JP2013505739A - 乳酸菌におけるアセト乳酸誘導生成物への改善されたフラックス - Google Patents

Abstract

乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性のない乳酸菌細胞の遺伝子改変および単離を可能にするエンジニアリング方法を開発した。これらの改変およびイソブタノール生合成経路を有する細胞において、イソブタノール生成の改良が認められた。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６７１７号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、産業微生物学および乳酸菌の代謝の分野に関する。さらに具体的には、内因的に発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の酵素活性を低減するか、またはなくす、遺伝子工学による改変を行って、イソブタノールを含めて所望の生成物の生合成用基質としてのアセト乳酸の利用可能性を増大させた。

乳酸菌に内在する生合成経路における代謝フラックスは、出発基質としてピルビン酸を使用する生成物の生成のために変更されてきた。乳酸菌において、重要なピルビン酸代謝経路は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性による乳酸への変換である。乳酸菌においてピルビン酸を乳酸から他の生成物に向け直す代謝工学は、予測不可能な結果をもたらしてきた。アラニン・デヒドロゲナーゼ（ａｌａｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を発現するＬＤＨ欠損ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）におけるアラニンの生成が、Ｈｏｌｓらによって明らかにされた（非特許文献１）。しかし、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現するＬＤＨ欠損ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）におけるエタノールの生成は、ごく限られていた。炭素のエタノールへの流れは、大幅には改善されておらず、乳酸が依然として生成された（非特許文献２）。

乳酸菌において、ピルビン酸は、ある経路においてアセト乳酸に変換され、次いでアセト乳酸デカルボキシラーゼによってアセトインに変換され、次いで２，３−ブタンジオールに変換される。追加の経路は、アセト乳酸をジアセチル、バリンまたはロイシンに変換する。Ｍｏｎｎｅｔら（非特許文献３）は、化学的突然変異生成により、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性をなくし、ＬＤＨ活性を低減して、アセト乳酸、アセトイン、およびジアセチルの生成を増大させた。特許文献１に、異種ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性を発現し、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を実質的になくすことによって、乳酸菌におけるピルビン酸から２，３−ブタンジオールへの高フラックスをエンジニアリングすることが開示されている。

同時係属中の特許文献２に、異種ＤＨＡＤを発現し、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を実質的になくすことによって、高いジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）活性の乳酸菌をエンジニアリングすることが開示されている。ＤＨＡＤは、イソブタノール合成の生合成経路における酵素の１つであり、同時係属中の特許文献３に開示されている。その中に、イソブタノール生成用の組換え微生物のエンジニアリングが開示されている。イソブタノールは燃料添加剤として有用であり、その利用可能性によって、石油化学燃料の需要を低減することができる。

ｄｅ Ｖｏｓら（非特許文献４）に、乳酸菌の細胞を急速に増殖する際に、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードするａｌｄＢの不活性化と乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈの不活性化を組み合わせるのは不可能のように思われたことが開示されている。

米国特許出願公開第２０１０／０１１２６５５号明細書 米国特許出願公開第２０１０／００８１１８３号明細書 米国特許出願公開第２００７／００９２９５７Ａ１号明細書

Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻：５８８〜５９２頁（１９９９年） Ｌｉｕら、（２００６年）、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３３巻：１〜７頁 Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻：５５１８〜５５２０頁（２０００年） Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ Ｊ．、８巻：２２７〜２３３頁（１９９８年）

乳酸菌における代謝フラックスを、乳酸およびアセトインから離れて２，３−ブタンジオール経路およびイソブタノール生成などアセト乳酸の下流に位置する他の生合成経路に変更する必要が依然としてある。

本明細書には、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）およびアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ａｌｄＢ）によって内因的に発現される、乳酸デヒドロゲナーゼ活性をなくし、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を低減するか、またはなくすように遺伝子改変された乳酸菌細胞が開示される。これらの細胞には、検出可能なデヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素活性がない。これらの細胞を使用して、中間体としてアセト乳酸を有するイソブタノールおよび他の生成物を生成することができる。

したがって、内因的に発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を低減するか、またはなくす少なくとも１つの遺伝子工学による改変と、内因的に発現された乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性をなくす少なくとも１つの遺伝子工学による改変とを含む組換え乳酸菌細胞が提供される。

別の実施形態において、組換え乳酸菌細胞は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減する少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含んでもよい。様々な基質の利用または他の生成物の生成を実現する追加の生合成経路および／または追加の改変など、別の遺伝子改変を含むこともできる。

別の実施形態において、組換え乳酸菌細胞を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）乳酸菌細胞を準備するステップと、
ｂ）（ａ）の細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子を、内因的に発現された乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性をなくすように遺伝子工学により改変するステップと、
ｃ）（ｂ）の細胞においてプラスミド由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現させて、非染色体で発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼを有する細胞を作製するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を、内因的に発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性をなくすように遺伝子工学により改変するステップと、
（ｅ）（ｄ）の細胞由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現するプラスミドを除去するステップと
を含み、それによって、内因的に発現された乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性がない組換え乳酸菌細胞が生成される方法が提供される。

もう１つの実施形態において、本発明は、イソブタノールを生成する方法であって、
（ａ）乳酸菌細胞を準備するステップであって、乳酸菌細胞が
ｉ）内因的に発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性をなくす少なくとも１つの遺伝子改変および内因的に発現された乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性をなくす少なくとも１つの遺伝子改変と、
ｉｉ）イソブタノール生合成経路と
を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の細胞を、イソブタノールが生成される条件下で培養するステップと
を含む方法を提供する。

もう１つの実施形態において、本発明は、乳酸菌用組込み型ベクターであって、
ａ）ＬＡＢ細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と、
ｂ）乳酸菌細胞において活性な選択マーカーおよび組込みの標的とされるＤＮＡセグメントの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と、
ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において活性な選択マーカーと、
ｄ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の複製開始点と、
ｅ）温度感受性である、乳酸菌細胞の複製開始点と
を含み、Ｔｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素が、ｂ）のＤＮＡセグメントのランダムな組込みを指示する組込み型ベクターを提供する。

もう１つの実施形態において、本発明は、ＤＮＡセグメントをＬＡＢ細胞ゲノムにランダムに組み込む方法であって、
ａ）ベクターを準備するステップであって、ベクターが
（ｉ）乳酸菌細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と、
（ｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および乳酸菌細胞において活性である選択マーカーの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と、
（ｉｉｉ）乳酸菌細胞において活性な第２の選択マーカーと、
（ｉｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の複製開始点と、
（ｖ）条件付きで活性である、乳酸菌細胞の複製開始点と
を含むステップと、
ｂ）組込み用ＤＮＡセグメントをステップａ（ｉｉ）の構成要素間に配置し、組込み構築物を作製するステップと、
ｃ）組込み構築物を乳酸菌細胞に形質転換し、それによって形質転換細胞が生成されるステップと、
ｄ）ステップａ（ｉｉ）の選択マーカーを使用して、ステップ（ｃ）の形質転換細胞を許容状態で増殖および選択して、選択された形質転換体を生成するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の選択された形質転換体を非許容状態で増殖させるステップと
を含み、ベクターは乳酸菌細胞から除去され、組込み用ＤＮＡセグメントは前記乳酸菌細胞のゲノムにランダムに組み込まれる方法を提供する。

図面と配列の簡単な説明
本出願の一部分をなす以下の詳細な説明、図面、および添付の配列の説明から、本発明の様々な実施形態をさらに詳しく理解することができる。

乳酸菌においてピルビン酸で開始する生合成経路の概略を示す図である。 イソブタノール生合成の生合成経路を示す図である。

以下の配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ − ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ」）に従うものであり、Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ） Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５ （２００９）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（Ｒｕｌｅｓ ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびにＳｅｃｔｉｏｎ ２０８およびＡｎｎｅｘ Ｃ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号およびフォーマットは、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２に記載の規則に従う。

配列番号：９５および９６は、トランスポザーゼ認識部位Ｔｎ５ＩＥおよびＴｎ５ＯＥである。

配列番号：９７は、プラスミドｐＦＰ９９６の配列である。

配列番号：８９、９０、９８−１１３、１１７、１１８、１２０−１２２、１２４−１２９、１３１−１３６、１３９−１４２、１４４−１４７、１４９−１５１、１５３、１５４、１５６、１５９−１６９、１７１−１７５、１７８−１８２、および１８４−１９０は、ＰＣＲおよび配列決定プライマーである。

配列番号：１１４は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）である。

配列番号：１１５は、プラスミドｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））の配列である。

配列番号：１１６は、プラスミドｐＤＭ１の配列である。

配列番号：１１９は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に由来するＲＢＳおよびｉｌｖＤコード領域を含むＰＣＲ断片の配列である。

配列番号：１２３は、ｓｕｆオペロン（ｓｕｆＣおよびｓｕｆＤの一部分）の５’部分を含む右ホモロジーアームＤＮＡ断片である。

配列番号：１３０は、ネイティブｓｕｆプロモーターおよび上流の配列を含んでｆｅｏＢＡオペロンになる左ホモロジーアームＤＮＡ断片である。

配列番号：１３７は、プラスミドｐＴＮ６の配列である。

配列番号：１３８は、Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−Ｐｓｐａｃ−ｌｏｘＰカセットの配列である。

配列番号：１４３は、Ｐｎｐｒプロモーターである。

配列番号：１４８は、Ｐｎｐｒ−ｔｎｐ融合ＤＮＡ断片である。

配列番号：１５２は、ＰｇｒｏＥプロモーター配列である。

配列番号：１５５は、ｋｉｖＤ（ｏ）コード領域をＲＢＳと共に含むＰＣＲ断片である。

配列番号：１５７は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたｓａｄＢコード領域である。

配列番号：１５８は、ＲＢＳおよびｓａｄＢ（ｏ）コード領域を含むＤＮＡ断片である。

配列番号：１７０は、ＰｒｒｎＣ１プロモーターである。

配列番号：１７６は、プラスミドｐＤＭ５の配列である。

配列番号：１７７は、ｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ断片である。

配列番号：１８３は、プラスミドｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））の配列である。

本発明は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ａｌｄＢ）および乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）によってコードされる内因的に発現された酵素の酵素活性を低減するか、またはなくすように遺伝子工学により改変された組換え乳酸菌（ＬＡＢ）細胞に関する。これらの改変された遺伝子により発現が低減されるか、またはなくなるため、細胞では、アセト乳酸デカルボキシラーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減されるか、またはない。本発明はまた、ａｌｄＢおよびｌｄｈの遺伝子工学による改変によってアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性および乳酸デヒドロゲナーゼ活性のないＬＡＢ細胞を得る方法にも関する。この方法では、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性および乳酸デヒドロゲナーゼ活性のうちの一方を非染色体で発現させる必要があり、染色体遺伝子が改変される。次いで、非染色体遺伝子をなくす。

これらの細胞において、ピルビン酸からアセト乳酸へのフラックスが増大しているが、アセトインからは離れている。これらの細胞を使用して、中間体としてアセト乳酸を有するイソブタノールおよび他の生成物を生成することができる。イソブタノールは、化石燃料に代わる燃料または燃料添加剤として有用である。

以下の略語および定義は、本明細書および特許請求の範囲の解釈に使用されることになる。

本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、もしくは「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの他の何らかの変形は、非排他的な包含を網羅するものとする。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないまたはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、もしくは装置に固有でない他の要素を含むことができる。さらに、別段の明示的記載のない限り、「または」は、包含的またはを意味するが、排他的またはを意味するものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満足される：Ａは真であり（または存在する）かつＢは偽であり（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在しない）かつＢは真であり（または存在する）、ならびにＡとＢが共に真である（または存在する）。

また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、元素または成分の場合の数（すなわち、出現頻度）に関して非制限的であるものとする。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈されるべきであり、元素または成分の単数形は、数が明らかに単数であるものとする場合を除いて複数形も包含する。

本明細書では、「発明」または「本発明」という用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の単一の実施形態を指すものではなく、本明細書および特許請求の範囲に記載するように可能な実施形態をすべて包含するものである。

本明細書では、本発明の材料または反応物質の使用量を修飾する「約」という用語は、例えば実社会で濃縮物または使用溶液を作製するのに使用される典型的な測定手順および液体取扱い手順；これらの手順における不注意による誤り；組成物の作製または方法の実施に使用する材料の製造、供給源、または純度の差異などによって起こり得る数値量のばらつきを指す。「約」という用語は、特定の初期の混合物によって生ずる組成物の異なる平衡条件のために異なる量も包含する。「約」という用語で修飾されていようがいまいが、特許請求の範囲は、量に対して等価なものを含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。

「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールをピルビン酸から生成するための酵素経路を指す。

「乳酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、ピルビン酸から乳酸への変換を触媒する酵素活性を有する１つのポリペプチド（または複数のポリペプチド）を指す。乳酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ１．１．１．２７（Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ）またはＥＣ１．１．１．２８（Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ）として知られている。

「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」」という用語は、アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有する１つのポリペプチド（または複数のポリペプチド）を指す。アセト乳酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．５として知られている。

「ピルビン酸ギ酸リアーゼ」、別名「ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ」」という用語は、ピルビン酸からギ酸への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。ピルビン酸ギ酸リアーゼは、ＥＣ２．３．１．５４として知られている。

「ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素」、別名「ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性化酵素」という用語は、ピルビン酸ギ酸リアーゼの活性に必要とされるポリペプチドを指す。ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性化酵素は、ＥＣ１．９７．１．４として知られている。

「通性嫌気性菌」という用語は、好気性環境と嫌気性環境の両方で増殖できる微生物を指す。

「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主有機体による代謝が可能な炭素源、特に単糖、オリゴ糖、多糖、および１炭素基質またはそれらの混合物からなる群から選択される炭素源を指す。

「遺伝子」という用語は、（５’非コード配列）の直前に制御配列および（３’非コード配列）の後にコード配列を場合によっては含む、特定のタンパク質として発現することが可能な核酸断片を指す。「ネイティブ遺伝子」は、それ独自の制御配列を有する自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」はネイティブ遺伝子でなく、自然界で共には見られない制御およびコード配列を含む任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列とコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然界に見られる様式とは異なる様式で配置された制御配列とコード配列を含んでもよい。「内在性遺伝子」は、有機体のゲノムのその天然の位置におけるネイティブ遺伝子を指す。「外来遺伝子」または「異種性遺伝子」は、宿主有機体に通常は見られないが、遺伝子移入により宿主有機体中に導入され、またはその発現を変更するようになど、そのネイティブ状態から何らかの方式で改変されている遺伝子を指す。「異種性遺伝子」は、ネイティブコード領域またはその一部分を含む。これは、対応するネイティブ遺伝子と異なる形で供給源の有機体に再導入される。例えば、異種性遺伝子は、ネイティブ宿主に再導入される非ネイティブ制御領域を含むキメラ遺伝子の一部分であるネイティブコード領域を含むことができる。また、外来遺伝子が、非ネイティブ有機体に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むこともできる。「導入遺伝子」は、形質転換手順でゲノムに導入された遺伝子である。

本明細書では、「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、範囲内、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含むことができる。

「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、全体としてネイティブ遺伝子に由来し、または自然界に見られる様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成され、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。様々なプロモーターは、様々なタイプの組織もしくは細胞において、または様々な発達段階で、または様々な環境もしくは生理的状態に応答して、遺伝子の発現を指示できることを当業者は理解している。大部分のタイプの細胞において大部分の場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、通常「構成プロモーター」と呼ばれる。大部分の場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有する場合があることもさらに認識される。

「機能的に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現をもたらすことができるとき（すなわち、コード配列はプロモーターの転写調節下にあるということ）、プロモーターはそのコード配列と機能的に連結されている。制御配列にコード配列をセンスまたはアンチセンス方向に機能的に連結させることができる。

本明細書では、「発現」という用語は、センス（ｍＲＮＡ）の転写および安定な蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する場合もある。

本明細書では、「形質転換」という用語は、核酸分子を宿主細胞に移入し、それがプラスミドとして維持され、またはゲノムに組み込まれ得ることを指す。形質転換核酸分子を含む宿主細胞は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」細胞と呼ばれる。

本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的代謝の一部分ではない遺伝子を運搬する場合が多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形をとっている染色体外要素を指す。このような要素は、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、線状または環状のファージまたはヌクレオチド配列とすることができ、多くのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる特徴のある構築物に結合または組み換えられている。

本明細書では、「コドン縮重」という用語は、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝暗号の性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するのにヌクレオチドコドンを使用する際に、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。したがって、宿主細胞の発現を改善するためのコード領域（ｒｅｇｏｉｎ）を合成するとき、コード領域を、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように設計することが望ましい。

様々な宿主の形質転換のための核酸分子のコード領域を指すような「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされたポリペプチドを変化させることなく、宿主有機体の典型的なコドン使用を反映するような核酸分子のコード領域におけるコドンの変化を指す。

本明細書では、「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」は同義で使用されることにし、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を場合によっては含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味することにする。ＤＮＡのポリマーの形態をとる単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１個または複数のセグメントを含んでもよい。

核酸断片は、核酸断片の一本鎖の形態を温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸断片とアニーリングすることができるとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子など別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、その例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （１９８９年）、特に第１１章、表１１．１に記載される（参照により本明細書に全体として組み込まれる）。温度およびイオン強度の条件によって、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似の断片（遠縁関係にある有機体に由来する相同配列など）、高度に類似の断片（近縁関係にある有機体に由来する機能酵素を覆製する遺伝子など）を求めてスクリーニングするように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄操作で、ストリンジェンシー条件が決まる。１組の好ましい条件では、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分間で始め、次いで２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分間を繰り返し、次いで０．２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を２回繰り返す一連の洗浄操作が用いられる。１組のより好ましいストリンジェントな条件では、より高い温度が用いられ、洗浄操作は、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の３０分間の洗浄操作２回の温度を６０℃に上げた点以外は上記と同一である。１組の別の好ましい極めてストリンジェントな条件では、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる最後の洗浄操作２回が６５℃で行われる。１組の追加のストリンジェントな条件には、例えば０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、その後に続く０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄操作が含まれる。

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチが起こり得るが、ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要とされる。核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、当技術分野において周知である変数である核酸の長さおよび相補性の程度によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸配列のハイブリッドのＴｍ値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍを算出する数式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによって、その特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記１１．７〜１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、その長さは、最も好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度を、プローブの長さなどの要因に応じて適宜調整できることを認識するであろう。

「かなりの割合」のアミノ酸またはヌクレオチド配列とは、当業者が手作業によって配列を評価することにより、またはＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定により、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定同定するのに十分量のポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む割合である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子と相同であると推定同定するためには、１０個以上の一続きの隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドが必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、配列依存性の遺伝子同定方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離方法（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）で使用することができる。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、塩基１２から１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅用プライマーとして使用することができる。したがって、「かなりの割合」のヌクレオチド配列は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分量の配列を構成する。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告される配列の恩恵を受ける当業者は、当業者に公知の目的のために、開示された配列をすべてまたはかなりの割合で今度は使用することができる。したがって、本発明は、添付の配列表に報告する完全配列、および上記に定義したかなりの割合の配列を含む。

「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。

当技術分野において公知である「同一性（％）」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野では、「同一性」は、適宜、このような配列のストリング間のマッチで決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．編） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ （１９８８年）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ （１９９３年）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編） Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ （１９９４年）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ （１９８７年）；５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編） Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）を含めて、公知の方法で容易に算出することができるが、これらに限定されない。

好ましい同一性測定方法は、被検配列間の最高のマッチをもたらすように設計されている。同一性および類似性の測定方法は、一般に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性（％）の算出は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して行うことができる。配列のマルチプルアライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと呼ばれ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、８巻：１８９〜１９１頁（１９９２年）によって記載されている）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見られるアライメント方法に対応する「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖアラインメント法」を含めて、アルゴリズムのいくつかの変形を包含する「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を使用して行われる。マルチプルアライメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性（％）算出のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を調べることによって「同一性（％）」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法」が利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと呼ばれ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、８巻：１８９〜１９１頁（１９９２年）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ． Ｇ．、およびＧｉｂｓｏｎ Ｔ． Ｊ．、（１９９４年）Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２２巻：４６７３ ４６８０頁）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見られるアラインメント方法に対応するものである。マルチプルアライメントのデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を調べることによって「同一性（％）」を得ることが可能である。

多くの配列同一性レベルが、ポリペプチドを他の種から同定するのに有用であり、このようなポリペプチドは、同じまたは同様の機能または活性を有するものであることが当業者にはよく理解されるであろう。同一性（％）の有用な例としては、２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、あるいは２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％など、２４％から１００％の任意の整数百分率は、本発明を説明するのに有用であり得る。適切な核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。

「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されているものがあり、または独自に開発することができる。典型的な配列解析ソフトウェアは、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；２） ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））；３） ＤＮＡＳＴＡＲ （ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））； ４） Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ））；５） Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組込みＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ．］ （１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ， Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含むようになるが、これらに限定されるものではない。本出願の文脈において、配列解析ソフトウェアが解析に使用される場合、解析の結果は、別段の指定のない限り記載のプログラムの「デフォルト値」に基づくことになることが理解されよう。本明細書では、「デフォルト値」は、最初に初期化されると、ソフトウェアと共に元々搭載される任意のセットの値またはパラメーターを意味することになる。

ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （１９８９年）（以降、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ， Ｔ． Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ， Ｍ． Ｌ．、およびＥｎｑｕｉｓｔ， Ｌ． Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （１９８４年）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７年）によって説明されている。

乳酸菌における改良されたイソブタノール生成
本発明は、いくつかの遺伝子に遺伝子改変、例えば欠失を有する乳酸菌（ＬＡＢ）細胞において大幅に改良されたイソブタノール生成を提供する。前記改変は、これらの細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをなくし、かつアセト乳酸酵素活性を低減するか、またはなくすものである。

ＬＡＢ細胞におけるピルビン酸の主要なフラックスは乳酸へのフラックスであるが、乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｄｈ）活性の発現の低減により変更される。Ｌｄｈ活性の低減によって、ピルビン酸から、アセト乳酸合成酵素によりアセト乳酸が生成し、アセト乳酸からアセトインが生成するフラックスが増大し得る（図１を参照のこと）。アセト乳酸デカルボキシラーゼは、アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する。アセト乳酸デカルボキシラーゼ欠損ＬＡＢ細胞における乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低減は、増殖約２０時間後にアセト乳酸およびアセトインの増加をもたらすことがわかった（Ｍｏｎｎｅｔら、Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｒｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻：５５１８〜５５２０頁（２０００年）。アセト乳酸からアセトインへのこれだけ効率的な変換は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性の非存在下にあっても起こる。Ｍｏｎｎｅｔら（同文献）によるＬＡＢ細胞の改変は、化学的突然変異生成と、その後に続いて酵素活性の低減を求めてスクリーニングすることによって行われた。したがって、ゲノムへの変化の性質は、遺伝子工学による改変が行われたときとは対照的に未知のものである。

本発明において、ＬＡＢ細胞において乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子によってコードされる酵素活性をなくすように遺伝子改変をエンジニアリングする方法を開発した。本発明によって酵素活性をなくすことは、機能活性の認識可能または検出可能なレベルをなくすことを意味する。これらの改変は、標準的なエンジニアリング方法では得ることができない。本明細書に記載されたように、イソブタノール生合成経路の存在下にこれらの改変を備えたＬＡＢ細胞において、イソブタノール生成は、ｌｄｈ遺伝子欠失ではあるがａｌｄＢ欠失ではない細胞におけるイソブタノール生成に比べて６倍増大したことがわかった。したがって、イソブタノール経路は、フラックスを、アセト乳酸からアセトインが生成されることから有効的に方向転換することができた。

乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子への改変によって酵素活性をなくす遺伝子工学による改変は、いずれのＬＡＢにおいても以下に記載するように行うことができ、イソブタノール生合成経路を存在させるようにエンジニアリングすることもできる。本開示において宿主細胞とすることができるＬＡＢとしては、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性をなくすこと
本発明では、ＬＡＢにおいて、生成物を生成するための発酵時に使用される増殖条件下に自然発現される内因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現に由来する酵素活性をなくすように、遺伝子改変がエンジニアリングされる。ＬＡＢは、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子、典型的には１つ、２つまたは３つの遺伝子を有することができる。例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする３つの遺伝子を有し、これらはｌｄｈＬ２（タンパク質配列番号：６、コード領域配列番号：５）、ｌｄｈＤ（タンパク質配列番号：２、コード領域配列番号：１）、およびｌｄｈＬ１（タンパク質配列番号：４、コード領域配列番号：３）と呼ばれる。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする１つの遺伝子を有し、これはｌｄｈＬ（タンパク質配列番号：８、コード領域配列番号：７）と呼ばれる。ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）は、ｌｄｈＤ（タンパク質配列番号：１４、コード領域配列番号：１３）およびｌｄｈＬ（タンパク質配列番号：１６、コード領域配列番号：１５）と呼ばれる２つの遺伝子を有する。

乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子において、その活性をなくすように遺伝子改変が行われる。２つ以上の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、生成のために使用される増殖条件下に発現される（活性である）と、これら活性遺伝子のそれぞれにおいて、酵素活性がなくなるようにそれらの発現に影響を及ぼす遺伝子改変を行うことができる。例えば、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）において、ｌｄｈＬ１およびｌｄｈＤ遺伝子が改変される。第３の遺伝子ｌｄｈＬ２は、典型的な状態では非活性のようであるので、これら状態での増殖にはこの遺伝子を改変する必要はない。典型的には、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子の発現が破壊されて、発現される酵素活性がなくなる。破壊の標的とすることができるＬＡＢ乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の例は、表１に記載の配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１のコード領域で表わされる。乳酸デヒドロゲナーゼは周知であるので、表１に記載の配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２の乳酸デヒドロゲナーゼと少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするものなど、他の標的遺伝子は、当業者に周知のように文献でまたバイオインフォマティクス手法を使用して同定することができる。典型的には、本明細書に記載されているものなど、既知の乳酸デヒドロゲナーゼ アミノ酸配列を含む一般に利用可能なデータベースの（上述した）ＢＬＡＳＴ検索を使用して、発現される乳酸デヒドロゲナーゼ活性をなくすための破壊の標的であり得る乳酸デヒドロゲナーゼおよびこれらをコードする配列を同定する。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づくものである。

さらに、本明細書に記載された配列または当技術分野で列挙されているものを使用して、自然界における他の相同体を同定することができる。例えば、本明細書に記載される乳酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸断片をそれぞれ使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存性プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は、当技術分野において周知である。配列依存性プロトコルの例としては、１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２）核酸増幅技術の様々な使用例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ， Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２巻：１０７４頁（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８９巻：３９２頁（１９９２年）］；および３）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニングの方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本ＬＡＢ細胞において、酵素活性がなくなるように乳酸デヒドロゲナーゼをコードする標的遺伝子の発現に影響を及ぼす、遺伝子工学による改変が少なくとも１つ行われる。遺伝子の発現をなくす、当業者に公知の遺伝子改変方法を使用して、発現される酵素活性をなくすことができる。方法としては、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の全部または一部分の欠失、コード化タンパク質を発現することができないまたは発現が酵素活性の生成に十分なレベルにまで起こらないように、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子にＤＮＡ断片を（プロモーターまたはコード領域で）挿入すること、突然変異を乳酸デヒドロゲナーゼコード領域に導入し、機能タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを加えること、および１つまたは複数の突然変異を乳酸デヒドロゲナーゼコード領域に導入して、アミノ酸を非機能タンパク質が発現されるように変更することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ発現をアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってブロックすることができ、コサプレッションを生じる構築物を導入することができる。これらの方法はすべて、当業者が配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１のものなどの乳酸デヒドロゲナーゼをコードする公知配列を利用して容易に実施することができる。

相同組換えに基づく方法など、一部の方法には、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする配列を包囲するゲノムＤＮＡ配列が有用である。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）などの場合、これらの配列はゲノム配列決定プロジェクトから利用可能であり、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースによって、Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アイデンティフィケーションｇｉ｜２８３７６９７４｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００４５６７．１｜［２８３７６９７４］で利用可能である。隣接するゲノムＤＮＡ配列も、当業者に周知であるように、コード配列内でプライマーを使用して、乳酸デヒドロゲナーゼコード配列から外側へ配列決定することによって得ることができる。

本明細書の実施例１に例示する乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性をなくす特に好適な方法は、乳酸デヒドロゲナーゼコード領域をフランキングするＤＮＡ配列によって媒介される相同組換えを使用して、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子全体を欠失させることである。フランキング配列は、互いに隣接してクローニングされ、したがってこれらのフランキング配列を使用したダブルクロスオーバー事象は、乳酸デヒドロゲナーゼコード領域を欠失させる。

アセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素活性をなくすこと
本発明では、ＬＡＢ細胞において、内因的に発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子の酵素活性を低減するか、またはなくすように遺伝子改変がエンジニアリングされる。ＬＡＢ細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、典型的にはａｌｄＢと呼ばれる。しかし、ａｌｄおよびａｌｄＣという代替名が使用されることがあった。したがって、ａｌｄおよびａｌｄＣは、同じ遺伝子を指す他の何らかの名称と同様に本明細書でアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を指すａｌｄＢと互換性がある。

改変の標的とすることができるＬＡＢ由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子の例は、表２に記載の配列番号：２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のコード領域で表わされる。アセト乳酸デカルボキシラーゼは周知であるので、表２に記載の配列番号：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、または３８のアセト乳酸デカルボキシラーゼと少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアセト乳酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするものなど、他の標的遺伝子は、当業者に周知のように文献でまたバイオインフォマティクス手法を使用して同定することができる。典型的には、本明細書に記載されているものなど、既知のアセト乳酸デカルボキシラーゼアミノ酸配列を含む一般に利用可能なデータベースの（上述した）ＢＬＡＳＴ検索を使用して、アセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性をなくすための改変の標的であり得るアセト乳酸デカルボキシラーゼおよびこれらをコードする配列を同定する。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づくものである。

さらに、上記のように、本明細書に記載されるアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列または当技術分野で列挙されているものを使用して、自然界における他の相同体を同定することができる。本ＬＡＢ細胞において、アセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性が低減されるまたはなくなるようにアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする標的遺伝子の発現に影響を及ぼす、遺伝子工学による改変が少なくとも１つ行われる。以下に記載するようにｌｄｈとａｌｄＢの改変を組み合わせる方法を使用して、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を改変する改変が記載のように行われる。

一時的発現はｌｄｈおよびａｌｄ遺伝子ノックアウトを可能にする
他の研究者らが以前に報告していたこと（ｄｅ Ｖｏｓら、（１９９８年）、Ｉｎｔ． Ｄａｉｒｙ Ｊ．、８巻：２２７〜２３３頁）と同様に、本出願人らは、本明細書の実施例４に記載されるように、ｌｄｈ遺伝子の発現をなくすようにエンジニアリングされた遺伝子改変を備えたＬＡＢ細胞におけるａｌｄＢ発現をなくす遺伝子改変を行った後に、株を回収することができた。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）において典型的な増殖状態で活性なｌｄｈ遺伝子であるｌｄｈＤとｌｄｈＬは両方とも、それらの発現をなくすように改変されていた。

本発明では、（上述されたように）ｌｄｈ遺伝子発現がなくなった細胞において、プラスミド由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性が、染色体ａｌｄＢ遺伝子のエンジニアリング時に発現される。非染色体で発現された（プラスミド由来の）アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性の存在下に、内因性ａｌｄＢ遺伝子において、その発現を低減するか、またはなくすように遺伝子改変がエンジニアリングされる。次いで、プラスミドが細胞から除去されると、ｌｄｈの発現によって生ずる酵素活性をなくし、かつａｌｄＢ遺伝子の発現によって生ずる酵素活性を低減するか、またはなくすことになる、改変を備えた細胞が作製される。この方法によって、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を欠いており、かつアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を欠くか、または低減させたように、エンジニアリングされた改変を備えた細胞を回収することができる。

あるいは、ａｌｄＢ遺伝子発現がなくなった細胞において、プラスミド由来の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を、染色体ｌｄｈ遺伝子のエンジニアリング時に発現することができる。２つ以上のｌｄｈ遺伝子が活性である場合、プラスミド由来の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現する前に、１つのｌｄｈ遺伝子の発現をなくすことができる。次いで、２番目のｌｄｈ遺伝子の発現がなくなる。次いで、プラスミドが細胞から除去されると、酵素活性がなくなるようにｌｄｈおよびａｌｄＢ遺伝子の発現に影響を及ぼす改変を備えた細胞が作製される。この方法によって、乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を欠いているエンジニアリングされた細胞を回収することができる。

あるいは、ｌｄｈ遺伝子発現がなくなった細胞においてプラスミド由来の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を、染色体ａｌｄＢ遺伝子のエンジニアリング時に発現することができる。次いで、プラスミドが細胞から除去されると、ｌｄｈの発現をなくし、かつａｌｄＢ遺伝子の発現を低減するか、またはなくす改変を備えた細胞が作製される。この方法によって、乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を欠いているエンジニアリングされた細胞を回収することができる。

当業者に周知のように、プラスミド由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現させることができる。本明細書に配列番号：２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７として記載されているアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列のいずれか、または上述したようにバイオインフォマティクスもしくは実験方法によってさらに同定されたいずれかのアセト乳酸デカルボキシラーゼコード領域を、キメラ遺伝子に由来するＬＡＢにおける発現のためのプロモーターに機能的に結合することができる。さらに、好適なアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素は、ＥＣ番号４．１．１．５として分類されている。あるいは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１として記載されている乳酸デヒドロゲナーゼをコードする配列のいずれか、または上述されたようにバイオインフォマティクスもしくは実験方法によってさらに同定されたいずれかの乳酸デヒドロゲナーゼコード領域を、キメラ遺伝子に由来するＬＡＢにおける発現のためのプロモーターに機能的に結合することができる。さらに、好適な乳酸デヒドロゲナーゼ酵素は、ＥＣ番号ＥＣ１．１．１．２７（Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ）またはＥＣ１．１．１．２８（Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ）として分類されている。リボソーム結合部位および終結制御領域をキメラ発現遺伝子に含めることができる。キメラ遺伝子は、典型的にはＬＡＢ細胞において自律増殖を可能にする選択マーカーおよび配列を含む発現ベクターまたはプラスミドに構築される。さらに、ＬＡＢ細胞において活性であるネイティブプロモーターを有するネイティブｌｄｈまたはａｌｄＢ遺伝子を、プラスミドの発現に使用することができる。

ＬＡＢ細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼコード領域の発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは、当業者によく知られている。いくつかの例としては、ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒ、およびｒｒｎＣ１プロモーター；ｎｉｓＡプロモーター（グラム陽性細菌における発現に有用（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４巻（８号）：２７６３〜２７６９頁（１９９８年））；ならびに合成Ｐ１１プロモーター（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に有用、Ｒｕｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５２巻：１０１１〜１０１９頁（２００６年））が挙げられる。さらに、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のｌｄｈＬ１およびｆａｂＺ１プロモーターは、ＬＡＢにおけるキメラ遺伝子の発現に有用である。ｆａｂＺ１プロモーターは、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストイル−［アシルキャリアータンパク質］デヒドラターゼをコードする第１の遺伝子ｆａｂＺ１を有するオペロンの転写を指図する。

終結制御領域も、様々な遺伝子、典型的には好ましい宿主に固有の遺伝子に由来することがある。場合によっては、終結部位が不必要なこともあるが、含まれる場合が最も好ましい。

ＬＡＢ細胞において有用なベクターまたはプラスミドとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）とＬＡＢの両方において複製および選択を可能にする２つの複製開始点および２つの選択マーカーを有するものが挙げられる。一例はｐＦＰ９９６であり、その配列は配列番号：９７として記載されるものであり、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および他のＬＡＢにおいて有用である。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換で使用される多くのプラスミドおよびベクターは、一般にＬＡＢに使用することができる。好適なベクターは限定されるものではないが、例えば、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ、１８３巻：１７５〜１８２頁（１９９６年）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ、１３７巻：２２７〜２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６２巻：１４８１〜１４８６頁（１９９６年））；接合プラスミドｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４巻：５８００〜５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３巻：４５８１〜４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７巻：１２６２〜１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３８巻：１８９９〜１９０３頁（１９９４年））などが挙げられる。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のプラスミドもいくつか報告されている（例えば、ｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ Ｒ、Ｇｏｌｉｃ Ｎ、Ｂｏｎｇｅｒｓ Ｒ、Ｌｅｅｒ ＲＪ、ｄｅ Ｖｏｓ ＷＭ、Ｓｉｅｚｅｎ ＲＪ、Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ Ｍ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００５年３月；７１巻（３号）：１２２３〜１２３０頁）。

ベクターまたはプラスミドは、電気穿孔法（Ｃｒｕｚ−Ｒｏｄｚら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２２４巻：１２５２〜１５４頁（１９９０年）、Ｂｒｉｎｇｅｌら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３３巻：６６４〜６７０頁（１９９０年）、Ａｌｅｇｒｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ、２４１巻：７３〜７７頁（２００４年））や接合（Ｓｈｒａｇｏら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５２：５７４−５７６（１９８６））など、当技術分野において公知である方法を使用して宿主細胞に導入することができる。

ｌｄｈおよびａｌｄＢ改変を備えた細胞を回収した後、細胞から発現プラスミドが除去される。プラスミドの除去は、当業者に公知であるいずれかの方法で実施することができる。典型的には、温度感受性の複製開始点が使用され、プラスミド保持細胞の制限温度における増殖によって、プラスミドが失われる。例えば、別の方法は、ネガティブ選択マーカーを除去対象のプラスミド上に配置することであり、この選択質物質の存在下での増殖によって、プラスミドが失われる。

ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減すること
本細胞におけるｌｄｈおよびａｌｄＢ遺伝子の上述された改変に加えて、内因性のピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減する少なくとも１つの改変を場合によっては有することができる。ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性はピルビン酸をギ酸に変換する（図１を参照のこと）。細胞におけるピルビン酸ギ酸リアーゼの活性を低減するか、またはなくすことができる。好ましくは、活性がなくなる。

ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の発現には、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）をコードする遺伝子およびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードする遺伝子は必要である。ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減するために、これらの遺伝子のどちらかまたは両方において改変を行うことができる。ＬＡＢの特定の株において、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素のそれぞれをコードする遺伝子が１つまたは複数存在し得る。例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＣＦＳ１は、２つのｐｆｌ遺伝子（ｐｆｌＢ１：コード領域配列番号：３９、タンパク質配列番号：４０；およびｐｆｌＢ２：コード領域配列番号：４１、タンパク質配列番号：４２）および２つのｐｆｌ活性化酵素遺伝子（ｐｆｌＡ１：コード領域配列番号：４３、タンパク質配列番号：４４；およびｐｆｌＡ２：コード領域配列番号：４５、タンパク質配列番号：４６）を含み、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２は、１つのｐｆｌ遺伝子（ｐｆｌＢ２）および１つのｐｆｌ活性化酵素遺伝子（ｐｆｌＡ２）しか含まない。生成宿主細胞において所望の生成条件下に活性である、ｐｆｌをコードする遺伝子すべて、および／または生成宿主細胞において所望の生成条件下に活性である、ｐｆｌ活性化酵素をコードする遺伝子すべてで、発現は低減される。

ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減するように改変することができるｐｆｌ遺伝子の例は、配列番号：３９、４１、４７、および５１のコード領域で表わされる。改変のための他の標的遺伝子としては、配列番号：４０、４２、４８、および５２を有するピルビン酸ギ酸リアーゼタンパク質をコードするもの、およびこれらのタンパク質のうちの１つと少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードするものが挙げられ、これらは、当業者に周知のように文献でまたバイオインフォマティクス手法を使用して、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質について上述されたように同定することができる。さらに、上記のように、本明細書に記載された配列または当技術分野で列挙されているものを使用して、自然界における他の相同体を同定することができる。

ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減するように改変することができるｐｆｌ活性化酵素遺伝子の例は、配列番号：４３、４５、４９、および５３のコード領域で表わされる。改変のための他の標的遺伝子としては、配列番号：４４、４６、５０、５４を有するピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素タンパク質をコードするもの、およびこれらのタンパク質のうちの１つと少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードするものが挙げられ、これらは、当業者に周知のように文献でまたバイオインフォマティクス手法を使用して、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質について上述されたように同定することができる。さらに、上記のように、本明細書に記載された配列または当技術分野で列挙されているものを使用して、自然界における他の相同体を同定することができる。

当業者で公知のタンパク質の発現を低減する遺伝子改変方法のいずれでも使用して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を変更することができる。ピルビン酸ギ酸リアーゼおよび／またはピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素遺伝子の発現を低減またはなくす方法としては、遺伝子の全部または一部分の欠失、コード化タンパク質が発現し得ないまたは低減された発現を有するように、遺伝子にＤＮＡ断片を（プロモーターまたはコード領域で）挿入すること、突然変異をコード領域に導入し、機能タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを加えること、および１つまたは複数の突然変異をコード領域に導入して、アミノ酸を非機能タンパク質または機能低下タンパク質が発現されるように変更することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、標的遺伝子由来の発現を、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によって部分的にまたは実質的にブロックすることができ、コサプレッションを生じる構築物を導入することができる。

イソブタノール生成
本発明の一実施形態において、上述されたｌｄｈおよびａｌｄＢ遺伝子へのエンジニアリングされた改変、およびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を場合によっては低減する改変を備えたＬＡＢ細胞が、イソブタノールを生成する。イソブタノール合成のための生合成経路は、同時係属中の米国特許出願公開第２００７／００９２９５７（Ａ１）号明細書に開示され、これは参照により本明細書に組み込まれる。開示されたイソブタノール生合成経路の線図は、図１に記載される。遺伝子工学によって作製された本明細書に開示されるＬＡＢ細胞において、イソブタノールの生成は、ｌｄｈおよびａｌｄＢ遺伝子によって発現される酵素活性をなくすことによって増大し、ｐｆｌおよび／またはｐｆｌＡ遺伝子の発現をなくすことによってさらに増大する。

さらに、参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願公開第２０１０／００８１１８２号明細書に開示されるように、ＬＡＢ宿主細胞を、Ｆｅ−Ｓクラスター形成タンパク質の発現が増大されるようにエンジニアリングして、イソブタノール経路のＦｅ−Ｓクラスターを必要とするジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素の活性を改善することができる。例えば、本明細書の実施例２に記載のように、Ｆｅ−Ｓクラスター形成タンパク質をコードする内因性ｓｕｆオペロンの発現を増大させることができる。

米国特許出願公開第２００７／００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載のように、イソブタノール生合成経路例のステップは、
例えば、ＥＣ番号２．２．１．６９で知られるアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）によって触媒されるピルビン酸からアセト乳酸への変換（図２経路ステップａ）；
例えば、ＥＣ番号１．１．１．８６で知られるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、別名ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によって触媒されるアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換（図２経路ステップｂ）；
例えば、ＥＣ番号４．２．１．９で知られるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、別名ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）によって触媒される２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換（図２経路ステップｃ）；
例えば、ＥＣ番号４．１．１．７２で知られる分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるα−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換（図２経路ステップｄ）；および
例えば、ＥＣ番号１．１．１．２６５で知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）に分類されることもある分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図２経路ステップｅ）
を含む。

代替経路のステップｆ、ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ、およびｋの場合、基質から生成物への変換、およびこれらの反応に関与する酵素は、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されている。

これらの酵素の発現に使用することができる遺伝子、および追加の２つのイソブタノール経路用の遺伝子については、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されており、上述されたように、使用することができる追加の遺伝子は、当業者に周知のように文献およびバイオインフォマティクス手法を使用して同定することができる。さらに、そこに記載される配列を使用して、上述されたように当技術分野において周知である配列依存性プロトコルを用いて、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。

例えば、使用することができる代表的ＡＬＳ酵素のなかには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のａｌｓＳおよびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のｂｕｄＢによってコードされるものも含まれる（Ｇｏｌｌｏｐら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２巻（６号）：３４４４〜３４４９頁（１９９０年）；Ｈｏｌｔｚｃｌａｗら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１２１巻（３号）：９１７〜９２２頁（１９７５年））。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：５５；タンパク質：配列番号：５６）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：５８；タンパク質：配列番号：５９）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：６０；タンパク質：配列番号：６１）由来のＡＬＳが本明細書に記載されている。使用することができる追加のＡｌｓコード領域およびコード化タンパク質としては、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：６２；タンパク質：配列番号：６３）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＤＮＡ：配列番号：６４；タンパク質：配列番号：６５）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ：配列番号：６６；タンパク質：配列番号：６７）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：６８；タンパク質：配列番号：６９）、ビブリオ・アングスツム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｓｔｕｍ）（ＤＮＡ：配列番号：７０；タンパク質：配列番号：７１）、およびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：７２；タンパク質：配列番号：７３）由来のものが挙げられる。ピルビン酸をアセト乳酸に変換する配列番号：５６、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、または７３を有するもののうちのいずれか１つと少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、もしくは９８％の配列同一性を有するアセト乳酸合成酵素をコードするＡｌｓ遺伝子を使用することができる。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づくものである。

さらに、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書は、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ配列の１００の最近傍であり、それらのいずれも使用することができるアセト乳酸合成酵素を表す系統樹を提供する。本株で使用することができる追加のＡｌｓ配列は、当業者に周知のように文献およびバイオインフォマティクスデータベースで同定することができる。バイオインフォマティクスを使用したコード配列および／またはタンパク質配列の同定は、典型的には本明細書に記載されているものなど、既知のＡｌｓをコードする配列またはコード化アミノ酸配列に関して公的に利用可能なデータベースの（上記の）ＢＬＡＳＴ検索によって行われる。同定は、以上に指定したＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づいている。さらに、上記のように、本明細書に列挙された配列または当技術分野で列挙されているものを使用して、自然界における他の相同体を同定することができる。

例えば、使用することができるＫＡＲＩ酵素は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：７４；タンパク質配列番号：７５）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：７６；タンパク質配列番号：７７）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１（ＤＮＡ：配列番号：７８；タンパク質配列番号：７９）、または蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５（ＤＮＡ：配列番号：８０；タンパク質配列番号：８１）のｉｌｖＣ遺伝子由来のものとすることができる。後者の３つは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書に開示されている。追加のＫＡＲＩ酵素については、米国仮特許出願第６１／２４６８４４号明細書、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３号明細書、同第２００９／０１６３３７号明細書、および同第２０１０／０１９７５１号明細書に記載されている。

例えば、使用することができるＤＨＡＤ酵素は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：８２；タンパク質配列番号：８３）またはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ：配列番号：８４；タンパク質配列番号：８５）のｉｌｖＤ遺伝子由来のものとすることができ、さらに使用することができるＤＨＡＤコード領域およびコード化タンパク質の配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／００８１１８３号明細書に記載されている。この参考文献には、使用することができる追加のＤＨＡＤ配列を得るための説明も含まれている。

例えば、使用することができる分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ酵素としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：８６；タンパク質配列番号：８７）のｋｉｖＤ遺伝子および上述されたようにバイオインフォマティクスを使用して当業者が同定することができる他のものに由来するものが挙げられる。

例えば、使用することができる分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．２６５で知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）に分類されることもある。これらの酵素は、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド）および／またはＮＡＤＰＨを電子供与体として利用し、使用することができる分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ酵素およびそれらのコード領域の配列は、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されている。

さらに、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）（ＤＮＡ：配列番号：９１、タンパク質配列番号：９２）であると同定された細菌の環境単離物から単離された新規ブタノールデヒドロゲナーゼは、イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する最後のステップに有用である。

乳酸デヒドロゲナーゼ活性を実質的に含まないＬＡＢ細胞におけるＤＨＡＤの活性の改善は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／００８１１８３号明細書に開示された。さらに、鉄−硫黄クラスター形成タンパク質の発現を増大させて、ＤＨＡＤの活性を改善することが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／００８１１８３号明細書に開示された。

米国特許出願公開第２００７／００９２９５７（Ａ１）号明細書には、キメラ遺伝子の構築およびＬＡＢの遺伝子工学が記載されており、開示された生合成経路を使用するイソブタノール生成にはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が例示されている。当業者に周知であり、本明細書の実施例に記載されているように、経路酵素発現のためのキメラ遺伝子は、細胞中で複製プラスミド上に存在し、または細胞ゲノムに組み込まれることがある。本明細書において、開発された新規組込み方法は以下に記載され、実施例３で使用される。

追加の生成物
本発明のエンジニアリングされたＬＡＢ細胞を、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を必要とすることなくアセト乳酸から作製される他の生成物の生成に使用して、改良された生成を実現することができる。これらの生成物としては、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸（ビタミンＢ５）、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール（イソアミルアルコール）、およびジアセチルを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらのまたは他の生成物の生成では、本ＬＡＢ細胞は、所望の生成物のための生合成経路をさらに有するものであり、それは内因性のもの、エンジニアリングされたもの、または両方を組み合わせたものとすることができる。

例えば、バリンの生合成経路は、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（ｉｌｖＣ）によるアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換ステップ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）による２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸（別名２−ケト−イソ吉草酸）への変換ステップ、および分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ）によるα−ケトイソ吉草酸からバリンへの変換ステップを含む。ロイシンの生合成は、α−ケトイソ吉草酸への同じステップと、続いてｌｅｕＡ（２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素）、ｌｅｕＣＤ（イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ）、ｌｅｕＢ（３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）、およびｔｙｒＢ／ｉｌｖＥ（芳香族アミノ酸トランスアミナーゼ）によってコードされる酵素によるα−ケトイソ吉草酸からロイシンへの変換を含む。パントテン酸の生合成は、α−ケトイソ吉草酸への同じステップと、続いてｐａｎＢ（３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）、ｐａｎＥ（２−デヒドロパントイン酸レダクターゼ）、およびｐａｎＣ（パントイン酸−β−アラニンリガーゼ）によってコードされる酵素によるα−ケトイソ吉草酸からパントテン酸への変換を含む。微生物においてパントテン酸の生成を向上させるための酵素の発現をエンジニアリングすることが、米国特許第６１７７２６４号明細書に記載されている。

２−ケト酸デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ）を使用して、アミノ酸生合成経路から２−ケト酸を変換することによって、２−メチル−１−ブタノールおよび３−メチル−１−ブタノールを生成することができる（ＡｔｓｕｍｉおよびＬｉａｏ、（２００８年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９巻：４１４〜４１９頁）。

ｌｄｈおよびａｌｄＢの発現をなくすことと組み合わせて、これらの経路のうちのいずれかにおける少なくとも１つの遺伝子の発現の増大を利用して、経路の生成物の生成を増大させることができる。ＬＡＢには、バリン、イソロイシンおよびロイシンのための分枝鎖アミノ酸経路を生来有するもの（ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）など）もあるが、そのような経路を有していないもの（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）など）もある。所望の生成物または所望の生成物の前駆体を生成する内因性経路をもたないＬＡＢは、欠損している経路酵素の発現のためのエンジニアリングが必要である。当業者は、所望の経路にどの酵素が存在し、欠損しているかを容易に評価することができる。

ジアセチルは、酵素活性を必要とすることなく、酸素の存在下にアセト乳酸から自発的に生成される。

ＬＡＢにおけるＴｎ５によって媒介される転移
所望の生合成経路の酵素を発現する遺伝子などの外来遺伝子発現の長期維持および安定には、発現遺伝子を細胞ゲノムに組み込むのが望ましいことがある。本明細書では、ＬＡＢ細胞におけるＴｎ５転移系を利用するベクターを調製した。ＬＡＢ細胞のゲノムへのランダムな組込みは、本明細書で開発されたＴｎ５転移ベクターを使用して実現されたことが明らかになった。組込みの場合、ベクターは、ＬＡＢ細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されており、それから発現されるＴｎ５トランスポザーゼコード領域（配列番号：９３；コード化タンパク質配列番号：９４）（その例は以上に列挙される）、ならびにトランスポザーゼ認識配列Ｔｎ５ＩＥおよびＴｎ５ＯＥ（配列番号：９５および９６）を含むものである。配列番号：９４と少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有し、Ｔｎ５トランスポザーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列であればいずれでも、ベクターで使用することができる。Ｔｎ５ＩＥとＴｎ５ＯＥとの間に、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位によりフランキングされたクロラムフェニコール耐性遺伝子、および多重クローニング部位（ＭＣＳ）がある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＬＡＢ細胞において活性な選択マーカーはいずれも、クロラムフェニコール耐性遺伝子の置き換わることができ、その例は、テトラサイクリン耐性マーカー、スペクチノマイシン耐性マーカー、およびエリスロマイシン耐性マーカーである。Ｃｒｅリコンビナーゼ部位はオプションである。さらに、ベクターは、Ｔｎ５転移ベクターの転移および消失をスクリーニングするために使用される第２のマーカー遺伝子を有する。この第２のマーカーは、以上に列挙したもののいずれも含めて、ＬＡＢ細胞において活性なマーカーであればいずれでもよい。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＬＡＢの複製開始点も有する。ＬＡＢの複製開始点は、温度感受性など条件次第で活性である。このベクターを使用して、典型的にはＭＣＳにおいてＴｎ５ＩＥとＴｎ５ＯＥの構成要素の間に配置されたＤＮＡセグメントをＬＡＢ細胞のゲノムにランダムに組み込むことができる。Ｔｎ５ＩＥとＴｎ５ＯＥの構成要素の間にＤＮＡセグメントを有する記載のベクターは、組込み構築物である。例えば、ベクターは、乳酸菌細胞のための温度感受性の複製開始点を有し、クロラムフェニコール耐性マーカーを使用して、形質転換体が選択される。形質転換体は、許容状態（典型的には３０℃の温度）で約１０世代増殖され、その間に組込みが行われる。次いで、形質転換体を非許容状態（典型的には３７℃の温度）で約２０世代増殖させて、プラスミドを除去し、クロラムフェニコール耐性コロニーをエリスロマイシン感受性（第２のマーカーの消失）についてスクリーニングして、プラスミドの消失を確認する。当技術分野において周知のように、クロラムフェニコール耐性マーカーは、細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼの発現によって典型的にはプラスミド上のキメラ遺伝子から切除することができる。

生成のための増殖
本明細書に開示される組換えＬＡＢ細胞は、以下の通りイソブタノールまたは他の生成物の発酵生成に使用することができる。組換え細胞は、好適な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。適切な基質としては、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトースもしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖、またはそれらの混合物、ならびにチーズホエー透過物、コーンスティープリカー、シュガービート糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能なフィードストックの未精製混合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

上記の炭素基質およびその混合物はすべて、本発明において適切であると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ（ｃａｓｓａｖａ）、サトウモロコシ（ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈｕｍ）、およびそれらの混合物などの再生可能な糖源に由来するものとすることができる。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀物を含めて、デンプン系フィードストックの糖化を経由した再生可能な穀物源に由来するものとすることができる。さらに、発酵性糖は、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／００３１９１８（Ａ１）号明細書に記載されているように、再生可能なセルロースまたはリグノセルロースバイオマスから、前処理および糖化のプロセスを経て誘導することができる。バイオマスは、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を指すものであり、セルロースを含み、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖を場合によってはさらに含む材料が挙げられる。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などの追加の成分も含むことができる。バイオマスは、単一の供給源に由来するものとすることができ、またはバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含むことができる。例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物または草と葉の混合物を含んでもよい。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、公共固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙スラッジ、庭ゴミ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ子実、トウモロコシ穂軸；トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、乾草、稲わら、スイッチグラス（ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ）、故紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆などの作物残渣；穀物、高木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および灌木、野菜、果物、花、動物性肥料、ならびにそれらの混合物の粉砕から得られた成分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

発酵培地は、適切な炭素源に加えて、イソブタノール生成にとって必要である培養物の増殖および酵素経路の促進に適した、当業者に公知の適切な鉱物、塩、補因子、緩衝液、および他の成分を含有しなければならない。

典型的には、細胞は適切な培地中、約２５℃から約４０℃の範囲の温度で増殖される。好適な増殖培地は、Ｂａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳブロスもしくは寒天（Ｄｉｆｃｏ）、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、または酵母用培地（ＹＭ）ブロスなどの工業的に調製された一般的な培地である。他の定義されたまたは合成の増殖培地も使用することができ、特定の菌株の増殖に適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知であろう。カタボライトリプレッションを直接的または間接的に調節することが知られている物質、例えば環状アデノシン２’，３’−モノリン酸の使用も、発酵培地に組み込むことができる。

発酵に適切なｐＨ範囲はｐＨ３．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。

発酵は、好気性または嫌気性条件下で行うことができ、嫌気性または微好気性条件が好ましい。

イソブタノール、または他の生成物の生成は、バッチ、フェドバッチ、または連続プロセスを使用して実施することができること、公知の発酵モードならいずれも適しているはずであることが考えられる。さらに、細胞を基質に全細胞触媒として固定化し、イソブタノール生成の発酵条件にかけることができると考えられる。

イソブタノールの発酵培地からの単離方法
生合成されたイソブタノールは、ＡＢＥ発酵について当技術分野において公知である方法を使用して発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４９巻：６３９〜６４８頁（１９９８年）、Ｇｒｏｏｔら、Ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７巻：６１〜７５頁（１９９２年）、およびそれらの引用文献を参照のこと）。例えば、固体は、発酵培地から遠心、濾過、デカンテーションなどによって除去することができる。次いで、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸留、または浸透気化などの方法を使用して発酵培地から単離することができる。

略語の意味は以下の通りである：「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチ当たりポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ_６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、、「ｇ」は引力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロベース対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量％を意味し、「％ｖ／ｖ」は容量／容量％を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。「モル選択性」という用語は、消費された糖基質１モル当たり生成された生成物のモル数であり、％で報告される。「ＳＬＰＭ」は、（空気の）１分当たりの標準リットルを表し、「ｄＯ」は溶存酸素であり、ｑ_ｐは、細胞１グラム当たりのイソブタノール（単位：グラム）として経時的に測定された「比生産性」である。

一般方法
当技術分野において公知である標準分子生物学的方法を使用して、組換えプラスミドを構築した。制限および改変酵素すべて、ならびにＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）から購入した。ＤＮＡ断片をＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）で精製した。プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）で調製した。Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡを、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）で調製した。オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ， ＴＸ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）によって合成された。

形質転換
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２を、下記の手順で形質転換した：１％グリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地（Ａｃｃｕｍｅｄｉａ、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）５ｍｌに、ＰＮ０５１２細胞を播種し、３０℃で一晩増殖させた。１％グリシン含ＭＲＳ培地１００ｍｌに、一晩培養物を０．１のＯＤ６００まで播種し、３０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を、３７００ｘｇで８分間、４℃で収穫し、１ｍＭの冷ＭｇＣｌ_２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで８分間、４℃で遠心し、冷３０％ＰＥＧ−１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで２０分間、４℃で再び遠心し、次いで１ｍｌの冷３０％ＰＥＧ−１０００に再懸濁した。６０μｌの細胞を、ギャップ１ｍｍの冷エレクトロポレーションキュベット中で、約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で１．７ｋＶ、２５μＦ、および４００Ωにおいて電気穿孔した。５００ｍＭスクロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１００ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有するＭＲＳ培地１ｍｌに、細胞を再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートし、１または２μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に蒔き、次いでＰａｃｋ−Ａｎａｅｒｏサシェ（三菱ガス化学株式会社、日本、東京）が入っている嫌気性ボックスに入れ、３０℃でインキュベートした。

実施例１
ｉｌｖＤ組込み型ベクターおよびＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋組込み株の構築
この実施例は、ＤＨＡＤの発現のため、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株ＰＮ０５１２ ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１の染色体へのラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤ遺伝子の組込みを説明する。Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１の構築は、参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国仮特許出願第６１／１００７８６号明細書の実施例１に記載された通りである。この株は、主要な乳酸デヒドロゲナーゼをコードする２つの遺伝子：ｌｄｈＤおよびｌｄｈＬ１について欠失している。この二重欠失体は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２（ＡＴＣＣ株＃ＰＴＡ−７７２７）において作製された。

２段階相同組換え手順に基づくプロセスを使用して、遺伝子ノックアウトが構築されて、無マーカー遺伝子欠失体が得られた（Ｆｅｒａｉｎら、１９９４年、Ｊ． Ｂａｃｔ．、１７６巻：５９６頁）。この手順では、シャトルベクターｐＦＰ９９６（配列番号：９７）が利用された。ｐＦＰ９９６は、グラム陽性細菌用のシャトルベクターである。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とグラム陽性細菌において複製することができる。ｐＢＲ３２２（ヌクレオチド＃２６２８から５３２３）およびｐＥ１９４（ヌクレオチド＃４３から２６２７）からの複製開始点を含む。ｐＥ１９４は、本来グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍ Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９８２年）、１５０巻（２号）：８０４〜８１４頁）から単離された小型プラスミドである。ｐＦＰ９９６において、複数のクローニング部位（ヌクレオチド＃１から５０）は、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＳｍａＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ用の制限部位を含む。抗生物質耐性マーカーは２つ存在する；一方は、アンピシリン耐性のものであり、他方はエリスロマイシン耐性のものである。選択のため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における形質転換にはアンピシリンを使用し、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における選択にはエリスロマイシンを使用した。

ＤＮＡの２つのセグメントはそれぞれ、９００から１２００ｂｐの配列を所期の欠失の上流または下流に含むものであるが、プラスミドにクローニングして、２つの遺伝子クロスオーバー用の相同性領域を提供した。細胞を、世代数（３０〜５０）を増加するのに増殖させて、クロスオーバー事象が起こることを可能にした。最初のクロスオーバー（シングルクロスオーバー）では、プラスミドがプラスミド上の２つの相同性領域のうちの１つを介した相同組換えにより染色体に組み込まれた。第２のクロスオーバー（ダブルクロスオーバー）事象では、野生型配列または所期の遺伝子欠失体が得られた。最初の組込み事象を引き起こした配列間のクロスオーバーは野生型配列をもたらし、他の相同性領域間クロスオーバーは所望の欠失体をもたらすはずである。第２のクロスオーバー事象を、抗生物質感受性によりスクリーニングした。シングルおよびダブルのクロスオーバー事象を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により分析した。

ΔｌｄｈＤ
ｌｄｈＤ遺伝子を欠失させるためのノックアウトカセットは、ＥｃｏＲＩ部位を含むＴｏｐ Ｄ Ｆ１（配列番号：９８）とＴｏｐ Ｄ Ｒ１（配列番号：９９）のプライマーを有する上流フランキング領域であるＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させることによって作製した。ｌｄｈＤのコード配列の一部分を含む下流の相同性領域を、Ｂｏｔ Ｄ Ｆ２（配列番号：１００）とＸｈｏＩ部位を含むＢｏｔ Ｄ Ｒ２（配列番号：１０１）のプライマーで増幅させた。２つの相同性領域を、以下の通りＰＣＲ ＳＯＥにより合わせた。０．９ｋｂｐの上流および下流ＰＣＲ生成物をゲル精製した。ＰＣＲ生成物を、ＰＣＲ反応において等量で混合し、プライマーＴｏｐ Ｄ Ｆ１およびＢｏｔ Ｄ Ｒ２で再増幅させた。１．８ｋｂｐの最終ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＴＯＰＯをｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ベクターｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ：：ｌｄｈＤを作製した。ｌｄｈＤ遺伝子の内部欠失を保有している組込み型ベクターを作製するために、ｐＦＰ９９６をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、５３１１−ｂｐの断片をゲル精製した。ベクターｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ：：ｌｄｈＤをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、１．８ｋｂｐの断片をゲル精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、ｌｄｈＤノックアウトカセットとベクターを連結させ、ベクターｐＦＰ９９６：：ｌｄｈＤ ｋｏを得た。

エレクトロコンピテントなラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２細胞を調製し、ｐＦＰ９９６：：ｌｄｈＤ ｋｏで形質転換し、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳに蒔いた。シングルクロスオーバー事象（ｓｃｏ）を得るために、形質転換体を、ＭＲＳ培地中、３７℃で約５０世代継代培養した。増殖した後、単一コロニーについて、一定分量ずつを、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳ上に蒔いた。プライマーｌｄｈＤ Ｓｅｑ Ｆ１（配列番号：１０２）およびＤチェックＲ（配列番号：１０３）を使用したＰＣＲ増幅により、エリスロマイシン耐性コロニーをスクリーニングして、野生型とｓｃｏ事象を保有するクローンとを識別した。ダブルクロスオーバーを有するクローンを得るために、ｓｃｏ株を、２０ｍＭのＤ，Ｌ−ラクタート含ＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、３７℃で約３０世代継代培養し、次いで単一コロニーについて、ラクタート含ＭＲＳ上に蒔いた。コロニーを摘出し、ラクタート含ＭＲＳおよび１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクタート含ＭＲＳ上にパッチして、エリスロマイシンに感受性を示すコロニーを見出した。感受性を示すコロニーを、プライマーＤチェックＲ（配列番号：１０３）およびＤチェックＦ３（配列番号：１０４）を使用したＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。野生型コロニーは３．２ｋｂｐの生成物をもたらし、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤと呼ばれる欠失クローンは２．３ｋｂｐのＰＣＲ生成物をもたらした。

ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１
ダブルΔｌｄｈＬ１ΔｌｄｈＤ欠失株を作製するために、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤ株において、ｌｄｈＬ１遺伝子の欠失を行った。ｌｄｈＬ１遺伝子を欠失させるためのノックアウトカセットを、ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。ｌｄｈＬ１左ホモロジーアームは、ＢｇｌＩＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３１（配列番号：１０５）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３２（配列番号：１０６）を使用して増幅させた。ｌｄｈＬ１右ホモロジーアームは、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３３（配列番号：１０７）およびＸｍａＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３４（配列番号：１０８）を使用して増幅させた。ｌｄｈＬ１左ホモロジーアームを、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングし、ｌｄｈＬ１右ホモロジーアームを、ｐＦＰ９９６の誘導体であるｐＦＰ９９６ｐｙｒＦΔｅｒｍのＸｈｏＩ／ＸｍａＩ部位にクローニングした。ｐＦＰ９９６ｐｙｒＦΔｅｒｍは、ｐＦＰ９９６におけるエリスロマイシンコード領域の代わりに、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２由来のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするｐｙｒＦ配列（配列番号：１０９）を含む。第２の相同クロスオーバーを単離するために、プラスミド由来のｐｙｒＦ遺伝子は、ΔｐｙｒＦ株における化学物質５−フルオロオロチン酸と一緒に有効的な対抗選択方法として使用することができる。ＸｍａＩ消化の後に、ｌｄｈＬ１ホモロジーアームを含むＸｍａＩ断片を単離し、ｐＦＰ９９６のＸｍａＩ制限部位にクローニングし、９００ｂｐの左相同性領域および１２００ｂｐの右相同性領域が得られ、ベクターｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１−アームが作製された。

ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤを、ｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１−アームで形質転換し、ラクタート（２０ｍＭ）およびエリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、３０℃で約１０世代増殖させた。次いで、形質転換体を、ＭＲＳ＋ラクタート中、非選択的条件下に、一連の播種により３７℃で約５０世代増殖させた後、ラクタートおよびエリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＭＲＳ上に培養物を蒔いた。単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１１０）およびプラスミド特異的プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１１１）を使用して、コロニーＰＣＲにより、シングルクロスオーバーについてスクリーニングした。シングルクロスオーバー組込み体を、ラクタート含ＭＲＳ中で、非選択的条件下に３７℃で、一連の播種により約４０世代増殖させた後、培養物をラクタート含ＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物をラクタート含ＭＲＳプレートにパッチし、３７℃で増殖し、次いでラクタートおよびエリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含むＭＲＳプレート上にパッチした。エリスロマイシン感受性単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１１０）およびｏＢＰ５６（配列番号：１１２）を使用して、コロニーＰＣＲにより、野生型または欠失第２クロスオーバーの有無についてスクリーニングした。野生型配列は、３５０５ｂｐの生成物をもたらし、欠失配列は、２５４５ｂｐの生成物をもたらした。欠失体は、ＰＣＲ生成物を配列決定することによって確認し、プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１１１）およびｏＢＰ５７（配列番号：１１３）を用いたコロニーＰＣＲにより、プラスミドが存在していないことを検査した。

ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ダブルｌｄｈＤｌｄｈＬ１欠失株をＰＮＰ０００１と称した。ΔｌｄｈＤ欠失体は、ｌｄｈＤ開始コドンがアミノ酸３３２の２７９を経由したその上流に８３ｂｐを含むものであった。ΔｌｄｈＬ１欠失体は、最終アミノ酸を経由したｆＭｅｔを含むものであった。

第２のクロスオーバー事象が野生型配列、または欠失体でなく所期の組込み体をもたらした点以外は、同じ２段階相同組換え手順で、ｐＦＰ９９６シャトルベクターを使用して、ｌｄｈＬ１プロモーターから発現されたＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤコード領域の単一コピーの染色体組込み体が構築されて、上記の無マーカー組込み体を得た。ＤＮＡの２つのセグメントは、配列を所期の組込み部位の上流および下流に含むものであるが、プラスミドにクローニングして、２つの遺伝子クロスオーバーのための相同性領域を提供した。

組込みによって、ｉｌｖＤコード領域がＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１株におけるｌｄｈＬ１プロモーターの下流に配置されることになるような、２つの遺伝子クロスオーバー用の相同性領域が提供されるように、２つのＤＮＡセグメント（ホモロジーアーム）を設計した。プラスミドにクローニングした左右のホモロジーアームはそれぞれ、約１２００塩基対であった。左ホモロジーアームは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＢｇｌＩＩ制限部位を含むプライマーＢＰ３１（配列番号：１０５）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３２（配列番号１０６）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。右ホモロジーアームは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３３（配列番号：１０７）およびＸｍａＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３４（配列番号：１０８）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。左ホモロジーアームをＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、右ホモロジーアームをＸｈｏＩおよびＸｍａＩで消化した。２つのホモロジーアームは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結させて、ｐＦＰ９９６の対応する制限部位になり、適切な制限酵素で消化された後、ベクターｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アームが形成される。

ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（配列番号：８２）由来のｉｌｖＤコード領域およびリボソーム結合配列（ＲＢＳ；配列番号：１１４）を含むＤＮＡ断片を、ｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））（配列番号：１１５）から増幅させた。ｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））の構築は、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／１００８０９号明細書に記載された。このプラスミドは、ＰＣＲによるＬ．ラクティス亜種ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８（ＮＣＩＭＢ ７０２１１８）由来のｉｌｖＤコード領域（Ｇｏｄｏｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９９２年）、１７４巻：６５８０〜６５８９頁）および５”ＰＣＲプライマーにおいて追加されたリボソーム結合配列（配列番号：１１４）を含むｐＤＭ２０である。ｐＤＭ２０は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ１４９１７プラスミドｐＬＦ１由来の最小ｐＬＦ１レプリコン（約０．７Ｋｂｐ）およびｐｅｍＫ−ｐｅｍＩ毒素−抗毒素（ＴＡ）、ｐＡＣＹＣ１８４由来のＰ１５Ａレプリコン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の両方における選択用のクロラムフェニコール耐性マーカー、ならびにＰ３０合成プロモーターを含む改変されたｐＤＭ１（配列番号：１１６）である（Ｒｕｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（２００６年）１５２巻：１０１１〜１０１９頁）。マルチクローニング部位で置換された、ｌａｃＺ領域に及ぶヌクレオチド３２８１〜３６４６を欠失させることによって、ベクターｐＤＭ１を改変した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＸｈｏＩ部位を含むｏＢＰ１２０（配列番号：１１７）、ならびにＤｒｄＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩ部位を含むｏＢＰ１８２（配列番号：１１８）を使用して、ｐＤＭ１由来のＰ３０プロモーターを増幅させた。得られたＰＣＲ生成物およびｐＤＭ１ベクターをＸｈｏＩおよびＤｒｄＩで消化した。これによって、ｌａｃＺおよびＰ３０が脱落する。ＰＣＲ生成物とｐＤＭ１消化の大型断片を連結させて、ベクターｐＤＭ２０を生成した。ここでは、Ｐ３０プロモーターが再挿入され、ＸｈｏＩおよびＤｒｄＩ制限部位によって結合された。

Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））を鋳型として使用し、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２４６（配列番号：１１９）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２３７（配列番号：１２０）を用いて、ｉｌｖＤコード領域およびＲＢＳを含むＤＮＡ断片（配列番号：１２１）をＰＣＲにより得た。ＸｈｏＩで消化した後、得られたＰＣＲ生成物とｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アームをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させた。ベクター特異的プライマーｏＢＰ５７（配列番号：１１３）およびｉｌｖＤ特異的プライマーｏＢＰ２３７（配列番号：１２１）を使用して、クローンを、左ホモロジーアームにおけるｌｄｈＬ１プロモーター同じ配向のインサートについて、ＰＣＲによりスクリーニングした。正しく配向されたインサートを有するクローンをｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アーム−ｉｌｖＤＬｌと名付けた。

Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤード領域の組込みは、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１をｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アーム−ｉｌｖＤＬｌで形質転換することによって得られた。０．５％グリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地（Ａｃｃｕｍｅｄｉａ、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）５ｍｌに、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１を播種し、３０℃で一晩増殖させた。０．５％グリシン含ＭＲＳ培地１００ｍｌに、一晩培養物を０．１のＯＤ６００まで播種し、３０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を、３７００ｘｇで８分間、４℃で収穫し、１ｍＭの冷ＭｇＣｌ_２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで８分間、４℃で遠心し、冷３０％ＰＥＧ−１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで２０分間、４℃で再び遠心し、次いで１ｍｌの冷３０％ＰＥＧ−１０００に再懸濁した。６０μｌの細胞を、ギャップ１ｍｍの冷エレクトロポレーションキュベット中で、約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で １．７ｋＶ、２５μＦ、および４００Ωにおいて電気穿孔した。５００ｍＭ スクロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有するＭＲＳ培地１ｍｌに、細胞を再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートし、次いで２μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に蒔いた。

ｉｌｖＤ特異的プライマーｏＢＰ２３７（配列番号：１２１）およびｏＢＰ２４６（配列番号：１２０）を使用して、形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングした。形質転換体を、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、３０℃で約８世代、次いでラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で、約４０世代増殖させた。培養物を、エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１１０）およびプラスミド特異的プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１１１）を使用して、コロニーＰＣＲにより、シングルクロスオーバーについてスクリーニングした。

シングルクロスオーバー組込み体を、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で約４３世代増殖させた。培養物をＭＲＳ培地上に蒔いた。コロニーをＭＲＳプレートにパッチし、３７℃で増殖させた。次いで、単離物を、エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するＭＲＳ培地上にパッチした。エリスロマイシン感受性単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１１０）およびｏＢＰ５６（配列番号：１１２）を使用して、（コロニー）ＰＣＲにより、野生型または組込み第２クロスオーバーの有無についてスクリーニングした。野生型配列は、２６００ｂｐの生成物をもたらし、組込み配列は、４３００ｂｐの生成物をもたらした。組込み体は、ＰＣＲ生成物を配列決定することによって確認し、同定された組込み株を、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋と称した。

実施例２
ｓｕｆオペロンプロモーター組込み型ベクターおよびＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋組込み株の構築
この実施例は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋の染色体への２つのプロモーターの組込みを説明する。プロモーターをｓｕｆオペロンの上流に組み込んだ。ｓｕｆオペロンの遺伝子産物は、Ｆｅ−Ｓクラスターアセンブリを担うものである。プロモーター組込みによって、内因性Ｆｅ−Ｓクラスターマシナリーの発現が増大した株になる。

上述されたように、シャトルベクターｐＦＰ９９６（配列番号：９７）を使用して、ｓｕｆオペロン染色体プロモーター組込み体が、２段階相同組換え手順で構築されて、無マーカー組込み体が得られた。

ｓｕｆオペロンプロモーター組込み型ベクターを３段階で構築した。第１のステップにおいて、ｓｕｆオペロンの５’部分（ｓｕｆＣおよびｓｕｆＤの一部分）を含む右ホモロジーアーム断片をｐＦＰ９９６にクローニングした。第２のステップにおいて、合成プロモーターであるＰ５およびＰ４［Ｒｕｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（２００６年）、１５２巻：１０１１頁］を、右アームの上流に位置するｐＦＰ９９６−右アームクローンにクローニングした。最終のステップにおいて、ネイティブｓｕｆプロモーターおよび上流の配列を含んでｆｅｏＢＡオペロンになる左ホモロジーアーム断片を、Ｐ５Ｐ４プロモーターの上流に位置するｐＦＰ９９６−Ｐ５Ｐ４−右アームクローンにクローニングした。

右ホモロジーアームＤＮＡ断片（配列番号：１２３）は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＸｍａＩ制限部位を含むプライマーＡＡ１９９（配列番号：１２４）およびＫｐｎＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２００（配列番号：１２５）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。ＸｍａＩおよびＫｐｎＩで消化した後、右ホモロジーアーム ＰＣＲ断片とｐＦＰ９９６をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させて、ｐＦＰ９９６−ｓｕｆＣＤが形成された。２つの部分相補的プライマー配列を用いて、ＰＣＲを行うことによって、プロモーターであるＰ５およびＰ４を含むＤＮＡ断片を生成した。ＸｈｏＩ部位、Ｐ５プロモーター配列、およびＰ４プロモーター配列の一部分を含むプライマーＡＡ２０３（配列番号：１２６）を、ＸｍａＩ部位およびＰ４プロモーター配列を含むプライマーＡＡ２０４（配列番号：１２７）と組み合わせ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲを行った。次いで、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、得られたＰＣＲ生成物をプライマーＡＡ２０６（配列番号：１２８）およびプライマーＡＡ２０７（配列番号：１２９）で増幅させた。ＸｈｏＩおよびＸｍａＩで消化した後、Ｐ５Ｐ４ ＰＣＲ生成物とｐＦＰ９９６−ｓｕｆＣＤを連結させて、ｐＦＰ９９６−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤが形成された。左ホモロジーアームＤＮＡ断片（配列番号：１３０）は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＥｃｏＲＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２０１（配列番号：１３１）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２０２（配列番号：１３２）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、左ホモロジーアームとｐＦＰ９９６−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤ をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させて、ｐＦＰ９９６−ｆｅｏＢＡ−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤが形成された。ベクターは配列決定によって確認された。ベクターは、５つの塩基対欠失（ＴＴＧＴＴ）を有し、上流Ｐ５プロモーターにおいて−３５の６量体の一部分を包含するものであった。

上述されたように、ｓｕｆオペロンの上流への合成プロモーター（Ｐ５Ｐ４）の組込み体は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋をｐＦＰ９９６−ｆｅｏＢＡ−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤで形質転換することによって得られた。形質転換体を、エリスロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、３０℃で約２０世代増殖させた。培養物を、エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物を、染色体特異的プライマーＡＡ２０９（配列番号：１３３）およびプラスミド特異的プライマーＡＡ２１０（配列番号：１３４）を用いて、コロニーＰＣＲにより、シングルクロスオーバーについてスクリーニングした。シングルクロスオーバー組込み体を、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で約３０世代増殖させた。培養物をＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物を、エリスロマイシン感受性についてスクリーニングした。単離物を、Ｐ５特異的プライマーＡＡ２１１（配列番号：１３５）および染色体特異的プライマーｏＢＰ１２６（配列番号：１３６）を使用して、（コロニー）ＰＣＲにより、野生型または組込み第２クロスオーバーの有無についてスクリーニングした。同定された組込み株を、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋と称した。

実施例３
Ｔｎ５−トランスポゾンベクター（ｐＴＮ６）の構築およびＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットの組込みのためのその使用
Ｔｎ５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において特徴が十分に明らかにされている細菌トランスポゾンである（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、（１９８３年）３０４巻：２８０〜２８２頁）。しかし、乳酸菌（ＬＡＢ）のためのＴｎ５によって媒介される転移系は、これまで報告されていない。この実施例では、ＬＡＢの染色体へのランダム遺伝子組込みの送達系としてのＴｎ５−トランスポゾンベクターの使用が、開発された。開発されたＴｎ５−トランスポゾンベクター（ｐＴＮ６）（配列番号：１３７）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）シャトルベクターである。プラスミドｐＴＮ６は、トランスポザーゼ遺伝子（ｔｎｐ）、トランスポザーゼ認識ヌクレオチド 配列Ｔｎ５ＩＥ（１９塩基対内側端部）およびＴｎ５ＯＥ（１９塩基対外側端部）、２つの抗生物質耐性マーカー；一方は、クロラムフェニコール耐性のもの、他方は、エリスロマイシン耐性のもの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰ１５Ａ複製開始点、温度感受性であるＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のｐＥ１９４複製開始点（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９８２年）、１５０巻：８０４〜８１４頁）、ならびに２つのｌｏｘＰヌクレオチド配列（３４塩基対）を含む。クロラムフェニコール耐性遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼによるその後の切除のためのｌｏｘＰ部位によってフランキングされている。ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＳｃａＩ、およびＳｐｅＩのための制限部位を含む複数のクローニング部位（ＭＳＣ）は、ｌｏｘＰ部位とＴｎ５ＯＥ部位の間に位置する。クロラムフェニコール耐性遺伝子、２つのｌｏｘＰ部位、およびＭＣＳは、Ｔｎ５ＩＥとＴｎ５ＯＥによってフランキングされている。

Ｔｎ５−トランスポゾンベクターｐＴＮ６を構築するために、第１に、Ｔｎ５ＩＥ、ｌｏｘＰ、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍ）、およびｌｏｘＰを含む１，０４８ｂｐのＴｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰカセットが、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された（配列番号：１３８）。Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−Ｐｓｐａｃ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＵＣ５７ベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７−Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰを生成した。クロラムフェニコール耐性遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の両方における選択のためにｓｐａｃプロモーターの制御下に発現される（Ｙａｎｓｕｒａ ＆ Ｈｅｎｎｅｒ、（１９８４年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、８１巻：４３９〜４４３頁）。プラスミドｐＵＣ５７−Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰをＮｓｉｌおよびＳａｃＩで消化し、１，０４４ｂｐのＴｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰ断片をゲル精製した。プラスミドｐＦＰ９９６（配列番号：９７）をＮｓｉＩおよびＳａｃＩで消化し、ｐＢＲ３２２およびｐＥ１９４の複製開始点を含む４，４１７ｂｐのｐＦＰ９９６断片をゲル精製した。Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰ断片と４，４１７ｂｐのｐＦＰ９９６断片を連結させて、ｐＴｎＣｍが形成された。

第２に、ｐＴｎＣｍ上のｐＢＲ３２２複製開始点をＰ１５Ａ複製開始点で置換した。プラスミドｐＴｎＣｍをＡａｔＩＩおよびＳａｌＩで消化し、ｐＥ１９４複製開始点およびＴｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰカセットを含む２，５２４ｂｐのｐＴｎＣｍ断片をゲル精製した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用することによって、ＳａｌＩ制限部位および１９ｂｐＴｎ５ＯＥヌクレオチド配列を含むプライマーＴ−Ｐ１５Ａ（ＳａｌＩＴｎ５ＯＥ）（配列番号：１３９）およびＡａｔＩＩ制限部位を含むプライマーＢ−Ｐ１５Ａ（ＡａｔＩＩ）（配列番号：１４０）を用いて、９１３ｂｐのｐ１５Ａ複製開始点を、ｐＡＣＹＣ１８４ ［ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９７８年）１３４巻：１１４１〜１１５６頁］からＰＣＲ増幅させた。Ｐ１５Ａ断片は、ＳａｌＩおよびＡａｔＩＩ制限酵素で消化した後、２，５２４ｂｐのｐＴｎＣｍ断片と連結させて、ｐＴＮ５が形成された。

第３に、エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ）を、ｐＴＮ５上のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｓｉＩ制限部位を含むプライマーＴ−ｅｒｍ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号：９７）およびＮｓｉＩ制限部位を含むプライマーＢ−ｅｒｍ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号：１４１）を用いて、１，１３２ｂｐのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ）ＤＮＡ断片を、ベクターｐＦＰ９９６（配列番号：１４２）からＰＣＲ増幅により生成し、ｐＴＮ５上のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローニングして、ｐＴＮ５−ｅｒｍが生成された。

最後に、トランスポザーゼをコードするｔｎｐ遺伝子配列を、ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）ＰＣＲにより、ｎｐｒ（バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の中性プロテアーゼ）プロモーター［Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８４年）、１５９巻：８１１〜８１９頁］に融合し、ｐＴＮ５−ｅｒｍ上のＮｓｉＩ部位にクローニングした。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｓｉＩ制限部位を含むＴ−Ｐｎｐｒ（ＮｓｉＩ）（配列番号：１４３）および１７ｂｐの重なり配列を含む Ｂ−Ｐｎｐｒ（ｔｎｐ）（配列番号：１４４）のプライマーセットを用いて、Ｐｎｐｒプロモーター（配列番号：１４５）を含むＤＮＡ断片を、ｐＢＥ８３から ［Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９９３年）、５９巻：３８９４〜３８９８頁］からＰＣＲ増幅させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、２１ｂｐの重なり配列を含むＴ−ｔｎｐ（Ｐｎｐｒ）（配列番号：９３）およびＮｓｉＩ制限部位を含むＢ−ｔｎｐ（ＮｓｉＩ）（配列番号：１４６）のプライマーセットを用いて、ｔｎｐコード領域（配列番号：１４７）を、ｐＵＴｍＴｎ５−（Ｓｈａｒｐｅら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（２００７年）、７３巻：１７２１〜１７２８頁）からＰＣＲ増幅させた。２つの反応のＰＣＲ生成物を混合し、外側プライマー（Ｔ−Ｐｎｐｒ（ＮｓｉＩ）およびＢ−ｔｎｐ（ＮｓｉＩ））を使用して増幅させると、Ｐｎｐｒ−ｔｎｐ融合ＤＮＡ断片（配列番号：１４８）が生成した。プラスミドｐＴＮ５−ｅｒｍをＮｓｉＩで消化し、仔ウシ小腸由来ホスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）で処理して、自己連結を防止した。消化されたｐＴＮ５−ｅｒｍベクターとＮｓｉＩで消化させたＰｎｐｒ−ｔｎｐ断片を連結させた。連結混合物を、電気穿孔で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。形質転換体を、３７℃で２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。次いで、Ｐｎｐｒ−ｔｎｐカセットの外側プライマーを用いて、形質転換体をコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、プライマーｐＴｎＣｍ（７１１）（配列番号：１４９）、ｐＴｎＣｍ（１４２２）（配列番号：１５０）、およびｐＴｎＣｍ（３０２５）（配列番号：１５１）を用いてＤＮＡ配列決定により確認した。得られたプラスミドをｐＴＮ６と名付けた。

このＴｎ５−トランスポゾンベクターｐＴＮ６を、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋株の染色体へのＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットの組込みのためのランダム遺伝子送達系として使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＳａｌＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むＴ−ｇｒｏＥ（ＳａｌＩＫｐｎＩ）（配列番号：１５２）およびＢａｍＨＩ制限部位を含むＢ−ｇｒｏＥ（ＢａｍＨＩ）（配列番号：１５３）のプライマーセットを用いて、ＰｇｒｏＥプロモーターを含むＤＮＡ断片（ＹｕａｎおよびＷｏｎｇ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９９５年）１７７巻：５４２７〜５４３３頁）（配列番号：１５４）を、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。得られた１５４ｂｐのＰｇｒｏＥプロモーター断片は、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した後、プラスミドｐＴＮ６のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥが形成された。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来の分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｉｖＤ遺伝子のコード領域は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたコドンであった。ＲＢＳを含むｋｉｖＤ（ｏ）と呼ばれる最適化されたコード領域配列（配列番号：８８）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。ＲＢＳを一緒に含むｋｉｖＤ（ｏ）コード領域（配列番号：１５５）を、ｐＵＣ５７ベクターでクローニングして、プラスミドｐＵＣ５７−ｋｉｖＤ（ｏ）が生成された。プラスミドｐＵＣ５７−ｋｉｖＤ（ｏ）をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、１，６４７ｂｐのＲＢＳ−ｋｉｖＤ（ｏ）断片をゲル精製した。ＲＢＳ−ｋｉｖＤ（ｏ）断片を、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ上のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位にクローニングして、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）が生成された。プライマーＴ−ｇｒｏＥ（ＳａｌＩＫｐｎＩ）およびｋｉｖＤ（ｏ）Ｒ（配列番号：１５３および１５６）を用いて、正確なクローンをコロニーＰＣＲにより確認し、予想されたサイズの１，８２２ｂｐの断片が生成された。次いで、米国特許出願第１２／４３０３５６号明細書に記載されていた、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来の分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼのｓａｄＢ遺伝子コード領域を、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）のｋｉｖＤ（ｏ）コード領域の下流にクローニングした。Ａ． キシロソキシダンス（Ａ． ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ｓａｄＢコード領域は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたコドンであった。ＲＢＳを含むｓａｄＢ（ｏ）と呼ばれる新しいコード領域（配列番号：１５７）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７ベクターでクローニングされ、プラスミドｐＵＣ５７−ｓａｄＢ（ｏ）が生成された。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｏｔＩ制限部位を含むＴ−ｓａｄＢ（ｏ）（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７０）およびＮｏｔＩ制限部位を含むＢ−ｓａｄＢ（ｏ）（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７１）のプライマーセットを用いて、ＲＢＳおよびｓａｄＢ（ｏ）コード領域を含む１，０８９ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：１６９）を、ｐＵＣ５７−ｓａｄＢ（ｏ）からＰＣＲ増幅させた。ＲＢＳ−ｓａｄＢ（ｏ）遺伝子断片は、ＮｏｔＩで消化した後、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）のＮｏｔＩ制限部位にクローニングして、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）が生成された。ｋｉｖＤ（ｏ）１５２９（配列番号：１６１）およびＢ−ｓｐａｃ（ｃｍ）（配列番号：１６２）プライマーを用いて、正確なクローンを、ＤＮＡ配列決定により確認した。この構築においては、ｓａｄＢ（ｏ）およびｋｉｖＤ（ｏ）コード領域が、ＰｇｒｏＥプロモーター由来のオペロンにおいて発現される。

一般方法に記載のように、得られたプラスミドｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）を、電気穿孔によりＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ^＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋に形質転換した。７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地上で、形質転換体を選択した。クロラムフェニコール耐性コロニーを、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、許容温度３０℃で、約１０世代増殖させた。培養物を、新鮮なＭＲＳ培地中、１／１００の希釈で播種し、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で約２０世代増殖させた。培養物を、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ上に蒔いた。単離物を、１．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳプレート上のコロニーを再び画線することにより、トランスポゾンに沿って染色体に組み込まれたＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットを含むと推定されたエリスロマイシン感受性コロニーについてスクリーニングした。ｋｉｖＤ（ｏ）配列特異的プライマーＫｉｖＤ（ｏ）１５２９およびｓａｄＢ（ｏ）配列特異的プライマーＢ−ｓａｄＢ（ｏ）（ＮｏｔＩ）を用いて、コロニーＰＣＲにより、トランスポゾンによって媒介された組込み体は、予想されたサイズのＰＣＲ生成物（１，２２０ｂｐ）を生成したことが確認された。

染色体に由来するｌｏｘＰ部位によってフランキングされているクロラムフェニコール耐性マーカーを切除するために、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するヘルパープラスミドｐＦＰ３５２（配列番号：１６３）を、一般方法に記載されたプロトコルに従って、トランスポゾンによって媒介された組込み体に形質転換し、１．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＭＲＳプレート上、３０℃で増殖させた。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間での組換えによってクロラムフェニコールマーカーを染色体から切除する。エリスロマイシン耐性形質転換体をＭＲＳ培地に播種し、３７℃で約１０世代増殖させた。培養物を、抗生物質を含まないラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ上に蒔き、３０℃で増殖させた。単離物を、１．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳプレートとクロラムフェニコール（７．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳプレートで別々に、コロニーの増殖を試験して、ｐＦＰ３５２の損失およびクロラムフェニコールマーカーの除去を評価することによって、エリスロマイシンとクロラムフェニコールの両方の感受性コロニーについてスクリーニングした。最後に、プライマーＢ−ｇｒｏＥ（ＢａｍＨＩ）を用いて、ゲノムＤＮＡ配列決定により、組込み体を確認した。ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）キット（Ｅｎｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡ配列決定の結果によって、ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットを、１，４−α−Ｄ−グルカン鎖のセグメントから同様のグルカン鎖における第一級ヒドロキシ基への移動を触媒するグリコーゲン分枝酵素をコードするｇｌｇＢ遺伝子のコード領域内に挿入したことが示された。得られた組込み体は、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）と名付けた。

実施例４
ａｌｄＢ欠失ベクターの構築および初期欠失の試み
ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）株において、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードするａｌｄＢ遺伝子を欠失させる試みを説明する。

２段階相同組換え手順を使用して、無マーカー欠失を作製することを試みた。相同組換え手順では、上述されたシャトルベクター、ｐＦＰ９９６（配列番号：９７）を利用した。ＤＮＡの２つのセグメントは、配列を所期の欠失の上流および下流に含むものであるが、プラスミドにクローニングして、２つの遺伝子クロスオーバーのための相同性領域を提供した。初期のシングルクロスオーバーによって、プラスミドが染色体に組み込まれる。次いで、第２のクロスオーバー事象では、野生型配列または所期の遺伝子欠失体を得ることができる。

相同ＤＮＡアームを、欠失が、ＡｌｄＢタンパク質の最初の２３個のアミノ酸をコードする領域（ａｌｄＢコード配列のヌクレオチド１−６８）を包含することになるように設計した。プラスミドにクローニングした左右のホモロジーアームは、それぞれ１１８６塩基対および７００塩基対であった。ホモロジーアームは、配列ＧＧＴＡＣＣＴで分けられ、６８ヌクレオチドａｌｄＢ配列欠失に取って代わった。左ホモロジーアームは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２３（配列番号：１２２）およびＫｐｎＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２４（配列番号：１６４）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。右ホモロジーアームは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＫｐｎＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３３５（配列番号：１６５）およびＢｓｒＧＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３３６（配列番号：１６６）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。左ホモロジーアームＤＮＡ断片をＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、右ホモロジーアームＤＮＡ断片をＫｐｎＩおよびＢｓｒＧＩで消化した。２つのホモロジーアームは、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅで連結させて、ｐＦＰ９９６の対応する制限部位になり、適切な制限酵素で消化された後、ベクターｐＦＰ９９６ａｌｄＢｄｅｌ２３アームが形成された。

シングルクロスオーバーは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）をｐＦＰ９９６ａｌｄＢｄｅｌ２３アームで形質転換することによって得られた。０．５％グリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地（Ａｃｃｕｍｅｄｉａ、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｎｓｉｎｇ， ＭＩ）１００ｍｌに、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）を播種し、３０℃でＯＤ６００ ０．７まで増殖させた。細胞を、３７００ｘｇで８分間、４℃で収穫し、冷１ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで８分間、４℃で遠心し、冷３０％ＰＥＧ−１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで２０分間、４℃で再び遠心し、次いで冷３０％ＰＥＧ−１０００ １ｍｌに再懸濁した。６０μｌの細胞を、ギャップ１ｍｍの冷エレクトロポレーションキュベット中で、約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）で１．７ｋＶ、２５μＦ、および４００Ωにおいて電気穿孔した。５００ｍＭ スクロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有するＭＲＳ培地１ｍｌに、細胞を再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートし、次いで１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に蒔いた。

プラスミド特異的プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１１１）およびｏＢＰ５７（配列番号：１１３）を使用して、形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングした。形質転換体を、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、３０℃で約１０世代、次いでラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、連続播種により３７℃で約３５世代増殖させた。培養物を、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地上に蒔いた。得られた単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４７（配列番号：１６７）とプラスミド特異的プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１１１）、および染色体特異的プライマーｏＢＰ５４（配列番号：１６８）とプラスミド特異的プライマーｏＢＰ３３７（配列番号：１６９）を使用して、シングルクロスオーバーについて、コロニーＰＣＲによりスクリーニングした。

シングルクロスオーバー組込み体を、グルコース不含ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、連続播種により３７℃で約４１世代増殖させた。培養物をグルコース不含ＭＲＳ培地上に蒔き、３７℃で増殖させた。コロニーをグルコース不含ＭＲＳプレートにパッチし、３７℃で増殖させた。９６個の単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ５４（配列番号：１６８）および欠失特異的プライマーｏＢＰ３３７（配列番号：１６９）を使用して、欠失第２クロスオーバーの有無について、（コロニー）ＰＣＲによりスクリーニングした。被験単離物はどれも、欠失を含んでいなかった。

実施例５
ｐＴＮ５−ＰｒｒｎＣ１−ａｌｄＢ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））ベクターの構築
この実施例の目的は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８［Ｇｏｄｏｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９９２年）１７４巻：６５８０〜６５８９頁］由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼのａｌｄＢコード領域（配列番号：３７）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）シャトルベクターｐＴＮ５へのクローニングを説明することである。ｐＴＮ５ベクターの構築は、実施例３に記載した通りである。

Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＳａｌＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むＴ−ｒｒｎＣ１（ＳａｌＩＫｐｎＩ）（配列番号：１７１）とＢａｍＨＩ制限部位を含むＢ−ｒｒｎＣ１（ＢａｍＨＩ）（配列番号：１７２）のプライマーセットを用いて、ＰｒｒｎＣ１プロモーター（配列番号：１７０）を含むＤＮＡ断片を、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｌａｃｔｉｓ） ＮＣＤＯ２１１８のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。得られた１４９ｂｐのＰｒｒｎＣ１プロモーター断片は、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した後、プラスミドｐＴＮ５のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＴＮ５−ＰｒｒｎＣ１が形成された。ＢａｍＨＩ制限部位を含むＴ−ａｌｄＢＬＩ（ＢａｍＨＩ）（配列番号：１７３）とＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ制限部位を含むＢ−ａｌｄＢＬＩ（ＮｏｔＩＳｐｅＩ）（配列番号：１７４）のプライマーセットを用いて、ＲＢＳおよびａｌｄＢコード領域を含むＤＮＡ断片を、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｌａｃｔｉｓ） ＮＣＤＯ２１１８のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。得られた７３５ｂｐのａｌｄＢ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））コード領域およびＲＢＳ断片は、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いでｐＴＮ５−ＰｒｒｎＣ１上のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングし、ｐＴＮ５−ＰｒｒｎＣ１−ａｌｄＢ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））が形成された。ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いて、正確なクローンを制限酵素のマッピングにより確認し、予想されたサイズ（３，５６９ｂｐおよび７３５ｂｐ）のＤＮＡ断片が示された。

実施例６
プラスミドによって発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼの存在下でのａｌｄＢ欠失
この実施例では、ａｌｄＢの欠失を引き起こすための第２のクロスオーバーを、プラスミド上のａｌｄＢ遺伝子を発現させる細胞において試みた。

実施例５のシングルクロスオーバー組込み体を、電気穿孔法によりプラスミドｐＴＮ５−ＰｒｒｎＣ１−ａｌｄＢ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））で形質転換させた。エレクトロコンピテントな細胞は、実施例４に上述されたように調製された。クロラムフェニコール（７．５μｇ／ｍｌ）およびエリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＭＲＳ寒天板上で３０℃、５日間インキュベートした後、形質転換体を選択した。クロラムフェニコール耐性およびエリスロマイシン耐性の形質転換体を、クロラムフェニコール（７．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、連続播種により３０℃で約２０世代増殖させ、次いで培養物をクロラムフェニコール（７．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＭＲＳ寒天板上に蒔いた。得られたコロニーを、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＭＲＳ寒天板上にパッチして、エリスロマイシン感受性を試験した。１３０個のうち４２個のコロニーが、エリスロマイシン感受性を示した。次いで、染色体特異的プライマーＯＢＰ４７とＯＢＰ５４（予想されたサイズ：約３．３ｋｂｐ）、および染色体特異的プライマーＯＢＰ５４とＯＢＰ３３７（予想されたサイズ：約１．９ｋｂｐ）を用いて、４２のエリスロマイシン感受性コロニーを、ＡｌｄＢタンパク質の最初の２３個のアミノ酸をコードする領域（ａｌｄＢコード配列のヌクレオチド１−６８）の欠失について、コロニーＰＣＲ分析によりスクリーニングした。コロニーＰＣＲ分析から、４２個のうち２２個のエリスロマイシン感受性コロニーがΔ２３ａａ ａｌｄＢを有することがわかった。

プラスミドｐＴＮ５−ＰｒｒｎＣ１−ａｌｄＢ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））を除去するために、Δ２３ａａ ａｌｄＢ欠失変異株を、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、連続播種により３７℃で約２０世代増殖させた。培養物をラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＭＲＳ寒天板上に蒔いた。Δ２３ａａ ａｌｄＢ欠失変異株のプラスミド除去は、クロラムフェニコール（７．５μｇ／ｍｌ）を含有するＭＲＳ寒天板上で株の増殖が認められないことによって確認された。ＡｌｄＢタンパク質の最初の２３個のアミノ酸に対応するａｌｄＢコード配列のヌクレオチド１−６８の欠失は、プラスミドｐＴＮ５−ＰｒｒｎＣ１−ａｌｄＢ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））を除去した後に、ＡＡ２１３プライマー（配列番号：１７５）を用いて、ＤＮＡ配列決定により確認され、ＡｌｄＢのプラスミド発現の存在下に内因性ａｌｄＢ遺伝子の欠失が成功したことがわかった。得られたΔ２３ａａ ａｌｄＢ突然変異株を、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢと名付けた。

実施例７
ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））ベクターの構築
本実施例の目的は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８（ＮＣＩＭＢ ７０２１１８）［Ｇｏｄｏｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９９２年）１７４巻：６５８０〜６５８９頁］由来のケト酸レダクトイソメラーゼのｉｌｖＣコード領域（配列番号：７４）のｐＤＭ５ベクターへのクローニングを説明することである。

ｐＤＭ１上のＰ３０プロモーターを、ｌａｃＯオペレーター配列およびｌａｃＩ リプレッサー遺伝子に融合させたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｇｒｏＥプロモーター（ＰｇｒｏＥ）で置換することによって、プラスミドｐＤＭ５（配列番号：１７６）を構築した。プラスミドｐＤＭ１は実施例１に記載されている。プラスミドｐＨＴＯ１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳａｃＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理して、平滑末端を作製し、ＢａｍＨＩで消化し、次いで１，５４８ｂｐのｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ断片（配列番号：１７７）をゲル精製した。ｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ断片を、Ｐ３０プロモーターの代わりにｐＤＭ１のＫｐｎＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑末端）およびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＤＭ５が形成された。

ｌｄｈＬ１（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター（ＰｌｄｈＬ１）およびラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８由来のｉｌｖＣコード領域を含むＤＮＡ断片ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））を、ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）ＰＣＲにより生成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｏｔＩ制限部位を含むＴ−ｌｄｈＬ１（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７８）および１９ｂｐの重なり配列を含むＢ−ｌｄｈＬＩ（ＣＬＩ）（配列番号：１７９）のプライマーセットを用いて、ＰｌｄｈＬ１プロモーターを含むＤＮＡ断片を、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、１７ｂｐの重なり配列を含むＴ−ＣＬＩ（ｌｄｈ）（配列番号：１８０）およびＰｖｕＩ制限部位を含むＢ−ＣＬＩ（ＰｖｕＩ）（配列番号：１８１）のプライマーセットを用いて、ｉｌｖＣコード領域を、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。２つの断片のＰＣＲ生成物を混合し、外側プライマーＴ−ｌｄｈＬ１（ＮｏｔＩ）およびＢ−ＣＬＩ（ＰｖｕＩ）を使用して増幅させて、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））融合ＤＮＡ断片が生成された。プラスミドｐＤＭ５をＮｏｔＩおよびＰｖｕＩ制限酵素で消化し、ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩ制限酵素で消化した後、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））カセットと連結させた。連結混合物を、電気穿孔で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。形質転換体を、３７℃で２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。次いで、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））カセットの外側プライマーを用いて、形質転換体をコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、Ｔ−ｌｄｈＬ１（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７８）およびｐＤＭ（Ｒ）ｎｅｗ（配列番号：１８２）を用いてＤＮＡ配列決定により確認した。得られたプラスミドは、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））（配列番号：１８３）と名付けた。

実施例８
ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢを含むベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））を使用したイソブタノールの生成
この実施例の目的は、ａｌｄＢ＋株バックグラウンドに比べて、組換えラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ａｌｄＢ−株バックグラウンドにおいて、イソブタノールの生成が増大していることを説明することである。

イソブタノール生合成経路の遺伝子を発現させる組換えラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を構築するために、２つの組込み体ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）およびＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ−のコンピテント細胞を、上述されたように調製し、プラスミドｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））で形質転換し、ＤＷＳ２２６９と名付けたＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）／ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））、およびＤＷＳ２２７９と名付けたＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ−／ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））を得た。イソブタノール経路の第１の酵素であるアセト乳酸合成酵素は、内在性遺伝子からの自然発現により準備した。

２つの株ＤＷＳ２２６９およびＤＷＳ２２７９を、１０ｍｌの培養試験管中、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ（１００ｍＭ ３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ７．０）培地に播種し、３０℃で１晩好気培養した。初期ＯＤ６００＝０．４の１晩培養物を、１２０ｍｌの血清ビン中、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、４０μＭクエン酸第二鉄、０．５ｍＭシステインを含有するＭＲＳ培地（１００ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０）４０ｍｌに播種し、１００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で９６時間嫌気増殖させた。培養物の試料を、３７００ｘｇで１０分間、４℃で遠心し、上澄液を、０．２μｍのフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）に通して濾過した。濾過された上澄液を、ＳＨＯＤＥＸ Ｓｕｇａｒカラムを備えたＨＰＬＣ（１２００ Ｓｅｒｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）を用いて、ＵＶ２１０および屈折率で検出し、移動相１０ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４で分析した。表５の結果は、ＭＲＳ培地（１００ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０）中、３７℃で嫌気増殖させた株ＤＷＳ２２６９およびＤＷＳ２２７９について、イソブタノール、アセトイン、およびエタノールの生成を示すものである。ａｌｄＢ−突然変異を含むＤＷＳ２２７９によって生成されたイソブタノールの量は８ｍＭであった。これは、野生型ａｌｄＢ＋を含むＤＷＳ２２６９によって生成されたイソブタノールレベル（１．３ｍＭ）より約６倍高い。

実施例９
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ ΔｐｆｌＢ２Ａ２：：ａｌｓＳ（ｏ）株の構築
この実施例の目的は、ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）をコードする遺伝子ｐｆｌＢ２、およびギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性化酵素をコードする遺伝子ｐｆｌＡ２について欠失しており、したがってギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性を含まない、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ 株バックグラウンドにおけるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株の構築を説明することである。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アセト乳酸合成酵素という酵素をコードする、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたコドンである遺伝子（ａｌｓＳ）を、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２のｐｆｌＢ２Ａ２遺伝子の代わりに組み込んだ。

上述した２段階相同組換え手順を用いて、ｐｆｌＢ２Ａ２遺伝子ノックアウトおよびａｌｓＳ遺伝子組込みをエンジニアリングした。ノックアウトは、ＰｆｌＢ２のＣ末端の３５１個のアミノ酸（コード配列のヌクレオチド１２０４〜２２５６）およびｐｆｌＡ２のコード配列全体を欠失するものであった。欠失配列を、終止コドン、インフレームで切断型ｐｆｌＢ２、続いてリボソーム結合配列、およびラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｓＳ遺伝子コドンのコード領域で置換した。

ノックアウト／組込み型ベクターを、プラスミドｐＦＰ９９６（配列番号：９７）において以下の通り構築した。ｐｆｌＢ２Ａ２遺伝子を欠失させるホモロジーアームを、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。ｐｆｌＢ２Ａ２左ホモロジーアームは、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３０９（配列番号：１８４）、および終止コドン（ＴＡＡの補体）とＸｍａＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３１０（配列番号：１８５）を使用して増幅させた。ｐｆｌＢ２Ａ２右ホモロジーアームは、ＫｐｎＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２７１（配列番号：１８６）およびＢｓｒＧＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２７２（配列番号：１８７）を使用して増幅させた。ｐｆｌＢ２Ａ２左ホモロジーアームをＸｈｏＩ／ＸｍａＩ部位にクローニングし、ｐｆｌＢ２Ａ２右ホモロジーアームをｐＦＰ９９６のＫｐｎＩ／ＢｓｒＧＩ部位にクローニングして、ｐＦＰ９９６−ｐｆｌＢ２Ａ２アームを作製した。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｓＳコード領域コドン（配列番号：５７；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪによって合成）は、ＸｍａＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２８２（配列番号：１８８）およびＫｐｎＩ制限部位を含むｏＢＰ２８３（配列番号：１８９）を使用して増幅させた。コドン最適化ａｌｓＳコード領域を、ｐＦＰ９９６−ｐｆｌＢ２Ａ２アームのＸｍａＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングして、ｐＦＰ９９６−ｐｆｌＢ２Ａ２アーム−ａｌｓ（ｏ）を作製した。

コンピテント細胞をグリシンの非存在下に調製した点以外は上記と同様にして、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ（実施例６で調製）をｐＦＰ９９６−ｐｆｌＢ２Ａ２アーム−ａｌｓ（ｏ）で形質転換し、形質転換体を、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳプレート上で選択した。形質転換体を、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＭＲＳプレートに画線し、次いでＭＲＳプレートに再画線した。単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ２７８（配列番号：１９０）およびａｌｓ（ｏ）特異的プライマーｏＢＰ２８３（配列番号：１８９）を使用して、シングルクロスオーバーについて、コロニーＰＣＲによりスクリーニングした。培養物をグルコース不含ＭＲＳ培地上に蒔く前に、シングルクロスオーバー組込み体を、グルコース不含ＭＲＳ培地中、連続播種により３７℃で約２５世代増殖させた。エリスロマイシン感受性単離物は、ａｌｓ（ｏ）特異的プライマーｏＢＰ２８２（配列番号：１８８）および染色体特異的プライマーｏＢＰ２８０（配列番号：８９）を使用して、野生型または欠失／組込み第２クロスオーバーの有無について、コロニーＰＣＲによりスクリーニングした。染色体特異的プライマーｏＢＰ２７９（配列番号：９０）およびｏＢＰ２８０（配列番号：８９）を用いて増幅させたＰＣＲ生成物を配列決定することによって、得られた欠失／組込み株ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ ΔｐｆｌＢ２Ａ２：：ａｌｓＳ（ｏ）を確認した。

実施例１０
ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））を含むＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋
ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ ΔｐｆｌＢ２Ａ２：：ａｌｓＳ（ｏ）を使用したイソブタノールの生成
この実施例の目的は、親株のＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ株バックグラウンドに比べて、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ ΔｐｆｌＢ２Ａ２：：ａｌｓＳ（ｏ）株バックグラウンドにおいて、イソブタノールの生成が増大していることを説明することである。

イソブタノール生合成経路の遺伝子を発現させる組換えラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を構築するために、組込み体ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ ΔｐｆｌＢ２Ａ２：：ａｌｓＳ（ｏ）のコンピテント細胞を、実施例１に記載されたように調製し、プラスミドｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））（実施例７に記載された構築）で形質転換し、ＤＷＳ２３０７と名付けたＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４^＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）Δ２３ａａ ａｌｄＢ ΔｐｆｌＢ２Ａ２：：ａｌｓＳ（ｏ）／ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ））を得た。

実施例８に記載されているのと同じ培地、増殖条件、および試料調製を使用して、株ＤＷＳ２３０７のイソブタノール生成を試験した。株ＤＷＳ２２７９（実施例８）を対照として増殖させた。濾過された上澄液を、ＳＨＯＤＥＸ Ｓｕｇａｒカラムを備えたＨＰＬＣ（１２００ Ｓｅｒｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）を用いて、ＵＶ２１０および屈折率で検出し、移動相１０ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４で分析した。表６の結果は、ＤＷＳ２２７９と比較した、ＤＷＳ２３０７についてのイソブタノール、ギ酸、アセトイン、およびエタノールの生成を示すものである。ΔｐｆｌＢ２Ａ２−突然変異を含むＤＷＳ２３０７によって生成されたイソブタノールの量は１９．１ｍＭであった。これは、野生型ｐｆｌＢ２Ａ２＋を含むＤＷＳ２２７９によって生成されたイソブタノールレベル（８ｍＭ）より約２．４倍高い。遺伝子ｐｆｌＢ２およびｐｆｌＡ２について欠失しており、したがってギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性を含んでいないＤＷＳ２３０７では、ギ酸の生成が見られなかった。

Claims (22)

1. 組換え乳酸菌細胞であって、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を低減するかまたは排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変、を含む上記組換え乳酸菌細胞。
2. 内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変、および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変を含む、請求項１に記載の菌細胞。
3. 遺伝子工学による改変がそれぞれ、アセト乳酸デカルボキシラーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも一部分の欠失である、請求項１に記載の菌細胞。
4. 前記アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が、ａｌｄＢ、ａｌｄＣ、およびａｌｄからなる群から選択される、請求項３に記載の菌細胞。
5. アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が、配列番号：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項４に記載の菌細胞。
6. 前記遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、ｌｄｈＬ、ｌｄｈＤ、ｌｄｈＬ１、およびｌｄｈＬ２からなる群から選択される、請求項３に記載の菌細胞。
7. 乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項６に記載の菌細胞。
8. 細胞が、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック、オエノコッカス、ペディオコッカス、およびストレプトコッカスからなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の菌細胞。
9. ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減する少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含む、請求項１に記載の菌細胞。
10. 遺伝子改変が、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードする遺伝子、または両遺伝子に存在する、請求項９に記載の菌細胞。
11. ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする前記遺伝子が、ｐｆｌ、ｐｆｌＢ１およびｐｆｌＢ２からなる群から選択され、ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性化酵素をコードする遺伝子が、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＡ１およびｐｆｌＡ２からなる群から選択される、請求項１０に記載の菌細胞。
12. 細胞がイソブタノールを生産する、請求項１、２、または８のいずれか１項に記載の菌細胞。
13. イソブタノール生合成経路を含む、請求項１２に記載の菌細胞。
14. イソブタノール生合成経路が、
    ａ）ピルビン酸からアセト乳酸へと、
    ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へと、
    ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へと、
    ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへと、
    ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへと
    からなる変換を生産するための基質を含む、請求項１３に記載の菌細胞。
15. 組換え乳酸菌細胞を生産する方法であって、
    ａ）乳酸菌細胞を備えるステップと、
    ｂ）（ａ）の細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子を、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
    ｃ）（ｂ）の細胞においてプラスミド由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現させて、非染色体で発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼを有する細胞を作出するステップと、
    （ｄ）（ｃ）の細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
    （ｅ）（ｄ）の細胞由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現するプラスミドを除去するステップと
    を含み、それによって、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性がない組換え乳酸菌細胞が生産される、上記方法。
16. 組換え乳酸菌細胞を生産する方法であって、
    ａ）乳酸菌細胞を備えるステップと、
    ｂ）（ｃ）の細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
    ｃ）（ｂ）の細胞においてプラスミド由来の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現させて、非染色体で発現された乳酸デヒドロゲナーゼを有する細胞を作出するステップと、
    （ｄ）（ａ）の細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子を、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
    （ｅ）（ｄ）の細胞に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現するプラスミドを除去するステップと
    を含み、それによって、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性がない組換え乳酸菌細胞が生産される、上記方法。
17. ステップ（ｂ）が、（ｃ）の前に、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする第１の遺伝子への改変を含み、次いでステップ（ｃ）の後に、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の遺伝子が遺伝子工学によって改変される、請求項１５に記載の方法。
18. ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減するように、少なくとも１つの内在性遺伝子を改変するステップをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. イソブタノールを生産する方法であって：
    （ａ）ｉ）内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子改変、および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子改変；および
    ｉｉ）イソブタノール生合成経路；
    を含む乳酸菌細胞を備えるステップ：および
    （ｂ）（ａ）の細胞を、イソブタノールが生産される条件下で培養するステップ：
    を含む、上記方法。
20. （ａ）の乳酸菌細胞が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減する少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 乳酸菌用組込み型ベクターであって：
    ａ）乳酸菌細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と；
    ｂ）大腸菌および乳酸菌細胞において活性な選択マーカーならびに組込みの標的とされるＤＮＡセグメントの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と；
    ｃ）乳酸菌細胞において活性な第２の選択マーカーと；
    ｄ）大腸菌細胞の複製開始点と；
    ｅ）条件付きで活性である、乳酸菌細胞の複製開始点と；
    を含み、Ｔｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素が、ｂ）のＤＮＡセグメントの乳酸菌細胞ゲノムへのランダムな組込みに向ける組込み型ベクター。
22. ＤＮＡセグメントを乳酸菌細胞ゲノムにランダムに組み込む方法であって：
    ａ）ｉ）乳酸菌細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と；
    ｉｉ）大腸菌および乳酸菌細胞において活性な選択マーカーならびに組込みの標的とされるＤＮＡセグメントの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と；
    ｉｉｉ）乳酸菌細胞において活性な第２の選択マーカーと；
    ｉｖ）大腸菌細胞の複製開始点と；
    ｖ）条件付きで活性である、乳酸菌細胞の複製開始点と；
    を含むベクターを備えるステップ：
    ｂ）組込み用ＤＮＡセグメントをステップａ（ｉｉ）の構成要素間に配置し、組込み構築物を作出するステップ：
    ｃ）組込み構築物を乳酸菌細胞に形質転換し、それによって形質転換細胞が生産されるステップ：
    ｄ）ステップａ（ｉｉ）の選択マーカーを使用して、ステップ（ｃ）の形質転換細胞を許容条件で増殖させ、選択して、選択された形質転換体を生産するステップと：
    ｅ）ステップ（ｄ）の選択された形質転換体を非許容条件で増殖させるステップと：
    を含み、ここでベクターが乳酸菌細胞から除去され、組込み用ＤＮＡセグメントが、乳酸菌細胞のゲノムにランダムに組み込まれる、上記方法。

Images