CN101880681B - 麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重组蛋白制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明通过对麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因的遗传密码子进行人工改造，合成酵母偏爱密码子并修改基因遗传密码子中的A/T含量，得到了一条基因密码子结构得到优化，A/T含量降低的MTHase基因序列。然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA，筛选出重组载体并将其导入Pichia pastoris细胞进行重组表达。获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株，其分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800mg/L，为用酶法以淀粉为原料工业化生产海藻糖打下了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种人工合成改造的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重组蛋白的制备方法。
背景技术
海藻糖[α-D-葡萄糖-(1，1)-α-D-葡萄糖苷]是一种广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母和昆虫等的具有多种功能的非还原性二糖。在自然界中，海藻糖既是一种贮藏性糖类，又是应激代谢的重要产物，具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。海藻糖还具有良好的保湿性能，其甜度只有蔗糖的一半，且无还原性醛基，因此海藻糖被广泛应用于食品和饮料的冷冻和保藏、用作化妆品的保湿剂以及药物的稳定剂等，在生物制品和食品行业的用途越来越广泛。由于它具有独特的功能，吸引科研人员对其进行了大量的研究。早期是从生物体内提取海藻糖，但成本太高，无法进行大规模的生产，阻碍了其大规模的应用。但是后来，科学家Kato从高温菌株Sulfolobus solfataricus KM1中分离到了麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)两个酶，在这两个酶的作用下，以淀粉为原料，可分解转化为海藻糖。用此方法生产海藻糖具有成本低，效率高，是最有竞争力的方法。目前科研人员对两个酶进行了基因克隆和重组表达，但在大肠杆菌表达这两个酶的效果均不理想，限制了酶法途径在海藻糖合成中的运用。
基于此，发明人在分析了MTHase基因密码子的成分后，以芝田硫化叶菌(Sulfolobusshibatae)B12嗜热嗜酸古细菌MTHase基因(GeneBank：AF201335)为基础，优化密码子结构，合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量，得到了一条基因密码子结构得到优化，A/T含量降低的MTHase基因序列，利用酵母表达系统的优点，将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA，筛选出重组载体并将其导入Pichia pastoris细胞进行重组表达。获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株，分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800mg/L，为工业化用酶法以淀粉为原料生产海藻糖打下基础。
发明内容
鉴于以上所述，本发明的一个目的是通过人工合成改造麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因，使其基因密码子结构得到优化，A/T含量降低，提供一种优化的编码这种酶的多核苷酸序列。因此，本发明涉及这样一种经人工合成改造的多核苷酸序列，该序列选自SEQ ID NO：4中的序列，其全长为1683bp，编码559个氨基酸残基。本发明还涉及用于人工合成改造该基因的全部引物序列。
本发明的另一个目的是提供含有编码这种麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的重组表达质粒。
本发明的另一个目的是提供含有编码这种麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的基因工程化的宿主细胞。
本发明的另一个目的是通过基因工程化宿主细胞，建立这种酶的重组表达制备方法。
本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的重组表达质粒；一种用该重组表达质粒进行基因工程化的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和重组表达该酶的方法。
本发明也涉及包含本发明直接用该人工改造基因经过基因工程方法产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法。
本发明中，编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组表达质粒。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于pPICZαA。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达质粒。
本发明中，编码的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组表达质粒可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组表达质粒的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，入哺乳动物细胞。代表性的例子有：大肠杆菌、酵母细胞和动物细胞如CHO、COS等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组表达质粒转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物，如大肠杆菌等，可采用本领域众所周知的方法和电转化方法进行。当宿主为酵母细胞时，一般采用电转化方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984，224：1431)，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。一般说来有以下步骤：
(1)得到编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因。
(2)用编码本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列，或用含有该序列的重组表达质粒转化合适的宿主细胞。
(3)在合适的培养基中培养宿主细胞。
(4)在合适的诱导条件下诱导麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的表达。
(5)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(1)中编码本发明的基因克隆通过合成合适的引物，通过PCR人工拼接合成靶基因。
在步骤(2)中，为了构建包括上述编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的重组表达质粒，所述的基因可结合到适于在目的宿主中进行基因表达的任意载体中。这些载体的实施例包括但不局限于毕赤酵母作宿主时使用的pPICZαA(Invitrogen公司)。使用由此获得的重组表达质粒，通过一定的转化方法转化宿主细胞。在本发明中，人工合成的基因经DNA重组技术，得到重组表达质粒pPICZαA/MTHase，并通过合适的转化方法转化宿主细胞Pichia pastorisSMD1168H。
在步骤(3)中，任何能够使产生本发明麦芽寡糖基海藻糖水解酶的微生物生长并产生所述的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的培养基都可以用于生产本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。在本发明中，将培养物在不同条件下培养，其中优选的培养温度为30℃，培养时间为72h，即可得到最高的表达量。
在步骤(4)中，所用诱导剂为甲醇，诱导浓度为0.5-1％，诱导温度为18-25℃。在本发明中，诱导剂为甲醇，诱导浓度为0.5％。所述基因工程菌诱导表达的培养温度为25℃。
在步骤(5)中，任何能够使产生本发明麦芽寡糖基海藻糖水解酶的分离纯化技术均可用于生产本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。在本发明中，通过直接对培养物离心的方法，在培养基上清液中得到大部分的重组麦芽寡糖基海藻糖水解酶。通过本方法得到的麦芽寡糖基海藻糖水解酶，按下述方法进行酶活测定。其活性测定方法为：将麦芽六糖溶于50mmol/LpH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制成5.0mmol/L的溶液，取1mL该溶液，加入MTSase酶制剂50μL，75℃反应2h，沸水中煮沸10min终止反应。待溶液冷却后，加入10μL MTHase表达上清液，75℃反应15min，用HPLC测定糖化液中海藻糖的含量。MTHase的酶活单位定义为每分钟水解1μmol麦芽四糖基海藻糖生成海藻糖所需要的酶量。
附图说明
图1重组MTHase基因工程菌的构建流程图
图2重组子鉴定结果
M1：1Kb DNA分子量标准(Invitrogen公司)；
M2：1Kb DNA分子量标准(MBI公司)；
1：pMD18-T/MTHase双酶切(EcoRI/XhoI)鉴定；
2：MTHase基因PCR产物双酶切(EcoRI/XhoI)片段；
3：pPICZαA载体双酶切(EcoRI/XhoI)片段；
4：重组质粒pPICZαA/MTHase双酶切(EcoRI/XhoI)鉴定；
5：以Pichia pastoris基因组DNA为模板扩增AOX1基因(副对照)；
6：以重组Pichia pastoris基因组DNA为模板扩增AOX1基因；
7：以重组Pichia pastoris基因组DNA为模板扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因片段.
图3MTHase表达产物电泳分析
1：诱导前；
2：24h诱导；
3：48h诱导；
4：72h诱导；
M：蛋白质分子量标准
图4重组工程菌传代后的稳定率
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通畅按照常规条件如Sambrook等人所著的分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
具体实施方式
实施例1 麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因的人工改造和合成
根据上面的编码氨基酸序列，按照酵母菌密码子偏好性原则设计用于基因拼接的正、反链DNA引物(如SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：47所示)。其中5’端加入XhoI酶切位点，3’端加入EcoR I酶切位点序列，便于与载体连接。
用超纯水配制引物，使引物浓度为：100pmol/μL，分别取引物1μL，混合后100℃沸水中作用15分钟，立即冰浴；加入5μL 10X T4DNA ligase Buffer，T4 Polynucleotide Kinase 5μL，加水至总体积为45μL，37℃作用30分钟；65℃20分钟，冰浴2分钟；加入5μL T4 DNALigase，16℃反应2小时，65℃20分钟。
取上述混合反应液1μL作为PCR反应的模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为扩增引物，按下述PCR扩增参数进行PCR扩增：94℃预变性5min；循环30次：94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min。最终延伸：72℃，10min。
实施例2 重组表达质粒的构建及阳性克隆的筛选
将实施例1最终获得的PCR产物经纯化回收，连接到pMD18-T vector(Takara，大连宝生物工程公司)，经过序列分析并选择正确的阳性克隆pMD8-T/MTHase，获得的序列是SEQID NO：4，用XhoI/EcoRI进行双酶切，分离、回收1.7kb左右的MTHase基因片段，将其连接到经XhoI/EcoRI双酶切的pPICZαA酵母表达载体(美国Invitrogen公司)，并筛选出阳性克隆pPICZαA/MTHase。将阳性克隆载体经BglII单酶切后，转化Pichia pastoris SMD1168H酵母菌，并在高浓度的Zeocin-YPD固体培养基上筛选阳性克隆菌株(Pichia pastoris SMD1168H/pPICZαA-MTHase)，并对其进行进一步的PCR鉴定确认。
实施例3 培养基及培养表达条件
将实施例2中描述的阳性菌株(Pichia pastoris MD1168H/pPICZαA-MTHase)接种于YPD培养基中，30℃培养12-24h，摇床转速为240rpm；当发酵液浓度达OD600＝5.0时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240rpm，培养28-35h；5000g离心5min，收集菌体，用PBS洗涤菌体1-2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度25℃，摇床转速为180rpm，每隔12h向培养基中加入5-10mL/L量的0.5％甲醇，培养72小时；
实施例4 表达产物的SDS-PAGE分析
将在实施例3中获得的培养物经5,000rpm离心10min，直接取上清液按分子克隆实验指南(第三版)所述操作步骤进行SDS-PAGE电泳分析。分析结果见附图3。
实施例5 基因工程菌遗传稳定性研究
连续传代
将鉴定后的基因工程菌(Pichia pastoris SMD1168H/pPICZαA-MTHase)进行适当稀释，涂布在YPD(+)平板上(含1000μg/ml Zeocin)，于30℃恒温培养2天，随机挑取50个单菌落，同一个菌落分别接种于YPD(+)和YPD(-)(不含1000μg/ml Zeocin)上，于30℃恒温培养2天(称为第1代)。将YPD(+)上的菌接种于YPD(+)平板上，YPD(-)上的菌接种于YPD(-)平板上，于30℃恒温培养2天(称为第2代)。依次进行连续传代50次，对两个平板上生长的菌落分别进行计数。
平板传代稳定性鉴定
在传代过程中，每隔一定天数将YPD(-)平板上的菌落接种于YPD(+)平板上(含1000μg/mL Zeocin)，菌落计数，计算该基因工程重组菌种在无选择压力下的遗传稳定率。
发酵条件下稳定性鉴定
发酵液稀释106倍，分别涂布于YPD(+)和YPD(-)平板，30℃恒温培养2天，以两种平板菌落数上的比值YPD(+)/YPD(-)间接表示该条件下菌株的稳定率。
实施例6 麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活性测定
将麦芽六糖溶于50mmol/L pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制成5.0mmol/L的溶液，取1mL该溶液，加入MTSase酶制剂50μL，75℃反应2h，沸水中煮沸10min终止反应。待溶液冷却后，加入10μL MTHase表达上清液，75℃反应15min，用HPLC测定糖化液中海藻糖的含量。MTHase的酶活单位定义为每分钟水解1μmol麦芽四糖基海藻糖生成海藻糖所需要的酶量。测定的MTHase酶活为843mg/L。
序列表
<110>成都大学
<120>麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重组蛋白制备方法
<160>47
<210>SEQ ID NO：1
<211>1713
<212>核酸
(A)链性：双链
(B)拓扑类型：线性
(C)人工合成基因序列
(ii)分子类型：DNA
1 CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTATGACC TTCGCTTACA AGATCGATGG TAACGAGGTT
61 ATCTTCACTT TGTGGGCTCC ATACCAAAAG TCCGTTAAGT TGAAGGTCTT GGAGAAGGGT
121 TTGTACGAGA TGGAGAGAGA CGAGAAGGGT TACTTCACCA TCACTTTGAA CAACGTCAAG
181 GTCAGAGACA GATACAAGTA CGTTTTGGAC GATGCTTCCG AGATCCCAGA CCCAGCTTCC
241 AGATACCAAC CAGAGGGTGT CCACGGTCCA TCTCAAATCA TCCAAGAGTC CAAGGAGTTC
301 AACAACGAGA CCTTCTTGAA GAAGGAGGAC TTGATCATCT ACGAGATCCA CGTCGGTACT
361 TTCACCCCAG AGGGTACTTT CGAGGGTGTC ATCAGAAAGT TGGACTACTT GAAGGATTTG
421 GGTATCACCG CTATCGAGAT CATGCCAATC GCTCAATTCC CAGGTAAGAG AGACTGGGGT
481 TACGATGGTG TTTACTTGTA CGCTGTCCAA AACTCCTACG GTGGTCCAGA GGGTTTCAGA
541 AAGTTGGTTG ATGAGGCTCA CAAGAAGGGT TTGGGTGTTA TCTTGGACGT TGTCTACAAC
601 CATGTTGGTC CAGAGGGTAA CTACATGGTT AAGTTGGGTC CATACTTCAG TCAAAAGTAC
661 AAGACCCCAT GGGGTTTGAC CTTCAACTTC GACGACGCTG AGTCCGATGA GGTCAGAAAG
721 TTCATCTTGG AGAACGTTGA ATACTGGATC AAGGAGTACA ACGTTGATGG TTTCAGATTG
781 GACGCTGTCC ACGCTATCAT CGACACCTCT CCAAAGCACA TCCTGGAGGA GATCGCTGAT
841 GTTGTCCACA AGTACAACAG AATCGTTATC GCTGAGTCCG ACTTGAACGA CCCACGTGTT
901 GTTAACCCAA AGGAGAAGTG TGGTTACAAC ATCGACGCTC AATGGGTTGA CGATTTCCAC
961 CACTCTATCC ACGCTTACTT GACCGGTGAG AGACAAGGTT ACTACACTGA CTTCGGTAAC
1021 TTGGACGATA TCGTTAAGTC CTACAAGGAC GTCTTCGTTT ACGATGGTAA GTACTCCAAC
1081 TTCAGAAGAA AGACCCACGG TGAGCCAGTT GGTGAGTTGG ATGGTTGTAA CTTCGTCGTT
1141 TACATCCAAA ACCACGATCA AGTCGGTAAC AGAGGTAAGG GTGAGAGAAT CATTAAGCTC
1201 GTCGACAGAG AGTCCTACAA GATCGCTGCT GCTTTGTACT TGTTGTCTCC ATACATCCCA
1261 ATGATCTTCA TGGGTGAGGA GTACGGTGAG GAGAACCCAT TCTACTTCTT CTCTGACTTC
1321 TCCGACTCCA AGTTGATCCA AGGTGTTAGA GAGGGTAGAA AGAAGGAGAA CGGTCAAGAC
1381 ACTGATCCAC AAGACGAGTC CACCTTCAAC GCTTCCAAGT TGTCTTGGAA GATCGATGAG
1441 GAGATTTTCA GTTTCTACAA GATCCTTATC AAGATGAGAA AGGAGTTGTC CATCGCTTGT
1501 GACAGAAGAG TCAACGTTGT CAACGGTGAG AACTGGTTGA TCATCAAGGG TAGAGAATAC
1561 TTCTCCTTGT ACGTCTTCAG TAAGTCCTCC ATCGAGGTTA AGTACAGTGG TACCTTGTTG
1621 TTGTCTTCCA ACAACAGTTT CCCACAACAC ATCGAGGAGG GTAAGTACGA GTTCGACAAG
1681 GGTTTCGCTT TGTACAAGTT GTAGTAAGAA TTC
<210>SEQ ID NO：2
<211>45
<212>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：2：
CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTATGACC TTCGCTTACA AGATC
<210>SEQ ID NO：3
<211>30
<213>：核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：3：
GAATTCTTAC TACAACTTGT ACAAAGCGAA
<210>SEQ ID NO：4
<211>1683
<213>核酸
(A)链性：双链
(B)拓扑类型：线性
(C)(1)…(3)起始密码子
(D)(1678)…(1683)终止密码子
(ii)分子类型：DNA
(iii)序列描述：SEQ ID NO：4：
1 ATGACCTTCG CTTACAAGAT CGATGGTAAC GAGGTTATCT TCACTTTGTG GGCTCCATAC
61 CAAAAGTCCG TTAAGTTGAA GGTCTTGGAG AAGGGTTTGT ACGAGATGGA GAGAGACGAG
121 AAGGGTTACT TCACCATCAC TTTGAACAAC GTCAAGGTCA GAGACAGATA CAAGTACGTT
181 TTGGACGATG CTTCCGAGAT CCCAGACCCA GCTTCCAGAT ACCAACCAGA GGGTGTCCAC
241 GGTCCATCTC AAATCATCCA AGAGTCCAAG GAGTTCAACA ACGAGACCTT CTTGAAGAAG
301 GAGGACTTGA TCATCTACGA GATCCACGTC GGTACTTTCA CCCCAGAGGG TACTTTCGAG
361 GGTGTCATCA GAAAGTTGGA CTACTTGAAG GATTTGGGTA TCACCGCTAT CGAGATCATG
421 CCAATCGCTC AATTCCCAGG TAAGAGAGAC TGGGGTTACG ATGGTGTTTA CTTGTACGCT
481 GTCCAAAACT CCTACGGTGG TCCAGAGGGT TTCAGAAAGT TGGTTGATGA GGCTCACAAG
541 AAGGGTTTGG GTGTTATCTT GGACGTTGTC TACAACCATG TTGGTCCAGA GGGTAACTAC
601 ATGGTTAAGT TGGGTCCATA CTTCAGTCAA AAGTACAAGA CCCCATGGGG TTTGACCTTC
661 AACTTCGACG ACGCTGAGTC CGATGAGGTC AGAAAGTTCA TCTTGGAGAA CGTTGAATAC
721 TGGATCAAGG AGTACAACGT TGATGGTTTC AGATTGGACG CTGTCCACGC TATCATCGAC
781 ACCTCTCCAA AGCACATCCT GGAGGAGATC GCTGATGTTG TCCACAAGTA CAACAGAATC
841 GTTATCGCTG AGTCCGACTT GAACGACCCA CGTGTTGTTA ACCCAAAGGA GAAGTGTGGT
901 TACAACATCG ACGCTCAATG GGTTGACGAT TTCCACCACT CTATCCACGC TTACTTGACC
961 GGTGAGAGAC AAGGTTACTA CACTGACTTC GGTAACTTGG ACGATATCGT TAAGTCCTAC
1021 AAGGACGTCT TCGTTTACGA TGGTAAGTAC TCCAACTTCA GAAGAAAGAC CCACGGTGAG
1081 CCAGTTGGTG AGTTGGATGG TTGTAACTTC GTCGTTTACA TCCAAAACCA CGATCAAGTC
1141 GGTAACAGAG GTAAGGGTGA GAGAATCATT AAGCTCGTCG ACAGAGAGTC CTACAAGATC
1201 GCTGCTGCTT TGTACTTGTT GTCTCCATAC ATCCCAATGA TCTTCATGGG TGAGGAGTAC
1261 GGTGAGGAGA ACCCATTCTA CTTCTTCTCT GACTTCTCCG ACTCCAAGTT GATCCAAGGT
1321 GTTAGAGAGG GTAGAAAGAA GGAGAACGGT CAAGACACTG ATCCACAAGA CGAGTCCACC
1381 TTCAACGCTT CCAAGTTGTC TTGGAAGATC GATGAGGAGA TTTTCAGTTT CTACAAGATC
1441 CTTATCAAGA TGAGAAAGGA GTTGTCCATC GCTTGTGACA GAAGAGTCAA CGTTGTCAAC
1501 GGTGAGAACT GGTTGATCAT CAAGGGTAGA GAATACTTCT CCTTGTACGT CTTCAGTAAG
1561 TCCTCCATCG AGGTTAAGTA CAGTGGTACC TTGTTGTTGT CTTCCAACAA CAGTTTCCCA
1621 CAACACATCG AGGAGGGTAA GTACGAGTTC GACAAGGGTT TCGCTTTGTA CAAGTTGTAG
1681 TAA
<210>SEQ ID NO：5
<211>1683
<213>核酸或蛋白质
(A)人工合成的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其推导的氨基酸序列
(iii)序列描述：SEQ ID NO：5：
1 ATGACCTTCGCTTACAAGATCGATGGTAACGAGGTTATCTTCACTTTGTGGGCTCCATAC
1 M T F A Y K I D G N E V I F T L W A P Y
61 CAAAAGTCCGTTAAGTTGAAGGTCTTGGAGAAGGGTTTGTACGAGATGGAGAGAGACGAG
21 Q K S V K L K V L E K G L Y E M E R D E
121 AAGGGTTACTTCACCATCACTTTGAACAACGTCAAGGTCAGAGACAGATACAAGTACGTT
41 K G Y F T I T L N N V K V R D R Y K Y V
181 TTGGACGATGCTTCCGAGATCCCAGACCCAGCTTCCAGATACCAACCAGAGGGTGTCCAC
61 L D D A S E I P D P A S R Y Q P E G V H
241 GGTCCATCTCAAATCATCCAAGAGTCCAAGGAGTTCAACAACGAGACCTTCTTGAAGAAG
81 G P S Q I I Q E S K E F N N E T F L K K
301 GAGGACTTGATCATCTACGAGATCCACGTCGGTACTTTCACCCCAGAGGGTACTTTCGAG
101 E D L I I Y E I H V G T F T P E G T F E
361 GGTGTCATCAGAAAGTTGGACTACTTGAAGGATTTGGGTATCACCGCTATCGAGATCATG
121 G V I R K L D Y L K D L G I T A I E I M
421 CCAATCGCTCAATTCCCAGGTAAGAGAGACTGGGGTTACGATGGTGTTTACTTGTACGCT
141 P I A Q F P G K R D W G Y D G V Y L Y A
481 GTCCAAAACTCCTACGGTGGTCCAGAGGGTTTCAGAAAGTTGGTTGATGAGGCTCACAAG
161 V Q N S Y G G P E G F R K L V D E A H K
541 AAGGGTTTGGGTGTTATCTTGGACGTTGTCTACAACCATGTTGGTCCAGAGGGTAACTAC
181 K G L G V I L D V V Y N H V G P E G N Y
601 ATGGTTAAGTTGGGTCCATACTTCAGTCAAAAGTACAAGACCCCATGGGGTTTGACCTTC
201 M V K L G P Y F S Q K Y K T P W G L T F
661 AACTTCGACGACGCTGAGTCCGATGAGGTCAGAAAGTTCATCTTGGAGAACGTTGAATAC
221 N F D D A E S D E V R K F I L E N V E Y
721 TGGATCAAGGAGTACAACGTTGATGGTTTCAGATTGGACGCTGTCCACGCTATCATCGAC
241 W I K E Y N V D G F R L D A V H A I I D
781 ACCTCTCCAAAGCACATCCTGGAGGAGATCGCTGATGTTGTCCACAAGTACAACAGAATC
261 T S P K H I L E E I A D V V H K Y N R I
841 GTTATCGCTGAGTCCGACTTGAACGACCCACGTGTTGTTAACCCAAAGGAGAAGTGTGGT
281 V I A E S D L N D P R V V N P K E K C G
901 TACAACATCGACGCTCAATGGGTTGACGATTTCCACCACTCTATCCACGCTTACTTGACC
301 Y N I D A Q W V D D F H H S I H A Y L T
961 GGTGAGAGACAAGGTTACTACACTGACTTCGGTAACTTGGACGATATCGTTAAGTCCTAC
321 G E R Q G Y Y T D F G N L D D I V K S Y
1021 AAGGACGTCTTCGTTTACGATGGTAAGTACTCCAACTTCAGAAGAAAGACCCACGGTGAG
341 K D V F V Y D G K Y S N F R R K T H G E
1081 CCAGTTGGTGAGTTGGATGGTTGTAACTTCGTCGTTTACATCCAAAACCACGATCAAGTC
361 P V G E L D G C N F V V Y I Q N H D Q V
1141 GGTAACAGAGGTAAGGGTGAGAGAATCATTAAGCTCGTCGACAGAGAGTCCTACAAGATC
381 G N R G K G E R I I K L V D R E S Y K I
1201 GCTGCTGCTTTGTACTTGTTGTCTCCATACATCCCAATGATCTTCATGGGTGAGGAGTAC
401 A A A L Y L L S P Y I P M I F M G E E Y
1261 GGTGAGGAGAACCCATTCTACTTCTTCTCTGACTTCTCCGACTCCAAGTTGATCCAAGGT
421 G E E N P F Y F F S D F S D S K L I Q G
1321 GTTAGAGAGGGTAGAAAGAAGGAGAACGGTCAAGACACTGATCCACAAGACGAGTCCACC
441 V R E G R K K E N G Q D T D P Q D E S T
1381 TTCAACGCTTCCAAGTTGTCTTGGAAGATCGATGAGGAGATTTTCAGTTTCTACAAGATC
461 F N A S K L S W K I D E E I F S F Y K I
1441 CTTATCAAGATGAGAAAGGAGTTGTCCATCGCTTGTGACAGAAGAGTCAACGTTGTCAAC
481 L I K M R K E L S I A C D R R V N V V N
1501 GGTGAGAACTGGTTGATCATCAAGGGTAGAGAATACTTCTCCTTGTACGTCTTCAGTAAG
501 G E N W L I I K G R E Y F S L Y V F S K
1561 TCCTCCATCGAGGTTAAGTACAGTGGTACCTTGTTGTTGTCTTCCAACAACAGTTTCCCA
521 S S I E V K Y S G T L L L S S N N S F P
1621 CAACACATCGAGGAGGGTAAGTACGAGTTCGACAAGGGTTTCGCTTTGTACAAGTTGTAG
541 Q H I E E G K Y E F D K G F A L Y K L *
1681 TAA
561 *
<210>SEQ ID NO：6
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf1
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：6：
CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTATGACC TTCGCTTACA AGATCGATGG TAACGAGGT
<210>SEQ ID NO：7
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr1
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：7：
TCTAGCTACC ATTGCTCCAA TAGAAGTGAA ACACCCGAGG TATGGTTTTC AGGCAATTC
<210>SEQ ID NO：8
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf2
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：8：
ATACCAAAAG TCCGTTAAGT TGAAGGTCTT GGAGAAGGGT TTGTACGAGA TGGAGAGAG
<210>SEQ ID NO：9
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr2
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：9：
AACATGCTCT ACCTCTCTCT GCTCTTCCCA ATGAAGTGGT AGTGAAACTT GTTGCAGTT
<210>SEQ ID NO：10
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf3
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：10：
TCACTTTGAA CAACGTCAAG GTCAGAGACA GATACAAGTA CGTTTTGGAC GATGCTTCC
<210>SEQ IDNO：11
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr3
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：11：
GCAAAACCTG CTACGAAGGC TCTAGGGTCT GGGTCGAAGG TCTATGGTTG GTCTCCCAC
<210>SEQ ID NO：12
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf4
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：12：
AGATACCAAC CAGAGGGTGT CCACGGTCCA TCTCAAATCA TCCAAGAGTC CAAGGAGTT
<210>SEQ ID NO：13
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr4
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：13：
AGGTTCTCAG GTTCCTCAAG TTGTTGCTCT GGAAGAACTT CTTCCTCCTG AACTAGTAG
<210>SEQ ID NO：14
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf5
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：14：
GAAGGAGGAC TTGATCATCT ACGAGATCCA CGTCGGTACT TTCACCCCAG AGGGTACTT
<210>SEQ ID NO：15
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr5
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：15：
AAGTGGGGTC TCCCATGAAA GCTCCCACAG TAGTCTTTCA ACCTGATGAA CTTCCTAAA
<210>SEQ ID NO：16
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf6
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：16：
TGGACTACTT GAAGGATTTG GGTATCACCG CTATCGAGAT CATGCCAATC GCTCAATTC
<210>SEQ ID NO：17
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr6
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：17：
GTACGGTTAG CGAGTTAAGG GTCCATTCTC TCTGACCCCA ATGCTACCAC AAATGAACA
<210>SEQ ID NO：18
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf7
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：18：
TACGATGGTG TTTACTTGTA CGCTGTCCAA AACTCCTACG GTGGTCCAGA GGGTTTCAG
<210>SEQ ID NO：19
<211>59
<213>核酸pFEr7
人工合成的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其推导的氨基酸序列
(iii)序列描述：SEQ ID NO：19：
CACCAGGTCT CCCAAAGTCT TTCAACCAAC TACTCCGAGT GTTCTTCCCA AACCCACAA
<210>SEQ ID NO：20
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf8
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：20：
CAAGAAGGGT TTGGGTGTTA TCTTGGACGT TGTCTACAAC CATGTTGGTC CAGAGGGTA
<210>SEQ ID NO：21
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr8
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：21：
GTACAACCAG GTCTCCCATT GATGTACCAA TTCAACCCAG GTATGAAGTC AGTTTTCAT
<210>SEQ ID NO：22
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf9
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：22：
CATACTTCAG TCAAAAGTAC AAGACCCCAT GGGGTTTGAC CTTCAACTTC GACGACGCT
<210>SEQ ID NO：23
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr9
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：23：
GAAGTTGAAG CTGCTGCGAC TCAGGCTACT CCAGTCTTTC AAGTAGAACC TCTTGCAAC
<210>SEQ ID NO：24
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf10
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：24：
TTCATCTTGG AGAACGTTGA ATACTGGATC AAGGAGTACA ACGTTGATGG TTTCAGATT
<210>SEQ ID NO：25
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr10
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：25：
TGCAACTACC AAAGTCTAAC CTGCGACAGG TGCGATAGTA GCTGTGGAGA GGTTTCGTG
<210>SEQ ID NO：26
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf11
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：26：
CGACACCTCT CCAAAGCACA TCCTGGAGGA GATCGCTGAT GTTGTCCACA AGTACAACA
<210>SEQ ID NO：27
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr11
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：27：
CAACAGGTGT TCATGTTGTC TTAGCAATAG CGACTCAGGC TGAACTTGCT GGGTGCACA
<210>SEQ ID NO：28
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf12
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：28：
ACTTGAACGA CCCACGTGTT GTTAACCCAA AGGAGAAGTG TGGTTACAAC ATCGACGCT
<210>SEQ ID NO：29
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr12
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：29：
ACCAATGTTG TAGCTGCGAG TTACCCAACT GCTAAAGGTG GTGAGATAGG TGCGAATGA
<210>SEQ ID NO：30
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf13
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：30：
CACTCTATCC ACGCTTACTT GACCGGTGAG AGACAAGGTT ACTACACTGA CTTCGGTAA
<210>SEQ ID NO：31
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr13
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：31：
TGATGTGACT GAAGCCATTG AACCTGCTAT AGCAATTCAG GATGTTCCTG CAGAAGCAA
<210>SEQ ID NO：32
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf14
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：32：
CTACAAGGAC GTCTTCGTTT ACGATGGTAA GTACTCCAAC TTCAGAAGAA AGACCCACG
<210>SEQ ID NO：33
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr14
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：33：
AAGTCTTCTT TCTGGGTGCC ACTCGGTCAA CCACTCAACC TACCAACATT GAAGCAGCA
<210>SEQ IDNO：34
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf15
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：34：
ATGGTTGTAA CTTCGTCGTT TACATCCAAA ACCACGATCA AGTCGGTAAC AGAGGTAAG
<210>SEQ ID NO：35
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr15
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：35：
TCAGCCATTG TCTCCATTCC CACTCTCTTA GTAATTCGAG CAGCTGTCTC TCAGGATGT
<210>SEQ ID NO：36
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf16
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：36：
GTCGACAGAG AGTCCTACAA GATCGCTGCT GCTTTGTACT TGTTGTCTCC ATACATCCC
<210>SEQ ID NO：37
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr16
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：37：
ACAACAGAGG TATGTAGGGT TACTAGAAGT ACCCACTCCT CATGCCACTC CTCTTGGGT
<210>SEQ ID NO：38
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf17
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：38：
GTACGGTGAG GAGAACCCAT TCTACTTCTT CTCTGACTTC TCCGACTCCA AGTTGATCC
<210>SEQ ID NO：39
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr17
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：39：
AGGCTGAGGT TCAACTAGGT TCCACAATCT CTCCCATCTT TCTTCCTCTT GCCAGTTCT
<210>SEQ ID NO：40
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf18
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：40：
AGAAGGAGAA CGGTCAAGAC ACTGATCCAC AAGACGAGTC CACCTTCAAC GCTTCCAAG
<210>SEQ ID NO：41
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr18
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：41：
GTGGAAGTTG CAAGGTTCAA CAGAACCTTC TAGCTACTCC TCTAAAAGTC AAAGATGT
<210>SEQ ID NO：42
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf19
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：42：
GAGATTTTCA GTTTCTACAA GATCCTTATC AAGATGAGAA AGGAGTTGTC CATCGCTTG
<210>SEQ ID NO：43
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr19
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：43：
TCCTCAACAG GTAGCGAACA CTGTCTTCTC AGTTGCAACA GTTGCCACTC TTGACCAAC
<210>SEQ ID NO：44
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf20
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：44：
CAACGGTGAG AACTGGTTGA TCATCAAGGG TAGAGAATAC TTCTCCTTGT ACGTCTTCA
<210>SEQ ID NO：45
<211>59
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr20
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：45：
AAGAGGAACA TGCAGAAGTC ATTCAGGAGG TAGCTCCAAT TCATGTCACC ATGGAACAA
<210>SEQ ID NO：46
<211>59(73)
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEf21
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：46：
AGTACAGTGG TACCTTGTTG TTGTCTTCCA ACAACAGTTT CCCACAACAC ATCGAGGAG
<210>SEQ ID NO：47
<211>73
<213>核酸
(A)链性：单链
(B)拓扑类型：线性
(C)PCR引物pFEr21
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO：47：
1 GGGTGTTGTG TAGCTCCTCC CATTCATGCT CAAGCTGTTC CCAAAGCGAA ACATGTTCAA
61 CATCATTCTT AAG
Claims (6)
1.一种人工合成改造的全长麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因，其碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
2.人工合成权利要求1所述全长麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的引物，其序列如SEQID NO:6至SEQ ID NO:47所示。
3.含有权利要求1所述基因的表达载体，所述表达载体为毕赤酵母表达载体pPICZαA。
4.含有权利要求1所述基因的基因工程菌，所述基因工程菌为Pichia pastorisSMD1168H/pPICZαA-MTHase。
5.含有权利要求1所述基因的细胞系，所述细胞系为阳性克隆酵母菌株Pichia pastorisSMD1168H/pPICZαA-MTHase。
6.一种制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，是将权利要求1所述的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因插入毕赤酵母表达载体，转化宿主菌酵母菌，筛选得到表达麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的基因工程菌，培养该基因工程菌，得到重组表达的麦芽寡糖基海藻糖水解酶；所述毕赤酵母表达载体为pPICZαA；所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因插入到pPICZαA载体的XhoI和EcoRI的酶切位点间；所述宿主酵母菌为Pichia pastoris SMD1168H；所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因工程菌为Pichia pastoris SMD1168H/pPICZαA-MTHase；所述表达为诱导表达，所用诱导剂为甲醇，诱导浓度为0.5%（v/v）；所述基因工程菌的培养温度为30℃，诱导表达的培养温度为25℃。
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