CN102154165A - 一种高产腺苷的枯草芽孢菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产腺苷的枯草芽孢菌，其分类命名为：枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)A409；其遗传标记为：鸟嘌呤营养缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失，同时还具有8-氮黄嘌呤抗性；其保藏编号为CGMCC No.4484，保藏日期为2010年12月17日。上述枯草芽孢杆菌菌株腺苷产量能够稳定在25g/L，比出发菌株的腺苷产量提高了5倍多，该菌株经过10代以上传代，生产腺苷的性能保持稳定，而且在5L发酵罐上也能够维持较高水平，具有大规模工业化的潜力。

Description

一种高产腺苷的枯草芽孢菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种高产腺苷的枯草芽孢杆菌。

背景技术

腺苷(Adenosine)又称腺嘌呤核苷，是人体细胞中具有重要生理功能的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸而参与心肌的能量代谢，具有抗癫痫和强效扩张冠脉的作用，临床上于治疗冠状血管障碍、心肌梗塞、动脉硬化、中风后遗症、原发性高血压、心绞痛等。同时腺苷还是重要的医药中间体，可合成8-氯腺苷、嘌呤毒素、高瓜氨基腺苷、赖氨酰氨基腺苷、s-甲硫腺苷、阿糖腺苷、环磷酸腺苷、三磷酸腺苷等。因此，腺苷具有广阔的市场和开发前景。

目前，腺苷的生产方法有化学合成法、酶解法和发酵法三种。化学合成法主要是以次黄嘌呤、肌苷、2-甲基硫代腺苷、2，8-二氯嘌呤、2′，3′，5′-三乙酰基次黄苷等为起始原料，经过多步反应合成的。此方法溶剂损耗量大，收率低，成本高，产量小，且环境污染严重。

酶解法就是用酶将RNA降解得到的腺苷，但是RNA降解过程产生4种核苷的混合物，给提取分离带来很大困难，也增加了成本。

腺苷发酵生产工艺技术首推日本，早在70年代就开始了该领域的研究，取得了一系列成果，迄今已进入大规模工业生产阶段。1968年Konishi等使用枯草杆菌的异亮氨酸缺陷型(Ile-)，在异亮氨酸0.03％的培养基中可以累积腺苷1.266g/L。1971年Haneda等人由枯草杆菌诱变一株肌苷产生菌Bacillus sp.No.1043，用MNNG(N-甲基-N′-硝基-N′-亚硝基胍)处理，得到缺失AMP脱氨酶的黄嘌呤缺陷型腺苷产生菌P53-18突变株，可以积累腺苷达16g/L。国内发酵生产腺苷起步较晚，但发展较快。高淑红(工业微生物，2008，38(2)：42-46)等使用Bacillus sp.ATCC 21616，最终积累腺苷10.37g/L，柏建新(CN1657608A)等从肌苷菌株出发选育出B.subtilis CGMCC No.1304，最高可积累腺苷达23g/L，但是易产生回复突变，产量不稳定。

离子注入技术作为一种新颖、有效的生物品种改良新技术已在工业微生物育种、农作物诱变育种、植物转基因、生命起源以及环境辐射与人类健康等方面取得了一系列重要研究成果。与传统诱变源相比，离子注入除了具有能量沉积效应外，还具有动量传递、质量沉积及电荷中和与交换效应，是一种将物理诱变和化学诱变特性相结合的综合诱变方法，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，强烈地影响生物细胞的生理、生化性能，造成碱基的改变，诱发染色体结构变异(余增亮，物理，1997，26(6)：333-338)，产生比其它电离辐射更为丰富的生物学内容和更为广泛的诱变图谱。因此，离子注入进行工业微生物育种已成为研究热点，并取得了丰硕成果。虞龙(Acta Laser Biology Sinica，1999，8(3)：17-220)等用离子注入诱变筛选到一株遗传性能稳定的高产菌，使维生素C在300t发酵罐上糖-酸摩尔转化率达到94.8％，重量转化率为102％，被业内专家喻为“自维生素C二步法发酵发明以来的重大突破”。陈祖华(微生物学通报，2000，27(3)：174-177)等用离子注入诱变处理热带假丝酵母，经筛选，获得了1株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌，在底物浓度为15％(体积比)下产酸量由43.5％g/L上升到73.2％g/L。惠友权(西北大学学报，2001，31(3)：251-254)等应用离子注入对产黄嘌呤氧化酶的球形节杆菌进行离子诱变筛选，得到较出发菌株提高40％的突变菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产腺苷的枯草芽孢菌，以克服腺苷产量不高、传代不稳定、易出现回复突变的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种高产腺苷的枯草芽孢菌，其分类命名为：枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)A409；其遗传标记为：鸟嘌呤营养缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失，同时还具有8-氮黄嘌呤抗性；目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为CGMCC No.4484，保藏日期为2010年12月17日。

该菌株是通过对一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)301(腺苷产量低，而传代不稳定，极易产生恢复突变)进行低能离子束注入，然后将诱变后的菌株转接于完全培养基平板上培养，采用双平板技术和抗性平板技术筛到腺苷高产菌。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)301是本实验室自行从土壤中筛选得到的菌株。

本发明采用离子束照射技术进行菌体诱变，具体诱变过程如下：

菌体经斜面培养基活化培养后，用磷酸缓冲盐洗下新鲜菌落，振荡，使其充分分散，制成一定浓度的悬浊液，备用。取0.1ml菌悬液均匀涂布于灭过菌的平皿中，以无菌风吹至干燥后进行离子注入。离子注入机为LZD900多功能离子注入机。使用20KeV N⁺离子在不同剂量进行注入，靶室真空度为10-3Pa。将平皿置于靶台上，以5s脉冲式注入，间隔15s，然后取出平皿，以1ml无菌水洗脱，涂布于完全培养基平板上，于30℃培养72h用于单菌落的挑选。

本发明的鸟嘌呤缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失菌株分离筛选方法为双平板技术，具体操作方法为：

挑出完全培养基平板上圈大饱满的菌落，对应点在基本培养基、鸟嘌呤补充培养基平板上，挑选在基本培养基上不生长，而在含鸟嘌呤的补充培养基上生长的相对应位置菌落。将检出的菌株转接于斜面，用于营养缺陷型的鉴定，以及进行发酵培养，从而筛选出产腺苷高的菌株。

本发明的抗8-氮黄嘌呤菌株的分离筛选方法为：

用离子束照射上面筛选出的菌株的菌悬液，经适当稀释后涂布于8-氮黄嘌呤抗性培养基平板上，32℃培养48小时挑取生长良好的菌落转接于斜面，进行发酵培养，最终筛选到腺苷高产菌。

本发明中的培养基配制为：

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10-30，蛋白胨10-20，酵母膏10-20，玉米浆10-20，NaCl 3-5，琼脂20，pH 6.4-7.5。

基本培养基(g/L)：葡萄糖3-8，(NH₄)₂SO₄ 1-5，柠檬酸钠0.5-2.5，KH₂PO₄ 5-10，K2HPO₄·3H₂O 2-5，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01-0.05，MnSO₄·H₂O 0.01-0.05，琼脂20，pH 6.4-7.5。

完全培养基(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，牛肉膏10，NaCl 3，琼脂20，pH 6.4-7.5。

鸟嘌呤补充培养基(g/L)：基本培养基+鸟嘌呤0.1-0.5，pH 6.4-7.5。

抗性培养基(g/L)：葡萄糖3-8，(NH₄)₂SO₄ 1-5，柠檬酸钠0.5-2.5，KH₂PO₄ 5-10，K2HPO₄·3H₂O 2-5，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01-0.05，MnSO₄·H₂O 0.01-0.05，鸟嘌呤0.1-0.5，不同浓度8-氮黄嘌呤，琼脂20，pH 6.4-7.5。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10-30，蛋白胨5-15，酵母膏10-20，玉米浆10-20，NaCl 3-5，鸟苷0.01-0.05，pH 6.4-7.5。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60-100，酵母膏10-30，KH₂PO₄ 1-5，MgSO₄·7H₂O 3-8，尿素3-8，(NH₄)₂SO₄ 10-30，MnSO₄·H₂O 0.01-0.05，KCl 1-10，豆饼水解液10-30，鸟嘌呤0.1-0.5，CaCO₃ 10-20，pH 6.4-7.5。

上述所有培养基都是121℃高压蒸汽灭菌15min。

利用上述高产腺苷的枯草芽孢菌发酵生产腺苷的方法，将CGMCC No.4484接种于种子培养基培养，再将种子液转接至发酵培养基中培养，发酵生产腺苷。

平板、种子、发酵培养温度均为25-40℃，优选为32-35℃；种子培养时间为12-24小时，优选20～22小时；发酵培养时间为48-72小时，优选为60-66小时；培养基的pH在6.4-7.5，最适为7.0；发酵罐通气搅拌的溶氧范围控制在30％-60％，优选为45％。其中，种子液转接至发酵培养基时，种子液体积与发酵培养基体积比为1-30∶100，优选接种量为8-12∶100。

本发明的有益效果包括：

1.与传统的辐射法及化学诱变剂相比，离子束诱变具有损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定、易于获得理想新品种等特点。

2.本发明获得了一株鸟嘌呤缺陷型，黄苷酸氨化酶缺失及抗8-氮黄嘌呤的腺苷高产菌株。

3.本发明的腺苷高产菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A409(CGMCCNo.4484)，具有高产性状稳定的特点，该菌株经过10代以上传代，生产腺苷的性能保持稳定。具有很强的工业使用性价值。

4.本发明还获得了发酵生产腺苷的最优发酵条件，使用本发明筛选的高产菌，选择最适的酵母膏和豆饼水解液的浓度，最佳pH，在33℃下发酵66小时，腺苷的产量稳定在25g/L，操作方便简单。

附图说明

图1为枯草芽孢菌A409和301中XMP氨化酶和sAMP合成酶酶活变化。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

以实验室保藏的低产腺苷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)301为出发菌株，将经N⁺离子束诱变(低能离子注入机靶室内真空度为2×10^-4，注入能量为20kev，剂量为5×10¹³ions·cm^-2.s^-1)后的菌悬液经无菌水稀释100倍后，取0.1ml涂布于完全培养基平板上32℃下培养3天，从中挑选圈大饱满的单菌落，对应点在基本培养基、鸟嘌呤补充培养基平板上，挑选在基本培养基上不生长，而在含鸟嘌呤的补充培养基上生长的相对应位置菌落。将检出的营养缺陷型再划斜面，转接一环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏12g/L，玉米浆14g/L，NaCl 3g/L，鸟苷0.02g/L)的500mL摇瓶中，于32℃下100rpm往复式摇床培养18小时。再转接2mL于装有25mL液体发酵培养基(葡萄糖100g/L，K₂HPO₄3g/L，(NH₄)₂SO₄ 12g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄·H₂O 0.02g/L，KCl 3g/L，尿素5g/L，酵母膏16g/L，鸟嘌呤0.1g/L，豆饼水解液15g/L，CaCO₃ 15g/L)的500mL摇瓶中，于33℃下260rpm摇床发酵培养66小时。经过初筛，得到192株比出发菌株产量高的突变株。然后对这192菌株进行复筛，复筛时，将每株菌接3瓶发酵培养基，复筛的条件和初筛相同，得到6株产量最高的腺苷菌株，实验结果见表1。

表1

将筛选出的菌株转接于斜面，用于鸟嘌呤营养缺陷型的鉴定。

鉴定方法一：平板检验法：用接种环挑一环斜面上生长良好的菌，来回之字型划线涂布与基本培养基和含鸟嘌呤的补充培养基，若在含鸟嘌呤的补充培养基上生长而在基本培养基上不长则为鸟嘌呤营养缺陷型，该菌株黄苷酸氨化酶缺失。

鉴定方法二：测酶活：琥珀腺苷酸(sAMP)合成酶的测定。

在GTP供给能量的情况下，底物IMP与天冬氨酸反应生成AMP，相应地引起OD₂₈₀的增加，以此表征酶活力。

表2sAMP合成酶测定反应体系组成

37℃保温15min后，加入1.5mL的7％高氯酸终止反应，离心后上清液用于测定OD₂₈₀的增加。比活定义为1min内，1mg的酶蛋白所能引起的280nm处吸光度的变化的1000倍(10³ΔOD280/min/mg蛋白)。蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法。

表3不同菌株sAMP合成酶比活力

黄苷酸(XMP)氨化酶的测定：

黄苷酸氨化酶催化黄苷酸生成鸟苷酸，通过黄苷酸的减少量来表征酶活的大小。

表4XMP氨化酶测定反应体系组成

30℃保温15min后，煮沸8min，离心后上清液用于测定OD₂₉₀的增加。比活定义为1min内，1mg的酶蛋白所能引起的290nm处吸光度的变化(ΔOD290/min/mg蛋白)。蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法。酶活的测定结果如下表所示：

表5不同菌株XMP氨化酶比活力

将最终得到产量最高的菌株a39再进行N⁺离子束诱变，诱变后的菌悬液经适当稀释后涂布于8-氮黄嘌呤抗性培养基平板上，32℃培养72小时挑取生长良好的菌落转接于斜面，进行发酵培养(条件同上)，根据腺苷产量的高低来确定复筛用的菌株，共得到21株产量比菌株a39有明显提高的菌株(提高2g/L以上)，复筛前，对复筛用的菌种的缺陷型和抗性再进行确认，复筛方法同上，实验结果见表6，最终筛选到一株腺苷高产菌枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)A409，产量达25g/L。对腺苷高产菌枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)A409和301进行一次酶活比较，进一步确认缺陷型，其结果见图1。

表6

实施例2：

将菌株A409从牛肉膏斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏12g/L，玉米浆15g/L，NaCl 3g/L，鸟苷0.025g/L)的500mL摇瓶中，于32℃下100rpm往复式摇床培养20小时。转接3mL于装有30mL液体发酵培养基(葡萄糖90g/L，K₂HPO₄ 4g/L，(NH₄)₂SO₄ 15g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄·H₂O 0.02g/L，KCl 3g/L，尿素5g/L，酵母膏16g/L，鸟嘌呤0.1g/L，豆饼水解液15g/L，CaCO₃ 15g/L)的500mL摇瓶中，于33℃下270rpm摇床发酵培养66小时。腺苷产量达到24.9g/L。

实施例3：

将菌株A409从牛肉膏斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基(同实施例1)的500mL摇瓶中，于32℃下100rpm往复式摇床培养20小时。转接2mL于装有20mL液体发酵培养基(葡萄糖95g/L，K₂HPO₄ 4g/L，(NH₄)₂SO₄ 15g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄·H₂O 0.02g/L，KCl 2g/L，尿素5g/L，酵母膏18g/L，鸟嘌呤0.1g/L，豆饼水解液15g/L，CaCO₃ 15g/L)的500mL摇瓶中，于33℃下270rpm摇床发酵培养68小时。腺苷产量达到25.3g/L。

实施例4：

以枯草芽孢杆菌A409在5L发酵罐中合成腺苷，种子和发酵培养基组合及其培养条件同实施例3。发酵培养基体积为3L，搅拌转速为400rpm，通气量前20小时为5L/min，后40小时为7L/min。用浓度为18％的氨水调pH，发酵温度33℃，发酵设备为美国NBS自动控制发酵罐。发酵时间为56-66小时，腺苷的最高产量为26.8g/L。

实施例5：

将菌株A409连续传10代，在实施例3的培养条件下进行发酵培养，生产腺苷。结果表明(见表6和7)，连续10代遗传培养，菌株A409生产腺苷的性能稳定。

表7连续传1-5代的菌株A302的生产腺苷性能

表8连续传6-10代的菌株A302的生产酸腺苷性能

发酵过程中对16h、26h的样进行缺陷型和抗性标记进行验证，存在用“+”标示。

Claims (7)

1.一种高产腺苷的枯草芽孢菌，其分类命名为：枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)A409；其遗传标记为：鸟嘌呤营养缺陷型、黄苷酸氨化酶缺失，同时还具有8-氮黄嘌呤抗性；其保藏编号为CGMCC No.4484，保藏日期为2010年12月17日。

2.利用权利要求1所述的高产腺苷的枯草芽孢菌发酵生产腺苷的方法，其特征在于，将CGMCC No.4484接种于种子培养基培养，再将种子液转接至发酵培养基中培养，发酵生产腺苷。

3.根据权利要求2所述的利用高产腺苷的枯草芽孢菌发酵生产腺苷的方法，其特征在于，所述的种子培养基包含如下组分：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母膏10-20g/L，玉米浆10-20g/L，NaCl 3-5g/L，鸟苷0.01-0.05g/L，其余为水，pH6.4-7.5。

4.根据权利要求2所述的利用高产腺苷的枯草芽孢菌发酵生产腺苷的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖60-100g/L，酵母膏10-30g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 3-8g/L，尿素3-8g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-30g/L，MnSO₄·H₂O0.01-0.05g/L，KCl 1-10g/L，豆饼水解液10-30g/L，鸟嘌呤0.1-0.5g/L，CaCO₃ 10-20g/L，其余为水，pH 6.4-7.5。

5.根据权利要求2所述的利用高产腺苷的枯草芽孢菌发酵生产腺苷的方法，其特征在于，种子培养，培养温度为25-40℃，培养时间为12-24小时。

6.根据权利要求2所述的利用高产腺苷的枯草芽孢菌发酵生产腺苷的方法，其特征在于，发酵培养，培养温度为25-40℃，培养时间为48-72小时。

7.根据权利要求2所述的利用高产腺苷的枯草芽孢菌发酵生产腺苷的方法，其特征在于，种子液转接至发酵培养基时，种子液体积与发酵培养基体积比为1-30∶100。

Images