CN104583416A

CN104583416A - 提高的萜类和类萜产生

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Publication number: CN104583416A
Application number: CN201380044215.7A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·厄斯特高·唐热; 迈克尔·内斯比; 克里斯托夫·福利; 法妮·德勒格兰奇; 延斯·霍顿-拉森; 西蒙·卡尔森
Original assignee: Evolva AG
Current assignee: Evolva Holding SA
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2015-04-29
Also published as: US9834800B2; BR112015003329A2; EP2885420B1; EP2885420A1; WO2014027118A1; AU2013304001B2; DK2885420T3; AU2013304001A1; US20180080054A1; CA2880962C; US10190140B2; CA2880962A1; US20150225754A1; HK1211984A1; MX2015002124A; MX363434B

Abstract

本发明提供了用于通过提高萜类和类萜的类异戊二烯前体的产生或积累或者二者来产生萜类和类萜的重组细胞和方法。

Description

提高的萜类和类萜产生

发明背景

技术领域

本文所述的本发明涉及基因改造和重组细胞，其可用于通过提高萜类(terpenes)和类萜的类异戊二烯前体的产生或积累或者二者来产生萜类和类萜。本发明提供了具有降低的法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的酶促活性的重组细胞以及使用这种细胞的方法，及其使用方法。本发明提供的重组细胞通常具有更高的通过甲羟戊酸生物化学途径的代谢流(metabolic flux)，并且还可包含编码可用于增加甲羟戊酸途径产物(特别是类异戊二烯)之酶的另外的重组表达构建体。

背景技术

萜类和相关类萜包括一大类生物来源的有机分子。萜类和类萜来自5碳异戊二烯单元，并因此也被称为类异戊二烯。它们由类异戊二烯焦磷酸产生，其是在若干生物学和商业上重要分子的生物合成中充当前体的有机分子。

类萜可见于所有种类的活生物体中，并且包括最大组的天然产物。植物类萜由于其芳香品质而被广泛使用，并且在传统草药疗法中起作用，而且被用于研究抗细菌、抗肿瘤和其他制药功能。类萜对于桉树的气味，肉桂、丁香和姜的香味，以及黄色花的颜色有作用。公知的类萜包括柠檬醛、薄荷醇、樟脑、植物墨西哥鼠尾草(Salvia divinorum)和大麻类中的Salvinorin A。

虽然使得由异戊烯焦磷酸(IPP)和/或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)到类萜的生物合成步骤是通用的，但是存在两种得到IPP和DMAPP的不同途径——甲羟戊酸途径和非甲醛戊酸的2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(MEP/DOXP)途径。甲羟戊酸途径在多种生物体中负责产生类异戊二烯衍生分子。许多类异戊二烯分子具有高的商业价值，并由于经济和持续性原因，非常希望在基因改造的宿主而非天然宿主中产生这些分子中的一些。

甲羟戊酸途径中产生基础C5类异戊二烯焦磷酸、异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的部分包括七个酶促步骤。参与这些步骤的7个酿酒酵母(S.cerevisiae)基因是(按在途径中的连续顺序)：ERG10、ERG13、HMGR、ERG12、ERG8、ERG19和IDI1。IPP和DMAPP是形成用于合成包含2至10之间任何数目的异戊二烯单元的高阶类异戊二烯焦磷酸前体之基础的异戊二烯单元。最重要的一些是牻牛儿基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。

发明内容

本发明包括用于有利地在重组细胞中通过提高类异戊二烯焦磷酸前体的产生来提高萜类和类萜之产生的方法。特别地，本发明涉及用于在所述重组细胞中提高异戊烯焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、牻牛儿基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)之产生或积累或者二者的方法。

在一个方面，本发明涉及用于在重组细胞中产生萜或类萜的方法，所述方法包括在基因改造的细胞中产生萜或类萜的条件下培养细胞的步骤，所述基因改造的细胞具有降低的内源异戊二烯基二磷酸合酶(prenyldiphosphate synthase)的表达，例如法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶，并且还包含编码用于产生所述萜或类萜之异源酶的一个或更多个重组表达构建体。

在本发明的一个实施方案中，对细胞进行基因改造以降低法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达。

在另一个实施方案中，通过向细胞中引入重组遗传构建体来在重组细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，所述启动子序列以比编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的内源基因的启动子水平低的水平指导表达。

在另一个实施方案中，通过向细胞中引入重组遗传构建体来在重组细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，其中在所述启动子和编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸序列之间是具有下式的异源插入序列：

-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-

其中X₂包含至少4个连续核苷酸，所述至少4个连续核苷酸与X₄的至少4个连续核苷酸互补并形成发夹二级结构元件，并且

其中X₃包含0个核苷酸或者在X₂和X₄之间形成发夹环的一个或更多个不配对核苷酸，并且

X₄包含至少4个连续核苷酸，所述至少4个连续核苷酸与X₂的至少4个连续核苷酸互补并形成发夹二级结构元件；并且

其中X₁和X₅包含0、1或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，通过向细胞中引入重组遗传构建体来在细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在构建体中与信使RNA去稳定基序(destabilizing motif)有效连接。

在另一个实施方案中，本发明进一步或替代地包括向细胞中引入编码截短形式的3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的重组表达构建体，所述截短形式的HMGR包含其催化活性羧基末端部分。在另一些实施方案中，本发明进一步或替代地包括向细胞中引入编码异源核酸序列的重组表达构建体，所述异源核酸序列编码双功能酶，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶。在一个非限制性实例中，所述双功能酶是粪肠球菌(E.faecalis)编码的mvaE基因或其功能同源物(functional homologue)。

在另一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，并且是哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞或酵母细胞。在另一个实施方案中，所述真核细胞是酵母细胞，所述酵母细胞是以下物种的酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastori)、棉病囊霉(Ashbya gossypii)、Arxula adeninivorans、产朊假丝酵母(Cyberlindnerajadinii)或白色假丝酵母(Candida albicans)。在一个具体实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母，而异戊二烯基二磷酸合成酶是ERG20、ERG9或BTS1。

在本发明的一个实施方案中，萜或类萜是单萜、二萜、倍半萜、类三萜(triperpenoid)或类四萜(tetraterpenoid)。通过本发明方法产生的单萜的非限制性实施方案是蒎烯、月桂烯或牻牛儿醇。通过本发明方法产生的二萜的非限制性实施方案是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素或蚜栖菌素(aphidicolin)。通过本发明方法产生的倍半萜的非限制性实施方案是紫穗槐二烯(amorphadiene)、百秋李醇(patchoulol)、檀香醇、长叶烯或罗汉柏烯(thujopsene)。通过本发明方法产生的类三萜的非限制性实施方案是角鲨烯，而类四萜是类胡萝卜素。

在第二个方面，本发明涉及用于产生萜或类萜的重组细胞，所述重组细胞被基因改造以使内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，并且还包含编码用于产生所述萜或类萜之异源酶的一个或更多个重组表达构建体。

在本发明的一个实施方案中，通过向细胞中引入重组遗传构建体来在重组细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，所述启动子序列以比编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的内源基因的启动子水平低的水平指导表达。

在另一些实施方案中，通过向细胞中引入重组遗传构建体来在重组细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，其中在所述启动子和编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸序列之间是具有下式的异源插入序列：

-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-

其中X₂包含至少4个连续核苷酸，所述至少4个连续核苷酸与X₄的至少4个连续核苷酸互补并形成发夹二级结构元件，以及

其中X₁和X₅包含0、1或更多个核苷酸。

在另一个实施方案中，通过向细胞中引入重组遗传构建体来在细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在构建体中与信使RNA去稳定基序有效连接。

进一步或替代地，本发明提供的重组细胞的实施方案还包含编码截短形式的3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的重组表达构建体，所述截短形式的HMGR包含其催化活性羧基末端部分。在另一些额外的或替代的实施方案中，重组细胞包含编码异源核酸序列的重组表达构建体，所述异源核酸序列编码双功能酶，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶。在一个非限制性实例中，所述双功能酶是粪肠球菌编码的mvaE基因或其功能同源物。

在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一些具体实施方案中，宿主细胞是真核细胞，所述真核细胞是哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞或酵母细胞。在另一个实施方案中，所述真核细胞是酵母细胞，并且所述酵母细胞是以下物种的酵母：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、博伊丁假丝酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、棉病囊霉、Arxula adeninivorans、产朊假丝酵母或白色假丝酵母。在一个实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母，而异戊二烯基二磷酸合成酶是ERG20、ERG9或BTS1。

本文所述发明涉及重组细胞，所述重组细胞被基因改造以具有提高的甲羟戊酸产生和/或具有更高的通过甲羟戊酸生化途径的代谢流，并且还可包含编码可用于增加甲羟戊酸途径产物(特别是类异戊二烯)之酶的另外的重组表达构建体。在一些实施方案中，基因改造的重组细胞表达增加的甲醛戊酸产生或积累或者二者的表型。

通过以下对于某些优选实施方案的更详细描述和权利要求，本发明的一些具体的优选实施方案将变得明显。

附图简述

图1示出了用于同源重组的构建体的概况，其可用于在编码法呢基二磷酸合酶之ORF的前方插入(A)弱KEX2启动子或(B)CYC1+SL。(C)示出了CYC1+SL，是指与SEQ ID NO：2的异源插入序列连接的CYC1启动子。

图2A示出了内源甲羟戊酸途径的一部分，其包括到多种生物碱和类萜的途径(左图)。此外，示出了产生所述生物碱和类萜的多种反应以及所涉及的酶(右图)。图2B示出了甲羟戊酸途径以及改造的途径的概况。以ERG10开始的中间栏示出了酿酒酵母的内源途径。右侧栏示出了根据本发明改造的一种途径的一个实例。还概括了在实施例4所述方法中使用的质粒。

图3示出了由CpDmaW和FgaMT催化的反应。

图4与野生型菌株相比含CYC1(5％)-ERG20或KEX2-ERG20的酵母细胞中DMAT和Me-DMAT的产生。

图5示出了与野生型菌株相比KEX2-ERG20中在肉豆蔻酸异丙酯中测定的苧烯(limonene)表达水平。

图6示出了含ADS质粒和对照质粒、截短形式的酿酒酵母HMGR1或者粪肠球菌的mvaE和mvaS的酵母细胞中产生之甲羟戊酸(上图)和紫穗槐二烯(下图)的水平。

图7示出了具有ERG13缺失的酵母细胞(左)和具有ERG13缺失但是还含有粪肠球菌之mvaE和mvaS的酵母细胞(右)的生长。

图8示出了野生型菌株和KEX2-ERG20+tGPPS+tLIMS菌株的最终OD₆₀₀。这表明经修饰的菌株生长良好并且OD₆₀₀大于10。

图9示出了在野生型菌株和KEX2-ERG20+FPPS+GPPS+CDPS+KS菌株中测定的贝壳衫烯(kaurene)产生的水平。

发明详述

为了所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此明确地通过引用并入。

可使用本领域技术人员公知的方法来构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和PCR技术。参见，例如以下文献中描述的技术：Maniatis等，1989，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，New York，and PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications(Innis等，1990，Academic Press，SanDiego，CA)。

在详细描述本发明之前，对若干术语进行了限定。如本文使用的，无数量词限制的名词包括复数指示物，除非上下文明确指出相反情况。例如，提到“核酸”意指一个或更多个核酸。

应注意，本文的术语如“优选地”“、“通常地”和“典型地”并不用于限制本发明要求保护的范围或者意味着某些特征对于要求保护之发明的结构或功能是关键的、必需的或甚至重要的。相反地，这些术语仅旨在强调替代的或额外的特征，这些特征可以用在或可不用在本发明的一个具体实施方案中。

为了描述和限定本发明的目的，应注意本文的术语“基本上”用于表示固有的不确定性程度，其可归因于任何定量的比较、值、测量或其他表示。本文还使用术语“基本上”来表示在不导致所讨论主题的基本功能改变的情况下，定量表示(quantitative representation)可不同于所规定参考的程度。

本文使用的术语“多核苷酸”“、“核苷酸”“、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用来指包括DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸。

本文使用的术语“类萜”应解释为包括这样的分子，其中所述分子的至少一部分来自异戊二烯基焦磷酸，例如IPP、DMAPP等。

应注意，术语“焦磷酸”和“二磷酸”在本文中可互换使用。

关于本文所述核苷酸和氨基酸序列之间的序列同一性，如本领域技术人员将理解的，高水平的序列同一性表明第一序列衍生自第二序列的可能性。氨基酸序列同一性要求在两个比对序列之间具有相同的氨基酸序列。因此，对与参考序列具有70％氨基酸同一性的候选序列，要求在比对后，候选序列中70％的氨基酸与参考系列中对应的氨基酸相同。通过借助计算机分析以及其中建议的默认参数来确定根据本发明的同一性，例如，没有限制地，ClustalW计算机比对程序(Higgins等，1994，Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW软件可由欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute)http：//www.ebi.ac.uk/clustalw的ClustalWWWW Service得到。使用该程序及其默认设置，将查询多肽和参考多肽的成熟(生物活性)部分比对。对完全保守残基的数目计数并除以参考多肽的长度。ClustalW算法可类似地用来比对核苷酸序列。可以用类似于氨基酸序列的方式来计算序列同一性。在某些实施方案中，本发明细胞包含本文中限定的编码萜和类萜生物合成途径之修饰的、异源的和额外的酶促组分的核酸序列。

在一个方面，本发明涉及用于在重组宿主细胞中产生萜或类萜的方法，所述方法包括以下步骤：在基因改造的细胞中产生萜或类萜的条件下培养，所述基因改造的细胞具有降低的内源异法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达，并且还包含编码用于产生所述萜或类萜之异源酶的一个或更多个重组表达构建体。

本发明的方法可用于例如通过本发明方法的所述重组宿主细胞大规模生产萜和/或类萜和/或类异戊二烯。如以下实例所示，本发明的方法可用于产生重组宿主细胞，所述重组宿主细胞具有提高的通过目的途径的代谢流，并且在重组宿主细胞中以出乎意料的更高水平有效产生目的萜和/或类萜和/或类异戊二烯。

本文所述提高的代谢流意指与参考宿主细胞中流向目的萜和/或类萜和/或类异戊二烯的流相比，重组宿主细胞中目的萜和/或类萜和/或类异戊二烯的流提高至少2倍。

法呢基二磷酸合酶和/或牻牛儿基二磷酸合酶的下调

在一个方面，本发明涉及具有降低活性或表达的内源法呢基二磷酸合酶和/或牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的宿主细胞。在一些具体实施方案中，当野生型宿主细胞表达具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶时，则本发明的宿主细胞优选地具有降低活性的所述具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶。这种宿主细胞的一个非限制性实例是酿酒酵母以及由ERG20基因编码的内源酶。

在本发明的一些实施方案中，野生型宿主细胞不表达任何具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶。在这样的实施方案中，宿主细胞优选地具有降低活性的法呢基二磷酸合酶和/或牻牛儿基二磷酸合酶。

所述降低的活性导致IPP和DMAPP的产生和积累或二者，因此本发明宿主细胞可用在积累和产生IPP、DMAPP以及以IPP或DMAPP作为前体的化合物的方法中，以及用于产生提高量的由所述类异戊二烯前体产生的萜类或类萜。

法呢基二磷酸合酶可以是本文描述的任何法呢基焦磷酸合酶。一般地，宿主细胞携带有编码法呢基二磷酸合酶的内源基因，其中本发明提供的重组细胞已经被进行了基因改造以降低法呢基二磷酸合酶的活性。

牻牛儿基二磷酸合酶可以是本文描述的任何牻牛儿基焦磷酸合酶。一般地，本发明提供的重组细胞已经进行了基因改造以降低牻牛儿基二磷酸合酶的活性。

一些宿主细胞包含还具有一些GGPP合酶活性的牻牛儿基二磷酸合酶。在本发明使用这些宿主细胞的实施方案中，则所述牻牛儿基二磷酸合酶可以是具有牻牛儿基二磷酸合酶和GGPP合酶二者活性的酶。

当宿主细胞携带编码具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的内源基因时，则本发明提供的重组细胞已经被基因改造以降低所述酶的活性。

根据本发明具有降低活性的法呢基二磷酸合酶的重组细胞可具有法呢基二磷酸合酶活性，其为具有野生型法呢基二磷酸合酶活性的类似细胞中法呢基二磷酸合酶活性的约80％、约50％、约30％、例如10％至50％的范围内。通常重要的是，重组细胞保留至少一些法呢基二磷酸合酶活性，因为这是大部分细胞必需的。如本文所示，可极大降低法呢基二磷酸合酶活性而不显著损害细胞生存力。具有极大降低的法呢基二磷酸合酶活性的重组细胞可具有比相应野生型细胞稍慢的生长速率。因此，优选地，本发明重组细胞的生长速率为具有野生型法呢基二磷酸合酶活性的类似细胞生长的至少50％。

在本发明的某些实施方案中，根据本发明具有降低活性的具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的宿主细胞具有所述酶的活性，其为具有具法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之野生型酶的类似宿主细胞中所述酶活性的至多80％、优选至多50％、例如至多30％，例如10％至50％的范围内。通常重要的是，重组细胞保留至少一些法呢基二磷酸合酶和至少一些牻牛儿基二磷酸合酶活性，因为这是大部分宿主细胞必需的。如本文所示，可极大降低法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性而不显著损害细胞生存力。具有极大降低的活性的重组细胞可具有比相应野生型细胞稍慢的生长速率。因此，优选地，本发明重组细胞的生长速率为具有具法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之野生酶的类似细胞生长的至少50％。

在本发明的另一些实施方案中，根据本发明具有降低活性的牻牛儿基二磷酸合酶之重组细胞的牻牛儿基二磷酸合酶活性为具有野生型牻牛儿基二磷酸合酶活性的类似宿主细胞中牻牛儿基二磷酸合酶活性的至多80％、优选至多50％、例如至多30％，例如10％至50％的范围内。通常重要的是，重组细胞保留至少一些牻牛儿基二磷酸合酶活性，因为这是大部分宿主细胞必需的。如本文所示，可极大降低牻牛儿基二磷酸合酶活性而不显著损害细胞生存力。具有极大降低活性的牻牛儿基二磷酸合酶的重组细胞可具有比相应野生型细胞稍慢的生长速率。然而，优选地，本发明重组细胞的生长速率为具有野生型牻牛儿基二磷酸合酶活性之类似宿主细胞生长的至少50％。

可以以多种不同方式来降低法呢基二磷酸合酶的活性。在某些实施方案中，可以将编码法呢基二磷酸合酶之基因的野生型启动子换成弱启动子，例如下文在“启动子序列”部分中描述的任意弱启动子。因此，可通过同源重组或通过缺失和插入来引入包含弱启动子的构建体，以使内源基因失活。因此，重组细胞可包含在弱启动子的控制下编码法呢基二磷酸合酶的ORF，所述弱启动子例如可以是“启动子序列”部分中描述的任意弱启动子。通常，本发明细胞仅包含宿主细胞内源的一种编码法呢基二磷酸合酶的ORF，以确保降低内源法呢基二磷酸合酶活性的总体水平。

在另一些实施方案中，替代地或同时地，重组细胞可包含异源插入序列，其降低编码法呢基二磷酸合酶之mRNA的表达。在一些具体实施方案中，异源核酸插入序列可位于启动子序列和编码法呢基二磷酸合酶的ORF之间。所述异源插入序列可以是下文在“异源插入序列”部分中描述的任意异源插入序列。

在另一些实施方案中，可使用使mRNA转录本去稳定的基序来降低法呢基二磷酸合酶活性。因此，本发明的重组细胞可包含含有与编码法呢基二磷酸合酶之开放阅读框(ORF)有效连接的启动子序列的核酸，以及包含使mRNA转录本去稳定之基序的核苷酸序列。所述基序可以是下文在“使mRNA转录本去稳定的基序”部分中描述的任意使mRNA转录本去稳定的基序。

类似地，可使用相同或类似方法来降低具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶或者具有牻牛儿基二磷酸合酶活性之酶的活性。

在本发明的一些具体实施方案中，重组细胞还可具有失活的和/或无内源法呢基二磷酸合酶活性和/或无内源牻牛儿基二磷酸合酶活性。这可以例如通过以下实现：

a)使编码内源法呢基二磷酸合酶的整个基因缺失；或

b)使编码内源法呢基二磷酸合酶的整个编码区缺失；或

c)使编码法呢基二磷酸合酶之基因的一部分缺失，导致内源法呢基二磷酸合酶活性全部丧失；或

d)使编码内源牻牛儿基二磷酸合酶的整个基因缺失；或

e)使编码内源牻牛儿基二磷酸合酶的整个编码区缺失；或

f)使编码内源牻牛儿基二磷酸合酶之基因的一部分缺失，导致牻牛儿二磷酸合酶活性全部丧失；或

g)使编码具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之内源酶的整个基因缺失；或

h)使编码具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之内源酶的整个编码区缺失；或

i)使编码具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之内源酶的基因的一部分缺失，导致所述酶的活性全部丧失。

法呢基二磷酸合酶活性和牻牛儿基合酶活性通常是宿主细胞必需的，因为FPP和GPP是基本细胞组成(例如麦角甾醇)的前体。因此，在宿主细胞或重组细胞没有内源法呢基二磷酸合酶活性的本发明实施方案中：

a)在麦角甾醇存在下培养细胞；或

b)细胞包含编码具有法呢基二磷酸活性之酶的异源核酸。

类似地，在宿主细胞或重组细胞没有内源牻牛儿基二磷酸合酶活性的本发明实施方案中，在有利的实施方案中：

a)在麦角甾醇存在下培养细胞；或

b)细胞包含编码具有牻牛儿基二磷酸和法呢基二磷酸活性之酶的异源核酸。

在第二个方面，本发明提供了用于产生萜或类萜的重组细胞，所述重组细胞被基因改造以使内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，并且还包含编码用于产生所述萜或类萜之异源酶的一个或更多个重组表达构建体。

宿主和重组细胞

本文提供的宿主和重组细胞可以是任何适于蛋白质表达(即，表达异源基因)的细胞，包括但不限于：真核细胞、原核细胞、酵母细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、微生物细胞和细菌细胞。另外，根据本发明的细胞满足以下标准中的一条或更多条：所述细胞应能够在大型发酵罐中迅速生长，应以有效方式产生有机小分子，应当安全并且在制药实施方案的情况下，应产生并将产物修饰为尽可能类似于“人”。另外，宿主细胞是可根据本发明进行基因改造以产生重组细胞的细胞，其是这样的细胞：其中核酸已经失去能力(缺失或以其他方式)或替换(例如，在基因座同源重组以改变细胞的表型，尤其是产生细胞酶或任何目的基因的表达降低)，或者已经引入了的异源核酸，尤其是编码赋予细胞上新的或增强之表型的酶的异源核酸。

在另一些具体实施方案中，重组细胞是以下酵母物种的酵母细胞：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、棉病囊霉、产朊假丝酵母、白色假丝酵母、Arxula adeninivorans、博伊丁假丝酵母，多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母。可用作宿主细胞用于基因改造和重组蛋白质表达的酵母是本领域中已知的。不同物种的酵母的生产力以及在加工和修饰蛋白质以及分泌其代谢产物的能力方面不同。酵母类型的不同“平台”使得其更好适应于不同工业应用。一般来说，酵母和真菌是本发明中使用的优异宿主细胞。它们提供了期望的容易的基因操作，并且在便宜培养基上迅速生长到高细胞密度。作为真核细胞，它们能够进行蛋白质修饰(例如糖基化(添加糖类))，因此产生甚至与来自植物或哺乳动物来源的天然产物相同或非常类似的更复杂的外源蛋白质。

在另一些实施方案中，用于如本文所述进行基因改造的宿主细胞是微藻类细胞(microalgal cell)，例如来自小球藻(Chlorella)或无绿藻(Prototheca)物种的细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞是丝状真菌的细胞，例如曲霉属(Aspergillus)物种。在另一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人、猫、猪、猿、犬、鼠、大鼠、小鼠或兔细胞。宿主细胞也可以是CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、BHK细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)或棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillu)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)物种的细胞。

在某些实施方案中，宿主细胞是这样的细胞，在其非重组形式中，包含编码至少一种以下酶的基因：

a)法呢基二磷酸合酶

b)牻牛儿基二磷酸合酶

c)具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶。

在另一些实施方案中，宿主细胞是这样的细胞，在其非重组形式中，包含编码具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的基因。例如，宿主细胞可以是包含非重组内源ERG20的酿酒酵母，并且其根据本发明，可进行重组操作以降低ERG20基因的表达。

重组细胞的另外方面

除了如本文所述进行基因改造以降低法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达之外，本发明还提供了具有提高的甲羟戊酸水平的重组细胞，特别是重组原核细胞或真核细胞的实施方案。在某些实施方案中，本发明提供了包含编码双功能酶之异源核酸序列的重组细胞，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶，包括但不限于由粪肠球菌编码的mvaE基因或其功能同源物。除了编码双功能酶的异源核酸序列外，重组细胞还可包含编码3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶(HMGS)的异源核酸序列，包括但不限于由粪肠球菌编码的mvaS基因或其功能同源物。

在另一些实施方案中，本发明提供了包含编码截短形式的3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶还原酶(HMGR)之重组表达构建体的重组细胞，所述截短形式的HMGR包含其催化活性羧基末端部分。

异源插入序列

在一些实施方案中，本发明的重组细胞包含位于启动子序列和编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF之间的异源核酸插入序列。在本发明的这些实施方案中，启动子可以是指导所述ORF在宿主细胞中表达的任意启动子，例如本文在“启动子序列”部分中描述的任意启动子。因此，启动子可以是弱启动子，其中所述启动子活性比野生型启动子的启动子活性在强度上低。在一个非限制性实例中，所述弱启动子具有比酿酒酵母中的ERG20启动子降低的启动子活性。因此，在本发明的一些实施方案中，其中核酸包含位于启动子序列和编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF之间的异源核酸插入序列，则所述启动子序列可以是指导所述ORF在野生型宿主细胞中表达的启动子，例如野生型ERG20启动子。所述异源核酸插入序列可以是适合于发夹二级结构元件的任何核酸序列。

在一些具体实施方案中，异源核酸插入序列可以是具有通式(I)的核酸序列：

-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-

其中X₃包含0个核苷酸或者一个或更多个在X₂和X₄之间形成发夹环的不配对核苷酸，并且

其中X₄包含至少4个连续核苷酸，所述至少4个连续核苷酸与X₂的至少4个连续核苷酸互补并形成发夹二级结构元件；并且

其中X₁和X₅包含0、1或更多个核苷酸。

X₂和X₄通常包含核苷酸序列。优选地，异源核酸插入序列包含彼此互补并且杂交从而形成发夹的段X₂和段X₄。段X₂和X₄可以彼此直接连接。在另一些实施方案中，X₂和X₄侧翼可以是段X₃，其形成环-发夹环。通常，X₃包含不配对的核酸。

有利地，异源插入序列足够长以允许环形成，但是足够短以允许异源插入序列之后的ORF的有限翻译速率。通常，掺入茎环序列的茎越长，翻译速率越慢。因此，在本发明的一些实施方案中，当希望非常慢的ORF翻译速度时，则应选择长的异源插入序列，特别是应选择具有长的彼此互补的X₂和X₄序列的异源插入序列。因此，在本发明的某些实施方案中，异源核酸插入序列包含10至50个核苷酸，优选10至30个核苷酸，更优选15至25个核苷酸，更优选17至23个核苷酸，更优选18至22个核苷酸，例如18至21个核苷酸，例如19至20个核苷酸。

X₂和X₄可单独地包含任意合适数目的核苷酸，只要X₂的至少4个核苷酸的连续序列与X₄的至少4个核苷酸的连续序列互补即可。在一个优选实施方案中，X₂和X₄包含相同数目的核苷酸。优选地，X₂的至少6个核苷酸、更优选至少8个核苷酸、甚至更优选至少10个核苷酸、例如8至20个核苷酸的连续序列与X₄相同数目的核苷酸的连续序列互补。

X₂可以例如包含4至25个，例如4至20个，例如4至15个，例如6至12个，例如8至12个，例如9至11个核苷酸。

X₄可以例如包含4至25个，例如4至20个，例如4至15个，例如6至12个，例如8至12个，例如9至11个核苷酸。

在一个优选实施方案中，X₂包含与X₄的核苷酸序列互补的核苷酸序列，即优选地X₂的所有核苷酸均与X₄的核苷酸序列互补。

在一个优选实施方案中，X₄包含与X₂的核苷酸序列互补的核苷酸序列，即优选地X₄的所有核苷酸均与X₂的核苷酸序列互补。非常优选地，X₂和X₄包含相同数目的核苷酸，其中，在X₂和X₄的整个长度上，X₂与X₄互补。

X₃可以不存在，即，X₃可包含0个核苷酸。还可能的是，X₃包含1至5个，例如1至3个核苷酸。如上所述，则优选地，X₃不与X₂或X₄杂交。

X₁可以不存在，即，X₁可包含0个核苷酸。还可能的是，X₁包含1至25个，例如1至20个，例如1至15个，例如1至10个，例如1至5个，例如1至3个核苷酸。

X₅可以不存在，即，X₅可包含0个核苷酸。还可能的是，X₅可包含1至5个，例如1至3个核苷酸。

序列可以是满足上文限定之要求的任何合适序列。在一个非限制性实例中，异源插入序列包含SEQ ID NO：2。

法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶

本发明的重组细胞通常包含编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者之酶的开放阅读框(ORF)。所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者的酶可以是任何法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者的酶。通常，其将是宿主细胞内源的法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者的酶。因此，举例来说，在宿主细胞是酿酒酵母的本发明实施方案中，则优选地，编码法呢基二磷酸合酶的ORF编码酿酒酵母法呢基二磷酸合酶。

法呢基二磷酸合酶可以是能够催化以下化学反应的任何酶：

牻牛儿基二磷酸+异戊烯二磷酸<＝>二磷酸+反式，反式-法呢基二磷酸

优选地，根据本发明的法呢基二磷酸合酶是归类为EC 2.5.1.10的酶。

牻牛儿基二磷酸合酶可以是能够催化以下化学反应的任何酶：

二甲基烯丙基二磷酸+异戊烯二磷酸<＝>二磷酸+牻牛儿基二磷酸

优选地，根据本发明的法呢基二磷酸合酶和/或牻牛儿基二磷酸合酶是归类为EC 2.5.1.1的酶。

具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶能够催化上述两种反应，是特别有利的，因此所述酶是归类为EC 2.5.1.1和EC2.5.1.10二者的酶。

法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶可来自多种来源，例如来自细菌、真菌、植物或哺乳动物。法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶可以是其野生型实施方案或者其功能同源物。

例如，具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶可以是酿酒酵母的具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶。因此，所述酶可以是SEQ ID NO：4的酶或其功能同源物，所述同源物与其具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％，例如至少99.5％，例如至少99.6％，例如至少99.7％，例如至少99.8％，例如至少99.9％，例如100％的序列同一性。序列同一性优选地如本文所述计算。

具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的功能同源物也能够催化以下化学反应之一或二者：

和/或

如本文进一步描述的，包含这种同源物的实施方案是有利的。

启动子序列

在某些实施方案中，本发明提供了包含以下核酸的重组宿主细胞，所述核酸包含与编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF有效连接的启动子序列，其中所述ORF优选地是所述宿主细胞内源的。本发明还涉及包含与ORF有效连接之启动子序列的核酸，其中所述ORF编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶。在这些实施方案中，启动子序列可以是能够指导所述ORF在特定宿主细胞中表达的任何序列。

如本文使用的，术语“启动子”意指有助于特定基因转录的DNA区。启动子通常紧邻地位于它们所调控的基因，与被转录的ORF在同一条链上并且通常在上游(朝着有义链的5′区)被编码。为了进行转录，合成RNA的酶(称为RNA聚合酶)必须连接到DNA 5’以开始ORF。启动子包含特定DNA序列和响应元件，其提供用于RNA聚合酶和用于募集RNA聚合酶的被称为转录因子之蛋白质的初始结合位点。这些转录因子具有与特定启动子连接并调控基因表达之相应核苷酸的特定活化物或阻遏物序列。

启动子序列的位置通常可以紧邻开放阅读框(ORF)，或者异源核酸插入序列可位于启动子序列和ORF之间。启动子的位置通常相对于转录起始位点指定，转录起始位点为特定基因的RNA开始转录的地方(即，位置上游是从-1开始往回计数的负数，例如，-100是上游100个碱基对的位置)。

根据本发明的启动子序列通常包含至少一个核心启动子，其为合适地起始转录所需之启动子的最小部分。另外，启动子序列可包含一种或更多种以下的启动子元件：

○转录起始位点(transcription start site，TSS)

○DNA聚合酶结合位点

○通用转录因子结合位点

○基因上游的近端启动子序列，其倾向于包含主要调控元件

○特异性转录因子结合位点

○基因上游的远端启动子序列，其可包含另外的调控元件，通常具有比近端启动子弱的影响

○阻遏蛋白结合位点。

原核启动子

在原核生物中，启动子包含从转录起始位点上游-10和-35位处的两个短序列。σ因子不仅有助于增强RNA聚合物与启动子的结合，还有助于转录RNAP靶向特定基因。-10位的序列被称为Pribnow框或-10元件，并且通常包含六个核苷酸TATAAT。-35位的另一个序列(-35元件)通常包含七个核苷酸TTGACAT。上述两种共有序列，尽管通常是保守的，但是在大部分启动子中均不完整。在任意给定的启动子中，通常仅发现每个共有序列中的3至6个碱基对。迄今还没有鉴定到在-10和-35两个位置处均具有完整共有序列的天然存在的启动子；已经发现具有完整保守之-10/-35六聚体的人工启动子以非常高的效力促进RNA链起始。

一些启动子还包含中心位于-50处的UP元件(共有序列5′-AAAWWTWTTTTNNNAAANNN-3′，W＝A或T，N＝任意碱基)；对于从包含UP元件的启动子的转录，-35元件的存在似乎并不重要。

真核启动子

真核启动子还通常位于ORF的上游，并且可具有远离转录起始位点数千碱基(kb)的调控元件。在真核生物中，转录复合物可导致DNA自身向后折叠，这允许将调控序列远离转录实际位点布置。许多真核启动子包含TATA框(序列TATAAA)，其进而与促进形成RNA聚合酶转录复合物的TATA结合蛋白结合。TATA框通常距离转录起始位点非常近(经常在50个碱基内)。

本发明的宿主和重组细胞包含重组表达构建体，所述重组表达构建体具有与编码蛋白质的核酸序列有效连接启动子序列，所述蛋白质尤其包括法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶。本发明的启动子序列没有限制，并且可以是适于所选择宿主细胞的任何启动子。

在本发明的某些实施方案中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。启动子序列还可以是合成启动子。

在本发明的另一些实施方案中，启动子的非限制性实例是：内源启动子、KEX2、PGK-1、GPD1、ADH1、ADH2、PYK1、TPI1、PDC1、TEF1、TEF2、FBA1、GAL1-10、CUP1、MET2、MET14、MET25、CYC1、GAL1-S、GAL1-L、TEF1、ADH1、CAG、CMV、人UbiC、RSV、EF-1α、SV40、Mt1、Tet-On、Tet-Off、Mo-MLV-LTR、Mx1、孕酮、RU486或雷帕霉素诱导型启动子。

在本发明的一些具体实施方案中，重组细胞包含在启动子序列和编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF之间的异源插入序列。启动子序列可包括野生型启动子，例如启动子序列可为指导所述ORF在野生型宿主细胞中表达的启动子。因此，启动子序列可以是例如野生型ERG20启动子。

在本发明的另一个实施方案中，启动子序列是弱启动子。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中核酸不包含异源核酸插入序列，则启动子序列优选是弱启动子。根据本发明的弱启动子是在宿主细胞中指导较低水平转录的启动子。特别地，优选地启动子序列以显著低于用野生型启动子(例如，酵母中ERG20启动子)所获得表达水平的表达水平指导编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF的表达。所述ORF优选地是编码天然法呢基二磷酸合酶、天然牻牛儿基二磷酸合酶或天然具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF，因此ORF优选是宿主或重组细胞内源的。

可如下确定启动子序列是否是弱启动子或者是否在宿主细胞中指导更低水平的转录：确定编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的mRNA在宿主细胞中的表达水平，其包含与潜在的弱启动子有效连接的编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF，以及确定编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的mRNA在第二参考细胞中的表达水平，其包含与野生型ERG20启动子有效连接的编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF。所述第二参考细胞可以是野生型细胞，并且优选地，所测试重组细胞与第二细胞为相同物种。可使用技术人员已知的任何可用方法(例如通过定量PCR)来确定编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的mRNA的表达水平。如果包含潜在弱启动子的宿主细胞中所述mRNA的表达水平显著低于第二参考细胞中的表达水平，则所述启动子是弱启动子。

优选地，待用于本发明的启动子序列指导编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF的表达，表达水平为野生型ERG20启动子所获得表达水平的至多70％、例如至多60％、例如至多50％、例如至多40％。表达水平优选地如上所述来确定。

因此，在某些实施方案中，优选地，在待用于本发明的启动子序列被包含在宿主细胞中并与编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF有效连接时，其指导所述ORF在所述宿主细胞中表达，以使得所述宿主细胞中编码法呢基二磷酸合酶的mRNA的水平为含野生型ERG20基因的第二细胞中存在的编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的mRNA水平的至多70％，例如至多60％，例如至多50％，例如至多40％，优选10％至50％，其中所述宿主细胞和第二细胞是相同物种。

因此，在某些实施方案中，优选地，在待用于本发明的异源启动子序列被包含在宿主细胞中并与编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的ORF有效连接时，其指导所述ORF在所述宿主细胞中的表达，以使得所述重组细胞中编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的mRNA的水平为含有编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的野生型基因的第二细胞中存在的编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的mRNA水平的至多70％，优选至多60％，甚至更优选至多50％，例如至多40％，优选10％至50％，其中所述重组细胞和第二细胞是相同物种。

还可如下确定启动子序列是否是弱启动子或者是否在宿主细胞中指导更低水平的转录：确定任何测试蛋白的表达水平，包括但不限于重组细胞中的报道基因(报道基因的一个非限制性实例是绿色荧光蛋白，GFP)所述重组细胞包含与潜在的弱启动子有效连接的编码所述测试蛋白(的ORF，以及确定包含与野生型ERG20启动子有效连接的编码所述测试蛋白质之ORF的第二细胞中所同一种测试蛋白的表达水平。第二细胞可以是野生型细胞，并且优选地，所测试重组细胞与第二细胞为相同物种。可使用技术人员已知的任何可用方法来确定测试蛋白的表达水平。例如，测试蛋白可以是荧光蛋白，并且表达水平可以通过确定荧光水平来评估。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，在待用于本发明的异源启动子序列被包含在重组细胞中并与编码测试蛋白的ORF有效连接时，指导所述ORF在所述重组细胞中的表达，以使得所述重组细胞中测试蛋白的水平为包含与野生型ERG20启动子有效连接的编码所述测试蛋白之ORF的第二细胞中存在的测试蛋白的水平的至多70％，例如至多60％，例如至多50％，例如至多40％，优选10％至50％，其中所述宿主细胞和第二细胞是相同物种。所述测试蛋白优选荧光蛋白，例如GFP。

本发明可使用的弱启动子的非限制性实例包括CYC-1启动子或KEX-2启动子，特别地，启动子序列可以是KEX-2启动子。因此，在本发明的某些实施方案中，异源启动子序列包括KEX-2启动子。

因此，在本发明的一些实施方案中，其中ORF编码法呢基二磷酸合酶，则优选所述法呢基二磷酸合酶是宿主或重组细胞的天然法呢基二磷酸合酶，并且异源启动子序列是指导所述天然法呢基二磷酸合酶以显著低于天然表达水平之水平表达的弱启动子。

在本发明的一些实施方案中，其中ORF编码牻牛儿基二磷酸合酶，则优选所述牛儿基二磷酸合酶是宿主或重组细胞的天然牻牛儿基二磷酸合酶，并且异源启动子序列是指导所述天然牻牛儿基二磷酸合酶以显著低于天然表达水平之水平表达的弱启动子。

本文使用的术语“显著低于”优选意指至多70％，优选至多60％，甚至更优选至多50％，例如至多40％。特别地，术语“显著低于”可用于意指10％至50％的范围。

使mRNA转录本去稳定的基序

在某些实施方案中，本发明的重组细胞包含这样的核酸，所述核酸包含：与编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的开放阅读框(ORF)有效连接的启动子序列，以及含有使mRNA转录本去稳定之基序的核苷酸序列。

在该实施方案中，启动子可以是本文“启动子序列”部分中描述的任何启动子，例如启动子可以是野生型ERG20启动子。因此，宿主细胞可包含天然法呢基二磷酸基因、牻牛儿基二磷酸合酶基因或者编码具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的基因，其已经被进一步修饰以在其ORF下游包含缩短该基因产生之mRNA的半衰期的DNA序列基序，例如使mRNA转录本去稳定的基序。使mRNA转录本去稳定的基序可以是在位于mRNA转录本的3′-UTR中时可以使mRNA转录本去稳定并导致转录本的半衰期缩短的任何基序(参见，例如Shalgi等，2005Genome Biology 6：R86)。因此，为了进一步降低法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性，可以将含有使mRNA转录本去稳定之基序的核苷酸序列插入到天然法呢基二磷酸基因、牻牛儿基二磷酸合酶基因或编码具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的基因，ORF的下游。酵母中这种去稳定序列的实例包括但不限于TATATATATATAT(SEQ ID NO：28)的M1基序共有序列和TGTATAATA(SEQ ID NO：29)的M24基序共有序列。

另外的异源核酸

除了包含与启动子序列有效连接的编码法呢基二磷酸合酶和/或牻牛儿基二磷酸合酶之ORF的核酸之外，本发明的重组细胞还包含一种或更多种另外的异源核酸。在一些替代实施方案中，所述重组细胞可包含指导细胞中的酶(尤其是本文所述用于产生萜类或类萜的酶)之表达的另外的重组表达构建体。

在一些具体实施方案中，所述另外的异源核酸可包含编码可用于化合物生物合成之酶的核酸，其理想地由甲羟戊酸(mevalonate)合成。

异源核酸优选地包含编码可用于化合物生物合成之酶的核酸，其理想地由IPP或DMAPP或者由IPP和DMAPP二者合成。因此，另外的异源核酸可编码可用于由IPP或DMAPP生物合成萜、类萜或生物碱的酶。

因此，另外的异源核酸可编码使用IPP或DMAPP作为底物的任何酶。这些酶可以是使用IPP或DMAPP作为底物的归类为EC 2.5.1的任何酶。这样的酶的实例包括GPP合酶、FPP合酶、GGPP合酶、能够催化并入较长类异戊二烯链(例如，多达约10个类异戊二烯的链)的合酶和异戊二烯转移酶。

特别地，可根据待通过重组细胞产生的特定类异戊二烯化合物或萜或类萜来选择另外的异源核酸。因此，如果重组细胞待用于产生特定的类异戊二烯化合物或萜或类萜，则所述细胞可包含编码所述特定的类异戊二烯化合物或萜或类萜的生物合成途径中之一种或更多种酶的一种或更多种另外的异源核酸序列。

因此，在本发明的某些实施方案中，另外的异源核酸可编码萜合酶。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中重组细胞待用在产生萜的方法中，则优选地，重组细胞包含编码萜合酶的另外的异源核酸。所述萜可以为例如下文“类萜和萜类”部分中详细描述的任何萜类。待用于本发明的可用萜合酶的实例描述在Degenhardt，2009，Phytochemistry 70：1621-1637中。因此，另外的异源核酸可以例如编码Degenhardt等，2009描述的任何萜合酶。

在本发明的某些实施方案中，一种另外的异源核酸可编码单萜合酶。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中宿主细胞待用在产生单萜的方法中，则优选地，所述宿主细胞包含编码单萜合酶的异源核酸。所述单萜可以是例如下文“类萜和萜类”部分中详细描述的任何单萜。所述单萜合酶可以是任何单萜合酶，例如Degenhardt等2009的表1中描述的任何单萜合酶。所述表还概括了为了合成某一种特定单萜可使用的各自单萜合酶。

在本发明的某些实施方案中，另外的异源核酸可编码类单萜合酶。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中重组细胞待用在产生类单萜的方法中，则优选地，所述细胞包含编码类单萜合酶的异源核酸。所述类单萜可以是例如下文“类萜和萜类”部分中详细描述的任何类单萜。因此，类单萜可以例如是苧烯，在这种情况下，细胞可包含编码苧烯合酶的另外的核酸。根据本发明的苧烯合酶是能够催化以下反应的酶：

特别地，苧烯合酶可以是归类为EC 4.2.3.16的酶。苧烯合酶可以例如是来自柠檬(Citrus limon)的苧烯合酶1或者其功能同源物。特别地，苧烯合酶可以是包含SEQ ID NO：13或由SEQ ID NO：13组成的多肽，或者其功能同源物，所述功能同源物与SEQ ID NO：13具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

在本法发明的另一个实施方案中，另外的异源核酸可编码倍半萜合酶。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中宿主细胞待用在产生倍半萜的方法中，则优选地，所述宿主细胞包含编码倍半萜合酶的异源核酸。所述倍半萜可以例如是下文“类萜和萜类”部分中详细描述的任何倍半萜。所述倍半萜合酶可以是任何倍半萜合酶，例如Degenhardt等2009，Id的表2中描述的任何倍半萜合酶。所述表还概括了为了合成某一种特定倍半萜可使用的各自倍半萜合酶。

在本发明的某些实施方案中，另外的异源核酸可编码紫穗槐二烯合酶，例如，紫穗槐-4，11-二烯合酶。所述紫穗槐二烯合酶可以是能够催化以下反应的任何酶：

特别地，待用于本发明的紫穗槐二烯合酶可以是归类为E.C.4.2.3.24的任何酶。

在一个具体实施方案中，紫穗槐二烯合酶是SEQ ID NO：8的紫穗槐二烯合酶或者其功能同源物，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：8具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。序列同一性优选地如本文所述确定。除了前述序列同一性外，紫穗槐二烯合酶的功能同源物还应该能够催化上述反应。

在本发明的另一个实施方案中，另外的异源核酸可编码GPP合酶。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中重组细胞待用在产生GPP的方法中，则优选地，所述细胞包含编码GPP合酶的异源核酸。另外，在本发明的一些实施方案中，其中细胞待用在制备单萜(例如，蒎烯、月桂烯和/或牻牛儿醇)的方法中，所述细胞有利地包含编码GPP合酶的异源核酸。所述GPP合酶可以是任何GPP合酶。优选地，GPP合酶是能够催化以下反应的酶：

二甲基烯丙基二磷酸+异戊烯二磷酸→二磷酸+牻牛儿基二磷酸。

优选地，GPP合酶是归类为EC 2.5.1.1的酶。可用的GPP合酶的一个实例是啤酒花(Humulus lupulus)GPP合酶，例如Wang和Dixon，2009，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106：9914-9919中描述的啤酒花(H.lupulus)GPP合酶。可用的GPP合酶的另一些实例在Orlova等2009，PlantCell，Vol.21，4002-4017以及Chang等2010，Plant Cell，Vol.22，454-467中进行了描述。GPP合酶还可以是Wang和Dixon 2009中描述的啤酒花合酶的功能同源物，其中所述功能同源物与啤酒花GPP合酶具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

可用于本发明的有用GPP合酶的另一个实例是来自北美冷杉(Abiesgrandis)的GPP合酶2。因此，GPP合酶可以是北美冷杉的GPP合酶2或者其保留了GPP合酶活性的片段或功能同源物。可用于本发明的有用GPP合酶的另一个实例是欧洲云杉(Picea abies)的GDPS。特别地，GPP合酶可以是包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成的多肽或者其功能同源物，所述功能同源物与SEQ ID NO：12具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

在本发明的另一个实施方案中，另外的异源核酸可编码FPP合酶，其不是宿主细胞内源的。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中重组细胞待用在产生FPP的方法中，则优选地，所述细胞包含编码并非宿主细胞内源之FPP合酶的异源核酸。另外，在本发明的一些实施方案中，其中重组细胞待用在制备倍半萜(例如，百秋李醇、檀香醇、长叶烯或罗汉柏烯)的方法中，则优选地，所述细胞包含编码并非所述宿主细胞内源之FPP合酶的异源核酸。所述FPP合酶可以是并非宿主细胞内源的任何FPP合酶。特别地，FPP合酶可以是能够催化由DMAPP和IPP产生FPP的酶。

可用的FPP合酶的实例包括具三齿蒿(A.tridentate)FPPS-1或具三齿蒿FPPS-2。FPP合酶还可以是具三齿蒿FPPS-1或具三齿蒿FPPS-2的功能同源物，其中所述功能同源物与具三齿蒿FPPS-1或具三齿蒿FPPS-2具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

FDPS可以是任何FDPS，但是对于本发明，优选地FDPS是能够催化至少一种以下反应的酶：

1)由一个DMAPP和2个IPP合成FPP

2)由一个GPP和一个IPP合成FPP。

可用于本发明的FPP合酶的其他实例包括但不限于来自聚球藻(Synechococcus)的FDPS(WH5701)和FDPS(CB101)。因此，FPP合酶可以是SEQ ID NO：14的多肽。FPP合酶也可以是SEQ ID NO：15的多肽。FPP合酶也可以是SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的功能同源物，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

在某些实施方案中，本发明的重组细胞可以包含编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)的另外的异源核酸序列。特别地，在本发明的一些实施方案中，其中细胞待用在产生GGPP的方法中，则优选地，所述重组细胞包含编码GGPP合酶的异源核酸。另外，在本发明的一些实施方案中，其中重组细胞待用在制备二萜或类四萜(例如，类胡萝卜素)的方法中，则优选地，所述细胞包含编码GGPP合酶的异源核酸。GGPPS可以是任何GGPPS，但是有利地GGPPS是能够催化至少一种以下反应的酶：

3)由一个DMAPP和3个IPP合成GGPP

4)由一个GPP和2个IPP合成GGPP

5)由一个FPP和1个IPP合成GGPP

特别地，GGPPS可能能够催化由一个DMAPP和3个IPP合成GGPP。在一些具体实施方案中，GGPP合酶是归类为EC 2.5.1.1或EC 2.5.1.10或者甚至更优选地EC 2.5.1.29的酶。

GGPPS可以是来自多种来源的GGPPS，例如来自细菌、真菌或哺乳动物。特别地，GGPPS可以是来自嗜酸热硫化叶菌(S.alcidocaldarius)GGPP合酶或啤酒花GGPP合酶的酶或者其功能同源物，所述功能同源物与嗜酸热硫化叶菌GGPP合酶或啤酒花GGPP合酶具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

特别地，GGPPS可以是SEQ ID NO：7的GGPPS或其功能同源物，所述功能同源物与其具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

另外的异源核酸还可编码GGPP合酶，其包括但不限于来自酿酒酵母的GGPP合酶。因此，GGPP合酶可以是SEQ ID NO：23的GGPP合酶或者功能同源物，所述功能同源物与SEQ ID NO：23具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

另外的异源核酸还可编码参与二萜生物合成的酶。例如，另外的异源核酸还可编码二萜合酶。二萜合酶的实例包括但不限于内根-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶。内根-贝壳杉烯合酶的一个实例是SEQ ID NO：17多肽或者其功能同源物，所述功能同源物与其具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性。异源核酸还可编码内根-柯巴基-二磷酸合酶(ent-copalyl-diphosphatesynthase)，例如SEQ ID NO：18的多肽或者与其功能同源物，所述功能同源物与其具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性。

另外的异源核酸还可编码异戊二烯合酶。所述异戊二烯合酶可以是能够催化以下反应的任何酶：

特别地，异戊二烯合酶可以是归类为EC 4.2.3.27的任何异戊二烯合酶。

另外的异源核酸序列还可编码在制备目标产物类萜或萜的过程中使用的任何酶。所述酶可以例如是异戊烯焦磷酸或二甲基烯丙基焦磷酸“下游”的任何酶，其旨在表示在重组细胞中催化产生由IPP或DMAPP产生之代谢物的酶。因此，所述酶可以是例如二甲丙烯基转移酶(dimethylallyltransferase)(EC 2.5.1.1)和牻牛儿基转移酶(geranyltranstransferase)(EC 2.5.1.10)。

本发明的重组细胞还可以包含编码一种或更多种以下酶的一种或更多种另外的异源核酸：例如，磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(EC1.17.7.1)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC 1.17.1.2)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶1(EC 5.3.3.2)、短链Z-异戊二烯基二磷酸合酶(EC2.5.1.68)、二甲丙烯基转移酶(EC 2.5.1.1)、牻牛儿基转移酶(EC 2.5.1.10)或牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(EC 2.5.1.29)。

另外，在一些替代实施方案中，本发明的重组细胞还可包含编码一种或更多种以下酶的一种或更多种另外的异源核酸：例如，乙酰乙酰CoA硫解酶、HMG-CoA还原酶或其催化结构域、HMG-CoA合酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法呢基焦磷酸合酶、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶和1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶还原异构酶，以及法呢基焦磷酸合酶，其中，在所述替代实施方案中，细胞表达提高的甲羟戊酸产生或积累或者二者的表型。

本文所述的本发明涉及重组细胞，所述重组细胞被基因改造以具有提高的甲羟戊酸产生和/或具有更高的通过甲羟戊酸生物合成途径的代谢流，并且还可包含编码可用于增加甲羟戊酸途径产物(尤其是类异戊二烯)之酶的额外的重组表达构建体。在一些实施方案中，基因改造的重组细胞表达提高的甲羟戊酸产生或积累或者二者的表型。

通常可提供编码萜合酶的所述另外的异源核酸序列与指导重组细胞中所述萜合酶之表达的核酸序列有效连接。指导重组细胞中所述萜合酶表达的核酸序列可以是并且通常是启动子序列，并且优选地根据特定宿主细胞来选择所述启动子序列。启动子可以例如是上文“启动子序列”部分中描述的任何启动子。

在另一个实施方案中，重组细胞可包含编码二甲基烯丙基酪氨酸合酶的额外的异源核酸。这样的细胞例如可用于产生DMAT。所述二甲基烯丙基酪氨酸合酶优选地是归类为EC 2.5.1.34的酶。例如，二甲基烯丙基酪氨酸合酶可以是SEQ ID NO：5的蛋白质或其功能同源物，所述功能同源物与其具有至少70％，优选至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性。

宿主细胞可包含编码异戊二烯转移酶(prenyl transferase)的额外的异源核酸。所述异戊二烯转移酶可以是能够催化烯丙基异戊二烯基基团转移到接受分子上的任何酶。例如，异戊二烯转移酶可以是异戊二烯基二磷酸合酶。有用的异戊二烯合酶的实例可在Bonitz等，2011PLoS One6(11)：E27336中找到。

改造用于产生类异戊二烯分子的真核细胞(例如酵母)的一个重要目的是找到绕过甲羟戊酸途径之广泛控制(参见图2A)的方式以促进生产。特别地，HMGR步骤是限速步骤，其受到来自甲羟戊酸途径的不同中间物和衍生物的反馈抑制。特别地，酿酒酵母编码的两种HMGR种内同源基因HMGR1和HMGR2二者均受反馈抑制的控制(虽然以不同方式)。真核HMGR通常是内质网(ER)居留(resident)的整合膜蛋白，其由两个不同结构域组成：由2-8个跨膜区段组成的疏水性NH₂端膜锚着点，和延伸到细胞质中的COOH端催化结构域。I类HMGR的COOH端催化结构域形成了二聚体，所述二聚体包含活性酶，并且每一个单体均有助于催化残基形成活性部位。出芽酵母酿酒酵母编码两种HMGR基因，被称为HMG1和HMG2。HMGR1是有氧生长期间HMGR活性的主要来源(Burg等，2011Prog Lipid Res.50(4)：403-410)。已经发现，由有催化活性的C末端(氨基酸619-1025的区域)组成的截短形式的酿酒酵母HMGR1的过表达可刺激甲羟戊酸水平并提高异源类异戊二烯衍生分子的产生(Rico等，2010Appl Environ Microbiol.Oct；76(19)：6449-54)。因此，在本发明某些另外的或替代的实施方案中，重组细胞包含编码截短形式之HMGR的另外的异源核酸序列。所述截短形式的HMGR最有利地包含催化活性C末端，例如其可包含酿酒酵母HMGR1的催化活性C末端，例如氨基酸2-530已经从N末端缺失。例如，所述截短形式的HMGR可以是Rico等，2010中描述的截短的HMGR1。特别地，截短的HMGR是衍生自SEQ ID NO：8之截短的HMGR或者其功能同源物，所述功能同源物与其在整个长度上具有70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。所述功能同源物优选地包含至多550个氨基酸，例如至多527个氨基酸，并且能够催化HMG CoA的还原以形成甲羟戊酸。

本发明的重组细胞还可能已被调整以降低角鲨烯合酶的活性。根据本发明的角鲨烯合酶优选地是归类为EC 2.5.1.21的酶。特别地，如果宿主细胞是酵母细胞，则所述酵母细胞还可能已被调整以降低ERG-9基因的表达。这可以例如通过使编码角鲨烯合酶的ORF处于弱启动子的控制下来实现，例如本文“启动子序列”部分中描述的任何弱启动子。这可以例如通过替换编码角鲨烯合酶的整个野生型基因或通过替换野生型启动子来实现。任选地，细胞是包含降低表达的编码角鲨烯合酶之mRNA的异源序列的重组细胞。在一些具体实施方案中，异源核酸插入序列可位于启动子序列和编码角鲨烯合酶的ORF之间。所述异源插入序列可以是下文“异源插入序列”部分中描述的任何异源插入序列。

本发明还提供了其中使用使mRNA转录本去稳定的基序降低角鲨烯合酶活性的方法和重组细胞。因此，本发明的重组细胞可包含：含有与编码角鲨烯合酶之开放阅读框(ORF)有效连接的启动子序列的核酸，以及含有使mRNA转录本去稳定之基序的核苷酸序列。所述基序可以是下文“使mRNA转录本去稳定的基序”部分中描述的任何使mRNA转录本去稳定的基序。

双功能酶

根据本发明的重组细胞还可包含编码双功能酶的异源核酸序列，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶。类似地，本发明的重组真核细胞可包含编码双功能酶的异源核酸序列，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶。

因此，根据本发明的双功能酶优选地是能够催化以下两种反应的酶：

i)

ii)

能够催化反应i)的酶归类为E.C：2.3.19，而能够催化反应ii)的酶归类为E.C.1.1.1.34。因此，待用于本发明的优选双功能酶可以归类为E.C.2.3.19或E.C.1.1.1.34。

所述双功能酶可以来源于任何可用来源。特别地，双功能酶可以是原核来源的。

在一个具体实施方案中，双功能酶是由粪肠球菌基因mvaE编码的酶或者其功能同源物。因此，双功能酶可以是SEQ ID NO：9的多肽或者其功能同源物，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：9具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。序列同一性优选地如本文所述确定。

除了前述序列同一性外，由粪肠球菌基因mvaE编码的酶的功能同源物还应该能够催化本文在本部分中概括的反应i)和ii)。

HMGS

根据本发明可用的重组细胞还可包含编码3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶(HMGS)的异源核酸序列。因此，在优选实施方案中，本发明的重组真核细胞可包含编码3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶(HMGS)的异源核酸序列。

待用于本发明的HMGS优选地是能够催化以下反应的酶：

特别地，待用于本发明的HMGS可以是归类为E.C.2.3.3.10的任何酶。

所述HMGS可来源于任何可用来源。特别地，HMGS可以是原核来源。

在一个优选实施方案中，HMGS是由粪肠球菌基因mvaS编码的酶或者其功能同源物。因此，HMGS可以是SEQ ID NO：10的多肽或者其功能同源物，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：10具有至少70％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。序列同一性优选地如本文所述确定。

除了前述序列同一性外，由粪肠球菌基因mvaS编码的酶的功能同源物还应该能够催化上述反应。

产生萜类或类萜的方法

如上所述，本发明的重组细胞可用于提高类异戊二烯焦磷酸和/或萜类和/或类萜的产量。

因此，本发明重组细胞的一些特别具体的实施方案可基因改造以提高类异戊二烯焦磷酸前体的积累，从而提高由所述类异戊二烯焦磷酸酶促转化得到之类萜或萜产物的产量。

因此，在一个方面，本发明涉及产生萜或类萜的方法，所述方法包括在细胞产生萜或类萜产物的条件下培养本文所述的重组细胞以及分离所述萜或类萜的步骤。

在一个使用重组酵母细胞实施方案的一个特定实施例中，所述细胞具有降低的ERG20基因活性，导致IPP和DMAPP的积累增加。在与异源GGP合酶或异源FPP合酶或异源GGPP合酶组合时，可利用DMAPP和IPP的积累来提高GPP、FPP和GGPP的产生。

因此，在另一个方面，本发明提供了用于产生类异戊二烯焦磷酸的方法，所述类异戊二烯焦磷酸包括但不限于法呢基焦磷酸(FPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、牻牛儿基焦磷酸(GPP)和/或牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)，所述方法通过在产生所述类异戊二烯焦磷酸的条件下培养根据本发明的重组细胞以及然后分离所述类异戊二烯焦磷酸来产生类异戊二烯焦磷酸。

在某些额外的或替代的实施方案中，重组细胞(例如，真核细胞)中甲羟戊酸的积累增加，所述重组细胞包含编码双功能酶的异源核酸序列(其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶)，并且任选地还包含编码3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶(HMGS)的异源核酸序列，甲羟戊酸的积累。在另一些额外的或替代的实施方案中，如本文所述当甲羟戊酸产生、积累或二者都增加时，所述重组细胞中还积累了具有以甲羟戊酸作为代谢前体的化合物。有利地利用这样的细胞来产生IPP和DMAPP，以及在所述重组细胞包含异源GGP合酶或异源FPP合酶或异源GGPP合酶时增加GPP、FPP和GGPP的产生。

因此，在本发明的一个方面，还提供了用于产生类异戊二烯焦磷酸的方法，所述类异戊二烯焦磷酸是法呢基焦磷酸(FPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、牻牛儿基焦磷酸(GPP)和/或牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)，所述方法通过在其中产生所述FPP、IPP、DMAPP、GPP或GGPP的条件下培养所述重组细胞然后分离所述FPP、IPP、DMAPP、GPP或GGPP产生类异戊二烯焦磷酸，所述重组细胞包含编码双功能酶的异源核酸序列，任选地还包含编码3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶(HMGS)的异源核酸序列，并且任选地还包含在上文“另外的异源核酸”部分中描述的一种或更多种另外的异源核酸序列，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶。

本发明提供了用于产生萜类或类萜的方法和重组细胞，特别地提高其产量。在某些实施方案中，待通过本发明方法产生的类萜或萜是类半萜(hemiterpenoid)、单萜、类倍半萜(sesquiterpenoid)、类二萜(diterpenoid)、二倍半萜(sesterpene)、类三萜(triterpenoid)、类四萜(tetraterpenoid)或类多萜(polyterpenoid)。

更特别地，类萜或萜是法呢基磷酸、法呢醇、牻牛儿基牻牛儿基、牻牛儿基牻牛儿醇、异戊二烯、异戊烯醇、异戊酸、牻牛儿基焦磷酸、桉树精(eucalyptol)、苧烯、蒎烯、法呢基焦磷酸、青蒿素、红没药醇(bisabolol)、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素、蚜栖菌素、羊毛甾醇、番茄红素或胡萝卜素。

可用于产生所述萜类和类萜的根据本发明的重组细胞已经根据本文所述方法进行基因改造以表现出降低的法呢基二磷酸产生。在所述实施方案中，重组细胞的表型包括降低了IPP向FPP和/或DMAPP向FPP的周转(turnover)。通过如本文所述基因改造所述细胞，根据本发明的重组细胞还表现出其中FPP、IPP、DMAPP、GPP和GGPP积累增加的表型。在某些另外的实施方案中，本发明提供了重组细胞，其可用在所公开的发明方法中，所述方法用于由所述产生并回收FPP、IPP、DMAPP、GPP或GGPP，其中所述重组细胞在其中所述细胞产生FPP、IPP、DMAPP、GPP和GGPP，并且有利地提高产量的条件下培养。

在另一些实施方案中，重组细胞还包含内源的或由于引入另外的异源重组表达构建体得到的酶，所述酶包括产生根据本发明的萜类或类萜的代谢途径。在所述实施方案中，使用本文所述重组细胞和方法，由于FPP合酶、GPP合酶或者具有FPP和GPP合酶二者活性之酶的表达降低，萜或类萜的产生增加，或者另外地或替代地，甲羟戊酸前体的积累提高。

或者，可从所述重组细胞回收所述IPP、FPP、GPP、DMAPP或GGPP前体并用于进一步处理以产生期望的类萜产物化合物。进一步处理可在同一细胞培养物中如上文进行和限定的过程进行，例如通过本发明的细胞积累类萜前体。或者，可将回收的前体添加至另一种细胞培养物或无细胞系统以产生期望的产物。

由于类异戊二烯焦磷酸可作为中间物，因此可基于类异戊二烯焦磷酸进行类萜或萜类的内源产生。另外，本发明的重组细胞可能具有另外的基因修饰从而使得它们能够进行类异戊二烯焦磷酸的积累以及得到期望类萜或萜产物之全部或基本上全部随后的生物合成过程。

因此，在某些实施方案中，本发明的方法还包括回收从本发明提供的重组细胞中由所述IPP、FPP、DMAPP、GPP和GGPP前体生物合成的化合物。

在一些替代实施方案中，本发明提供了其中IPP、DMAPP或二者的产生或积累增加的方法和基因改造重组细胞，包括培养本发明的重组细胞，其中代谢活性法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性如本文所述被下调。

在一些另外的或可选的实施方案中，所述重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加在甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或替代的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。

在另外一些具体实施方案中，本发明提供了用于产生GPP的方法和重组细胞，特别地，其中GPP的产生、积累或者二者都增加，其中有利地通过培养已经基因改造以降低法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性的表达来获得更大产量的GPP，并且其中所述重组细胞还包含编码异源GPP合酶的重组表达构建体。在一些另外的或可替选的实施方案中，重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或替代的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。

在另外一些具体实施方案中，本发明提供了用于产生FPP的方法和重组细胞，特别地，其中FPP的产生、积累或者二者皆有增加，其中有利地通过培养已经基因改造以降低法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性的表达来获得更大产量的FPP，并且其中所述重组细胞还包含编码异源FPP合酶的重组表达构建体。在一些另外的或可选的实施方案中，重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或替代的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。

在另外一些具体实施方案中，本发明提供了用于产生GGPP的方法和重组细胞，特别地，其中GGPP的产生、积累或者二者皆有增加，其中有利地通过培养已经基因改造以降低法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性的表达来获得更大产量的GGPP，并且其中所述重组细胞还包含编码异源GGPP合酶的重组表达构建体。在一些另外的或替代的实施方案中，重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或替代的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。

在另外一些具体实施方案中，本发明提供了用于产生异戊二烯的方法和重组细胞，特别地，其中异戊二烯的产生、积累或者二者皆有增加，其中有利地通过培养已经基因改造以降低法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性的表达来获得更大产量的异戊二烯，并且其中所述重组细胞还包含编码异源异戊二烯合酶的重组表达构建体。在一些另外的或可选的实施方案中，重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或替代的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。在某些具体实施方案中，分离并进一步聚合所述异戊二烯以生产异戊二烯橡胶。

本发明特别地提供了用于产生萜类和类萜的方法和重组细胞。在一些具体实施方案中，本文提供的重组细胞被用于产生类单萜，包括但不限于本文“类萜和萜类”部分中描述的类单萜。如本文提供的，通过培养已经基因改造以降低法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性的表达的重组细胞来产生所述类单萜，并且其中所述重组细胞还包含编码异源GPP合酶的重组表达构建体以及一种或更多种另外的异源核酸，所述一种或更多种另外的异源核酸各自编码由GPP产生所述类单萜的生物合成途径中的酶，例如，所述异源核酸可编码本文“另外的异源核酸”部分中描述的任何类单萜合酶。在一些另外的或替代的实施方案中，重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或可选的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。示例性类单萜包括但不限于苧烯，在这种情况下所述类单萜合酶可以是上文“另外的异源核酸”中描述的任何苧烯合酶。

在另外一些具体实施方案中，本文提供的重组细胞被用于产生类倍半萜或类三萜，包括但不限于本文“类萜和萜类”部分中描述的类倍半萜或类三萜。如本文提供的，通过培养已经基因改造以降低法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性的表达的重组细胞来产生所述类倍半萜或类三萜，并且其中所述重组细胞还包含编码异源FPP合酶的重组表达构建体以及一种或更多种另外的异源核酸，所述一种或更多种另外的异源核酸各自编码由FPP产生所述类倍半萜或类三萜的生物合成途径中的酶，例如，所述异源核酸可编码本文“另外的异源核酸”部分中描述的任何类倍半萜或类三萜合酶。在一些另外的或替代的实施方案中，重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或可选的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。示例性类倍半萜包括但不限于紫穗槐二烯或青蒿素，在这种情况下，一种类倍半萜合酶可以是紫穗槐二烯合酶，例如上文“另外的异源核酸”部分中描述的任何紫穗槐二烯合酶。示例性类三萜包括但不限于环阿屯醇、葫芦素E(curcubitacinE)、印楝素A、羽扇豆醇、β-香树素和皂苷，在这种情况下，所述类三萜合酶可以是上文“另外的异源核酸”部分中描述的任何EC 2.5.1.21(角鲨烯合酶)合酶。

在另外一些具体实施方案中，本文提供的重组细胞被用于产生类二萜或类四萜，包括但不限于本文“类萜和萜类”部分中描述的类二萜或类四萜。如本文提供的，通过培养已经基因改造以降低法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性的表达的重组细胞来产生所述类二萜或类四萜，并且其中所述重组细胞还包含编码异源GPP合酶、异源FPP合酶的重组表达构建体以及一种或更多种另外的异源核酸，所述一种或更多种另外的异源核酸各自编码由GPP、FPP和/或GPP合酶产生所述类二萜或类四萜的生物合成途径中的酶，例如，所述异源核酸可编码本文“另外的异源核酸”部分中描述的任何类二萜或类四萜合酶。在一些另外的或可选的实施方案中，重组细胞包含编码本文所述双功能酶的异源核酸序列，其中所述细胞产生或积累或者二者皆有地增加甲羟戊酸途径中的代谢物(特别是甲羟戊酸)，尤其包括异源HMGS的表达。在另一些另外的或替代的实施方案中，所述重组细胞是被基因改造以降低ERG9的表达或活性的酵母细胞。示例性类二萜包括但不限于蓖麻烯(casbene)、紫杉烯(taxadiene)、松香二烯(abietadiene)、紫杉醇(paclitaxel)和incensole，在这种情况下，所述类二萜合酶可以是上文“另外的异源核酸”部分中描述的任何GGPP合酶。示例性类四萜包括但不限于黄体素、β-胡萝卜素、玉米黄素、虾青素(astaxanthin)和apo-类胡萝卜素(例如视黄醇、β-紫罗酮、脱落酸和胭脂树素)，在这种情况下，所述类四萜合酶可以是上文“另外的异源核酸”部分中描述的任何EC 2.5.1.32合酶。

类萜和萜类

本发明提供了使用本发明的重组细胞产生类萜、萜类或类异戊二烯(类萜通常也称为类异戊二烯)的方法和重组细胞，所述重组细胞的特征在于具有降低的法呢基二磷酸合酶活性、牻牛儿基二磷酸合酶活性和/或具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的活性，其中在一些具体实施方案中，重组细胞是表达降低之ERG20活性的酵母细胞。

类萜根据所使用的异戊二烯单元(下示)的数目分类：

因此分类包括以下类别：

●类半萜，1个异戊二烯单元(5个碳)

●类单萜，2个异戊二烯单元(10个C)

●类倍半萜，3个异戊二烯单元(15个C)

●类二萜，4个异戊二烯单元(20个C)(例如，银杏苦内酯)

●类二倍半萜(Sesterterpenoid)，5个异戊二烯单元(25个C)

●类三萜，6个异戊二烯单元(30个C)

●类四萜，8个异戊二烯单元(40个C)(例如，类胡萝卜素)

●类多萜具有很多异戊二烯单元。

类半萜包括异戊二烯、异戊烯醇和异戊酸。

类单萜包括牻牛儿基焦磷酸、桉树精、苧烯和蒎烯。

类倍半萜包括法呢基焦磷酸、紫穗槐二烯、青蒿素和红没药醇。

类二萜包括牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素和蚜栖菌素。二萜的另一个非限制性实例是内根-贝壳杉烯。

类三萜包括角鲨烯和羊毛甾醇。

类四萜包括番茄红素以及胡萝卜素和类胡萝卜素。

萜类是多个异戊二烯单元组合形成的烃。类萜可以看作是萜的衍生物。术语萜有时被广义地用于包括类萜。如萜类一样，可根据所使用的异戊二烯单元的数目对进行类萜分类。本发明聚焦于类萜，尤其是由类异戊二烯焦磷酸(法呢基焦磷酸(FPP)、异戊烯基-焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基-焦磷酸(DMAPP)、牻牛儿基-焦磷酸(GPP)和/或牻牛儿基牻牛儿基-焦磷酸(GGPP))衍生的类萜。

对于类萜，理解类半萜类的类萜，例如但不限于异戊二烯、异戊烯醇和异戊酸；类单萜类的类萜，例如但不限于牻牛儿基焦磷酸、桉树精、苧烯和蒎烯；类倍半萜类的类萜，例如但不限于法呢基焦磷酸、青蒿素和红没药醇；类二萜类的类萜，例如但不限于牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素和蚜栖菌素；类三萜类的类萜，例如但不限于羊毛甾醇；类四萜类的类萜，包括但不限于番茄红素和胡萝卜素。

本发明还涉及用于产生其他异戊二烯化化合物的方法。因此，本发明涉及用于产生已经被异戊二烯化以包含类异戊二烯侧链之任何化合物的方法。

表1.核酸和氨基酸序列

实施例

实施例1

用弱KEX2启动子替换天然ERG20启动子

通过同源重组用KEX2启动子序列替换野生型ERG20启动子区。通过PCR产生包含ERG20启动子上游序列(用于同源重组)、用于赋予奈尔丝菌素抗性之基因(NatR)的表达盒、KEX2启动子和ERG20 ORF序列(用于同源重组)的DNA片段。图1A中提供了PCR片段和同源重组的概况。SEQ ID NO：1提供了KEX2启动子的序列。将PCR DNA片段转化到酿酒酵母宿主菌株中，并随后在含奈尔丝菌素的培养板上选择。鉴定KEX2启动子成功替换了天然ERG20启动子的克隆。这些酵母菌株在本文中也称为KEX2-ERG20菌株。

用CYC1启动子和在ERG20基因的5’UTR中产生茎环结构的短序列替换天然ERG20启动子

通过同源重组用CYC1启动子序列和异源5’UTR序列替换野生型ERG20启动子区。5’UTR区包含折叠成茎环结构的序列，其部分地封锁了5’-＞3’方向AUG的核糖体扫描，并因此减少了转录本的翻译。SEQ IDNO：2提供了5’UTR区的序列。通过PCR产生包含ERG20启动子上游序列(用于同源重组)、用于赋予奈尔丝菌素抗性之基因(NatR)的表达盒、具有含颈环结构序列之5’UTR序列的CYC1启动子和ERG20 ORF序列(用于同源重组)的DNA片段。图1B中提供了PCR片段和同源重组的概况，并且图1C中提供了示出5’UTR区的详图。SEQ ID NO：3提供了CYC1启动子的序列。将DNA片段转化到酿酒酵母宿主菌株中，随后在含奈尔丝菌素的培养板上选择。鉴定具有含5’UTR序列之茎环的CYC1启动子成功替换了天然ERG20启动子的克隆。这些酵母菌株在本文中也称为CYC1(5％)-ERG20。

实施例2.DMAPP积累的评估

甲羟戊酸途径的第一部分产生类异戊二烯焦磷酸——异戊烯焦磷酸/异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基磷酸/二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。图2中提供了所述途径的概括。异戊烯二磷酸δ异构酶1(IDI1)催化IPP和DMAPP分子之间的相互转变，并且在酿酒酵母中该比值通常为5∶1。本发明描述了，在与异源GPP合酶(GPPS)或异源FPP合酶(FPPS)或异源GGPP合酶(GGPPS)的表达组合时，IPP和DMAPP的积累获得了产生更多牻牛儿基焦磷酸(GPP)(1个DMAPP和1个IPP连接)、法呢基焦磷酸(FPP)(1个DMAPP和2个IPP连接)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)(1个DMAPP和3个IPP连接)的潜力。

麦角类生物碱裸麦角碱之生物合成途径的两个第一步骤可由两种酶麦角菌CpDmaW(SEQ ID NO：5)和烟曲霉FgaMT(SEQ ID NO：6)催化，这两种酶在酿酒酵母中均有活性。第一种酶CpDmaW催化色氨酸和DMAPP分子的连接以产生DMAT，而第二种酶FgaMT催化随后的甲基化步骤，从而得到Me-DMAT(参见图3)。

使用DMAT和/或Me-DMAT的测量值来间接地评估酵母菌株中DMAPP的积累，所述酵母菌株具有野生型ERG20基因，或在ERG20ORF前具有KEX2启动子，或在ERG20 ORF前具有异源5’UTR中有茎环结构的CYC1启动子。将CpDmaW和FgaMT基因克隆到多拷贝二重表达质粒(2μ)上，其中CpDmaW处于TEF1启动子的控制下，并且FgaMT处于PGK1启动子的控制下。将这种质粒转化到野生型和ERG20改造的酿酒酵母菌株中。

使酵母培养物在30℃下培养过夜，然后在0.1的OD600下使用所述酵母培养物接种含有25ml完全合成(SC)2％培养基的250ml培养烧瓶。主要的培养物在30℃下生长72小时。用乙酸乙酯提取酵母培养物上清液，并将提取物用于通过LC-MS对DMAT和Met-DMAT的量化。

与未修饰的对照相比，72小时后CYC1(5％)-ERG20和KEX2-ERG20菌株表现出DMAT积累约2倍和3倍的提高(参见图4A)。这代表DMAPP水平提高了约2倍和3倍。很可能，这还反映了IPP的类似积累，因为异戊烯二磷酸δ异构酶1(IDI1)催化IPP和DMAPP之间的正反应和逆反应二者。

与未修饰的对照菌株相比，72小时后CYC1(5％)-ERG20和KEX2-ERG20菌株表现出Me-DMAT积累约2倍和2.5倍的提高(参见图4B)。这代表DMAPP水平提高了约2倍和2.5倍，并且可能IPP也有类似积累。计算每个OD₆₀₀下DMAT和Me-DMAT的量，从而提供每个细胞中产量的指示。

这些测量值证明，通过将天然ERG20启动子替换成弱KEX2启动子或在ERG20转录本的5’UTR中引入茎环结构的CYC1启动子，可以使DMAPP水平提高数倍。在与异源GPP合酶或异源FPP合酶或异源GGPP合酶组合时，DMAPP和IPP的积累可用于提高GPP、FPP和GGPP的产生。

实施例3.GPP的产生

通过测定表达苧烯合酶1之酵母菌株中苧烯的水平间接地确定GPP产量。苧烯合酶1催化由GPP产生苧烯，因此可使用这种酵母菌株中苧烯的水平作为GPP水平的间接量度。

本实施例中使用的酵母菌株如下：

将处于TEF1启动子控制下的来自北美冷杉之编码截短的GPP合酶2的核酸(来自GPPS2北美冷杉，SEQ ID NO：12)和处于PGK1p启动子控制下的来自柠檬之编码截短的苧烯合酶1的核酸(来自LIMS1柠檬，SEQ ID NO：13)克隆到单拷贝载体(ARS-CEN)上。截短的GPPS2序列来自北美冷杉的GPPS2(由GenBank登录号AF513112编码)，后者的氨基酸2-86已经缺失以产生截短的tGPPS2。截短的LIMS1序列来自柠檬的LIMS(由GenBank登录号Q8LSK3编码)，后者的氨基酸2-52已经缺失以产生截短的tLIMS1。

将这种质粒转化到野生型酿酒酵母(也称为“WT+tGPPS+tLIMS”)以及根据实施例1所述制备的KEX2-ERG20酿酒酵母菌株(也称为“KEX2-ERG20+tGPPS+tLIMS”)和根据实施例1所述制备的CYC1(5％)-ERG20酿酒酵母菌株(也称为“CYC1(5％)-ERG20+tGPPS+tLIMS”)中。

使酵母培养物在30℃下生长过夜，然后在0.1的OD600下使用所述酵母培养物接种含有25ml SC 2％培养基的250ml培养烧瓶，所述培养基补充有10％肉豆蔻酸异丙酯。主要培养物在30℃下生长72小时。修饰的菌株生长良好并且生长至OD₆₀₀大于10(参见图8)。通过GC-MS对肉豆蔻酸异丙酯中积累的苧烯进行量化。计算每个OD₆₀₀下苧烯的量，从而提供每个细胞中苧烯产量的指示。

如图5中所示，与WT+tGPPS+tLIMS菌株相比，KEX2-ERG20+tGPPS+tLIMS菌株表现出苧烯水平惊人地提高80至100倍，这指示了提高GPP水平的类似水平。

在CYC1(5％)-ERG20+tGPPS+tLIMS中也获得了提高的GPP水平，但是低于KEX2-ERG20+tGPPS+tLIMS中的水平。

实施例4

合成天然粪肠球菌mvaE和mvaS序列，并且作为两个独立表达盒分别在组成型PGK1和TEF1启动子的控制下克隆到单拷贝载体(ARS-CEN)上以产生mvaE/mvaS质粒。天然粪肠球菌mvaE编码SEQID NO：9的多肽，而天然粪肠球菌mvaS编码SEQ ID NO：10的多肽。从酿酒酵母基因组DNA PCR扩增编码截短形式之酿酒酵母HMGR1(tHMGR，来自SEQ ID NO：8)的核酸，并且作为表达盒在组成型GPD1启动子的控制下克隆到单拷贝载体(ARS-CEN)上以产生tHMGR质粒。合成编码SEQ ID NO：11之多肽的酵母密码子优化的黄花蒿紫穗槐-4，11-二烯合酶基因并且作为表达盒在组成型PGK1启动子的控制下克隆到多拷贝载体(2μ)上以产生ADS质粒。将所述ADS质粒转化到具有mvaE/mvaS、HMGR或空对照质粒的酿酒酵母中。用于实验的酵母菌株具有通过5’UTR中之茎环结构翻译下调的ERG9基因。

2ml酵母起始培养物在30℃下培养过夜，并且使用所述培养物接种250ml摇瓶中之含有10％十二烷的25ml SC 2％葡萄糖培养基中。十二烷充当了紫穗槐-4，11-二烯的捕获剂。所述培养物在30℃下生长72小时。通过离心从酵母细胞和培养物上清液中分离十二烷并且直接在气相色谱-质谱系统(GC-MS)中进行分析以评估紫穗槐-4，11-二烯产量。为了测量甲羟戊酸水平，用2M HCl处理一小部分的酵母培养物以将甲羟戊酸转变为甲羟戊酸内酯(mevanololactone)。接着，用乙酸乙酯提取样品，然后进行GC-MS分析。结果在图6中示出。

mvaS可拯救(rescue)酿酒酵母中缺陷的甲羟戊酸途径

酿酒酵母中ERG13的缺失导致缺陷的甲羟戊酸途径。通过同源重组用赋予奈尔丝菌素抗性之NatR基因的表达盒替换ERG13基因，产生ΔERG13菌株。缺失的菌株仅在生长培养基补充有甲羟戊酸(10mg/ml甲羟戊酸)的情况下可以生长。在用mvaE/mvaS质粒转化所述缺失的菌株后，所述菌株可以在不补充甲羟戊酸的生长培养基中生长，这证明了mvaS可从功能上拯救酿酒酵母中的ERG13缺失。结果在图7中示出。

实施例5.GGPP的产生

通过测定表达FPPS、GGPPS、内根-柯巴基-二磷酸合酶(CDPS)和内根-贝壳杉烯合酶(KS)之酵母菌株中内根-贝壳杉烯的水平间接地确定GGPP产量。使用来自拟南芥的内根-柯巴基-二磷酸合酶(CDPS)，其序列以(SEQ ID NO：18)提供。使用拟南芥的内根-贝壳杉烯合酶，其序列以(SEQ ID NO：17)提供。内根-柯巴基-二磷酸合酶催化由GGPP形成内根-柯巴基-PP，而内根-贝壳杉烯合酶催化由内根-柯巴基-PP形成内根-贝壳杉烯。因此，这种酵母菌株中的内根-贝壳杉烯的水平可用作GGPP水平的间接量度。

本实施例中使用的酵母菌株如下：

将处于TEF1启动子控制下的来自酿酒酵母之编码截短的GPP合酶2的核酸(BTS1；SEQ ID NO：23)，处于PGK1启动子控制下的来自聚球藻之编码FPP合酶的核酸(SEQ ID NO：14)和来自拟南芥之编码CDPS的SEQ ID NO：18的核酸，以及处于TEF1启动子控制下的SEQ ID NO：17的KS转化到野生型酿酒酵母(也称为“WT+FPPS+BTS1+CDPS+KS”)以及如实施例1所述制备的KEX2-ERG20酿酒酵母菌株(也称为“KEX2-ERG20+FPPS+BTS1+CDPS+KS”)中。

在气相色谱-质谱系统(GC-MS)中分析内根-贝壳杉烯的存在。结果在图9中示出。

参考文献

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Rico et al，Appl Environ Microbiol. 2010 Oct；76(19)：6449-54.

Claims

1.一种用于在重组宿主细胞中产生萜或类萜的方法，所述方法包括在基因改造的细胞中产生萜或类萜的条件下培养的步骤，所述基因改造的细胞中内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者之活性的酶的表达被降低，并且还包含编码用于产生所述萜或类萜之异源酶的一个或更多个重组表达构建体。

2.权利要求1所述的方法，其中对所述细胞进行基因改造以降低法呢基二磷酸合酶的表达。

3.权利要求1所述的方法，其中对所述细胞进行基因改造以降低牻牛儿基二磷酸合酶的表达。

4.权利要求1所述的方法，其中对所述细胞进行基因改造以降低具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过向所述细胞中引入重组遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在所述构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，所述启动子序列以比编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的内源基因的启动子水平低的水平指导表达。

6.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过向所述细胞中引入重组遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在所述构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，其中在所述启动子和编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸序列之间是具有下式的异源插入序列：

-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-

其中X₁和X₅包含0、1或更多个核苷酸。

7.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过向所述细胞中引入重组遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在所述构建体中与信使RNA去稳定基序有效连接。

8.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过使所述细胞中内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶失活，并且向所述细胞中引入编码由弱启动子调控的法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的异源遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低。

9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括向所述细胞中引入编码截短形式的3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的重组表达构建体，所述截短形式的HMGR包含其催化活性羧基末端部分。

10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其还包括编码双功能酶的异源核酸序列，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶。

11.权利要求10所述的方法，其中所述双功能酶是粪肠球菌(E.faecalis)编码的mvaE基因或其功能同源物。

12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。

13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞，所述真核细胞是哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞或酵母细胞。

14.权利要求13所述的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞。

15.权利要求14所述的方法，其中所述酵母细胞是以下物种的酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastori)、棉病囊霉(Ashbya gossypii)、Arxula adeninivorans、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)或白色假丝酵母(Candida albicans)。

16.权利要求15所述的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。

17.权利要求2所述的方法，其中所述法呢基二磷酸合酶是ERG20。

18.权利要求10的方法，其中所述异源核酸序列编码截短形式的3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)。

19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述萜或类萜是单萜、二萜、倍半萜、类三萜或类四萜。

20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述萜或类萜是包含异戊二烯部分的分子。

21.权利要求20所述的方法，其中所述单萜是蒎烯、月桂烯或牻牛儿醇。

22.权利要求19所述的方法，其中所述二萜是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素或蚜栖菌素。

23.权利要求19所述的方法，其中所述倍半萜是紫穗槐二烯、百秋李醇、檀香醇、长叶烯或罗汉柏烯。

24.权利要求19所述的方法，其中所述类三萜是角鲨烯。

25.权利要求19所述的方法，其中所述类四萜是类胡萝卜素。

26.一种用于产生萜或类萜的重组细胞，所述重组细胞被基因改造以使内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，并且还包含编码用于产生所述萜或类萜之异源酶的一个或更多个重组表达构建体。

27.权利要求26所述的重组细胞，其中所述细胞被基因改造以降低法呢基二磷酸合酶的表达。

28.权利要求26所述的重组细胞，其中所述细胞被基因改造以降低牻牛儿基二磷酸合酶的表达。

29.权利要求26所述的重组细胞，其中所述细胞被基因改造以降低具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达。

30.权利要求26至29中任一项所述的重组细胞，其中通过向所述细胞中引入重组遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在所述构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，所述启动子序列以比编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的内源基因的启动子水平低的水平指导表达。

31.权利要求26至29中任一项所述的重组细胞，其中通过向所述细胞中引入重组遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在所述构建体中与指导所述法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的表达的启动子序列有效连接，其中在所述启动子和编码法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸序列之间是具有下式的异源插入序列：

-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-

其中X₁和X₅包含0、1或更多个核苷酸。

32.权利要求26至29中任一项所述的重组细胞，其中通过向所述细胞中引入重组遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低，其中，法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的核酸在所述构建体中与信使RNA去稳定基序有效连接。

33.权利要求26至29中任一项所述的重组细胞，其中通过使所述细胞中内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶失活，并且向所述细胞中引入编码由弱启动子调控的法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性之酶的异源遗传构建体来在所述细胞中产生内源法呢基二磷酸合酶、牻牛儿基二磷酸合酶或者具有法呢基二磷酸合酶和牻牛儿基二磷酸合酶二者活性的酶的表达降低。

34.权利要求26至33中任一项所述的重组细胞，其还包含向所述细胞中引入编码截短形式的3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的重组表达构建体，所述截短形式的HMGR包含其催化活性羧基末端部分。

35.权利要求26至34中任一项所述的重组细胞，其还包含编码双功能酶的异源核酸序列，其中所述双功能酶是乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶。

36.权利要求26至35中任一项所述的重组细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。

37.权利要求26至36中任一项所述的重组细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞，所述真核细胞是哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞或酵母细胞。

38.权利要求37所述的重组细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞。

39.权利要求38所述的重组细胞，其中所述酵母细胞是以下物种的酵母：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、博伊丁假丝酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、棉病囊霉、Arxula adeninivorans、产朊假丝酵母或白色假丝酵母。

40.权利要求39所述的重组细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。

41.权利要求27所述的重组细胞，其中所述法呢基二磷酸合酶是酵母ERG20。

42.权利要求35所述的重组细胞，其中所述异源核酸序列编码截短形式的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)。

43.权利要求26至42中任一项所述的重组体，其中所述萜或类萜是单萜、二萜、倍半萜、类三萜或类四萜。

44.权利要求26至43中任一项所述的重组体，其中所述萜或类萜是包含异戊二烯部分的分子。

45.权利要求43所述的重组体，其中所述单萜是蒎烯、月桂烯或牻牛儿醇。

46.权利要求43所述的重组体，其中所述二萜是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素或蚜栖菌素。

47.权利要求43所述的重组体，其中所述倍半萜是紫穗槐二烯、百秋李醇、檀香醇、长叶烯或罗汉柏烯。

48.权利要求43所述的重组体，其中所述类三萜是角鲨烯。

49.权利要求43所述的重组体，其中所述类四萜是类胡萝卜素。