CN113473998A - 用于预防和/或治疗内脏痛的乳酸乳球菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于预防和/或治疗内脏痛的乳酸乳球菌的菌株或其细胞级分。
Description
技术领域
本发明涉及具有减轻疼痛，特别是内脏痛的能力的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株；这些菌株对于预防和/或治疗个体中的内脏痛是有用的。本发明还涉及这些乳酸乳球菌的菌株中的新菌株和含有它们的组合物。
背景技术
内脏痛是与内脏相关的疼痛，所述内脏包括身体的内部器官。此处，术语内脏包括从口腔到肛门的所有胃肠道。这些器官还包括例如心脏、肺、生殖器官、膀胱、输尿管、消化道器官，优选舌、腹部肠道、肝脏、胰腺、脾脏和肾脏。内脏痛的特征在于模糊、弥漫性、钝痛的酸痛，所述疼痛是局部性的，但可以具有向腹部和/或背部辐射的趋势。它可以伴有不适感，并且在严重时，它诱发强烈的自主神经现象，如出汗、血管舒缩应答、心动过缓、恶心和呕吐。它通常在身体的中线和深处感觉到。
存在其中可能出现腹痛或内脏痛的各种状况。例如，胰腺炎疼痛、产痛、来自与肠梗阻相关的腹部手术的疼痛、肠易激综合征中的疼痛、非溃疡性消化不良或痛经中的腹痛。同样地，肝痛、肾痛、上腹痛、胸膜痛和痛苦的胆绞痛、阑尾炎痛都可以被视为内脏痛。来自早期心肌梗塞的胸骨下疼痛或压力也是内脏的。进一步地，灼口综合征(BMS)是慢性特发性病症，其特征在于舌和其它口腔部位中的烧灼感或感觉迟钝，即使怀疑是胃起源，也没有明确的病因。这种BMS伴有口干、刺痛或味觉障碍。考虑到在BMS患者中鉴定的周围神经改变，一些临床试验已证实了局部GABA-A结合受体配体对BMS症状的功效(de Castro等人，2014)。胃、十二指肠或结肠的疾病可以引起内脏痛。引起内脏痛的通常遇到的胃肠道(GI)病症包括功能性肠紊乱(FBD)和炎性肠病(IBD)。这些GI病症包括目前只能适度控制的广泛范围的疾病状态，所述疾病状态就FBD而言包括胃食管反流、消化不良、肠易激综合征(IBS)和功能性腹痛综合征(FAPS)，并且就IBD而言包括克罗恩氏病、回肠炎和溃疡性结肠炎，所有这些都经常产生内脏痛。
根据罗马IV(Rome IV)标准，肠易激综合征(IBS)是一种病因不明的功能性胃肠道病症，影响大多数国家中10-20％的成人。IBS导致严重影响患者的生活质量的各种症状(Dean等人，2005)。已显示了应激是IBS的发作、维持和恶化中的重要因素(Chang等人，2011)，其导致显著的发病率和卫生保健成本。IBS是一种脑-肠轴的病症，并且临床症状包括腹痛和排便习惯中的变化(即便秘、腹泻)，而无结构异常(Camilleri等人，2012)。从30％到40％不等的IBS患者子集据报告显示出对结肠扩张的敏感性增强，这通过其响应结肠扩张对于疼痛的阈值降低、增加的感觉强度和/或夸大的内脏转诊(referral)是显而易见的(Mayer等人，1994，Mayer等人，2008，Bouin等人，2001，Zhou等人，2010)。因此，内脏超敏反应已提议作为负责由IBS患者经历的肠运动、胃气胀和腹痛症状的严重程度的关键临床标记物(Kuiken等人，2005，Posserud等人，2007，Camilleri等人，2008)。为了更好地理解IBS病理生理学，开发了模拟IBS特征的急性和慢性应激动物模型，所述IBS特征例如内脏敏感性和肠道通过时间中的变化(Gué等人，1997)。在大鼠中，与对直肠扩张的内脏超敏反应相关的急性束缚应激与促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的中枢释放相联系(Gué等人，1997)。目前用于这些病症(IBS和BMS)的药理学治疗迄今为止主要是症状驱动的，并且其功效一般较低(Craig等人，2018)。
根据前文显而易见的是需要用于预防和/或治疗内脏痛的药理学药剂的替代方案。
一些实验证据提示了，益生菌将是调节特别是IBS患者中的腹痛的有效治疗选项(Moayyedi等人，2010，Hungin等人，2013，Ford等人，2014，Didari等人，2015)；然而，由于所使用的益生菌菌株、这些菌株的混合物和剂量、以及治疗持续时间和IBS患者的亚型，临床结果在研究中相当大地不同(Mazurak等人，2015)。
最近，产生γ-氨基丁酸(GABA)的人肠道共生齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)，显示在内脏超敏反应的大鼠粪便滞留模型中调节感觉神经元活性(Pokusaeva等人，2017)。此外，大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Nissle 1917证实为产生C12AsnGABAOH脂肽，能够抑制小鼠中的内脏敏感性(Pérez-Berezo等人，2017)。然而，没有给出益生菌本身的功效的证据，仅显示了C12AsnGABAOH脂肽的镇痛性质。
因此，鉴定减轻内脏痛并且易于以低生产成本生产的新治疗方法仍然是有用的。
发明内容
在此背景下，本发明人集中于乳酸菌乳酸乳球菌的研究。虽然乳酸乳球菌乳酸亚种菌株已知在体外产生GABA(Nomura等人，1999)，并且理论上，能够在遗传上表达5'-磷酸吡啶醛(PLP)依赖性酶谷氨酸脱羧酶(GAD)，所述酶转换GABA中的谷氨酸盐，由于未知的原因，其表达GAD和产生GABA的有效能力是非常偶然的。事实上，本发明人显示了，尽管乳酸乳球菌NCDO2727和NCDO2118菌株之间涉及GABA生物合成的gad操纵子的强相似性，但在相似培养条件下的GABA生产是非常不同的，具有通过NCDO2727菌株产生的极弱量的GABA(图2A中始终低于0.2mM的GABA浓度)。以同样的方式，在NCDO2118菌株中获得了高GAD活性，而在NCDO2727菌株中，所述量极低(表3)。
乳制品中经常遇到的乳酸乳球菌是摄入最多的细菌之一(Mills等人，2010，Laroute等人，2017)。这种细菌通常在乳制品例如干酪或发酵乳制品包括发酵乳中发现。
尽管不被视为共生细菌，但发现取决于所研究的菌株，乳酸乳球菌在肠道中短暂存在(Wang等人，2011，Radziwill-Bienkowska等人，2016，Zhang等人，2016)。
本发明人鉴定了能够在少于或等于24小时的培养时间内产生大量GABA，即至少10mM的γ-氨基丁酸(GABA)的新乳酸乳球菌的菌株，并且他们已显示了这些菌株具有令人惊讶和出乎意料的减轻内脏痛的能力。因此，这些乳酸乳球菌的菌株代表了用于预防和/或治疗内脏痛的新药剂。
此外，本发明人已证实了产生少量GABA的乳酸乳球菌的菌株NCDO2727并不具有这种有利性质。
相应地，本发明的一个目的是能够在少于或等于24小时的培养时间内，产生至少10mM的γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸乳球菌的菌株，用于预防和/或治疗个体中的内脏痛。
优选地，本发明的乳酸乳球菌的菌株能够在少于或等于24小时的培养时间内，产生至少10mM的GABA，更优选20mM的GABA，还更优选40mM的GABA且最优选至少60mM的GABA(图2A)。
可以通过在发酵罐中在补充有谷氨酸盐、精氨酸、葡萄糖和NaCl的培养基M17中培养乳酸乳球菌的菌株，来评价产生GABA的能力。在培养的最初几个小时内，pH维持在6.6下，GAD被诱导并累积。在培养7-8小时时，收集菌株用于个别处理，然后pH降低到4.6以定量GABA生产率。GABA的浓度随着时间过去进行测量直至24小时。
允许本发明的乳酸乳球菌的菌株生长和GAD表达诱导的培养基的制备和培养条件的定义是本领域技术人员众所周知的；这种培养基可以适于每种特定的乳酸乳球菌的菌株；例如，对于菌株CNCM I-5388，向基础M17培养基中加入精氨酸和NaCl已证明诱导GAD的表达；在不添加任何特定化合物的这种M17培养基上培养时，其它菌株例如CNCM I-5386能够以类似于NCDO2118的水平增强GAD表达。
根据本发明的个体是哺乳动物或鸟类；例如，个体可以是来自家畜育种的动物，例如家禽或宠物；根据一个具体实施例，个体是人。
优选地，本发明的乳酸乳球菌的菌株的特征在于，在7小时至8小时的培养时间内，通过所述菌株产生的5'-磷酸吡啶醛(PLP)依赖性酶谷氨酸脱羧酶(GAD)的活性为至少20微摩尔/min.mg蛋白质。
优选地，在7小时至8小时的培养时间内，通过本发明中的乳酸乳球菌的菌株产生的GAD的活性为至少20微摩尔/min.mg蛋白质，更优选40微摩尔/min.mg，还更优选60微摩尔/min.mg，并且以至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700微摩尔/min.mg，且最优选至少820微摩尔/min.mg的渐增次序。
优选地，本发明的乳酸乳球菌的菌株的特征在于，在8.5小时至11.5小时的培养时间内，通过所述菌株在pH 4.6下的GABA生产率为至少1毫摩尔/h/g的细胞干重。
优选地，在8.5小时至11.5小时的培养时间内，在本发明中的GABA比生产率为至少1毫摩尔/h/g的细胞干重，更优选3毫摩尔/h/g的细胞干重，且最优选至少7毫摩尔/h/g的细胞干重。
用于评价GAD活性的方法是本领域已知的，如实施例1中所示。GABA生产率是在8.5小时和11.5小时之间计算的比速率(平均值)。
本发明中的乳酸乳球菌的菌株可以选自由CNCM I-5388、CNCM I-5386和NCDO2118组成的组，优选CNCM I-5388和CNCM I-5386，且更优选地，所述乳酸乳球菌的菌株是菌株CNCM I-5388。
菌株CNCM I-5388和CNCM I-5386根据布达佩斯条约保藏于CNCM(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes，25rue du Docteur Roux，Paris)，CNCM I-5386保藏于2018年11月29日，并且CNCM I-5388保藏于2018年12月13日。
本发明的乳酸乳球菌的菌株在预防或治疗内脏痛方面是特别有利的。
本发明的乳酸乳球菌的菌株的预防和治疗效应在游离谷氨酸盐的存在下获得；例如，游离谷氨酸盐的量为约4mg/109cfu乳酸乳酸菌/每天，或约17mg/kg bw/天。
如实施例2中所证实的，游离谷氨酸盐本身并不对基础和应激诱导的结肠直肠活动产生任何有益或不利的作用。
取决于大陆和饮食文化，经典饮食提供不同水平的游离谷氨酸盐(游离谷氨酸盐的平均人群摄入量范围为5.5mg/kg bw/天(奥地利的老人)至37mg/kg bw/天(比利时的幼儿)；对于比利时的其它儿童，高水平摄入量范围高达82mg/kg bw/天，对于丹麦婴儿为77mg/kg bw/天，且对于保加利亚的其它儿童为56mg/kg bw/天；此外，来自天然游离谷氨酸盐和饮食蛋白质，成人可以摄入81至155mg/kg bw/天的范围。David R.Tennant，Ann.Nutr.Metab.2018；73:21-28)。因此，根据这些数据，本发明人认为本发明的乳酸乳球菌的菌株可以单独施用，即无需添加游离谷氨酸盐，以实施腹痛或内脏痛的有效预防或减轻。
可替代地，在不含游离谷氨酸盐的饮食或游离谷氨酸盐尤其贫乏的饮食的情况下，本发明的乳酸乳球菌的菌株可以连同游离谷氨酸盐一起施用。相应地，在一个具体实施例中，本发明的另一个目的是本发明的乳酸乳球菌的菌株与介于10至20mg/kg bw/天，特别是17mg/kg bw/天的游离谷氨酸盐的组合，用于预防和/或治疗个体中的内脏痛。
对于本发明的不同方面，内脏痛可以由损伤、感染、炎症、疾病或者热刺激、机械刺激、电刺激、化学刺激或放射性刺激引起。
本发明中的内脏痛特别是在慢性腹部和骨盆疼痛病症中观察到的那些，所述病症包括肠易激综合征(IBS)以及灼口综合征(BMS)。IBS患者显示出对激惹性刺激(即直肠扩张)的应答阈值显著降低，抱怨在正常器官功能期间的敏感性增加，以及在扩大的躯体(腹部)转诊区域中存在的触痛增加(即，内脏和躯体过敏反应两者)。功能性内脏(胃肠道)病症起因于改变的中枢神经系统处理和/或失调的中枢调节。在这个事件级联中，位于背根神经节(DRG)中的初级传入伤害感受器的内脏输入负责疼痛感知中的变化。然而，所有慢性疾病，如肝炎、消化性溃疡、IBD(克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、其中腹痛和/或背痛是主诉的IBS，并且所有感知感觉都由外周感觉(传入)神经元中的活性启动(Keszthelyi D.等人，2012)。关于灼口综合征(BMS)，其为影响美国超过100万人的重要慢性疼痛病症(Miziara等人，2009)。BMS的特征在于涉及唇和舌(主要是尖端和前面三分之二)的阳性(灼痛、味觉障碍和感觉迟钝)和阴性(味觉丧失和感觉异常)感觉症状两者。BMS可以分类成三种类型(Sun等人，2013)。在1型中，患者在清醒时没有疼痛，但随着时间的推移，经历增加的症状。在2型中，患者具有整天的持续疼痛；这种类型占55％的患者，并且具有与心理障碍的最强相关(Coculescu等人，2014)。在3型中，患者具有间歇性症状，具有在白天的无痛期。此外，这些BMS患者经常患有抑郁、焦虑，有时患有糖尿病，且甚至患有营养/矿物质缺乏症。
根据本发明的一个实施例，内脏痛由胃肠道病症引起，所述胃肠道病症例如肠易激综合征或灼口综合征，其特征在于在不存在潜在牙齿或医学原因的情况下的口腔粘膜灼伤。功能性和器质性消化不良、麻醉性肠综合征、IBD、结肠癌、慢性胰腺炎、憩室炎、阑尾炎、卵巢囊肿也是这种情况。
已知内脏痛在各种心理学应激条件下(急性和慢性)增加。
急性部分束缚应激增加内脏敏感性(超敏反应)，并且还降低敏感性的阈值(异常性疼痛)。
根据本发明的一个实施例，当内脏痛与心理学应激事件和/或焦虑相联系时，本发明中的乳酸乳球菌的菌株是有用的。心理学应激事件和/或焦虑的模型是急性部分束缚应激(PRS)。
PRS被视为轻度非致溃疡模型(Williams等人，1987)，并且由用乙醚的轻度麻醉组成，所述轻度麻醉约束动物的身体运动。为此，将动物的上前肢用胶带粘在胸干上，以便在2小时内约束动物的身体运动。然后将大鼠放回其饲养笼中。在大鼠中，PRS通过以下反映：与对直肠扩张的内脏超敏反应相关的促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮血浆浓度中的增加(Sun等人，2006)，所述直肠扩张与促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的中枢释放相联系(Gue等人，1997)，以及肠道通透性中的增加(Ait-Belgnaoui等人，2005)。
事实上，本发明人显示了，产生高水平GABA的乳酸乳球菌NCDO2118预防急性应激大鼠模型中的内脏超敏反应，而产生低水平GABA的乳酸乳球菌NCDO2727不能诱导这种效应。
进一步地，不能产生GABA的NCDO2118ΔgadB突变株未能预防同一模型中的内脏超敏反应。
在本发明的一个方面，本发明的乳酸乳球菌的菌株的特征在于通过这些菌株产生的效应从与心理学应激事件和/或焦虑相联系的内脏痛治疗的10天开始，更优选从7天开始，还更优选从5天开始，且最优选从4天开始获得。
事实上，本发明人显示了，通过CNCM I-5388产生的有益效应从与急性应激相联系的内脏痛治疗的5天开始获得，而通过NCDO2118产生的效应从这种治疗的10天开始获得。
本发明的另一个方面是如上定义的乳酸乳球菌的菌株，用于预防和/或治疗由于灼口综合征(BMS)的内脏痛。
本发明的一个目的还是从如上定义的乳酸乳球菌的菌株获得的细胞级分，用于预防和/或治疗内脏痛，且特别是用于预防和/或治疗与心理学应激事件和/或焦虑相联系的内脏痛。
所述细胞级分特别是含有从本发明的乳酸乳球菌的培养物获得的细菌酶，尤其是GAD的制剂。它还可以是这些菌株的培养上清液或级分。细胞级分可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备。以非限制性方式，这些方法一般包括在培养后裂解所获得的细菌的步骤，以及特别是通过离心或过滤，从裂解步骤后获得的总裂解物中分离含有所述细菌的膜的级分的步骤。
本发明的另一个方面是从如上定义的乳酸乳球菌的菌株获得的细胞级分，用于预防和/或治疗由于灼口综合征(BMS)引起的内脏痛。
本发明的一个目的还是用于预防和/或治疗内脏痛的组合物，其包含根据本发明的乳酸乳球菌的菌株或根据本发明的细胞级分和任选的游离谷氨酸盐，优选量为介于10至20mg/kg bw/天，特别是17mg/kg bw/天。
在本发明的组合物中，所述菌株可以以整个细菌的形式使用，所述整个细菌可以是活的或死的。可替代地，所述菌株可以以细菌裂解物的形式使用。优选地，细菌细胞作为活的存活细胞存在。
本发明的组合物可以是适合于施用特别是经口施用的任何形式。这包括例如固体、半固体、液体和粉末。
当细菌是活细菌的形式时，每天给予的组合物可以包含根据本发明的乳酸乳球菌的菌株的含量，该含量允许施用至少106个菌落形成单位(cfu)，优选至少107cfu，还更优选至少108cfu，且最优选至少109cfu的所述乳酸乳球菌的菌株。
本发明的另一个方面是包含根据本发明的乳酸乳球菌的菌株或根据本发明的细胞级分的组合物，用于预防和/或治疗由于灼口综合征(BMS)引起的内脏痛。
本发明的一个目的还是用于预防和/或治疗内脏痛的方法，其包括向有此需要的哺乳动物施用治疗量的如上定义的本发明的乳酸乳球菌的菌株或本发明的细胞级分。治疗量的确定是本领域技术人员众所周知的，尤其是考虑到本文提供的详细公开内容。
本发明的一个目的还是如上定义的本发明的乳酸乳球菌的菌株或本发明的细胞级分用于制备用于预防和/或治疗内脏痛的药物中的用途。
如本文使用的，治疗或预防尤其包括：预防和/或减少内脏痛。
本发明的组合物可以是药物组合物或营养组合物，包括食物产品如食物补充剂和功能性食物。食物产品包含乳制品和发酵乳制品。
药物组合物可以以经口形式，例如片剂、胶囊、粉末、糖浆剂、泡腾组合物和喷雾剂。所述药物组合物还可以以舌下和含服形式，例如在舌下施用的舌下片剂和溶液组合物以及置于颊和牙龈之间的含片。
食物补充剂指定由化合物制成的产品，所述化合物通常用于粮食中，但以片剂、粉末、胶囊、饮剂或通常与滋养品(aliments)无关的任何其它形式，并且对个人的健康具有有益效应。
功能性食物是对个人的健康也具有有益效应的食物。特别地，食物补充剂和功能性食物可以具有针对疾病或疼痛的保护性或治愈性生理效应。
组合物可以以液体形式或以通过使液体干燥获得的干粉形式存在。
在一个优选的实施例中，产品是新鲜产品。未经历严格热处理步骤的新鲜产物具有存在的细菌菌株以活的形式存在的优点。
本发明人还鉴定了具有先前讨论的特定能力的两种新的乳酸乳球菌的菌株。
因此，本发明还提供了乳酸乳球菌的菌株，其特征在于所述菌株选自由CNCM I-5388、CNCM I-5386组成的组。
本发明还包括从选自以下项组成的组的乳酸乳球菌的菌株获得的细胞级分：CNCMI-5388、CNCM I-5386。
本发明还提供了包含如上定义的所述乳酸乳球菌的菌株或如上定义的所述细胞级分的组合物。
所述组合物中每克组合物的干重可以包含至少106个菌落形成单位(cfu)，优选至少107cfu，更优选至少108cfu，且最优选至少109cfu。
如上定义的组合物可以是药物组合物或营养组合物，包括如上定义的食物产品。
所述组合物可以以液体形式或以通过使液体干燥获得的干粉形式存在。
在一个优选的实施例中，产品是新鲜产品。
本发明的一个目的涉及药物组合物，其包含如上定义的乳酸乳球菌的菌株或细胞级分和药学上可接受的溶媒；任选地，所述组合物还包含游离谷氨酸盐。
在本发明的一个实施例中，如上定义的组合物用作药物。所述药物的制剂适于允许以喷雾剂或在舌下融解的片剂形式的局部治疗。
所述组合物可特别用于预防和/或治疗内脏痛。
本发明进一步涉及用于预防和/或治疗如上定义的内脏痛的治疗方法，其包括将如上定义的乳酸乳球菌的菌株或细胞级分或组合物施用于个体。
本发明还涉及任选地与游离谷氨酸盐结合的本发明的乳酸乳球菌的菌株或细胞级分，用于制备用于预防和/或治疗如上定义的内脏痛的药物。
附图说明
本发明根据下述进一步描述将得到更清楚地理解，所述进一步描述参考了说明本发明中的乳酸乳球菌的菌株用于减轻内脏痛能力的实例以及附图。
图1显示了不同菌株中的gad簇的组构。
图2显示了在补充有游离谷氨酸盐(8g/L)、精氨酸(5g/L)、葡萄糖(45g/L)和NaCl(300mM)的M17中，在乳酸乳球菌NCDO2118(方块)、CNCM I-5388(菱形)、CNCM I-5386(三角形)或NCDO2727(圆圈)的生长过程中的GABA生产(mM)(A)和生物量(g/L)的演变(B)。独立的一式两份(实心符号：第一个实验和空心符号：第二个实验)。
图3显示了在CRD的所有扩张压力(从15到60mmHg)下，游离谷氨酸盐(饮食中的2mg以及与乳酸乳球菌共施用的2mg)的10天经口施用对溶媒治疗的大鼠的PRS诱导的结肠直肠敏感性的作用。数据表示为平均值±SEM(对于“溶媒”组(空心方块，虚线)，n＝10；对于“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝10；对于“溶媒+游离谷氨酸盐”组(黑色圆圈，虚线)，n＝11；对于“PRS+溶媒+游离谷氨酸盐”组(黑色圆圈，实线)，n＝11)。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图4显示了在CRD的所有扩张压力(从15到60mmHg)下，乳酸乳球菌NCDO2118和乳酸乳球菌NCDO2727的10天经口施用对PRS诱导的内脏超敏反应的作用。数据表示为平均值±SEM(对于“溶媒”组(白色方块，虚线)和“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝9；对于“PRS+NCDO2118+游离谷氨酸盐”组(黑色三角形，实线)，n＝12；对于“PRS+NCDO2727+游离谷氨酸盐”组(黑色星形，实线)，n＝8)。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，***P<0.001。相对于用溶媒治疗的应激动物的值，+P<0.05；++P<0.01。
图5显示了在CRD的所有扩张压力(从15到60mmHg)下，乳酸乳球菌NCDO2118和乳酸乳球菌CNCM I-5388的5天或10天经口施用对PRS诱导的内脏超敏反应的作用。A.在5天时用乳酸乳球菌NCDO2118获得的结果。数据表示为平均值±SEM(对于“溶媒”组(白色方块，虚线)，n＝11，对于“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝11，并且对于“PRS+NCDO2118+游离谷氨酸盐”组(黑色三角形，实线)，n＝11)。**P<0.01相对于用溶媒治疗的动物的基础值显著不同。B.在5天时用乳酸乳球菌CNCM I-5388获得的结果。数据表示为平均值+SEM(对于“溶媒”组(白色方块，虚线)，n＝7；对于“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝7；对于“PRS+CNCMI-5388”组(黑色/白色菱形，点划线)和“PRS+CNCM I-5388+游离谷氨酸盐”(黑色菱形，实线)，n＝7)。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，*P<0.05；**P<0.01，C.在10天时用乳酸乳球菌NCDO2118获得的结果。数据表示为平均值+SEM(对于“溶媒”组(白色方块，实线)，n＝9；对于“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝9；对于“PRS+NCDO2118+游离谷氨酸盐”组(黑色三角形，实线)，n＝12；对于“PRS+NCDO2118”组(黑色/白色三角形，点划线)，n＝8)。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，***P<0.001。相对于用溶媒治疗的应激动物的值，+P<0.05；++P<0.01。D.在10天时用乳酸乳球菌CNCM I-5388获得的结果。数据表示为平均值±SEM(对于“溶媒”组(白色方块，虚线)，n＝7；对于“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝7；对于“PRS+CNCM I-5388”组(白色/黑色菱形，点划线)，n＝8，并且对于“PRS+CNCM I-5388+游离谷氨酸盐”(黑色菱形，实线)，n＝7)。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，**P<0.01。相对于用溶媒治疗的应激动物的值，+P<0.05。
图6显示了在CRD的所有扩张压力(从15到60mmHg)下，产生GABA的乳酸乳球菌NCDO2118和不产生GABA的NCDO2118ΔgadB突变体(109cfu/天)对PRS诱导的内脏超敏反应的作用。数据表示为平均值±SEM(对于“溶媒”组(白色方块，虚线)和“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝13；对于“PRS+NCDO2118+游离谷氨酸盐”组(黑色三角形，实线)，n＝14；对于“PRS+NCDO2118ΔgadB+游离谷氨酸盐”组(倒三角形，点划线)，n＝13)。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，**P<0.01；****P<0.0001。相对于用溶媒治疗的应激动物的值，++P<0.01；+++P<0.001。相对于用NCDO2118治疗的应激动物的值，$P<0.05。
图7显示了在CRD的所有扩张压力(从15到60mmHg)下，乳酸乳球菌CNCM I-5388的5天或10天经口施用对PRS诱导的内脏超敏反应的作用。A.在5天时用乳酸乳球菌CNCM I-5388获得的结果。数据表示为平均值±SEM(对于“溶媒”组(白色方块，虚线)，n＝10，对于“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝10，对于“PRS+CNCM I-5388”组(白色环形，实线)，n＝10，对于“PRS+CNCM I-5388+游离谷氨酸盐”组(黑色环形，实线)，n＝9，对于“PRS+CNCM I-5388+游离谷氨酸盐+抑制剂””组(白色斜方形，实线)，n＝9，对于“PRS+CNCM I-5388ΔgadB突变体+游离谷氨酸盐”组(黑色斜方形，实线)，n＝9。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001。相对于用溶媒治疗的应激动物的值，+++P<0.001。B.在10天时用乳酸乳球菌CNCM I-5388获得的结果。数据表示为平均值±SEM(对于“溶媒”组(白色方块，虚线)，n＝10，对于“PRS+溶媒”组(黑色方块，实线)，n＝10，对于“PRS+CNCM I-5388”组(白色环形，实线)，n＝9，对于“PRS+CNCM I-5388+游离谷氨酸盐”组(黑色环形，实线)，n＝9，对于“PRS+CNCM I-5388+游离谷氨酸盐+抑制剂””组(白色斜方形，实线)，n＝9，对于“PRS+CNCM I-5388ΔgadB突变体+游离谷氨酸盐”组(黑色斜方形，实线)，n＝9。相对于用溶媒治疗的动物的基础值，*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001。相对于用溶媒治疗的应激动物的值，+P<0.05；++P<0.01。
具体实施方式
实例1：目的细菌悬浮液的生理学表征
1.材料与方法：
1.1.细菌菌株、培养基和培养条件：
数据集由属于乳酸乳球菌乳酸亚种的四种菌株组成。两种菌株NCDO2118和NCDO2727从蔬菜中分离，而CNCM I-5388和CNCM I-5386具有乳起源(分别为生奶和乳清)。
在这些菌株中，涉及GABA生物合成的gad簇位于染色体上的kefA和rnhB基因之间(图1)。gad簇由分别编码操纵子调节物、谷氨酸盐/GABA逆向转运蛋白和谷氨酸脱羧酶的gadR、gadC和gadB组成。除了CNCM I-5386之外，相同的簇组构在这些菌株中得到保留。事实上，插入序列IS981的拷贝已在gadCB操纵子的启动子中发现。该插入序列含有向外的-35启动子组分，并且其在距天然-10框的正确距离处的插入可以修饰启动子的强度及其调控。gadR、gadC和gadB基因的核苷酸序列在4种菌株中是高度相似的，具有多于98％的同一性(图1)。
在补充有55mM(8g/L)游离谷氨酸盐、29mM(5g/L)精氨酸、250mM(45g/L)葡萄糖和300mM NaCl的培养基M17(表1)中，在2-L Biostat B-plus生物反应器(Sartorius，Melsungen，德国)中一式两份地执行细菌培养。培养物在30℃下进行温育。
表1：培养基M7的组成。
发酵在氧限制条件下进行，其中空气处于气相中，但不含气泡。通过KOH添加8小时将pH维持在6.6下，然后将pH修饰并且调控在4.6下。
培养物用来自在锥形瓶中在类似培养基上生长的预培养物的细胞进行接种，在指数期过程中收获并浓缩，以便获得发酵罐中在580nm处0.25的初始光密度(OD)。
细菌生长通过在580nm处的分光光度计测量进行估计(Libra S11，Biochom，1吸光度单位等价于0.3g/L)。
每30分钟收集样品，用于生长培养基中的GABA浓度的HPLC测量。
如下制备用于经口施用的细胞样品。在pH修饰之前收获细胞(即，对于NCDO2118和NCDO2727，在7小时)。
将大约3×1011个细胞所需的培养体积在5000g和4℃下离心10分钟，以使细菌细胞形成团块。
细胞用0.9％NaCl洗涤两次，并且悬浮于含有15％甘油的0.9％NaCl中至10×109cfu/mL的最终浓度，并且贮存于-20℃下直至使用。
1.2.GABA提取和定量：
通过HPLC(Agilent Technologies 1200Series，Waldbronn，德国)测量培养物上清液或酶测定的反应混合物中的GABA浓度。
在HPLC之前，通过向一体积的样品中加入四体积的甲醇来沉淀蛋白质。将混合物离心并且保存上清液用于HPLC分析。氨基酸由邻苯二甲醛(OPA)和9-芴甲基-氯甲酸酯(FMOC-C1)自动衍生。通过具有三乙胺(0.018％)、四氢呋喃(0.3％)和乙腈的乙酸盐缓冲液(pH 7.2)的线性梯度，在Hypersil AA-ODS柱(Agilent Technologies)上在40℃下分离衍生物。使用二极管阵列检测器，对于OPA衍生物在338nm处，且对于FMOC衍生物在262nm处。
1.3.谷氨酸脱羧酶(GAD)活性：
在培养7小时收获50mg细菌细胞。细胞用0.2％KCl洗涤两次，并且悬浮于含有4.5mM MgCl2、22％甘油和1.5mM DTT的乙酸钠缓冲液(100mM，pH 4.6)中。细胞通过超声处理(间隔开30s和60s的四个周期，6.5m/s)进行破坏，并且在处理过程中保持在冰上。通过在10,000g和4℃下离心15分钟去除细胞碎片。
上清液用于酶测定，并且通过Bradford法用牛血清白蛋白作为标准，确定提取物的蛋白质浓度。
酶测定用0.5mL底物溶液实现，所述底物溶液由20mM谷氨酸钠、2mM磷酸吡哆醛(PLP)组成，在30℃下温育，然后与0.5mL上清液混合。每30分钟直到4小时，取样100μL并且通过煮沸5分钟停止脱羧反应而失活。随后使用HPLC分析反应混合物中的GABA存在。
在7小时和中性pH条件下测量GAD活性。
一个酶活性单位在此处定义为每分钟和每mg蛋白质转换1微摩尔谷氨酸盐的酶量。
2.结果：
2.1.体外GABA生产：
对于NCDO2118、CNCM I-5388、CNCM I-5386和NCDO2727菌株，在整个培养过程中测量了生物量和GABA浓度(图2)。
在前8小时内，与NCDO2727相比，细菌NCDO2118以及CNCM I-5388、CNCM I-5386在pH 6.6下快速生长(生长率大约0.7-0.8h-1)。GABA对于所有菌株都以低水平累积。然后在8小时，将pH降低并控制在4.6，此后生长停止，且生物量减少。这种细胞活力的丧失通过铺平板得到确认。
尽管生长停滞，通过NCDO2118菌株或CNCM I-5388和CNCM I-5386的GABA生产继续，伴随增加的GABA生产率(表2)。对于CNCM I-5388，最大GABA浓度在24小时达到60mM。用生物反应器中的第二培养物(独立的一式两份)获得了类似的结果。40-60mM的GABA生产对应于在生物反应器内的初始浓度的游离谷氨酸盐的完全生物转换。
尽管所有四种菌株中的gad操纵子序列和组构的强相似性，但在相似培养条件下表征的NCDO2727菌株的GABA生产模式非常不同，具有产生的极弱量的GABA，因为GABA浓度始终低于0.2mM(图2A)且GABA生产率很低(表2)。
表2：在生物反应器(一式两份)中的乳酸乳球菌NCDO2118、CNCM I-5388、CNCM I-5386和NCDO2727的生长过程中，在7至11.5小时之间计算的GABA生产的特定速率(毫摩尔/g细胞干重/h)。
2.2.体外GAD活性：
在NCDO2118菌株中获得的高GAD活性与其高GABA生产能力一致，而在NCDO2727菌株中，该量极低(表3)。对于CNCM I-5386菌株获得了中等水平的GAD活性，而对于CNCM I-5388菌株测量到非常高的活性。然而，可以注意到，在7小时的中性pH条件下，尽管生物反应器中累积的低GABA生产，但NCDO2118菌株、CNCM I-5388或CNCM I-5386中的GAD活性很高，提示了用于GABA生产的酶促设备已经在细胞中表达但尚未激活。
| NCDO2118 | NCDO2727 | CNCM I-5388 | CNCM I-5386 | |
| GAD 7小时 | 42.7±5.9 | 0.6±0.4 | 826.2±93.0 | 20.7±4.3 |
表3：在补充有游离谷氨酸盐(8g/L)、精氨酸(5g/L)和NaCl(300mM)的M17中生长7小时后，乳酸乳球菌的菌株的特定GAD活性(微摩尔/min.mg蛋白质)(对于生物反应器中的两个培养物重复各自，n＝3)。
实例2：目的乳酸乳球菌的菌株在大鼠应激模型(模型IBS)中的效应
1.材料与方法：
1.1.动物和手术程序：
成年雌性Wistar大鼠(200-225g)购自Janvier Labs(Le Genest St Isle，法国)，并且在标准条件下(温度22±2℃和12小时光/暗循环)个别饲养在聚丙烯笼中。允许动物自由获取水和食物(标准丸粒2016，Envigo RMS SARL，Gannat，法国)。所有实验都通过当地动物护理和使用委员会(Local Animal Care and Use Committee)批准，符合欧洲指令2010/63/UE。
根据先前描述的技术(Morteau等人，1994)，在通过腹膜内施用0.6mg/kg乙酰丙嗪(calmivet，Vetoquinol，Lure，法国)和120mg/kg氯胺酮(Imalgene 1000，Merial，Lyon，法国)的全身麻醉下，动物准备用于腹部横纹肌肌电图(EMG)。
三对NiCr金属丝电极(60cm长度和80μm直径)在横向距离中线2cm处双侧植入横纹肌中。电极的自由端外部置于(exteriorised)颈部的背面，并且通过附着至皮肤的玻璃管保护。
1.2.结肠直肠扩张程序和EMG记录：
在结肠直肠扩张(CRD)前的几天内，雌性大鼠习惯于在聚丙烯隧道(20cm长度和7cm直径)中，以便熟悉该环境，在所述聚丙烯隧道中，它们无法移动、逃跑或转身。
使用固定在取自取栓术探头(Fogarty)的刚性导管上的4cm长的乳胶球囊。
在距离肛门1cm处将球囊插入直肠后执行其为机械刺激的CRD。将管固定在尾巴的基部处。通过将球囊连接到Distender Series IIR Barostat(G&J Electronics Inc，Toronto，加拿大)，从0到60mmHg执行结肠的等压扩张。
第一次扩张在15mmHg的压力下执行，并且在每个后续步骤下增加15mmHg的增量，直到达到60mmHg的最大压力，每个扩张步骤持续5分钟。
与腹部绞痛有关的横纹肌峰电位丛，在脑电图机(Mini VIII，Alvar，Paris，法国)上从植入电极记录，使用短时间常数(0.03s)以去除低频信号(<3Hz)。EMG记录在手术后7天开始。
对于5分钟时期的收缩次数代表内脏痛的强度。
1.3.应激程序：
所有应激期间都在一天的同一时间(10am到中午12点)执行，以使昼夜节律的任何影响降到最低。
部分束缚应激(PRS)，急性应激的相对轻度的非致溃疡性模型，如先前所述(Williams等人，1988)执行。
雌性大鼠用二乙醚进行镇静，并且其前肩、上前肢和胸干包裹在纸带的约束线束中，以限制但不阻止身体运动。
然后将动物放在其饲养笼中2小时。
1.4.实验方案：
基于通过经口管饲法的10天治疗的四个系列的实验，对于每个系列，使用配备用于EMG的三组7至12只雌性大鼠进行。
大鼠通过管饲法每天一次给予乳酸乳球菌NCDO2118或NCDO2727，共10天。使用洗涤的细菌细胞(109cfu/天)，以便使最初施用于大鼠的GABA量降到最低。除非另有说明，否则将游离谷氨酸盐(0.2％(w/v))添加到管饲法混合物中，以促进体内GABA产生。
对于所有条件，在治疗的第9天时记录对CRD的基础腹部应答，并且在治疗的第10天时记录PRS诱导的对CRD的内脏超敏反应。
CRD测量在2小时PRS期间后20分钟执行。
对于溶媒治疗的动物，游离谷氨酸盐(0.2％(m/v))被验证为本身对基础和应激诱导的结肠直肠敏感性没有作用。
1.5.统计方法：
对于动物实验，数据报告为平均值±平均值的标准误(SEM)。软件GraphPad Prism6.0(GraphPad，San Diego，CA)用于统计分析。执行单因素ANOVA，随后为Tukey氏多重比较检验，以比较不同动物组之间的数据。统计显著性在P<0.05下接受。
2.结果：
2.1.游离谷氨酸盐对基础和应激诱导的结肠直肠敏感性的作用
在基础条件下(即，在PRS之前)用溶媒治疗的大鼠中，逐渐的结肠直肠扩张(CRD)以压力依赖的方式增加腹部收缩的频率(图3)。
与溶媒相比，游离谷氨酸盐的施用并不影响对CRD的腹部应答(图3)。
在溶媒治疗的大鼠中，与基础条件相比，2小时PRS显著增加了腹部收缩的次数；游离谷氨酸盐的施用并未修饰PRS期间后测量的对CRD的内脏超敏反应应答(图3)。
因此，游离谷氨酸盐本身对基础和应激诱导的结肠直肠敏感性没有作用。
2.2.乳酸乳球菌NCDO2118对内脏超敏反应的作用
图4中显示了乳酸乳球菌NCDO2118和NCDO2727对应激诱导的对CRD的内脏超敏反应的影响。
在溶媒治疗的大鼠中，对于从30mmHg开始施加的所有扩张压力，与基础条件相比，2小时PRS显著增加了腹部收缩的次数(P<0.001，图4)。
重要的是，乳酸乳球菌NCDO2118的10天经口施用压制了PRS诱导的腹部收缩增强(对于60mmHg的扩张压力，P<0.01，图4)，恢复了对CRD的准基础敏感性。
相比之下，乳酸乳球菌NCDO2727的经口施用对应激诱导的内脏超敏反应没有作用(图4)。
总之，急性束缚应激在大鼠中诱导对扩张的结肠超敏反应，并且这种超敏反应表型在10天的每天经口施用(109cfu/天)后，通过乳酸乳球菌NCDO2118而不是乳酸乳球菌NCDO2727逆转。
实例3：应激诱导的内脏超敏反应通过乳酸乳球菌NCDO2118的预防是由于其在体内递送GABA的能力
1.材料与方法：
1.1.细菌菌株
使用菌株NCDO2118和NCDO2727。
通过染色体中的双交换构建了乳酸乳球菌NCDO2118ΔgadB。
GAD编码基因gadB被缺失以便中断GABA途径。
829和981bp的两个片段分别仅在gadB编码序列的上游和下游进行PCR扩增，以NCDO2118染色体作为基质。引物在表4中列出。两个片段通过重叠PCR进行融合。pGhost9载体进行PCR扩增，并且使用Gibson组装方法(New Englang Biolabs)连接到融合片段。所得到的质粒通过测序进行验证，并且引入乳酸乳球菌NCDO2118中。然后如先前所述(Maguin等人，1996)，通过双交换获得gadB的染色体缺失。染色体内gadB序列的缺失通过PCR进行验证。
菌株的培养条件与实例1中所述的相同。
表4：用于乳酸乳球菌NCDO218中的gadB失活的引物。
1.2.gad操纵子的序列分析：
在NCDO2118菌株中，gad操纵子序列从NCBI-GenBank数据库中的登录号CP009054下保藏的染色体序列中提取。
为了扩增NCDO2727菌株中的gad操纵子，使用两种引物，GadSeq_F(5'-TCCAGAAATAACAGCTACATTGACATAATG-3')和GadSeq_R(5'-TAACAGCCCCATTATCTAAGATTACTCC-3')。使用Q5 High-Fidelity DNA聚合酶(NEB)并根据制造商的建议，用25-μL反应混合物中的20ng基因组DNA进行扩增。PCR条件由以下组成：在98℃下3分钟的初始变性步骤，随后为98℃10秒、64℃30秒和72℃3分钟的30个循环，以及在72℃下2分钟的最终延伸步骤。
然后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAgen)纯化扩增子。
序列通过Eurofins Genomics用表5中列出的一组引物执行。操纵子的序列已保藏在NCBI-GenBank数据库中的登录号MK225577下。
gad操纵子的序列通过Blast比对算法进行比较。
| 引物名称 | 5’-3’序列 | SEQ ID NO： |
| GabSeq_2_F | AAAATATAGAAGGAGACTATTGCAAATAGC | 9 |
| GabSeq_2_R | AAAAATTAATGGCCATCGTTGGTAGTTCTC | 10 |
| GabSeq_3_F | TCTGTGCAGCAGAAATGGCGACGGTTGAA | 11 |
| GabSeq_3_R | TCCCCATAAATTTTTCTTTTTCACTCGCAT | 12 |
| GabSeq_4_F | CGGTTATTCCTCAAAAAGACTTATCATTAA | 13 |
表5：用于乳酸乳球菌NCDO2727中的gad操纵子测序的引物
2.结果：
伴随这种缺失，且在相同的培养条件下，突变体可以与野生型相似地生长(0.65h-1的生长率)。然而，在这些条件下，并未产生GABA(在24小时<0.29mM)，并且在7小时并未检测到GAD活性。
当动物接受NCDO2118ΔgadB等基因菌株时，乳酸乳球菌NCDO2118治疗对应激诱导的内脏超敏反应的有益作用(P<0.001)被逆转(图6，NCDO2118ΔgadB相对于NCDO2118治疗的动物，P<0.05)。
实例4：在大鼠应激模型(模型IBS)中，用目的乳酸乳球菌获得的对内脏超敏反应的作用的比较
1.材料与方法：
动物的制备与实例2中所述的相同。
大鼠通过管饲法每天一次给予乳酸乳球菌NCDO2118或CNCM 1-5388，共4或9天。使用洗涤的细菌细胞(109cfu/天)，以便使最初施用于大鼠的GABA量降到最低。除非另有说明，否则将游离谷氨酸盐(0.2％(w/v))添加到管饲法混合物中，以促进体内GABA产生。
2.结果：
图5和图7中显示了随着时间过去，乳酸乳球菌NCDO2118、CNCM I-5388和CNCM I-5388Δgad对应激诱导的对CRD的内脏超敏反应的影响。
CNCM I-5388和NCDO2118在谷氨酸盐的存在下降低对应激的内脏超敏反应。
参考文献
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关于已保藏的微生物或其他生物材料的说明
(PCT细则13bis)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)
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序列表
<110> 农业食品和环境国家研究中心
国立图卢兹应用科学学院
国家科学研究中心
普尔潘工程师学校
图卢兹国家兽医学院
图卢兹第三大学-保尔·萨巴梯埃
穆里尔·科凯恩-布斯克特
海伦·尤塔梅内
穆里尔·梅西尔·博宁
瓦西里亚·西奥多鲁
瓦莱丽·拉鲁特
玛丽-莱恩·达维兰-明戈
<120> 用于预防和/或治疗内脏痛的乳酸乳球菌菌株
<130> F539/191
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Claims (17)
1.一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的菌株，其能够在少于或等于24小时的培养时间内产生至少10mM的γ-氨基丁酸(GABA)，所述菌株用于预防和/或治疗腹痛或内脏痛。
2.一种乳酸乳球菌的菌株，其在7小时至8小时的培养时间内产生至少20微摩尔/min.mg的5'-磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶谷氨酸脱羧酶(GAD)，所述菌株用于预防和/或治疗腹痛或内脏痛。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的乳酸乳球菌的菌株，其特征在于所述菌株选自由CNCM I-5388、CNCM I-5386和NCDO2118组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的乳酸乳球菌的菌株，其特征在于所述菌株在游离谷氨酸盐的存在下施用。
5.一种细胞级分，其得自根据权利要求1至3中任一项所述的乳酸乳球菌的菌株，所述细胞级分用于预防和/或治疗内脏痛。
6.一种组合物，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的乳酸乳球菌的菌株、或根据权利要求4所述的细胞级分，所述组合物用于预防和/或治疗内脏痛。
7.根据权利要求6所述的包含乳酸乳球菌的菌株的组合物，其特征在于所述组合物包含的乳酸乳球菌的菌株含量允许每天施用至少106个菌落形成单位(cfu)的所述乳酸乳球菌的菌株。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含游离谷氨酸盐。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物是食物产品。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的乳酸乳球菌的菌株、或根据权利要求5所述的细胞级分、或根据权利要求6至9中任一项所述的组合物，其特征在于内脏痛与心理学应激事件和/或焦虑相联系。
11.根据权利要求10的用于它们的用途的根据权利要求1至3中任一项所述的乳酸乳球菌的菌株、或根据权利要求5所述的细胞级分、或根据权利要求6至9中任一项所述的组合物，其特征在于内脏痛是由于灼口综合征(BMS)引起。
12.一种乳酸乳球菌的菌株，其特征在于所述菌株选自由CNCM I-5388、CNCM I-5386组成的组。
13.一种细胞级分，其得自根据权利要求12所述的乳酸乳球菌的菌株。
14.一种组合物，其包含根据权利要求12所述的乳酸乳球菌的菌株、或根据权利要求13所述的细胞级分。
15.根据权利要求14所述的包含乳酸乳球菌的菌株的组合物，其特征在于所述组合物包含至少106cfu/克干重。
16.根据权利要求14或15所述的组合物，其特征在于所述组合物是食物产品。
17.根据权利要求14或15所述的组合物，所述组合物用作药物。
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