CN107779443A - 纤维二糖水解酶突变体及其应用 - Google Patents

纤维二糖水解酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纤维二糖水解酶突变体，其活性在纤维素降解中提供降解的功能，酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还公开了一种组合物，其含有一种或几种酶，酶为纤维二糖水解酶突变体。本发明还公开了纤维二糖水解酶突变体或组合物于纤维素水解中的应用。本发明的纤维二糖水解酶突变体具有水解纤维素的活性，且，得到了活性提高的突变体，提高了对纤维素的水解效果。

Description

纤维二糖水解酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶突变体，和通过基因定点突变的方法获得纤维二糖水解酶的突变体，以及纤维二糖水解酶突变体在纤维素降解中的应用。
背景技术
由于能源危机日益严重，可再生且环保效果显著的木质纤维素糖化工艺越来越受到人们的关注。利用纤维素酶降解木质纤维素成纤维二糖，进而转化成单糖，发酵生产包括乙醇在内的生物基产品对社会经济发展具有重要的现实意义。然而，由于纤维素酶降解天然纤维素底物的效率低，成本高，因此由纤维素转化为生物燃料的过程依然具有很大挑战性。同时，由于底物的特异性，以及纤维素酶发酵液酶系的不平衡也限制了其应用。在纤维素降解过程中，纤维素酶的水解效率是纤维素转化为葡萄糖的一个瓶颈。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种纤维二糖水解酶突变体，解决终产物对纤维二糖水解酶抑制作用的问题。
本发明还有一个目的是提供纤维二糖水解酶突变体于纤维素降解中的应用。
本发明提供的技术方案为：
一种纤维二糖水解酶突变体，所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
一种组合物，其含有一种或几种酶，所述酶为所述的纤维二糖水解酶突变体。这几种酶中的一种或任意几种同时用于酶系复配中从而用于降解纤维素。优选的是，所述组合物中，所述一种或几种酶均必须包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代精氨酸。
一种DNA分子，所述DNA分子编码所述的酶。
优选的是，所述的DNA分子中，所述DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
一种重组载体，其含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。
宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的DNA分子或所述的重组载体。
一种获得所述的纤维二糖水解酶突变体的方法，包括如下步骤：
步骤一、构建包含SEQ ID NO：2所示的碱基序列的重组载体，该重组载体以大肠杆菌为宿主；
步骤二、以步骤一中得到的重组载体为模板，分别利用如SEQ ID NO:13和14所示的引物对、如SEQ ID NO:15和16所示的引物对、如SEQ ID NO:17和18所示的引物对、所示的引物对，通过PCR扩增得到包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示的碱基序列的PCR产物；
步骤三、对所述PCR产物进行去甲基化处理，之后各自分别转化入大肠杆菌细胞中培养，获得含有纤维二糖水解突变体基因的重组载体。
优选的是，所述的方法中，步骤三中，利用甲基化酶DpnI进行酶解对所述PCR产物进行去甲基化处理。
纤维二糖水解酶突变体的生产方法，包括如下步骤：将获得的含有所述纤维二糖水解突变体基因的重组载体的宿主细胞在培养基中培养，在所述宿主细胞中生产基于重组载体所含有的纤维二糖水解酶突变体基因编码的纤维二糖水解酶突变体。
所述的纤维二糖水解酶突变体或所述的组合物于纤维素水解中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明的纤维二糖水解酶突变体具有水解纤维素的活性，所述水解纤维素的活性在纤维素降解中提供降解的功能，能用于降解纤维素。同时，为了提高纤维二糖水解酶的水解率，本发明得到纤维二糖水解酶的突变体如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代精氨酸，提高了对纤维素的水解效果。可将其单独或与其他突变体组合使用，以提高水解效率。
本发明的纤维二糖水解酶突变体SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代精氨酸(T389K、氨基酸序列SEQ ID NO:3)的表达量很高，且活性很高，能够用于降解纤维素。高活力的纤维二糖水解酶可用于酶系复配中，平衡水解酶系，提高转化效率。水解率的提高可以提高单位时间内纤维二糖水解酶的水解效率，降低酶用量。
定义
为了便于理解本发明，本发明涉及的术语和短语的含义定义如下：
“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3’”与序列“5’-C-A-T-3’”反向互补。
“基因”，是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列称为结构基因，本发明中所称的基因为结构基因。
“载体”，是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。
“重组载体”，是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。
“引物”，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物称为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。
“纤维素酶”，纤维素酶是指能降解纤维素1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，适当调节组合物(即对组分酶系)中这三种主要成分活性的比例，实现完成纤维素的降解。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的纤维二糖水解酶突变体T389K表达后凝胶电泳图；
图2是本发明所述的纤维二糖水解酶突变体T389K提高水解率效果的曲线图；
图3是本发明所述的纤维二糖水解酶突变体的水解率效果的曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种纤维二糖水解酶突变体，所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明还提供一种组合物，其含有一种或几种酶，所述酶为所述的纤维二糖水解酶突变体。
在一些优选的实施例中，为提高水解效率，该组合物中，所述一种或几种酶总是包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为赖氨酸的酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:2)，可将其单独加入，用于降解纤维素，也可与其他几个突变体中的任一种或几种同时加入，提高纤维素的水解效率。
本发明提供的所述酶与其他用于降解纤维素比如β-1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶的酶共同作用，用于降解纤维素。本发明提供的酶也可单独用于降解纤维二糖。
本发明还提供一种DNA分子，所述DNA分子编码所述的酶。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列，为如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为赖氨酸的酶突变体。由于氨基酸密码子存在简并性，对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子(synonymous codon)。简并性使得那些即使密码子中碱基被改变，但仍然能编码出原氨基酸。密码子的简并性也使DNA分子上碱基组成有较大余地的变动。所以，本发明所述的DNA分子包括但不限于以上的多核苷酸序列，还存在很多能够编码所述酶的可能的多核苷酸序列，这里不在一一列举。
本发明还提供一种重组载体，其含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列，该DNA分子的序列选自：SEQ ID NO:4、6、8、10和12。本发明中使用的用于表达的调节序列为pET系列载体，当然，也可以使用其他适于编码所述酶的核苷酸序列的表达载体，使其能够在多种真核宿主细胞和原核宿主细胞中表达即可。
本发明还提供宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的DNA分子或所述的重组载体。该重组载体所含的DNA分子能够编码所述酶。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为大肠杆菌细胞。
本发明还提供一种获得所述的纤维二糖水解酶突变体的方法，包括如下步骤：
步骤一、构建包含SEQ ID NO：2所示的碱基序列的重组载体，该重组载体以大肠杆菌为宿主；
步骤二、以步骤一中得到的重组载体为模板，分别利用如SEQ ID NO:13和14所示的引物对、如SEQ ID NO:15和16所示的引物对、如SEQ ID NO:17和18所示的引物对、所示的引物对，通过PCR扩增得到包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示的碱基序列的PCR产物；引物序列不限于此列举出的序列，也可以是其他序列，只要能得到目的核苷酸序列即可。
步骤三、对所述PCR产物均进行去甲基化处理，之后各自分别转化入大肠杆菌细胞中培养，获得含有纤维二糖水解突变体基因的重组载体。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤三中，利用甲基化酶DpnI进行酶解对所述PCR产物进行去甲基化处理。
本发明还提供纤维二糖水解酶突变体的生产方法，包括如下步骤：将权利要求7获得的含有所述纤维二糖水解突变体基因的重组载体的宿主细胞在培养基中培养，在所述宿主细胞中生产基于重组载体所含有的纤维二糖水解酶突变体基因编码的纤维二糖水解酶突变体。
本发明还提供所述的纤维二糖水解酶突变体或所述的组合物于纤维素水解中的应用。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，还提供如下的实施例1至5进行说明：
实施例1
本实施例的野生型纤维二糖水解酶，来源于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，DNA分子序列如SEQ ID NO：2所示，经全基因合成所得。其中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4的首尾各6个碱基为NdeI(5’)和XhoI(3’)的酶切位点。
本发明提供的纤维二糖水解酶突变体为通过对如SEQ ID NO：2所示的DNA分子编码的蛋白质进行突变而来。以含有纤维二糖水解酶DNA序列(SEQ ID NO：2)的重组质粒为模板进行突变，得到纤维二糖水解酶突变体T389K(SEQ ID NO：3)、T389R(SEQ ID NO：5)、T389D(SEQ ID NO：7)、T389E(SEQ ID NO：9)和T389Q(SEQ ID NO：11)。
上述构建方法中使用的表达载体指pET15、pET22或pET28等。
实施例2
1、构建pET28a(+)-bgl1：编码野生型纤维二糖水解酶(氨基酸序列SEQ ID NO:1)的基因(核苷酸序列SEQ ID NO:2)的重组载体
将野生型基因序列(SEQ ID NO:2)和pET系列的一种表达载体pET28a分别使用NheI和Xho I酶进行酶切后，纯化回收酶切后的基因片段和pET载体，并将基因片段连接到pET28a载体上得到连接子pET28a(+)-bgl1。将该连接子pET28a(+)-bgl1转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ IDNO:2相同)，挑选含有正确序列的相应菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1大量培养后，提取质粒即得到大量正确的pET28a(+)-bgl1的重组载体(氨基酸序列SEQ ID NO:1，核苷酸序列SEQ ID NO:2)，以该pET28a(+)-bgl1的重组载体为模板进行后续突变基因的构建。
采用定点突变方法，以基因片段的重组载体为模板，通过设计突变引物SEQ IDNO:13(上游引物)和SEQ ID NO:14(下游引物)进行突变。上游引物设计中将突变位点作为中心，左右各12-30个碱基，下游引物为上游引物的反向互补序列。所述突变引物包括：其中上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:13示，另一条引物的碱基序列如SEQ ID NO:14所示。
之后利用突变引物重组质粒进行高保真PCR扩增(详见下面的步骤2)。得到的PCR产物是一个缺失的环状，即是线性的重组载体，本发明采用的Thermo公司生产的phusion酶通过突变引物把重组质粒扩增了全长，所以得到PCR产物是环状的(包含突变的基因序列和载体)，将该PCR产物转入到大肠杆菌DH5a细胞中后这个线性的重组载体又会自动修复成为和重组载体一样的环状结构。
2、构建pET28a(+)-bgl1/T389K
利用突变引物，以pET28a(+)-bgl1为模板，进行高保真PCR扩增，得到pET28a(+)-bgl1/T389K(核苷酸序列SEQ ID NO:3)。此时，pET28a(+)-bgl1/T389K为一线性的重组载体。
利用如下表1和表2所示，采用Thermo公司phusion酶进行高保真PCR扩增.
表1PCR扩增体系
表2 PCR循环的条件
首先将PCR得到的突变产物按照表3所示分别进行去甲基化处理之后，转入大肠杆菌DH5α或大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，并进行DNA序列测定。并将含有突变正确的DNA序列的菌斑培养并提取质粒，获得含有突变纤维二糖水解酶基因的重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)或E.coli Rosetta等表达菌株，筛选阳性克隆，即得到含有本发明的突变基因的工程菌株。
需要说明的是，由于E.coli DH5α等宿主都具有甲基化修饰，而作为模板的pET28a(+)-bgl1重组载体是从E.coli DH5α等宿主细胞中提取的，所以其DNA序列具有甲基化位点，DpnI能够特异性识别这些位点，将模板DNA切开成小段，从而将利用DpnI酶切后的PCR产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中后，模板DNA即pET28a(+)-bgl1重组载体在含有卡那霉素的固体平板上不会生长。而成功突变的PCR产物中由于没有甲基化位点，不会受到DpnI的酶切影响，从而在转入到E.coli DH5α中，突变的线性的重组载体又会自动修复成为和重组载体一样的环状结构，并成功复制。因此在筛选阳性克隆时，去除了残留模板DNA的干扰。
表3利用甲基化酶DpnI处理PCR产物的体系
通过以上方法，分别得到了含有突变基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/T389K等。
实施例3
含本发明纤维二糖水解酶突变基因工程菌的表达与蛋白纯化
将纤维二糖水解酶突变体(核苷酸序列SEQ ID NO:3)按照2％的体积比接种于20mL含有卡那霉素的液体LB培养基中，28℃过夜培养。将活化后的培养液接种于含有卡那霉素的100mL LB液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD600＝0.6(以UNICOUV2102紫外可见分光光度计，以培养用LB培养基为空白对照)；之后加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，并于28℃、180rpm条件下继续培养10小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的结合缓冲液(Binding buffer)，350W功率、冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液。
粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化，洗脱液中咪唑浓度为500mM，洗脱10个柱体积。之后得到的蛋白经过检测达到SDS-PAGE纯度的要求。通过以上方法得纤维二糖水解酶蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO：1)和纤维二糖水解酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO：3)。
实施例4
使用二硝基水杨酸法测定蛋白的酶活，实际是以微晶纤维素为底物进行的测定，测定氨基酸序列SEQ ID NO：3所示的纤维二糖水解酶突变体T398K活性及水解率，具体方法和步骤为：
样品：5％(w/v)微晶纤维素在50℃恒温水浴锅预热5-10min，加入20mg/mL的酶稀释液。
水浴：将混合均匀的样品、底物和酶的对照组同时置于50℃恒温水浴锅中，水浴反应24h。
灭活：反应结束时，将样品、底物和酶的对照组一起煮沸5min使酶失活。
测定：在540nm波长下测定吸光度，算出样品中还原糖含量，并算出水解效果，如图2所示，水解24h时，野生型的水解率为21.6％，突变体T398K的水解率为24.4％，提高了13.5％。
实施例5
依照上述实施例2至3中的方法，构建得到了E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/T389R、T389D、T389E和T389Q的工程菌株，并进行了蛋白表达，测定纤维二糖水解酶突变体T389K(SEQ ID NO：3)、T389R(SEQ ID NO：5)、T389D(SEQ ID NO：7)、T389E(SEQ ID NO：9)和T389Q(SEQ ID NO：11)活性及水解率，依照实施例4的方法，在540nm波长下测定吸光度，算出样品中还原糖含量，并算出水解效果，如图3所示，水解24h时，野生型和突变体T389K、T389R、T389D、T389E、T389Q的水解率分别为21.6％，24.4％，13.7％，14.8％，14.0％和20.6％。
酶活性的提高可以提高单位时间内纤维二糖水解酶的水解效率，降低酶用量，提高在酶系复配中平衡酶系提高整体水解率的作用，具有广泛的应用前景。
各纤维二糖水解酶突变体突变体的突变引物序列如下，依次为上游引物和下游引物：
T389K
SEQ ID NO：13：CTCTACCTACCCGACCAACGAAACCTCTTCTAAACCGGGTGCTGTTCGTGGTTCTTG
SEQ ID NO：14：CAAGAACCACGAACAGCACCCGGTTTAGAAGAGGTTTCGTTGGTCGGGTAGGTAGAG
T389R
SEQ ID NO：15：CTCTACCTACCCGACCAACGAAACCTCTTCTCGTCCGGGTGCTGTTCGTGGTTCTTG
SEQ ID NO：16：CAAGAACCACGAACAGCACCCGGACGAGAAGAGGTTTCGTTGGTCGGGTAGGTAGAG
T389D
SEQ ID NO：17：CTCTACCTACCCGACCAACGAAACCTCTTCTGACCCGGGTGCTGTTCGTGGTTCTTG
SEQ ID NO：18：CAAGAACCACGAACAGCACCCGGTTTAGAAGAGGTTTCGTTGGTCGGGTAGGTAGAG
T389E
SEQ ID NO：19：CTCTACCTACCCGACCAACGAAACCTCTTCTGAACCGGGTGCTGTTCGTGGTTCTTG
SEQ ID NO：20：CAAGAACCACGAACAGCACCCGGTTCAGAAGAGGTTTCGTTGGTCGGGTAGGTAGAG
T389Q
SEQ ID NO：21：CTCTACCTACCCGACCAACGAAACCTCTTCTCAGCCGGGTGCTGTTCGTGGTTCTTG
SEQ ID NO：22：CAAGAACCACGAACAGCACCCGGCTGAGAAGAGGTTTCGTTGGTCGGGTAGGTAGAG
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的纤维二糖水解酶突变体及其应用的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，根据本发明，由于提供了酶活性提高的酶及其组合物，可以提高单位时间内纤维二糖水解酶的水解效率，降低酶用量，提高在酶系复配中平衡酶系提高整体水解率的作用，具有广泛的应用前景。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 纤维二糖水解酶突变体及其应用
<130> 2016
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp Gln
1 5 10 15
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val Val
20 25 30
Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr Asn
35 40 45
Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Asp Phe Val Thr
85 90 95
Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala Ser
100 105 110
Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser Phe
115 120 125
Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr
130 135 140
Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr Asn
145 150 155 160
Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro
165 170 175
Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Glu
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Ser Cys
195 200 205
Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Gln Ala Asn Ser Ile Ser Glu Ala Leu
210 215 220
Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly Asp
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp
245 250 255
Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser Phe
260 265 270
Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys Leu Thr
275 280 285
Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr Val
290 295 300
Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala Glu
325 330 335
Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys
340 345 350
Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp
355 360 365
Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Glu
370 375 380
Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser Ser
385 390 395 400
Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val Thr
405 410 415
Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ser
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Gly
<210> 2
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catatgtctg cttgcaccct gcagtctgaa acccacccgc cgctgacctg gcagaaatgc 60
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ctgtgcccgg acaacgaaac ctgcgctaaa aactgctgcc tggacggtgc tgcttacgct 240
tctacctacg gtgttaccac ctctggtaac tctctgtcta tcgacttcgt tacccagtct 300
gctcagaaaa acgttggtgc tcgtctgtac ctgatggctt ctgacaccac ctaccaggaa 360
ttcaccctgc tgggtaacga attctctttc gacgttgacg tttctcagct gccgtgcggt 420
ctgaacggtg ctctgtactt cgtttctatg gacgctgacg gtggtgtttc taaatacccg 480
accaacaccg ctggtgctaa atacggtacc ggttactgcg actctcagtg cccgcgtgac 540
ctgaaattca tcaacggtca ggctaacgtt gaaggttggg aaccgtcttc taacaacgct 600
aacaccggta tcggtggtca cggttcttgc tgctctgaaa tggacatctg gcaggctaac 660
tctatctctg aagctctgac cccgcacccg tgcaccaccg ttggtcagga aatctgcgaa 720
ggtgacggtt gcggtggtac ctactctgac aaccgttacg gtggtacctg cgacccggac 780
ggttgcgact ggaacccgta ccgtctgggt aacacctctt tctacggtcc gggttcttct 840
ttcaccctgg acaccaccaa aaaactgacc gttgttaccc agttcgaaac ctctggtgct 900
atcaaccgtt actacgttca gaacggtgtt accttccagc agccgaacgc tgaactgggt 960
tcttactctg gtaacgaact gaacgacgac tactgcaccg ctgaagaagc tgaattcggt 1020
ggttcttctt tctctgacaa aggtggtctg acccagttca aaaaagctac ctctggtggt 1080
atggttctgg ttatgtctct gtgggacgac tactacgcta acatgctgtg gctggactct 1140
acctacccga ccaacgaaac ctcttctacc ccgggtgctg ttcgtggttc ttgctctacc 1200
tcttctggtg ttccggctca ggttgaatct cagtctccga acgctaaagt taccttctct 1260
aacatcaaat tcggtccgat cggttctacc ggtaacccgt ctggttaact cgag 1314
<210> 3
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp Gln
1 5 10 15
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val Val
20 25 30
Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr Asn
35 40 45
Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn Glu
50 55 60
Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Asp Phe Val Thr
85 90 95
Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala Ser
100 105 110
Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser Phe
115 120 125
Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr
130 135 140
Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr Asn
145 150 155 160
Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro
165 170 175
Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Glu
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Ser Cys
195 200 205
Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Gln Ala Asn Ser Ile Ser Glu Ala Leu
210 215 220
Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly Asp
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp
245 250 255
Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser Phe
260 265 270
Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys Leu Thr
275 280 285
Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr Val
290 295 300
Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala Glu
325 330 335
Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys
340 345 350
Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp
355 360 365
Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val Thr
405 410 415
Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ser
420 425 430
Gly
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<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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tctatctctg aagctctgac cccgcacccg tgcaccaccg ttggtcagga aatctgcgaa 720
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<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
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50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Asp Phe Val Thr
85 90 95
Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala Ser
100 105 110
Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser Phe
115 120 125
Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr
130 135 140
Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr Asn
145 150 155 160
Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro
165 170 175
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Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly Asp
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys
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355 360 365
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Gly
<210> 6
<211> 1302
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<211> 433
<212> PRT
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Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr
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Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser Phe
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ggtgttccgg ctcaggttga atctcagtct ccgaacgcta aagttacctt ctctaacatc 1260
aaattcggtc cgatcggttc taccggtaac ccgtctggtt aa 1302
<210> 9
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp Gln
1 5 10 15
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val Val
20 25 30
Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr Asn
35 40 45
Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Asp Phe Val Thr
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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275 280 285
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290 295 300
Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala Glu
325 330 335
Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys
340 345 350
Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp
355 360 365
Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Glu
370 375 380
Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Glu Ser Ser
385 390 395 400
Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val Thr
405 410 415
Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ser
420 425 430
Gly
<210> 10
<211> 1302
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tctgcttgca ccctgcagtc tgaaacccac ccgccgctga cctggcagaa atgctcttct 60
ggtggtacct gcacccagca gaccggttct gttgttatcg acgctaactg gcgttggacc 120
cacgctacca actcttctac caactgctac gacggtaaca cctggtcttc taccctgtgc 180
ccggacaacg aaacctgcgc taaaaactgc tgcctggacg gtgctgctta cgcttctacc 240
tacggtgtta ccacctctgg taactctctg tctatcgact tcgttaccca gtctgctcag 300
aaaaacgttg gtgctcgtct gtacctgatg gcttctgaca ccacctacca ggaattcacc 360
ctgctgggta acgaattctc tttcgacgtt gacgtttctc agctgccgtg cggtctgaac 420
ggtgctctgt acttcgtttc tatggacgct gacggtggtg tttctaaata cccgaccaac 480
accgctggtg ctaaatacgg taccggttac tgcgactctc agtgcccgcg tgacctgaaa 540
ttcatcaacg gtcaggctaa cgttgaaggt tgggaaccgt cttctaacaa cgctaacacc 600
ggtatcggtg gtcacggttc ttgctgctct gaaatggaca tctggcaggc taactctatc 660
tctgaagctc tgaccccgca cccgtgcacc accgttggtc aggaaatctg cgaaggtgac 720
ggttgcggtg gtacctactc tgacaaccgt tacggtggta cctgcgaccc ggacggttgc 780
gactggaacc cgtaccgtct gggtaacacc tctttctacg gtccgggttc ttctttcacc 840
ctggacacca ccaaaaaact gaccgttgtt acccagttcg aaacctctgg tgctatcaac 900
cgttactacg ttcagaacgg tgttaccttc cagcagccga acgctgaact gggttcttac 960
tctggtaacg aactgaacga cgactactgc accgctgaag aagctgaatt cggtggttct 1020
tctttctctg acaaaggtgg tctgacccag ttcaaaaaag ctacctctgg tggtatggtt 1080
ctggttatgt ctctgtggga cgactactac gctaacatgc tgtggctgga ctctacctac 1140
ccgaccaacg aaacctcttc tgaaccgggt gctgttcgtg gttcttgctc tacctcttct 1200
ggtgttccgg ctcaggttga atctcagtct ccgaacgcta aagttacctt ctctaacatc 1260
aaattcggtc cgatcggttc taccggtaac ccgtctggtt aa 1302
<210> 11
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp Gln
1 5 10 15
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val Val
20 25 30
Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr Asn
35 40 45
Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn Glu
50 55 60
Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Asp Phe Val Thr
85 90 95
Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala Ser
100 105 110
Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser Phe
115 120 125
Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr
130 135 140
Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr Asn
145 150 155 160
Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro
165 170 175
Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Glu
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Ser Cys
195 200 205
Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Gln Ala Asn Ser Ile Ser Glu Ala Leu
210 215 220
Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly Asp
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp
245 250 255
Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser Phe
260 265 270
Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys Leu Thr
275 280 285
Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr Val
290 295 300
Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala Glu
325 330 335
Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys
340 345 350
Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp
355 360 365
Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Glu
370 375 380
Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val Thr
405 410 415
Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ser
420 425 430
Gly
<210> 12
<211> 1302
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tctgcttgca ccctgcagtc tgaaacccac ccgccgctga cctggcagaa atgctcttct 60
ggtggtacct gcacccagca gaccggttct gttgttatcg acgctaactg gcgttggacc 120
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ctgctgggta acgaattctc tttcgacgtt gacgtttctc agctgccgtg cggtctgaac 420
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accgctggtg ctaaatacgg taccggttac tgcgactctc agtgcccgcg tgacctgaaa 540
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ggtatcggtg gtcacggttc ttgctgctct gaaatggaca tctggcaggc taactctatc 660
tctgaagctc tgaccccgca cccgtgcacc accgttggtc aggaaatctg cgaaggtgac 720
ggttgcggtg gtacctactc tgacaaccgt tacggtggta cctgcgaccc ggacggttgc 780
gactggaacc cgtaccgtct gggtaacacc tctttctacg gtccgggttc ttctttcacc 840
ctggacacca ccaaaaaact gaccgttgtt acccagttcg aaacctctgg tgctatcaac 900
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<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctctacctac ccgaccaacg aaacctcttc taaaccgggt gctgttcgtg gttcttg 57
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caagaaccac gaacagcacc cggtttagaa gaggtttcgt tggtcgggta ggtagag 57
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctctacctac ccgaccaacg aaacctcttc tcgtccgggt gctgttcgtg gttcttg 57
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caagaaccac gaacagcacc cggacgagaa gaggtttcgt tggtcgggta ggtagag 57
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctctacctac ccgaccaacg aaacctcttc tgacccgggt gctgttcgtg gttcttg 57
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caagaaccac gaacagcacc cggtttagaa gaggtttcgt tggtcgggta ggtagag 57
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctctacctac ccgaccaacg aaacctcttc tgaaccgggt gctgttcgtg gttcttg 57
<210> 20
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
caagaaccac gaacagcacc cggttcagaa gaggtttcgt tggtcgggta ggtagag 57
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctctacctac ccgaccaacg aaacctcttc tcagccgggt gctgttcgtg gttcttg 57
<210> 22
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
caagaaccac gaacagcacc cggctgagaa gaggtttcgt tggtcgggta ggtagag 57

Claims (10)

1.一种纤维二糖水解酶突变体，其特征在于，所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.一种组合物，其含有一种或几种酶，其特征在于，所述酶为权利要求1所述的纤维二糖水解酶突变体。
3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如权利要求1或2所述的酶。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
5.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。
6.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的DNA分子或权利要求5所述的重组载体。
7.一种获得如权利要求1所述的纤维二糖水解酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、构建包含SEQ ID NO：2所示的碱基序列的重组载体，该重组载体以大肠杆菌为宿主；
步骤二、以步骤一中得到的重组载体为模板，分别利用如SEQ ID NO:13和14所示的引物对、如SEQ ID NO:15和16所示的引物对、如SEQ ID NO:17和18所示的引物对、所示的引物对，通过PCR扩增得到包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQID NO：12所示的碱基序列的PCR产物；
步骤三、对所述PCR产物均进行去甲基化处理，之后各自分别转化入大肠杆菌细胞中培养，获得含有纤维二糖水解突变体基因的重组载体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤三中，利用甲基化酶DpnI进行酶解对所述PCR产物进行去甲基化处理。
9.纤维二糖水解酶突变体的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求7获得的含有所述纤维二糖水解突变体基因的重组载体的宿主细胞在培养基中培养，在所述宿主细胞中生产基于重组载体所含有的纤维二糖水解酶突变体基因编码的纤维二糖水解酶突变体。
10.权利要求1所述的纤维二糖水解酶突变体或权利要求2所述的组合物于纤维素水解中的应用。
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