CN110229804A - 一种柠檬烯合成酶SynLS1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柠檬烯合成酶SynLS1及其应用，柠檬烯合成酶SynLS1的氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。本发明成功构建了含有该基因的重组表达载体，建立生物合成柠檬烯的方法以NPP为底物合成了柠檬烯。本发明柠檬烯合成酶催化活性高，能够实现柠檬烯在微生物细胞中的合成，有效的降低了生产成本，有利于工业化生产。

Description

一种柠檬烯合成酶SynLS1及其应用

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，涉及一种柠檬烯合成酶SynLS1及其在生物合成柠檬烯中的应用。

背景技术

柠檬烯(Limonene)化学名为1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯，分子式为C₁₀H₁₆，相对分子量为136。柠檬烯是一种单环单萜，无色液体，且不溶于水，与苯、氯仿、乙醚混溶。自然界中的柠檬烯有两种光学异构体，D-柠檬烯和L-柠檬烯。D-柠檬烯具有抗炎、抑菌、抗癌等多种生理及药理活性，在食品工业、医药卫生领域及日化工业等领域都有着广阔的应用，其需求量也日益增大。

D-柠檬烯广泛存在于柑橘类水果(柠檬、甜橙、葡萄柚等)的果肉和果皮中，目前D-柠檬烯主要通过对柑橘类水果的果肉及果皮进行分离提取获得，其产量及产品质量因受到季节及环境等因素的影响而不稳定。基于此，随着近些年合成生物学和代谢工程技术的快速发展，微生物细胞平台为萜类化合物的合成提供了有效的途径。

微生物细胞合成柠檬烯需要引入外源的柠檬烯合成酶，柠檬烯合成酶能够催化底物合成柠檬烯以及少量其他萜类化合物。但目前，柠檬烯合成酶催化活性不高，生产成本高。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种活性高，生产成本低的柠檬烯合成酶SynLS1。

本发明的第二个目的是提供柠檬烯合成酶SynLS1的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种柠檬烯合成酶SynLS1，其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

编码一种柠檬烯合成酶SynLS1的基因，所述基因的核苷酸序列用SEQ ID No.2所示。

一种柠檬烯合成酶SynLS1催化底物橙花基焦磷酸合成柠檬烯的应用。

本发明的优点：

本发明提供一种编码柠檬烯合成酶SynLS1的基因和其编码的柠檬烯合成酶SynLS1，并成功构建了含有该基因的重组表达载体，建立生物合成柠檬烯的方法以NPP为底物合成了柠檬烯。本发明柠檬烯合成酶催化活性高，能够实现柠檬烯在微生物细胞中的合成，有效的降低了生产成本，有利于工业化生产。

附图说明

图1为表达载体pNLS1图谱。

图2为菌株ScLim1发酵液和柠檬烯标品的气相色谱图，其中，1:柠檬烯标准品；2：ScLim1发酵液。

具体实施方式

本发明所用大肠杆菌菌株E.coliDH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。

酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司。

酿酒酵母菌株yJGZ1来源于已发表文献(Jiang G Z,Yao M D,WangY,etal.Manipulation of GES and ERG20 for geraniol overproduction in Saccharomycescerevisiae[J].Metabolic Engineering,2017,41:57-66.)。

LB培养基组成为：10g/L氯化钠、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

SD培养基组成为：20g/L葡萄糖，酵母基本氮源6.7g/L，氨基酸缺省混合粉末2g/L，余量为水，0.1Mpa压力115℃下灭菌15min。SD培养基在使用前根据具体情况添加所需的无菌氨基酸母液。

YPD培养组成为：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力115℃下灭菌15min。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1柠檬烯合成酶基因SynLS1的获得

通过在NCBI数据库中检索柠檬烯合成酶，得到ClLS1基因，结合酿酒酵母对密码子的偏好性，同时去除常用酶切位点及N端转运肽，通过全人工合成得到柠檬烯合成酶SynLS1基因，该基因的核苷酸序列用SEQ ID No.2所示。该基因编码得到的柠檬烯合成酶的氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

将通过化学全合成得到的柠檬烯合成酶SynLS1基因片段，通过PCR方法在片段两端分别加上BsaI酶切位点。用高保真DNA聚合酶，建立PCR体系。

PCR过程是，95℃变性5min；95℃变性30s，选择57℃退火30s，72℃延伸1min，循环数为30个。

以SynLS1基因片段为模板，以SynLS1-F(SEQ ID No.3)和SynLS1-R(SEQ ID No.4)为引物，大量扩增制备含BsaI酶切位点序列的SynLS1基因，纯化扩增产物后，备用。

实施例2重组表达载体pCSN的构建

通过在NCBI数据库中检索橙花基焦磷酸合成酶，得到NDPS1基因，结合酿酒酵母对密码子的偏好性，同时去除常用酶切位点及N端转运肽，通过全人工合成得到橙花基焦磷酸合成酶tSlNDPS1基因，该基因的核苷酸序列用SEQ ID No.5所示。

提取酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C的基因组并以该基因组为模板，分别以ENO2-F(SEQID No.6)、ENO2-R(SEQ ID No.7)、GAL10-F(SEQ ID No.8)、GAL10-R(SEQ ID No.9)、GPM1-F(SEQ ID No.10)、GPM1-R(SEQ ID No.11)、GAL7-F(SEQ ID No.12)、GAL7-R(SEQ IDNo.13)、GPD-F(SEQ ID No.14)和GPD-R(SEQ ID No.15)为引物，通过PCR反应分别得到ENO2终止子，GAL10启动子，GPM1终止子，GAL7启动子和GPD终止子片段，这些片段的核苷酸序列依次用SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示。PCR反应过程与实施例1相同。

再分别以ENO2终止子，GAL10启动子，tSlNDPS1基因，GPM1终止子，GAL7启动子和GPD终止子为模板，分别以ENO2-F2(SEQ ID No.21)、EG-R(SEQ ID No.22)、EG-F(SEQ IDNo.23)、GtS-R(SEQ ID No.24)、GtS-F(SEQ ID No.25)、tSG-R(SEQ ID No.26)、tSG-F(SEQID No.27)、GG-R(SEQ ID No.28)、GG-F(SEQ ID No.29)、GBsaG-R(SEQ ID No.30)、GBsaG-F(SEQ ID No.31)和GPD-R2(SEQ ID No.32)为引物，进行多步重叠延伸PCR反应，得到两端添加了NotI酶切位点的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段。

将得到的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段使用FastDigest内切酶NotI进行酶切，反应体系为：5μL 10*FD buffer，4μL NotI内切酶、30μL T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，1h。将NotI单酶切后的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段连于相同酶切线性化的表达载体骨架pRS426(Addgene，USA)上，通过连接反应得到pCSN质粒。

其连接反应体系为：1μL 10*T4DNA连接酶缓冲液,1μLT4DNA连接酶,6μL用NotI单酶切后的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段和2μLNotI单酶切后的表达载体骨架pRS426。连接反应条件为：30℃，30min。

实施例3重组表达载体pNLS1的构建

将实施例1中得到的含BsaI酶切位点序列的SynLS1基因片段使用FastDigest内切酶BsaI进行酶切，反应体系为：5μL 10*FD buffer，4μLBsaI内切酶、30μLSynLS1基因片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，4h。将BsaI单酶切后的SynLS1基因片段连于相同酶切线性化的表达载体pCSN的GAL7启动子下游和GPD终止子上游处，通过连接反应得到pNLS1质粒(图1)。

其连接反应体系为：1μL 10*T4DNA连接酶缓冲液,1μLT4DNA连接酶,6μL用BsaI单酶切后的SynLS1基因片段和2μLBsaI单酶切后的表达载体骨架pCSN。连接反应条件为：30℃，30min。

实施例4重组酿酒酵母的构建及生物合成柠檬烯

1.重组酿酒酵母的构建

将所构建的载体pNLS1通过化学转化的方式转入宿主细胞酿酒酵母菌株yJGZ1中，得到重组菌株ScLim1。

2.重组菌株ScLim1生物合成柠檬烯

挑重组菌株ScLim1单菌落接种于不含有尿嘧啶的SD培养基中，30℃，250rpm，震荡培养20h左右，再次转接到新鲜的不含有尿嘧啶的SD培养基中，30℃摇床，250rpm，培养20h左右后转接至50mLYPD发酵培养基中，初始OD₆₀₀为0.2左右，同时添加10％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯，其目的是为了防止目的产物柠檬烯的挥发并且缓解柠檬烯对于酵母细胞的毒性，然后放置于30℃摇床，250rpm，培养48h，合成柠檬烯。

经过气相色谱检测，重组菌株ScLim1在50mLYPD培养基中发酵48h能够合成25.6mg/L柠檬烯(图2)。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种柠檬烯合成酶SynLS1及其应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 556

<212> PRT

<213> 柠檬(Citrus lemon)

<400> 1

Met Asp Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Gln Pro Ser Ile Trp Asp His Asp

1 5 10 15

Phe Leu Gln Ser Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Asp Glu Ala Tyr Lys Arg

20 25 30

Arg Ala Glu Glu Leu Arg Gly Lys Val Lys Ile Ala Ile Lys Asp Val

35 40 45

Ile Glu Pro Leu Asp Gln Leu Glu Leu Ile Asp Asn Leu Gln Arg Leu

50 55 60

Gly Leu Ala His Arg Phe Glu Thr Glu Ile Arg Asn Ile Leu Asn Asn

65 70 75 80

Ile Tyr Asn Asn Asn Lys Asp Tyr Asn Trp Arg Lys Glu Asn Leu Tyr

85 90 95

Ala Thr Ser Leu Glu Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Pro Val

100 105 110

Ser Gln Glu Val Phe Asn Gly Phe Lys Asp Asp Gln Gly Gly Phe Ile

115 120 125

Cys Asp Asp Phe Lys Gly Ile Leu Ser Leu His Glu Ala Ser Tyr Tyr

130 135 140

Ser Leu Glu Gly Glu Ser Ile Met Glu Glu Ala Trp Gln Phe Thr Ser

145 150 155 160

Lys His Leu Lys Glu Val Met Ile Ser Lys Asn Met Glu Glu Asp Val

165 170 175

Phe Val Ala Glu Gln Ala Lys Arg Ala Leu Glu Leu Pro Leu His Trp

180 185 190

Lys Val Pro Met Leu Glu Ala Arg Trp Phe Ile His Ile Tyr Glu Arg

195 200 205

Arg Glu Asp Lys Asn His Leu Leu Leu Glu Leu Ala Lys Met Glu Phe

210 215 220

Asn Thr Leu Gln Ala Ile Tyr Gln Glu Glu Leu Lys Glu Ile Ser Gly

225 230 235 240

Trp Trp Lys Asp Thr Gly Leu Gly Glu Lys Leu Ser Phe Ala Arg Asn

245 250 255

Arg Leu Val Ala Ser Phe Leu Trp Ser Met Gly Ile Ala Phe Glu Pro

260 265 270

Gln Phe Ala Tyr Cys Arg Arg Val Leu Thr Ile Ser Ile Ala Leu Ile

275 280 285

Thr Val Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu

290 295 300

Glu Ile Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp Ile Asn Tyr Ala Leu

305 310 315 320

Lys His Leu Pro Gly Tyr Met Lys Met Cys Phe Leu Ala Leu Tyr Asn

325 330 335

Phe Val Asn Glu Phe Ala Tyr Tyr Val Leu Lys Gln Gln Asp Phe Asp

340 345 350

Leu Leu Leu Ser Ile Lys Asn Ala Trp Leu Gly Leu Ile Gln Ala Tyr

355 360 365

Leu Val Glu Ala Lys Trp Tyr His Ser Lys Tyr Thr Pro Lys Leu Glu

370 375 380

Glu Tyr Leu Glu Asn Gly Leu Val Ser Ile Thr Gly Pro Leu Ile Ile

385 390 395 400

Thr Ile Ser Tyr Leu Ser Gly Thr Asn Pro Ile Ile Lys Lys Glu Leu

405 410 415

Glu Phe Leu Glu Ser Asn Pro Asp Ile Val His Trp Ser Ser Lys Ile

420 425 430

Phe Arg Leu Gln Asp Asp Leu Gly Thr Ser Ser Asp Glu Ile Gln Arg

435 440 445

Gly Asp Val Pro Lys Ser Ile Gln Cys Tyr Met His Glu Thr Gly Ala

450 455 460

Ser Glu Glu Val Ala Arg Gln His Ile Lys Asp Met Met Arg Gln Met

465 470 475 480

Trp Lys Lys Val Asn Ala Tyr Thr Ala Asp Lys Asp Ser Pro Leu Thr

485 490 495

Gly Thr Thr Thr Glu Phe Leu Leu Asn Leu Val Arg Met Ser His Phe

500 505 510

Met Tyr Leu His Gly Asp Gly His Gly Val Gln Asn Gln Glu Thr Ile

515 520 525

Asp Val Gly Phe Thr Leu Leu Phe Gln Pro Ile Pro Leu Glu Asp Lys

530 535 540

His Met Ala Phe Thr Ala Ser Pro Gly Thr Lys Gly

545 550 555

<210> 2

<211> 1671

<212> DNA

<213> 柠檬(Citrus lemon)

<400> 2

atggatagaa gatctgctaa ttatcaacca tcaatttggg atcatgattt cttgcaatct 60

ttaaattcta actacacaga tgaagcatac aaaagaagag ctgaagaatt acgtggtaaa 120

gttaagatcg caattaaaga tgttattgaa ccattagatc aattggaatt gattgataat 180

ttgcaaagat tgggtttagc tcatagattt gaaactgaaa ttagaaacat cttgaacaac 240

atctataaca acaataagga ttacaactgg agaaaggaaa atttgtacgc tacttctttg 300

gagtttagat tgttaagaca acatggttac ccagtttcac aagaagtttt taatggtttt 360

aaagatgatc aaggtggttt tatttgtgat gatttcaagg gtattttgtc tttacatgaa 420

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aagatggagt ttaatacatt acaagctatc tatcaagaag aattgaagga aatttctggt 720

tggtggaaag atactggttt aggtgaaaaa ttgtcatttg caagaaatag attggttgct 780

tcatttttgt ggtcaatggg tattgcattt gaaccacaat ttgcttactg tagaagagtt 840

ttgacaattt ctattgcatt gatcactgtt attgatgata tatatgatgt ttacggtaca 900

ttagatgaat tggaaatttt tactgatgca gttgaaagat gggatattaa ctacgctttg 960

aagcatttgc caggttacat gaagatgtgt ttcttggcat tgtacaactt cgttaacgaa 1020

tttgcttatt acgttttaaa acaacaagat tttgatttgt tgttatctat taaaaatgct 1080

tggttgggtt tgatccaagc atatttggtt gaggctaagt ggtatcattc taagtacact 1140

ccaaaattag aagaatactt ggaaaacggt ttagtttcaa ttacaggtcc attgatcatc 1200

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tcaaatccag atattgttca ttggtcttca aagattttta gattgcaaga tgatttgggt 1320

acatcttcag atgaaattca aagaggtgac gttccaaaat ctattcaatg ttacatgcat 1380

gaaactggtg catcagaaga agttgctaga caacatatca aggatatgat gagacaaatg 1440

tggaagaaag ttaatgcata cacagctgat aaagattctc cattaactgg tactacaact 1500

gaatttttgt tgaatttggt tagaatgtca catttcatgt atttgcatgg tgacggtcat 1560

ggtgttcaaa accaagaaac aattgatgtt ggttttactt tgttgttcca accaatccca 1620

ttggaagata agcacatggc ttttactgct tctccaggta ctaaaggtta a 1671

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtctcaatg gatagaagat ctgctaatta cc 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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tgttacgaag ataacgataa cgatttggat gaagaattga tgccaaagca cattgctttg 120

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aagcacatta ttccaaagtt gaaggaaatt tgtgacattt cttctaagtt gggtatccaa 240

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gaagaaacta ctaagggtaa caagggtttg cacttggtta ttgctttgaa ctacggtggt 480

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ttgaaggaag ctatcatgaa cttccaacaa agacacagaa gattcggtgg tcacacttac 780

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<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtgctttta actaagaatt attagtc 27

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tatagttttt tctccttgac gtt 23

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttatattga attttcaaaa attcttactt 30

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<211> 22

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agtctgaaga atgaatgatt tg 22

<210> 11

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<210> 12

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttgccagct tactatcctt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttttgaggg aatattcaac tgt 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtgaattta ctttaaatct tgcatt 26

<210> 15

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggaatctgtg tatattactg cat 23

<210> 16

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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agtgctttta actaagaatt attagtcttt tctgcttatt ttttcatcat agtttagaac 60

actttatatt aacgaatagt ttatgaatct atttaggttt aaaaattgat acagttttat 120

aagttacttt ttcaaagact cgtgctgtct attgcataat gcactggaag gggaaaaaaa 180

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gaccacagtg atatgcatat gggagatgga gatgatacct 400

<210> 17

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480

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agtctgaaga atgaatgatt tgatgatttc tttttccctc catttttctt actgaatata 60

tcaatgatat agacttgtat agtttattat ttcaaattaa gtagctatat atagtcaaga 120

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<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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gcagtaatat acacagattc c 501

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcggccgcag tgcttttaac taagaattat tagtc 35

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

taacgtcaag gagaaaaaac tataaggtat catctccatc tcccatat 48

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atatgggaga tggagatgat accttatagt tttttctcct tgacgtta 48

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcttgttcaa acctctagca gacattttat attgaatttt caaaaattct t 51

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aagaattttt gaaaattcaa tataaaatgt ctgctagagg tttgaacaag a 51

<210> 26

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcatcaaatc attcattctt cagactttag taagtgtgac caccgaa 47

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

attcggtggt cacacttact aaagtctgaa gaatgaatga tttgatga 48

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcaagaagga tagtaagctg gcaaatattc gaactgccca ttcagctttt 50

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaaagctgaa tgggcagttc gaatatttgc cagcttacta tccttcttga 50

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttcactttag gagaccggtc tcccattttt tgagggaata ttcaactgtt 50

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaaaaatggg agaccggtct cctaaagtga atttacttta aatcttgcat 50

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcggccgcgg aatctgtgta tattactgca t 31

Claims (3)

1.一种柠檬烯合成酶SynLS1，其特征是其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1一种柠檬烯合成酶SynLS1的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列用SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1的一种柠檬烯合成酶SynLS1催化底物橙花基焦磷酸合成柠檬烯的应用。