸序列的编码碱性蛋白酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.，43，473，(1995))的1.3kb的DNA片段。另外，将从芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERMBP-7875)提取的基因组DNA作为模板，使用在表10中所示的S237ppp-F2(BamH I)和S237pKAPpp-R的引物组合进行PCR，扩增包含碱性纤维素酶基因(日本特开2000—210081号公报)的启动子区域的0.6kb的DNA片段。接着，混合得到的2个片段作为模板，使用在表10中所示的S237ppp-F2(BamH I)和KAPter-R(BgIII)的引物组合进行SOE-PCR，由此得到在碱性纤维素酶基因的启动子区域下游连接有碱性蛋白酶基因的1.8kb的DNA片段。将得到的1.8kb的DNA片段插入在穿梭载体pHY300PLK(Yakult)的BamH I—BgIII限制性酶切位点，构建碱性蛋白酶生产率评价用质粒pHYKAP(S237p)。
通过原生质体转化法将构建的质粒pHYKAP(S237p)导入各菌株中。将由此得到的重组菌株在10mL的LB培养基中以37℃振荡培养一夜，再将0.05mL该培养液接种在50mL的2×L-麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4～5水合物、15ppm四环素)中，以30℃振荡培养3日。培养后，测定由离心分离除去菌体的培养液上清的碱性蛋白酶活性，求出通过培养向菌体外分泌生产的碱性蛋白酶量。培养液上清中的蛋白酶的活性测定如下进行。即，在以2mM氯化钙溶液适当稀释的培养上清液50μl中，加入含有以7.5mM的琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-丙氨酸对硝基苯胺(Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide)(STANA：肽研究所)作为底物的75mM硼酸—KCl缓冲液(pH10.5)100μL并混合，通过在420nm的吸光度(OD420nm)变化来定量在30℃进行反应时游离的对硝基苯胺量。以在1分钟使1μmol对硝基苯胺游离的酶量作为1U。
[表10]
| 引物名 | 序列(5′-3′) | 序列编号 |
| S237pKAPpp-F | ACTTTAAAAATATTTAGGAGGTAATATGAAGAAACCGTTGGGGAAA | 44 |
| KAPter-R(Bglll) | GGGAGATCTTCAGCGATCTATTTCTCTTTTTC | 45 |
| S237ppp-F2(BamHl) | CCCGGATCCAACAGGCTTATATTTA | 46 |
| S237pKAPpp-R | TTTCCCCAACGGTTTCTTCATATTACCTCCTAAATATTTTTAAAGT | 47 |
其结果如在表11中所示的那样，当使用secY-K株作为宿主时，其蛋白酶分泌生产率和对照的168株(野生型)是同等的，不能确认特别的生产率提高。即，SecY蛋白质的增加对蛋白酶生产率没有影响，结合比较例3的结果，提示secY基因的过量表达特别有助于纤维素酶生产率的提高。
[表11]
| 菌株名称 | 强化基因 | 蛋白酶分泌生产量(相对值) |
| secY-K株 | secY | 100 |
| 168株 | 无 | 100 |
序列表
<110>花王株式会社
<120>重组微生物
<130>KS0950
<150>JP 2006-38924
<151>2006-02-16
<150>JP 2006-254917
<151>2006-09-20
<160>47
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1296
<212>DNA
<213>枯草杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1296)
<223>
<400>1
<210>2
<211>431
<212>PRT
<213>枯草杆菌
<400>2
<210>3
<211>3150
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属KSM-S237
<220>
<221>CDS
<222>(573)..(3044)
<223>
<220>
<221>信号肽
<222>(573)..(659)
<223>
<220>
<221>成熟肽
<222>(660)..(3044)
<223>
<400>3
<210>4
<211>824
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-S237
<400>4
<210>5
<211>3332
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属KSM-64
<220>
<221>CDS
<222>(610)..(3075)
<223>
<220>
<221>信号肽
<222>(610)..(696)
<223>
<220>
<221>成熟肽
<222>(697)..(3075)
<223>
<400>5
<210>6
<211>822
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-64
<400>6
<210>7
<211>230
<212>DNA
<213>枯草杆菌
<400>7
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因spoVG的5’-侧区域的
核苷酸序列设计
<400>8
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因spoVG的5’-侧区域的
核苷酸序列设计
<400>9
<210>10
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secY的核苷酸序列设计，
5’-端按照枯草杆菌基因spoVG的5’-侧区域的核苷酸序列设计
<400>10
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secY的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗氯霉素基因的核苷酸序列设计
<400>11
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为正向PCR引物的寡核苷酸，用于扩增抗氯霉素基因
<400>12
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为反向PCR引物的寡核苷酸，用于扩增抗氯霉素基因
<400>13
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因spoVG的5’-侧区域的
核苷酸序列设计
<400>14
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为反向PCR引物的寡核苷酸，用于扩增抗氯霉素基因
<400>15
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计
<400>16
<210>17
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计，
5’-端按照枯草杆菌基因spoVG的5’-侧区域的核苷酸序列设计
<400>17
<210>18
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗氯霉素基因的核苷酸序列设计
<400>18
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计
<400>19
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计
<400>20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计
<400>21
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因的
上游区域的核苷酸序列设计，并在5’-端插入插入BamHI限制性酶切位点
<400>22
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因的
下游区域的核苷酸序列设计，并在5’-端插入插入BamHI限制性酶切位点
<400>23
<210>24
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secE的核苷酸序列设计，
5’-端按照枯草杆菌基因secY的5’-侧区域的核苷酸序列设计
<400>24
<210>25
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secE的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗新霉素基因的核苷酸序列设计
<400>25
<210>26
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗新霉素基因的核苷酸序列设计
<400>26
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照质粒pUB110的基因repU的5’-侧区域的
核苷酸序列设计
<400>27
<210>28
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照质粒pUB110的基因repU的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗新霉素基因的核苷酸序列设计
<400>28
<210>29
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照抗新霉素基因的核苷酸序列设计，
5’-端按照质粒pUB110的基因repU的核苷酸序列设计
<400>29
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照抗新霉素基因的5’-侧区域的核苷酸序列设计
<400>30
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照枯草杆菌基因secY的核苷酸序列设计
<400>31
<210>32
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secG的核苷酸序列设计，
5’-端按照枯草杆菌基因spoVG的5’-侧区域的核苷酸序列设计
<400>32
<210>33
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secY的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗新霉素基因的核苷酸序列设计
<400>33
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因的
上游区域的核苷酸序列设计，并在5’-端插入插入BamHI限制性酶切位点
<400>34
<210>35
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，其3’-端按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因
的核苷酸序列设计，其5’-端按照芽孢杆菌属KSM-K38的碱性淀粉酶基因的核苷酸
序列设计
<400>35
<210>36
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，其3’-端按照芽孢杆菌属KSM-K38的碱性淀粉酶基因的
核苷酸序列设计，其5’-端按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因的核苷
酸序列设计
<400>36
<210>37
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照芽孢杆菌属KSM-K38的碱性淀粉酶基因的核苷酸序
列设计，并在5’-端插入XbaI限制性酶切位点
<400>37
<210>38
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secG的核苷酸序列设计，
5’-端按照枯草杆菌基因secY的5’-侧区域的核苷酸序列设计
<400>38
<210>39
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secY的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗新霉素基因的核苷酸序列设计
<400>39
<210>40
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secE的核苷酸序列设计，
5’-端按照枯草杆菌基因spoVG的5’-侧区域的核苷酸序列设计
<400>40
<210>41
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照枯草杆菌基因secE的核苷酸序列设计，
5’-端按照抗氯霉素基因的核苷酸序列设计
<400>41
<210>42
<211>1441
<212>DNA
<213>克劳氏芽孢杆菌KSM-K16
<220>
<221>CDS
<222>(164)..(1303)
<223>
<400>42
<210>43
<211>380
<212>PRT
<213>克劳氏芽孢杆菌KSM-K16
<400>43
<210>44
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的碱性蛋白酶基因的
核苷酸序列设计，5’-端按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因的核苷酸序
列设计
<400>44
<210>45
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的碱性蛋白酶基因的下游
区域的核苷酸序列设计
<400>45
<210>46
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因的上游区
域的核苷酸序列设计
<400>46
<210>47
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-端按照芽孢杆菌属KSM-S237的碱性纤维素酶基因的
核苷酸序列设计，5’-端按照克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的碱性蛋白酶基因的核苷酸
序列设计，
<400>47
Claims (10)
1.一种重组微生物，其特征在于：
在进行基因构建，使枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因过量表达而获得的微生物中，导入编码纤维素酶的基因。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：
将在微生物中具有功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位导入枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因的基因组上的上游，或导入枯草杆菌secY基因或含有该基因的基因组上的操纵子的先头基因的上游，或者导入将在微生物中具有功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位与枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因的上游连接而得到的基因片段，由此使secY基因或相当于该基因的基因过量表达。
3.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于：
在微生物中具有功能的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位是枯草杆菌spoVG基因或相当于该基因的基因的转录起始控制区域或转录起始控制区域和核糖体结合部位。
4.如权利要求1～3中任一项所述的重组微生物，其特征在于：
微生物是芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。
5.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：
芽孢杆菌(Bacillus)属细菌是枯草杆菌(Bacillus subtilis)。
6.如权利要求1～5中任一项所述的重组微生物，其特征在于：
在编码纤维素酶的基因上游结合有选自转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌用信号区域中的1个以上的区域。
7.如权利要求6所述的重组微生物，其特征在于：
结合有由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域组成的三区域。
8.如权利要求6或7所述的重组微生物，其特征在于：
分泌信号区域来自芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的纤维素酶基因，转录起始控制区域和翻译起始控制区域来自该纤维素酶基因的上游0.6～1kb的区域。
9.如权利要求6～8中任一项所述的重组微生物，其特征在于：
由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域组成的三区域是包括由序列编号3所示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基序号1～659的碱基序列、由序列编号5所示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基序号1～696的碱基序列、或与该碱基序列的任意一个具有70％以上同一性的碱基序列构成的DNA片段，或者由该碱基序列的一部分缺失而形成的碱基序列构成的DNA片段。
10.一种纤维素酶的制造方法，其特征在于：
使用权利要求1～9中任一项所述的重组微生物。
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