CN104403957A - 一种胁迫条件下低蛋白酶a外泌酵母菌株及其构建方法 - Google Patents

一种胁迫条件下低蛋白酶a外泌酵母菌株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种在胁迫条件下调节蛋白酶A胞内外分泌的新方法，是通过敲除蛋白酶A编码基因即PEP4基因的一个等位基因的同时过表达编码液泡分选受体的MRL1基因来实现的。本发明选育的酿酒酵母菌株明显降低了蛋白酶A的胞外分泌量，能够提高纯生啤酒的泡持性，胞外蛋白酶A酶活较出发菌株有明显降低，约降低到出发菌株的54％，同时，重组菌株的胞内蛋白酶A酶活跟出发菌株相比无显著变化。本发明为降低蛋白酶A胞外酶活的同时不改变发酵特性提供了一种的新的思路和方法，对提高工业酵母泡沫稳定性具有指导意义。

Description

一种胁迫条件下低蛋白酶A外泌酵母菌株及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别是一株在发酵末期胁迫条件下适合低蛋白酶A外泌的酵母菌株及其构建方法。
背景技术：
在纯生啤酒发展的过程中，一些有关纯生啤酒的质量问题一直困扰着酿造工程师，其中纯生啤酒的泡沫稳定性问题尤为突出。由于纯生啤酒在包装前未经过巴氏灭菌，在发酵末期，氮源不足，高的酒精和二氧化碳浓度会给酵母造成一个胁迫环境，导致蛋白酶A的外泌，分解泡沫阳性蛋白，降低啤酒泡持性，对纯生啤酒的泡沫质量产生不利影响。因此，提高纯生啤酒的泡沫稳定性，成为当今世界改善纯生啤酒质量的一个重大技术难题。
虽然，通过优化发酵工艺，或者添加泡沫稳定剂能够从一定程度上改善啤酒泡沫稳定性，但是这种方法都不能从源头上解决泡沫衰减问题。基因工程上通过敲除产生蛋白酶A的基因PEP4来降低蛋白酶A外泌，从而使啤酒的稳定性增加。但是，由于胞内蛋白酶A对酿酒酵母细胞的生理生化功能有很重要的作用，例如参与液泡内多种酶的成熟和激活过程；影响细胞内一些糖代谢酶的正常表达等。所以PEP4缺失菌株的发酵特性会受到胞内蛋白酶A缺失的影响。
正常代谢条件下酿酒酵母蛋白酶A的分泌过程是，前蛋白酶A原(preproPrA)在粗面内质网合成后，先经过内质网的修饰和折叠，再运输到高尔基体，最终被液泡分选受体定向运输至液泡并在液泡中形成成熟的蛋白酶A(PrA)。MRL1基因作为编码液泡分选受体的基因，在蛋白酶A从高尔基体向液泡定向分泌的过程中起着重要作用。当蛋白酶A原前肽上的识别位点与分选受体特异性结合，蛋白酶A原从反面高尔基体网络被输送至液泡，并在到达液泡后被激活，由54个氨基酸残基组成的前肽被切除，最后形成分子量约42kD活性蛋白酶A。但是随着发酵后期各种营养物质缺乏、氮源不足等胁迫条件下就会错误地运送到胞外，并在胞外被激活。
然而，目前对于在胁迫条件下，通过调控液泡分选受体的表达量来控制蛋白酶A的内外分泌的研究报道很少，理论基础尚属不清楚，尤其是在选育低蛋白酶A外泌的酵母菌株的研究方面更是空白，因此，本发明通过设置一个氮源缺乏，并且高的酒精和二氧化碳浓度的胁迫环境，来模拟啤酒发酵后期的发酵条件，首先确定MRL1基因在胁迫条件下对蛋白酶A分泌的调控作用，进而通过构建一株敲除PEP4基因同时过表达MRL1基因的酿酒酵母菌株，在降低蛋白酶A外泌的同时保证菌体的正常代谢不受影响。进而选育出适合发酵的低产蛋白酶A菌株，这种方法对于提高啤酒泡沫稳定性，尤其是纯生啤酒的泡沫稳定性具有指导意义。
发明内容：
本发明解决上述问题所采用的技术方案之一，是提供一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，所述方法是在酿酒酵母出发菌种中敲除蛋白酶A编码基因即PEP4基因的一个等位基因的同时过表达编码液泡分选受体的MRL1基因，步骤如下：
(1)先将强启动子PGK1p-PGK1t片段插入到表达载体上，再将MRL1基因插入到启动子PGK1p和终止子PGK1t之间，然后将KanMX抗性标记插入表达质粒，在此基础上将含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子插入质粒，最终得到重组质粒。
(2)以重组质粒为模板扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子、强启动子PGK1p-PGK1t、MRL1基因及KanMX抗性标记的重组片段，将重组片段化转入出发菌中，得到敲除单个PEP4拷贝的同时过表达MRL1的重组菌株。
具体如下：
(1)重组质粒的构建
①以质粒pPGK1为模板，扩增其上的强启动子片段PGK1p-PGK1t，并连接到表达载体上；
②以出发菌株的总DNA为模板，扩增出MRL1基因片段，并将其插入到(1)-①所构建质粒的启动子PGK1p和终止子PGK1t之间；
③以含有Amp+抗性的穿梭质粒为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因，并将其插入到(1)-②所构建的质粒上；
④以出发菌株的总DNA为模板，PCR扩增出PEP4基因的上、下游序列，并将其连接到(1)-③所构建的质粒上，最终获得重组质粒；
(2)敲除PEP4同时过表达MRL1基因
①以步骤(1)中的重组质粒为模板，扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子，强启动子，MRL1基因及KanMX抗性标记的重组片段；
②用醋酸锂转化法将(2)-①中的重组片段转化入出发菌株中，得到敲除单个PEP4拷贝的同时过表达MRL1基因的重组菌株。
所述PEP4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1；
所述MRL1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2；
优选的，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RY1，编号CGMCC No2.1525；
优选的，所述表达载体为YEP352质粒；
优选的，所述穿梭质粒为pUC6质粒。
本发明所采用的技术方案之二，是提供一种由技术方案一构建的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株的出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RY1，编号CGMCC No 2.1525；表达载体为YEP352质粒；表达载体为YEP352质粒。
所述菌株胞内蛋白酶A的酶活跟出发菌株相比无显著变化，但是胞外酶活较出发菌株得到显著降低，同时由于胞内酶活变化不显著使得重组菌株的代谢特性并未发生明显改变。
有益效果：
1、本发明选育的酿酒酵母菌株明显降低了蛋白酶A的胞外分泌量，能够提高纯生啤酒的泡持性，胞外蛋白酶A酶活较出发菌株有明显降低，约降低到出发菌株的54％，同时，重组菌株的胞内蛋白酶A酶活跟出发菌株相比无显著变化。
2、重组菌株跟出发菌株相比，在发酵过程中，耗糖速率和α-氨基氮同化速率变化不大，表观糖度均能降低到4°Brix以下，达到发酵结束的标准；发酵结束后，两株菌的残糖和酒精度也基本相当。可见，本发明所提供的基因工程菌在降低蛋白酶A外泌的同时并未影响菌株的正常代谢。
3、本发明选育的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株是通过敲除PEP4基因的一个等位基因的同时过表达MRL1基因的，这为胁迫条件下选育低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株提供了一个新的方向。
附图说明：
图1重组质粒Yep-PMKZ的构建流程示意图；
图2重组质粒Yep-PMKZ的验证电泳图；
其中泳道M为5000 bp DNA Ladder Marker；
泳道1为以Yep-PMK为模板，MRL1-U和MRL1-D为引物，PCR验证1146bp的MRL1基因片段；
泳道2为以Yep-PMK为模板，KAN-U和KAN-D为引物，PCR验证1613bp的KanMX基因片段；
泳道3为以Yep-PMK为模板，PGK-U和MRL1-D为引物，PCR验证MRL1的连接方向，产物大小为2625bp；
泳道4为以Yep-PMKU为模板，PA-U和PA-D为引物，PCR验证1210bp的MU基因片段；
泳道5为以Yep-PMKZ为模板，PB-U和PB-D为引物，PCR验证1327bp的MD基因片段；
图3基因盒MU-KanMX-PGK1p-MRL1-PGK1t-MD片段与酵母基因组的同源重组示意图；
图4重组菌株验证电泳图；
其中泳道M为5000 bp DNA Ladder Marker；
泳道1,2以YZM-S和YZM-X为引物进行验证；泳道3,4以YZM-XS和YZM-XX为引物进行验证；泳道1,3的模板为出发菌株RYI，均不能扩增出条带；泳道2,4的模板为重组菌株RPMKZ，可以分别扩增出1720bp，2077bp大小的特异性条带；
图5重组菌株和出发菌株的α-氨基氮的变化趋势；
图6重组菌株和出发菌株的表观糖度的变化趋势。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株及其构建方法。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：PEP4基因敲除且MRL1基因过表达菌株的构建
(1)Yep-PMKZ质粒的构建
重组质粒Yep-PMKZ的构建流程如图1所示。
①以pPGK1质粒为模板，PCR扩增出强启动子PGK1p-PGK1t基因片段；
上游引物PGK-U：CGCGGATCCTCTAACTGAT CTATCCAAAACTGA(SEQ ID NO:3)
下游引物PGK-D：CGCGTCGACTAACGAACGCAGAATTTTC(SEQ ID NO:4)
划线部分为酶切位点
PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃100s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
PCR反应体系(20μL)
PCR buffer dNTP 上、下游引物 模板 Taq酶 DdH2O 总体积
2.0μL 1.5μL 各1.0μL 1.0μL 0.5μL 13.0μL 20.0μL
将PCR产物连接到表达载体YEP352上，获得重组质粒Yep-P。
②以酵母出发菌株RY1(CGMCC No 2.1525)总DNA为模板，PCR扩增出MRL1基因；
上游引物MRL1-U：CCGCTCGAGATGTTGAAACGATCATCTCTAATAT(SEQ ID NO:5)
下游引物MRL1-D：CCGCTCGAGTTATACGCTATTATCAGCCAAAGTT(SEQ ID NO:6)
划线部分为酶切位点
PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；62℃1min；72℃1min，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将PCR产物连接到重组质粒Yep-P上，得到重组质粒Yep-PM。
③以pUC6质粒为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；
上游引物KAN-U：GGGGTACCCAGCTGAAGCTTCGTACGC(SEQ ID NO:7)
下游引物KAN-D：CGGGATCCGCATAGGCCA CTAGTGGATC TG(SEQ ID NO:8)
划线部分为酶切位点
PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃90s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将PCR产物连接到重组质粒Yep-PM上，得到重组质粒Yep-PMK。
④以出发菌株RY1总DNA为模板，PCR扩增出PEP4基因的上游序列MU；
上游引物PA-U：ACGAATTCGAGCTCGGTACCGATACTACAGGTCTGTTTAACGAGGG(SEQID NO:9)
下游引物PA-D：CGAAGCTTCAGCTGGGTACCGTTAGTTTTGGTTTTTGTTTGAATT(SEQID NO:10)
划线部分为酶切位点；
PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；48℃1min；72℃80s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将PCR产物连接到重组质粒Yep-PMK上，得到重组质粒Yep-PMKU
⑤以出发菌株RY1总DNA为模板，PCR扩增出PEP4基因的下游序列MD；
上游引物PB-U：TAGTCGACCTGCAGGCATGCGCTAAACTTTTCTTACTTCTCCGCC(SEQ ID NO:11)
下游引物PB-D：CCAGTGCCAAGCTTGCATGCTCACTACTTTCACATCTTCTTTCG(SEQ IDNO:12)
划线部分为酶切位点；
PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；52℃1min；72℃80s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
将PCR产物连接到重组质粒Yep-PMKU上，得到重组质粒Yep-PMKZ。图2为重组质粒的验证电泳图。
(2)敲除单个PEP4拷贝同时过表达MRL1基因
基因盒MU-KanMX-PGK1p-MRL1-PGK1t-MD片段与酵母基因组重组过程如图3所示。
以重组质粒Yep-PMKZ为模板，PCR扩增获得长达7017bp的含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子、强启动子PGK1p-PGK1t、MRL1基因及KanMX抗性标记的重组盒MU-KanMX-PGK1p-MRL1-PGK1t-MD，用醋酸锂转化法将其转化入出发菌株RY1中，通过同源重组后获得敲除单个PEP4拷贝的同时过表达MRL1基因的重组菌株RPMKZ，并保存菌株。
将重组菌株RPMKZ进行PCR验证，以重组菌株RPMKZ的基因组为模板，YZM-S/YZM-X为引物进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；53℃1min；72℃100s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，可得到1720bp的特异性条带，而出发菌株基因组不能扩增出片段。以重组菌株RPMKZ的基因组为模板，YZM-XS/YZM-XX为引物进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；53℃1min；72℃2min，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，可得到2077bp的特异性条带，而以出发菌株基因组为对照不能扩增出片段。结果表明，在酵母基因组中实现了单个PEP4基因的敲除。图4为重组菌株RPMKZ验证电泳图。
重组菌株RPMKZ的两对特异性验证引物：
上游引物YZM-S：AAAGGGTAATGGTAGGTT(SEQ ID NO:13)
下游引物YZM-X：CAAGACTGTCAAGGAGGG(SEQ ID NO:14)
上游引物YZM-SX：CGACGACGAGTTACACGACATA(SEQ ID NO:15)
下游引物YZM-XX：ATCTTGAGGTGCCGTTCTTTAC(SEQ ID NO:16)
实施例2：胞内外蛋白酶A活力的比较
对酵母菌株RY1和RPMKZ两株菌进行啤酒发酵实验。发酵结束后，取发酵液离心收集菌体，经细胞破壁处理后测定胞内蛋白酶A活力，同时测定发酵液的胞外蛋白酶A活力，结果如表1。通过观察发现，单个PEP4基因缺失的同时过表达MRL1基因的重组菌株RPMKZ的胞内酶活跟出发菌株相差不大，但是胞外酶活降低到出发菌株的54％。这是由于虽然敲除了一个PEP4基因的拷贝使蛋白酶A的表达总量有所降低，但是在敲除PEP4的基础上过表达液泡分选受体基因MRL1可以使分选到胞内的蛋白酶A量相应增加，弥补因敲除PEP4的一个拷贝造成的胞内蛋白酶A的减少，同时使分泌到胞外的蛋白酶A的量进一步降低。
表1 重组菌株和出发菌株胞内外PrA的比较
实施例3：发酵性能-α-氨基氮变化的比较
α-氨基氮是酵母生长代谢的主要氮源，本研究考察了酵母菌株RY1和RPMKZ两株菌对α-氨基氮同化代谢的差异。如图5所示，从主发酵开始，发酵液中的α-氨基氮浓度均呈明显降低的趋势，在发酵末期，α-氨基氮的变化趋势趋于平稳。这是因为在主发酵期，酵母生长代谢要利用大量的α-氨基氮，故而同化吸收的速率很快。而在发酵末期，酵母数量达到稳定值，α-氨基氮的同化速度也趋于平稳。研究表明两株菌在啤酒发酵过程中α-氨基氮的浓度变化没有太大差异，但是发酵末期两株菌发酵液的α-氨基氮浓度有所上升，这是由发酵末期会出现酵母自溶，酵母细胞内的α-氨基氮外泄导致发酵液α-氨基氮浓度的升高，同时大量的蛋白酶A也会外泄到胞外，影响泡沫稳定性，所以必须在此之前分离酵母。
实施例4：发酵性能-耗糖速率的比较变化的比较
耗糖速率是评价酵母活性的一个重要参考指标。绘制酵母菌株的耗糖曲线可以确定该菌株的发酵速度，从而判断其是否已丧失应有的发酵能力。一般情况下，要求啤酒酵母发酵速度越快越好。因为发酵速度快的菌株不但容易在麦汁中形成生长优势，酒龄短，pH降低快，在生产中不易污染杂菌，而且有利于提高啤酒的非生物稳定性。如图6所示，在整个发酵过程中，酵母菌株RY1和RPMKZ两株菌的耗糖速率基本没有明显差异。在发酵旺盛期，耗糖速率比较快，因为此时酵母生长代谢速率比较旺盛，对碳源的消耗比较大。发酵末期酵母生长代谢平稳，对碳源需求降低，耗糖曲线趋于平稳。
实施例5：发酵性能-残糖和酒精度的比较
发酵结束以后，我们测定了酵母菌株RY1和RPMKZ两株菌的残糖和酒精度这两个发酵指标。如表2所示，敲除PEP4单拷贝同时过表达MRL1基因的重组菌株RPMKZ跟出发菌株相比，基本没有明显差异。这是由于过表达MRL1基因会增强蛋白酶A向液泡分选的效率，进而不会影响胞内蛋白酶A活力，所以不会影响酵母的发酵特性。
表2 重组菌株和出发菌株残糖和酒精度的比较

Claims (9)

1.一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述方法是在酿酒酵母出发菌株中敲除蛋白酶A编码基因即PEP4基因的一个等位基因的同时过表达编码液泡分选受体的MRL1基因。
2.如权利要求1所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，构建步骤如下：
(1)将强启动子PGK1p-PGK1t片段插入到表达载体上，再将MRL1基因插入到启动子PGK1p和终止子PGK1t之间，然后将KanMX抗性标记插入表达质粒，在此基础上将含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子插入质粒，最终得到重组质粒；
(2)以重组质粒为模板扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子、强启动子PGK1p-PGK1t、MRL1基因及KanMX抗性标记的重组片段，将重组片段化转入出发菌株中，得到敲除单个PEP4拷贝的同时过表达MRL1的重组菌株。
3.如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，构建步骤如下：
(1)重组质粒的构建
①以质粒pPGK1为模板，扩增其上的强启动子片段PGK1p-PGK1t，并连接到表达载体上；
②以出发菌株的总DNA为模板，扩增出MRL1基因片段，并将其插入到(1)-①所构建质粒的启动子PGK1p和终止子PGK1t之间；
③以含有Amp+抗性的穿梭质粒为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因，并将其插入到(1)-②所构建的质粒上；
④以出发菌株的总DNA为模板，PCR扩增出PEP4基因的上、下游序列，并将其连接到(1)-③所构建的质粒上，最终获得重组质粒；
(2)敲除PEP4同时过表达MRL1基因
①以步骤(1)中的重组质粒为模板，扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子，强启动子，MRL1基因及KanMX抗性标记的重组片段；
②用醋酸锂转化法将(2)-①中的重组片段转化入出发菌株中，得到敲除单个PEP4拷贝的同时过表达MRL1基因的重组菌株。
4.如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述PEP4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1；所述MRL1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2。
5.如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RY1，编号CGMCC No 2.1525。
6.如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述表达载体为YEP352质粒。
7.如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述穿梭质粒为pUC6质粒。
8.一株低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株由权利要求1或2所述的方法构建，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RY1，编号CGMCC No 2.1525，所述表达载体为YEP352质粒，所述穿梭质粒为pUC6质粒。
9.权利要求8所述的低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株在啤酒生产中的应用。
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