CN102876760A

CN102876760A - 枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用

Info

Publication number: CN102876760A
Application number: CN2012104043990A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 柏建新; 张春伟; 陈晓春; 陈勇; 谢婧婧; 吴菁岚
Original assignee: NANJING BIOTOGETHER CO Ltd; Nanjing Tech University
Current assignee: NANJING BIOTOGETHER CO Ltd; Nanjing Tech University
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2012-10-22
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-10-22
Also published as: CN102876760B

Abstract

本发明公开了枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用，所述的枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）为CGMCC No.4484。本发明筛选到的菌株能利用多种碳源和氮源发酵生产腺苷且联产乙偶姻，通过在发酵培养基中添加柠檬酸钠能显著提高腺苷及乙偶姻的产量，操作方便简单，培养条件粗放，在5L发酵罐上能维持较高的水平，具有大规模工业化的潜力。

Description

枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用

技术领域

本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用。

背景技术

腺苷（Adenosine）又称腺嘌呤核苷，由糖苷键连接腺嘌呤和核糖而成，是人体细胞中具有重要生理功能的内源性核苷。腺苷以其扩张血管作用而被人们所熟知，具有广泛的心脏效应以及快速显著的冠脉扩张作用，大量研究表明，腺苷还具有触发或介导缺血预适应、减少再灌注损伤等心脏保护效应。在美国，腺苷是经FDA批准的转复阵发性室上性心动过速（PSVT）的一线药物，也是经FDA批准的用于心脏药物负荷试验的两种药物之一，已成为急诊处理快速心律失常和药物负荷试验的常规用药。另外腺苷还是重要的医药中间体，可合成8-氯腺苷、嘌呤毒素、高瓜氨基腺苷、赖氨酰氨基腺苷、s-甲硫腺苷、阿糖腺苷、环磷酸腺苷、三磷酸腺苷等。因此，腺苷具有广阔的市场和开发前景。

乙偶姻（Acetoin），即3-羟基丁酮，自然地存在于玉米、葡萄酒、蜂蜜、可可、黄油、咖啡、草莓和醋栗等物质中。由于其具有特有的奶油香味，因此多用于奶油、干酪、咖啡、坚果的香味增强剂，同时也可以用于配制奶油、乳品、酸乳和草莓型香精等，啤酒风味、奶酪香味均与乙偶姻有关。因此，乙偶姻在食品、制药、香料以及化妆品等行业都有着非常重要的用途，同时作为一种新兴的平台化合物，也广泛应用于其他行业。

目前，腺苷和乙偶姻的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法三种。腺苷的化学合成法主要是以次黄嘌呤、肌苷、2-甲基硫代腺苷、2,8-二氯嘌呤、2′,3′,5′-三乙酰基次黄苷等为起始原料，经过多步反应合成的。乙偶姻的化学合成方法主要是丁二酮部分加氢还原和2,3-丁二醇选择性氧化生产。化学法合成腺苷及乙偶姻此方法溶剂损耗量大，收率低，成本高，产量小，且环境污染严重。

腺苷的酶解法就是用酶将RNA降解得到的腺苷，但是RNA降解过程产生4种核苷的混合物，给提取分离带来很大困难，也增加了成本。乙偶姻的酶转化法主要是通过分离纯化丁二酮还原酶，催化丁二酮的还原，得到乙偶姻，但该法获得大量特异性的酶比较困难，并且原料与化学法相同，都为丁二酮或2,3-丁二醇，存在同样的原料限制。

腺苷发酵工艺技术首推日本，早在70年代就开始了该领域的研究，取得了一系列成果，迄今已进入大规模工业化生产阶段；国内发酵法生产腺苷起步较晚，目前有少数几家研究单位进行研究，主要采用物理、化学方法对肌苷产生菌枯草芽孢杆菌进行诱变处理，选育出特定营养缺陷型菌，进行发酵生产腺苷。自然界中某些细菌具有产乙偶姻的能力，能以糖质为原料进行发酵生产，但通常乙偶姻是作为丁二酮和2,3丁二酮的副产物，产量较少。因此通过菌株的筛选分离或分子改造，可以选育到高产乙偶姻的菌株，进行大规模工业化发酵生产。

综上所述，现有的技术都是利用枯草芽孢杆菌单独生产腺苷或乙偶姻，存在原料利用率低、成本高的问题。发酵法高产腺苷且联产乙偶姻避免了这些问题，以期待减轻资源和环境压力，提高产品质量。

申请人于2011年1月5日申请过一项专利“一种高产腺苷的枯草芽孢菌”（201110000716.8），并对其中的生产菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）A-409进行了保藏。目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为CGMCC No.4484，保藏日期为2010年12月17日。

申请人在无意间发现该菌株不但可以高产腺苷，还可以用于联产乙偶姻，因此产生了本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用，所述的枯草芽孢菌（Bacillussubtilis）为CGMCC No.4484。

具体的操作方法是，将CGMCC No.4484接种于种子培养基培养，再将种子液转接至发酵培养基中培养，发酵生产腺苷及乙偶姻。

其中，所述的种子培养基包含如下组分：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，玉米浆10-20ml/L，酵母膏10-20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，NaCl 3-5g/L，鸟苷0.01-0.05g/L，其余为水，pH 6.0-7.0。

其中，种子培养，培养温度为25-40℃，优选为32-35℃；培养时间为12-24小时，优选20-22小时。

其中，所述的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖60-120g/L，酵母膏10-20g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-20g/L，尿素2-6g/L，KH₂PO₄ 2-6g/L，KCl 2-6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，MnSO₄·H₂O 0.01-0.05g/L，豆饼水解物5-30ml/L，CaCO₃ 10-40g/L，其余为水，pH6.0-7.0。

其中，发酵培养基中添加柠檬酸钠，柠檬酸钠的添加浓度为1-5g/L。

其中，发酵培养，培养温度为25-40℃，优选为32-35℃；培养时间为48-72小时，优选为60-66小时。发酵罐通气搅拌的溶氧范围控制在30%-60%，优选为45%。

其中，所述的发酵生产条件为接种量5~20%（v/v），优选接种量为8-10%。

菌株的生长、腺苷及乙偶姻含量曲线：见附图1。如图1所示，发酵前期0-6h，菌体生长缓慢，伴随着一个明显的延滞期，由于菌体量比较小，且刚适应培养基环境，因此菌体生长比较缓慢，基本没有腺苷及乙偶姻的生成，葡萄糖消耗速率也较小；6h后菌体进入对数生长期，由于需要消耗葡萄糖来满足菌体生长的要求以及合成各前体物质来满足腺苷及乙偶姻的生成，培养基中的葡萄糖含量急剧下降，菌体浓度迅速增加，腺苷及乙偶姻快速增长，菌体在生长过程中代谢产生有机酸使培养液pH下降；30h以后，菌进入稳定期，葡萄糖消耗减慢，菌体总量的增长幅度不再明显，腺苷及乙偶姻平稳增长。54h进入发酵后期，菌体逐渐衰亡，已无法再消耗葡萄糖，而腺苷及乙偶姻的产量稍有增加，说明该菌是生长半耦联型。

本发明的有益效果：

1.本发明筛选到了一株高产腺苷且联产乙偶姻的枯草芽孢杆菌，该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产腺苷并联产乙偶姻，操作方便简单，培养条件粗放。

2.采用本发明方法选育出的高产腺苷联产乙偶姻的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）A409（CGMCC No.4484），具有高产性状稳定的特点，该菌株经过10代以上传代，生产腺苷及乙偶姻的性能保持稳定，具有很强的工业使用性价值。

3.本发明还获得了发酵生产腺苷的最优发酵条件，使用本发明筛选的高产菌，选择最适的碳源和氮源的浓度，最佳pH，在33℃下发酵60小时，腺苷的产量稳定在25g/L，乙偶姻的产量稳定在16g/L，操作方便简单。

4.本发明通过在发酵培养基中添加柠檬酸钠，使腺苷的产量比出发菌株提高到25.1g/L，乙偶姻提高到16.2g/L。该菌具有较高的合成腺苷和乙偶姻的能力，其中乙偶姻的还原态副产物2,3-丁二醇的产量很低，为0.2g/L左右。

5.本发明筛选到的腺苷高产菌株还能副产高价值的乙偶姻，提高了产品生产效率。

附图说明

图1为枯草芽孢菌A409发酵生产腺苷且联产乙偶姻的过程曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例使用的分析方法如下：

发酵液中的产物腺苷采用Agilent 1100高效液相色谱仪测定，色谱柱为江苏淮阴汉邦科技有限公司Lichrospher C18[4.6x250mm，5um]，流动相：V（甲醇）:V(pH6.6的磷酸三乙胺溶液)＝30：70，柱温：室温，检测波长：254nm，流速：0.8mL·min^-1，进样量：20μL。

乙偶姻以及各种副产物如乙酸、乳酸等采用Agilent 1100高效液相色谱仪测定，色谱柱为Aminex HPX-87H离子排斥色谱柱（300mm×7.8mm×9μm），流动相为3mmol/LH₂SO₄，流速0.4mL/min，柱温60°C，检测波长210nm，进样量为20μL。

2,3-丁二醇采用Agilent7890A气相色谱仪测定，色谱柱为安捷伦HP-5（30m×0.25mm×0.25μm），氢焰离子化检测器（FID），载气为N₂（纯度为99.99%），流速为1.5ml/min，汽化温度为250°C，柱温为230°C，检测温度为270°C，分流比为40:1，H₂流量为30ml/min，空气流量为400ml/min，尾吹流量为25ml/min，进样量为1ul。

实施例1：

斜面培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆10ml/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，NaCl 3g/L，鸟苷0.03g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH7.0；

种子培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，玉米浆10ml/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，NaCl 4g/L，鸟苷0.03g/L，其余为水，pH7.0；

发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母膏15g/L，(NH₄)₂SO₄ 16g/L，尿素3g/L，KH₂PO₄4g/L，KCl 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，豆饼水解物20ml/L，CaCO₃ 30g/L，其余为水，pH7.0；

将菌株A409从斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，于32℃下200rpm往复式摇床培养20小时。转接3mL于装有30mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于33℃下250rpm摇床发酵培养66小时。腺苷产量达到20g/L，乙偶姻的产量达到13g/L。

实施例2：

发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母膏15g/L，(NH₄)₂SO₄ 16g/L，尿素3g/L，KH₂PO₄4g/L，KCl 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，豆饼水解物20ml/L，CaCO₃ 30g/L，其余为水，pH7.0；

将菌株A409从斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基（同实施例1）的500mL摇瓶中，于32℃下200rpm往复式摇床培养20小时。转接2mL于装有20mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于33℃下250rpm摇床发酵培养66小时。腺苷产量达到21.6g/L，乙偶姻产量达到13.6g/L。

实施例3：

以枯草芽孢杆菌A409在5L发酵罐中合成腺苷，配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，配制发酵培养基，配方与培养方法同实施例2，将种子液按发酵液体积的10%（v/v）的接种量接入冷却后的发酵培养液中，发酵培养基体积为3L，通气量控制为2vvm，搅拌转速500rmp，用浓度为20%的氨水调pH 6.5，35℃发酵66h，最后得到的发酵液中腺苷的含量为23g/L，乙偶姻含量为15g/L；

对比例1：

与实施例3的方法相同，所不同的是利用的培养基添为加了2g/L柠檬酸钠的培养基，腺苷与乙偶姻的产量分别提高了9.1%和8%。

实施例4：

发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母膏15g/L，(NH₄)₂SO₄ 16g/L，尿素3g/L，KH₂PO₄4g/L，KCl 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，豆饼水解物20ml/L，柠檬酸钠2g/L，CaCO₃ 30g/L，其余为水，pH7.0；

配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积的10%(v/v)的接种量接入冷却后的发酵培养液中，发酵培养基体积为3L，通气量控制为2vvm，搅拌转速500rmp，用浓度为20%的氨水调pH 6.5，，35℃发酵66h，最后得到的发酵液中腺苷的含量为25.1g/L，乙偶姻含量为16.2g/L；

实施例5：

发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母膏15g/L，(NH₄)₂SO₄ 16g/L，尿素3g/L，KH₂PO₄4g/L，KCl 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，豆饼水解物20ml/L，柠檬酸钠5g/L，CaCO₃ 30g/L，其余为水，pH7.0；

配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积的10%(v/v)的接种量接入冷却后的发酵培养液中，发酵培养基体积为3L，通气量控制为2vvm，搅拌转速500rmp，用浓度为20%的氨水调pH 6.5，在线监测发酵液中的葡萄糖残留量，当葡萄糖的含量下降为5g/L时，流加葡萄糖150g至发酵液中，35℃发酵66h，最后得到的发酵液中腺苷的含量为26.2g/L，乙偶姻含量为16.8g/L。

Claims

1.枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用，所述的枯草芽孢菌（Bacillussubtilis）为CGMCC No.4484。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将CGMCC No.4484接种于种子培养基培养，再将种子液转接至发酵培养基中培养，发酵生产腺苷及乙偶姻。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的种子培养基包含如下组分：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，玉米浆10-20ml/L，酵母膏10-20g/L，MgSO₄·7H₂O0.1-1g/L，NaCl 3-5g/L，鸟苷0.01-0.05g/L，其余为水，pH 6.0-7.0。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，种子培养，培养温度为25-40℃，培养时间为12-24小时。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖60-120g/L，酵母膏10-20g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-20g/L，尿素2-6g/L，KH₂PO₄ 2-6g/L，KCl 2-6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，MnSO₄·H₂O 0.01-0.05g/L，豆饼水解物5-30ml/L，CaCO₃ 10-40g/L，其余为水，pH 6.0-7.0。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养基中添加柠檬酸钠，柠檬酸钠的添加浓度为1-5g/L。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养，培养温度为25-40℃，培养时间为48-72小时。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵生产条件为接种量5~20%（v/v）。