CN101503678A - 一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及其编码基因与应用。该麦芽寡糖基海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶相关功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。该麦芽寡糖基海藻糖合成酶蛋白具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性，该麦芽寡糖基海藻糖合成酶的分子量为90kDa，酶活性的pH范围为7.0～9.0，最适pH为8.0；酶活性的温度范围为20～40℃，最适反应温度为35℃。

Description

一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖由两个吡喃环葡萄糖以1，1-糖苷键连结而成，是一种非还原性二糖。海藻糖有3种光学异构体，其中αβ和ββ型在自然界中很少存在，αα型是最常见的海藻糖，αα型海藻糖结构式如式I所示。

海藻糖无色无嗅，口感略带甜味，其甜度相当于蔗糖的45％。海藻糖的理化性质稳定，不会焦糖化，不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，但能被海藻糖酶水解为两个葡萄糖分子。

海藻糖的制备方法：传统方法有化学合成法和微生物抽提法，特别是酵母提取法曾经是海藻糖的主要商品生产方式。但这些方法产品收率低，制造成本过高，价格昂贵，近年来已经逐步被淘汰。

海藻糖的生物合成途径有5种，磷酸化酶法利用转基因植物生产海藻糖，有关研究在国内外也颇为活跃。荷兰植物生物技术公司将编码大肠杆菌的6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖酯酶的基因OtsA和OtsB导入甜菜、马铃薯基因组中，然后从块茎中提取海藻糖。其缺点是目前块茎中海藻糖的含量还不够高。酶转化法是制备海藻糖的新方法。1990年意大利M De Rosa小组首先发现了能够将淀粉水解物转化为海藻糖的酶，但未申请专利。1994年日本林原生化研究所发明了用两种酶，即麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖基海藻糖水解酶(MTHase)，协同作用，由淀粉直接酶法生产海藻糖。配合其它淀粉水解酶，海藻糖转化率可达70％。1995年林原公司实现了双酶转化法的工业化生产，是当时海藻糖生产方法中成本最低的途径。

酶转化法分为两种：双酶法和单酶法。单酶法是由TreS基因编码的海藻糖合成酶通过分子内转糖基作用，可把海藻糖转化为麦芽糖：

双酶法首先由MTSase作用于麦芽糊精末端，催化分子内的转糖基化，形成麦芽寡糖基海藻糖。然后在MTHase作用下断裂麦芽寡糖和海藻糖间的α-1，4-糖苷键，释放出海藻糖。

这两种酶系在自然界的微生物中广泛存在，至少有15个菌属含有上述单酶或双酶系，但主要存在于古细菌、极端环境微生物中，或是在极端环境下诱导生成。关于海藻糖生成和代谢机制的研究一直是极端微生物(Extremophiles)研究的热点课题，在Nature，Science等顶级杂志上常有相关论文，也有大量研究课题，如近年的欧盟课题QLK1-CT-2000-01376；POCTI/BIO/48333/2002.有大量关于海藻糖合成酶系的基因工程表达研究，但海藻糖合成酶基因的编码特征特殊，在异源生物中不易表达，或表达量偏低，因此虽然有大量论文发表，但很少有依据基因工程表达申报的专利公开，据此推测相关技术尚待研究开发。

经过联网检索，关于海藻糖的酶法转化共检索到23个专利。其中林原生化研究所的国际专利01100417.7是日本生产海藻糖的主要方法。南宁中诺生物工程有限责任公司申请的中国专利200410013006.9公开的一种海藻糖合成酶，在40L发酵罐水平上表达，以27.27％的麦芽糖为底物，转化时间32h，转化率70％。是目前国内生产海藻糖的主要方法。中国专利200410013007.3、200410013008.8结果类似。

工业化生产：1995年日本林原Hayashibara公司首先实现了双酶法规模化生产海藻糖，大幅降低了生产成本和产品价格。目前海藻糖生产生产企业主要有日本林原研究所、美国Cargill公司、广西南宁中诺公司。其中广西南宁中诺公司通过选用木薯淀粉做原料，优化转化工艺，已经将海藻糖的价格降低到25000元/吨。

长期以来制约海藻糖广泛应用的根本原因是生产成本偏高。由于海藻糖和麦芽糖一样，都由淀粉二步转化生成：麦芽糖由淀粉酶和糖化酶转化，海藻糖由麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶转化，因此一旦海藻糖生产酶的产量、生产成本和效率能够和麦芽糖生产酶的一样，海藻糖的价格就可以和麦芽糖一样，其的产品竞争力和市场份额将非常巨大。

发明内容

本发明的目的是提供一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的麦芽寡糖基海藻糖合成酶，来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，名称为MTSase-1，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与麦芽寡糖基海藻糖合成酶相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由811个氨基酸残基组成。

所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的MTSase-1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

 

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的MTSase-1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的MTSase-1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase-1)的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase-1)的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的DNA分子；

序列表中的序列2由2436个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述转基因重组菌具体可为含有所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因的重组大肠杆菌，如含有上述基因的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS。所述重组大肠杆菌优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)PlysS TreY-30a，产生重组麦芽寡糖基海藻糖合成酶。

本发明还提供了一种表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶的方法。

本发明所提供的表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶的方法，是培养上述含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1编码基因的转基因重组菌，得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶。

本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1的分子量为90kDa，酶活性的pH范围为7.0～9.0，最适pH为8.0；酶活性的温度范围为20～40℃，最适反应温度为35℃。

本发明的的方法，诱导产酶，在最适反应温度和pH值条件下检测酶活力。结果表明，最大酶活力可达45.09U/ml发酵液，比活力为1588U/mg蛋白。

附图说明

图1为本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因的琼脂糖电泳检测图

图2为本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的SDS-PAGE图

图3为本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶最适反应温度检测结果图

图4为本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶热稳定性检测结果图

图5为本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶最适反应pH检测结果图

图6为本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶pH稳定性检测结果图

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料：

1)菌株和质粒谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium　glutamicum)CGMCC1.1886购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和表达载体pET-30a(+)为Novagen公司产品；pGEM-T Vector为Promega公司产品；大肠杆菌Top10为Invitrogen公司产品。

2)主要试剂

限制性内切酶、T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；Pfu DNA聚合酶购自天为时代公司；X-Gal购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海申能博彩公司；Ni-NTA Spin Kit购自德国QIAGEN公司；DNA分子量标准DL2000购自天根生化科技有限公司；糊精购自北京双旋微生物培养基制品厂；其他化学试剂为国产和进口分析纯试剂。

实施例1、麦芽寡糖基海藻糖合成酶

一、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase-1)及其编码基因(TreY-1)的获得

设计PCR扩增引物，上游引物TreY-1F：5′CCATGGATGGCACGTCCAATTTCC3′，下游引物TreY-1R：5′CCATGGAAACTCACTATCGGGTACTAAAAC3′其中上、下游引物中分别引入NcoI酶切位点，如下划线所示，使目的片段可经NcoI酶切后插入到同样酶切处理的表达载体pET30a中。

以TreY-1F和TreY-1R为引物，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC1.1886基因组DNA为模板，进行PCR反应。反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸3min20s，进行30个循环；最后延伸7min；随后加入2U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，10mmol/L dATP1μL，72℃加A反应20min，使得平末端的扩增产物带有3’端A突出的粘性末端，以便与克隆载体连接。

PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，得到电泳条带大小约为2.4kb，如图1所示。产物经回收纯化后，连接到pGEM-T Vector(Promega公司)上，转化大肠杆菌Top10，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，并进行测序鉴定。测序结果表明该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列该片段，即为麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因(TreY-1)。该基因表达序列表中序列1的氨基酸残基序列，即为麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1。图1中，泳道1是TreY-1基因PCR产物；泳道2是DL2000plus分子量标准。

二、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1的表达

1、制备表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1的重组菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)PlysS TreY-30a。

将步骤一获得的TreY-1基因成熟蛋白编码序列进行NcoI酶切后插入到大肠杆菌表达载体pET30a(Novagen公司)中，利用pET30a载体上的T7promoter primer(5′TAATACGAC TCACTATAGGG3′)为上游引物，TreY-1R为下游引物做PCR，扩增得到约2.7kb片段；另外NcoI酶切鉴定，得到2.4kb和5.4kb两个片段。两者结果与理论值均相符，证明已经构建得到正确的表达载体，将该表达载体命名为TreY-30a。该质粒TreY-30a转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen公司)得到含有TreY-30a的重组菌E.coli PlysS TreY-30a。将pET30a按照上述方法转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS得到含有pET30a的重组菌E.coli PlysS(pET30a)。

2、重组大肠杆菌的诱导表达及表达产物分析

将E.coli PlysS TreY-30a菌株或E.coli PlysS(pET30a)菌株接种到含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养，当菌体的OD600值达0.6时，加入IPTG(终浓度0.5mM)，25℃条件下诱导4h。

重组菌经0.5mM IPTG诱导4h后，分别取2OD菌液离心收集菌体，加300μlTris-HCl缓冲液(pH8.0)超声破碎，12000rpm离心10min，取上清液做SDS-PAGE，同时取Ni-NTA Spin Kit(购自德国QIAGEN公司)，严格按照试剂盒操作步骤进行纯化。结果如图2所示，结果表明重组菌在分子量约为90kDa处有特异蛋白条带，与理论推测的分子量相符，表明TreY-1基因在BL21(DE3)pLysS中得到表达，目的蛋白基本是以可溶的活性蛋白形式存在。经Ni柱纯化后得到单一蛋白条带。其中，图2中，泳道1是Ni柱纯化的重组蛋白；泳道2是pLysS(pET30a)菌体蛋白；泳道3是E.coli PlysS TreY-30a菌体蛋白离心后上清；泳道4是E.coli PlysS TreY-30a菌体蛋白；M是蛋白marker。

三、重组大肠杆菌(E.coli)PlysS TreY-30a产生麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1的性质分析

1、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1酶活力的检测

在100μl 8.8g/100ml的糊精溶液中，加入100μl步骤二中的步骤2制备的Ni柱纯化酶液，NTA-40Buffer(含有20mM pH7.9的Tris-HCl，0.5M NaCl和40mM咪唑的溶液)，35℃反应10min，100℃终止反应，加800μl水充分混匀，取100μl，再加入100μl水，600μl 5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测反应前后还原糖含量，以每分钟内使相当于葡萄糖减少1μg的酶量定义为一个酶活力单位。

酶比活力计算公式：

比活力＝[1.3342×(OD_{550水解反应后}-OD_{550水解反应前})×0.2×10×1000/10]/[20.263×0.467×3×0.001]

【注：1.3342——DNS法测定葡萄糖含量标准曲线斜率；0.2——酶活测定体积ml；10(分子中)——稀释倍数；1000——mg换算为μg系数；10(分母中)——时间min；20.263×0.467×3×0.001——100μl酶液蛋白mg数】

结果表明，在35℃反应10min，酶活力为45.09U/ml发酵液，比活力为1588U/mg蛋白。

2、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1最适反应温度及热稳定性

1)重组酶麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1最适反应温度测定

在pH8.0，不同温度条件下(15-60℃，间隔5℃)反应10min，分别测定本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(步骤二中的步骤2制备的Ni纯化后的酶液)的活力。将最适温度下测定的酶活力(最高酶活力)定为100％，其余温度下测定的酶活力与最适温度的酶活力的比值即为其相对酶活力，以百分数表示。

结果如图3所示，发现麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1最适反应温度为35℃(图3)，温度高于40℃时，酶活力显著下降。

2)重组酶麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1的热稳定性测定

将步骤二中的步骤2制备的Ni纯化后的酶液，分别在不同温度下(30℃、35℃、40℃、45℃和50℃)保温30min后按照上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1酶活力的检测方法，检测酶活力，将未经温度处理样品的酶活力(最高酶活力)定为100％，不同温度处理后的酶活力与未经温度处理酶活力的比值为相对酶活力，以百分数表示。

结果如图4所示，重组酶在30～35℃的条件下保温30min后仍具有85％以上的酶活力，而在40℃及以上条件下保温30min酶活迅速下降甚至失活(图4)。

3、重组酶最适反应pH及pH稳定性

1)重组酶麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1最适pH测定

在35℃，不同pH反应条件下(pH5、pH6、pH7、pH8和pH9)反应10min，分别测定步骤二中的步骤2制备的Ni纯化后重组酶麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1的活力，将在最适pH条件下测定的酶活力定为100％，不同pH值测定的酶活力与最适pH下测定的酶活力即为其相对酶活力，以百分数表示。

结果如图5所示，测得该酶最适pH为8.0左右(图5)，并在中性偏碱性条件下均具较高活性。

2)重组酶麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1pH稳定性测定

将步骤二中的步骤2制备的Ni柱纯化后的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1的酶液在不同pH值(pH5、pH6、pH7、pH8、pH9和pH10)的磷酸缓冲液中35℃保温30min，按照上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase-1酶活力的检测方法测定酶活力，将处理前的酶活力(最高酶活力)定为100％，其余pH值缓冲液保存处理测定的酶活力与最适温度的酶活力的比值即为其相对酶活力，以百分数表示。

结果如图6所示，该酶在pH5.0～9.0的条件下保温30min后仍具有68％以上的酶活力(图6)。

序列表

<160>2

<210>1

<211>811

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>1

<210>2

<211>2436

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>2

Claims (10)

1、一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列；

2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶相关功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与1)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体。

5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶的重组表达载体；所述大肠杆菌表达载体优选为pET30a载体。

6、含有权利要求2或3所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因的转基因细胞系或转基因重组菌。

7、根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于：所述转基因重组菌是将权利要求4或5所述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶的转基因重组菌；所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

8、权利要求2或3所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述海藻糖合成酶为麦芽寡糖基海藻糖合成酶。

10、一种表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶的方法，是培养权利要求6-7中任意一项所述的转基因重组菌得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶。

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