CN108913755B - 用于检测影响啤酒酵母蛋白酶a基因表达量的发酵条件的多重引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种用于检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的多重引物、试剂盒及检测方法，属于食品检测领域，能够解决传统的通过测定蛋白酶A活力来检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件时存在的耗时长、检测过程繁琐、检测周期长的问题。该技术方案包括多重引物的设计、以不同发酵条件下提取得到的酵母菌株总RNA为模板依次进行反转录合成cDNA模板、多重PCR扩增反应、毛细管电泳分离，并利用GeXP系统对毛细管电泳分离结果进行分析；以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶A基因的表达量，并根据蛋白酶A基因的表达量判断影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测领域，尤其涉及用于检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的多重引物、试剂盒及筛选方法。
背景技术
洁白细腻而持久的泡沫是优质啤酒的重要标志之一，泡沫的持久性用泡持性指标来衡量，国标中规定了优级啤酒的泡持性标准，瓶装酒≥180秒，听装酒≥150秒。蛋白质是构成啤酒泡沫的骨架成分，泡持的衰减主要是由于蛋白质被蛋白酶A破坏导致的。蛋白酶A来源于啤酒酵母，当酵母自溶时就会被释放出来，逐渐分解发酵液内的疏水性蛋白质或者改变疏水性蛋白质的特性，从而影响发酵液的泡持性。通过合理的调整麦汁配方及工艺参数能够降低啤酒发酵过程中酵母蛋白酶A基因表达量，降低蛋白酶A的活力，从而达到提高啤酒品质的效果。因此，提供一种用于检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的手段具有非常重要的意义。
目前，主要通过测定蛋白酶A活力的方式检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件。但是，该检测方法检测的是酵母分泌到胞外后的蛋白酶A含量，有很大的滞后性，不能实时反映酵母细胞内蛋白酶的变化，而且该检测方法耗时长，检测过程繁琐，检测之前需要将酵母菌株进行发酵试验，检测周期长。
发明内容
本申请针对通过测定蛋白酶A活力检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件时具有滞后性、耗时长、检测过程繁琐、检测周期长的问题，提出了一种用于检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的多重引物、试剂盒及筛选方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测影响啤酒酵母蛋白酶A 基因表达量的发酵条件的多重引物，包括根据酵母蛋白酶A关键基因PEP4 的同源基因PEP4-Sc和PEP4-Sb分别设计特异性上下游引物，具体包括：
本发明还提供了一种试剂盒，包含如上述技术方案所述的用于检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的多重引物。
本发明还提供了一种利用如上述技术方案所述的多重引物检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的方法，包括以下步骤：
以不同发酵条件下提取得到的酵母菌株总RNA为模板依次进行反转录合成cDNA模板、多重PCR扩增反应、毛细管电泳分离，并利用GeXP系统对毛细管电泳分离结果进行分析；
以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶A基因的表达量，以此判断影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件。
作为优选，所述内参基因包括ACT1的同源基因ACT1-Sc、ACT1-Sb，根据内参基因设计特异性上下游引物，具体包括：
作为优选，以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶A基因的表达量的具体计算方法为：
PEP4-Sc基因表达量＝PEP4-Sc峰面积/(ACT1-Sc峰面积+ACT1-Sb峰面积)/2。
作为优选，所述不同发酵条件包括不同的麦汁配方，具体包括，调整影响蛋白酶A基因表达的关键氨基酸谷氨酸及组氨酸的含量，使谷氨酸含量在130-150mg/L，组氨酸含量在100-125mg/L。
作为优选，所述不同发酵条件还包括不同的啤酒发酵工艺参数，具体包括，调整酵母活力、酵母死亡率及酵母代数，使酵母活力为40-80mmol H+/min，酵母死亡率为0-0.2％，酵母代数为1-4代。
作为优选，以酵母菌株总RNA为模板、以序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.8所示的下游引物为特异性引物反转录合成cDNA模板第一链；以合成的cDNA模板第一链为模板、以序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的上游引物为特异性引物进行多重PCR扩增反应。
作为优选，所述反转录合成cDNA模板的反应参数设置为：48℃，1min； 42℃，60min；95℃，5min。
作为优选，所述多重PCR扩增反应的参数设置为：95℃预变性10min； 94℃变性30s；退火温度55℃，30s；70℃延伸1min，整个PCR扩增反应过程循环35次。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、通过检测酵母蛋白酶A基因表达量，能够快速、准确地检测出影响啤酒发酵过程中酵母蛋白酶A基因表达量低的发酵条件，有利于优化啤酒发酵工艺，提高啤酒品质。
2、采用GeXP多功能遗传分析系统，能够快速、准确、高通量地检测酵母蛋白酶A关键基因的表达量，具有更强的特异性、灵敏性、自动化程度等特点，保证了结果的可靠性和可重复性。
附图说明
图1为实施例1中的酵母蛋白酶A关键基因及内参基因的多重扩增产物电泳结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种快速检测工业巴氏酵母蛋白酶A基因的方法，包括总RNA的提取、反转录反应制备cDNA模板、多重PCR反应、毛细血管电泳、产物片段分析。
(1)多重引物设计
根据工业巴氏酵母蛋白酶A基因PEP4-Sc，PEP4-Sb以及内参基因 ACT1-Sc、ACT1-Sb的全长序列，设计适用于GeXP检测的特异性上下游多重引物(表1)。
表1工业巴氏酵母蛋白酶A基因以及内参基因的特异性上下游引物
(2)总RNA提取与纯化
按照RNA提取试剂盒的流程，逐步操作，提取酵母RNA。
向样品中加入200μL磷酸缓冲液，12000rpm离心，去上清。加入200μL 磷酸缓冲液重悬再加入20μL溶壁酶，30℃处理45min；
加入600μL裂解液，1mL裂解液中加入10μL 2-巯基乙醇，12000rpm 室温离心2min，转移上清至RNase-free的离心管中；
加入587μL无水乙醇，充分涡旋。取500μL到柱子，12000rpm离心 15s；
加入700μL洗涤缓冲液I，12000rpm离心15s。加入500μL洗涤缓冲液II，12000rpm离心15s；
加入30μL 80℃的RNase-Free水，室温12000rpm离心2min；
加入2μL DNase I于37℃处理40min，加入2μL DNase失活剂于室温放置5min，12000rpm离心2min，即可得到纯化的总RNA，立即检测浓度，-80℃冰箱保存；
RNA纯度测定：如果测定的OD260/280在1.8-2.1之间，即可用于后续实验，否则重新提取。
(3)反转录反应制备cDNA模板
以酵母总RNA为模板合成cDNA第一链，表1中多重引物的下游引物为特异性引物。
反转录反应制备cDNA模板反应参数设置如下：
48℃，1min；42℃，60min；95℃，5min。
(4)多重PCR反应
以上述合成的cDNA第一链为模板，表1中多重引物的上游引物为特异性引物，进行多重PCR扩增反应。
PCR扩增参数设置如下：
95℃预变性10min；94℃变性30s；退火温度55℃，30s；70℃延伸1min，整个PCR扩增反应过程循环35次。
(5)多重PCR产物毛细管电泳
取1μL PCR多重产物加到分装有39μL的95％去离子甲酰胺(SLS)和 400bp Marker混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油。另外在缓冲液板每孔中加入250μL的分离缓冲液。全部准备完后，上机进行毛细管电泳。分离胶、分离缓冲液购自BeckmanCoulter。
(6)产物片段分析
按照GeXP多功能遗传分析系统的检测流程进行蛋白酶A基因表达量的检测：首先进行毛细管电泳分离，结果见图1，利用GeXP系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果。每个峰均表示相应的基因，每个峰的面积对应着基因的表达量，其中每个峰的峰面积结果见表2。根据蛋白酶A基因大小、内参基因大小、系统对照大小查找其对应的峰面积。系统对照的峰图代表了毛细管电泳结果是否正常。
表2蛋白酶A关键基因和内参基因对应的峰面积结果
| 序号 | 基因名称 | 峰面积 |
| 1 | PEP4-Sc | 53356 |
| 2 | PEP4-Sb | 18267 |
| 3 | ACT1-Sc | 5081 |
| 4 | ACT1-Sb | 2938 |
(7)以内参基因为对照，计算蛋白酶A基因的表达量。
PEP4-Sc基因表达量＝PEP4-Sc峰面积/(ACT1-Sc峰面积+ACT1-Sb峰面积)/2
PEP4-Sb基因表达量＝PEP4-Sb峰面积/(ACT1-Sc峰面积+ACT1-Sb峰面积)/2
计算得到PEP4-Sc基因表达量为13.31，PEP4-Sb基因表达量为4.56，由于Sc来源的蛋白酶A基因表达量远高于Sb来源的基因表达量，且其表达量在不同条件下的波动较大，受外界环境影响大，表明Sc来源的蛋白酶A基因在酵母菌株中起主导作用，因此以Sc来源的蛋白酶A基因表达量来代表啤酒发酵过程中酵母蛋白酶A基因表达量。
实施例2
取A工厂和B工厂的麦汁和对应的同时期发酵液，分析麦汁中谷氨酸、组氨酸含量，记录酵母活力、酵母死亡率和酵母代数情况，以实施例1所述的方法测定发酵液中酵母的蛋白酶A基因表达量。实验结果如表3：
表3A工厂和B工厂发酵液中酵母的蛋白酶A基因表达量结果
由上述实验结果可以发现，通过调整麦汁配方，调整啤酒发酵工艺参数，可以有效降低发酵液中酵母的蛋白酶A基因表达量，从而提高啤酒泡持性，提升啤酒品质。同时，采用本发明所述的多重引物检测酵母蛋白酶A基因表达量，能够快速、准确地反映蛋白酶A在酵母细胞内的变化情况，从而准确判断影响酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件，对于提高啤酒泡持性，提升啤酒品质具有重要意义。
。
序列表
<110> 青岛啤酒股份有限公司
<120> 用于检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的多重引物、试剂盒及检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<212> DNA
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<400> 8
gtacgactca ctatagggaa ttccgactcg tccaacatc 39
Claims (4)
1.一种利用多重引物检测影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以不同发酵条件下提取得到的酵母菌株总RNA为模板依次进行反转录合成cDNA模板、多重PCR扩增反应、毛细管电泳分离，并利用GeXP系统对毛细管电泳分离结果进行分析；
以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶A基因的表达量，以此判断影响啤酒酵母蛋白酶A基因表达量的发酵条件；
所述多重引物包括根据酵母蛋白酶A关键基因PEP4的同源基因PEP4-Sc和PEP4-Sb分别设计特异性上下游引物，具体包括：
所述内参基因包括ACT1的同源基因ACT1-Sc、ACT1-Sb，根据内参基因设计特异性上下游引物，具体包括：
以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶A基因的表达量的具体计算方法为：
PEP4-Sc基因表达量＝PEP4-Sc峰面积/(ACT1-Sc峰面积+ACT1-Sb峰面积)/2；
所述不同发酵条件包括不同的麦汁配方，具体包括，调整影响蛋白酶A基因表达的关键氨基酸谷氨酸及组氨酸的含量，使谷氨酸含量在130-150mg/L，组氨酸含量在100-125mg/L；
所述不同发酵条件还包括不同的啤酒发酵工艺参数，具体包括，调整酵母活力、酵母死亡率及酵母代数，使酵母活力为40-80mmol H+/min，酵母死亡率为0-0.2％，酵母代数为1-4代。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以酵母菌株总RNA为模板、以序列SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的下游引物为特异性引物反转录合成cDNA模板第一链；以合成的cDNA模板第一链为模板、以序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5和SEQ ID NO.7所示的上游引物为特异性引物进行多重PCR扩增反应。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反转录合成cDNA模板的反应参数设置为：48℃，1min；42℃，60min；95℃，5min。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的参数设置为：95℃预变性10min；94℃变性30s；退火温度55℃，30s；70℃延伸1min，整个PCR扩增反应过程循环35次。
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