CN107922917A - 乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产乳酸的酵母属微生物，其具有减弱的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性和提高的醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性，以及由通过培养该微生物获得的培养液生产乳酸的方法。

Description

乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法
技术领域
本发明涉及产乳酸的重组酵母属(Saccharomyces sp.)微生物，以及通过培养所述微生物由包含其的培养基生产乳酸的方法。
背景技术
通常，乳酸是具有包括食品添加剂如食品防腐剂、香精、或酸化剂等广泛应用的重要有机酸，并已广泛用于工业目的，如化妆品工业、化学工业、金属工业、电子工业、纺织工业、染色纺织品工业和制药工业等。另外，乳酸是生物可降解塑料之一的聚乳酸的必需组分，因此，对乳酸的需求已显著提高。乳酸也用作制备多种化合物的重要原料，该化合物包括聚乳酸、乙醛、聚丙二醇、丙烯酸、2，3-五硫酮(2，3-pentathione)等。特别地，D型乳酸是用于生产立构复合物PLA的必需组分，该立构复合物PLA是生产高耐热PLA 的必需光学异构体。
特别地，用于生产乳酸的方法包括传统化学合成法和生物发酵法。当乳酸是经由化学合成法生产的时，乳酸以外消旋混合物的形式产生，该外消旋混合物由50％的D型乳酸和50％的L型乳酸构成，控制该组成比例是困难的，因此，由此生产的聚乳酸可以变为具有低熔点的无定形聚合物，从而限制了其使用的发展。在另一方面，根据所用的菌株，生物发酵法能够选择性地生产D型乳酸或L型乳酸。因此，由于后者可以产生特定异构体(isoform)的乳酸，其在商业上是优选的。
同时，通过引入用于转化为D型乳酸的酶的基因，已做出尝试经由使用具有D型乳酸生产能力的酵母属微生物的各种基因操作以提高乳酸生产率。具体来说，已做出尝试通过加强乳酸脱氢酶(LDH)的活性同时降低丙酮酸脱羧酶(PDC)的活性、醛脱氢酶(ALD)的活性和/或乙酰辅酶A合成酶(ACS)的活性以提高乳酸生产率(美国专利申请公开第2012-021421号、第2010-0248233 号和第2006-0148050号)。然而，由于产乳酸菌株的低细胞生长，总发酵生产率是低的。
发明内容
技术问题
因此，本发明人已做出许多努力以获得乳酸生产率提高的、细胞生长高效的、同时PDC活性降低的微生物。结果是，已证实了其中PDC同种型 (isotype)活性可控的、醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高的菌株能够提高乳酸的产量，并促进菌株的细胞生长，从而提高总乳酸发酵生产率，这使得本发明得以完成。
技术方案
本发明的目的是提供乳酸生产率提高的酵母属微生物。
本发明的另一目的是提供使用酵母属微生物生产乳酸的方法。
有利效果
本发明涉及使用通过控制PDC同种型活性、提高醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性而具有提高的乳酸发酵生产率的微生物。因此，所述微生物可以广泛用于乳酸发酵生产工业。
附图说明
图1是示出酵母属微生物的乳酸产生途径、醇发酵途径和乙酰辅酶A产生途径之间关系的示意图。
最佳实施方案
在本发明的第一方面，为了实现上述目的，提供了乳酸生产率提高的酵母属微生物，其中该微生物是经突变的，使得(a)丙酮酸脱羧酶(PDC)活性相比未经突变的产乳酸菌株降低；(b)醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性相比未经突变的产乳酸菌株提高。
通常，产乳酸的酵母属微生物经由乳酸脱氢酶(LDH)利用丙酮酸作为底物而产生乳酸。醇发酵途径和乙酰辅酶A产生途径被阻断，所述醇发酵途径和乙酰辅酶A产生途径是使用丙酮酸作为通用底物的代表性代谢途径。降低 PDC活性可以有助于乳酸的生产及其产量的提高，然而，当降低的水平达到一定水平时，产生了不足量的胞质(cytosolic)乙酰辅酶A，其反过来阻断细胞生长，因此不能实现正常发酵。因此，本发明人通过提高总乳酸发酵生产率而研发了乳酸生产率提高的酵母属微生物，其中通过将乙酰辅酶A途径调节在最低水平来维持微生物的生长率并提高乳酸产量。
本文所用的术语“丙酮酸脱羧酶(PDC)”指具有能够介导从丙酮酸产生碳酸和乙醛的反应的活性的蛋白质，但不限于具有相同活性的其任何衍生物或同种型。已经知道该蛋白质涉及醇发酵的步骤，并大多存在于酵母和植物中。本发明的丙酮酸脱羧酶可以固有存在于酵母属微生物中，或可以是PDC1、 PDC5和/或PDC6，或特别地是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PDC1、 PDC5和/或PDC6，但不限于此。该蛋白质可以包括其任何变体或类似物，只要它们是生物学相同的且具有与该蛋白质相当的活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知的数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，PDC1可以由SEQ ID NO：71的氨基酸序列构成，PDC5可以由SEQ ID NO：72的氨基酸序列构成，PDC6可以由SEQ ID NO：73的氨基酸序列构成。与以上列出的氨基酸序列中的每一个相比，该蛋白质可以包括同源性大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％的氨基酸序列。由基因密码简并获得的、编码相同氨基酸序列的以上列出的序列的任何变体也可以包括在本发明中。
本文所用的术语“同源性”指多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的相似程度，是代表与本发明的氨基酸序列或核苷酸序列具有相同序列的序列单元，具有等于或大于上述可能性的可能性。这种同源性可以通过用肉眼比对两个给定序列来确定，更确切地说，其可以使用序列比对程序来确定，该序列比对程序是容易得到的，其通过将待比对序列并排排列以解释同源性程度。本领域已知的序列比对程序包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和包含CLUSTAL W的软件等。
已报道了关于通过使PDC1缺陷而生产乳酸的大量实例，PDC1在乳酸生产中表现出主要的活性(Appl Microbiol Biotechnol.2009，82(5)：883-90)。在这种情况下，因为PDC6很少被表达，实际表现出的PDC活性是由于PDC5 基因的表达。根据报道，单独的PDC1缺陷并不会阻碍野生型菌株的细胞生长，并且相比野生型，约60％至70％的PDC活性可以被保留，因此在菌株中没有观察到显著的表型变化(J Bacteriol.1990，172(2)：678-685)。同时，为了最大限度地经由与PDC竞争丙酮酸的LDH途径生产乳酸，可以制备在PDC1、 PDC5和PDC6中同时具有三重缺陷的菌株。在这种情况下，可以最大化乳酸发酵产量，但是由于在葡萄糖存在下诱导的分解代谢物阻遏，乙醇和乙酸的代谢能力可以被进一步抑制，从而降低了细胞生长，最终导致发酵生产率降低(Curr Genet.2003/43(3)/139-160)。
由于PDC6很少被表达，实际表现出的PDC活性是由于PDC5基因的表达。根据报道，单独的PDC1缺陷不会阻碍野生型菌株的细胞生长，并且相比野生型，约60％至70％的PDC活性可以被保留，因此在菌株中没有观察到显著的表型变化(J Bacteriol.1990，172(2)：678-685)。作为替代，可以制备在 PDC1和PDC5基因中同时具有双重缺陷的菌株，所述PDC1和PDC5基因在酵母中表现出主要的PDC活性。在这种情况下，在缺乏共底物例如乙酸或乙醇时，可以使用糖源例如糖原进行乳酸发酵。然而，由于PDC活性的快速降低，导致酵母菌株的生长率降低，从而降低了乳酸发酵生产率(Biosci Biotechnol Biochem.2006，70(5)：1148-1153)。
特别地，本发明的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低可以i)使PDC1活性失活，降低PDC5活性；或ii)降低PDC1活性，使PDC5活性失活。
在本发明的示例性实施方案中，基于其中PDC1活性是失活的酿酒酵母菌株制备了4种不同菌株，其包括通过替换PDC5基因启动子而PDC5活性降低的菌株、通过恢复PDC1活性而发生PDC5基因缺陷的菌株、发生PDC1 和PDC5基因双重缺陷的菌株和发生PDC1、PDC5和PDC6基因三重缺陷的菌株。在由此制备的菌株中，具有三重基因缺陷的菌株表现出几乎不经历细胞生长。
本文所用的术语“醛脱氢酶(ALD)”指具有主要由乙醛产生乙酸的活性的蛋白质，其为具有通过醛的氧化而产生羧酸或酰基的活性的蛋白质，但在本发明中不限于具有相同活性的其衍生物或同种型。本发明的醛脱氢酶可以源自酵母属微生物，或可以是ALD2和/或ALD3。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的ALD2和/或ALD3，但不限于此，并且可以包括其任何变体或类似物，只要它们是生物学相同的并具有与该蛋白质相当的活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从本领域已知的数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，ALD2可以由SEQ ID NO：74的氨基酸序列构成，ALD3 可以由SEQ ID NO：75的氨基酸序列构成。与该氨基酸序列相比，该蛋白质可以包括同源性大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％的氨基酸序列。由基因密码子简并获得的、编码相同氨基酸序列的该序列的任何变体也可以包括在本发明中。
本文所用的术语“乙酰辅酶A合成酶(ACS)”指具有催化乙酸和CoA的硫酯化结合ATP分解反应的活性的蛋白质，但在本发明中不限于具有相同活性的衍生物或同种型。已经知道，该蛋白质存在于微生物、植物和动物等中。本发明的乙酰辅酶A合成酶可以源自酵母属微生物，或可以是ACS1。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的ACS1，但不限于此，并且可以包括其任何变体或类似物，只要它们是生物学相同的并具有与蛋白质相当的活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，ACS1可以由SEQ ID NO：76的氨基酸序列构成，与该氨基酸序列相比，可以包括同源性大于70％、特别地大于80％、更特别地大于 90％、甚至更特别地大于95％的氨基酸序列。由基因密码子简并获得的、编码相同氨基酸序列的该序列的蛋白质突变体也可以包括在本发明中。
在本发明的一个示例性实施方案中，对于相比未经突变的微生物具有降低的PDC活性的菌株，制备了其中ALD2和ACS活性或ALD3和ACS活性提高的菌株。特别地，基于具有经由PDC1缺陷而失活的PDC1、以及降低的PDC5活性的菌株，制备了ALD和ACS活性提高的菌株，所述PDC5活性是通过用具有低表达能力的启动子替换PDC5的基因启动子而降低的。更特别地，制备了酵母属微生物的菌株，其中PDC1活性是失活的，PDC5活性是降低的，选自ALD2和ALD3中的至少一种的活性是提高的，且ACS1 的活性是提高的。因此，证实了菌株的生长率、D-乳酸生产率及其产量显著提高。
术语本发明的酶活性的“失活”指用于使酶活性失活的方法，其包括抑制酶的表达或使得酶的表达不能表现其原有活性的任何方法。该方法可以包括由同源重组引起的部分基因缺陷或全部基因缺陷，由外源基因插入到相关基因引起的酶表达的抑制，由酶的基因启动子序列的替换或修饰导致的酶表达的抑制，或由酶的替换或修饰引起的突变为失去其原有功能的失活酶等，但不限于此。
本文所用的术语酶活性“降低”指用于降低酶活性的方法，包括用于降低酶的表达水平或降低被表达的酶活性的任何方法。该方法可以包括由酶基因的启动子序列的替换或修饰导致的表达降低，或者由酶的替换或修饰导致的突变为活性降低的酶等，但不限于此。
本文所用的术语酶活性“提高”指插入含有酶基因的质粒，染色体上编码酶的基因拷贝数增加，或者由酶基因的启动子序列的替换或修饰、或突变而导致的酶活性提高等，但不限于此。
本文所用的术语“酵母微生物”指属于通过出芽而增殖的真菌纲 (Eumycetes)微生物，但不限于此，只要其参与乳酸产生途径、醇产生途径和/ 或乙酰辅酶A产生途径中的任一种。依据酵母的形状，酵母微生物可以分类为酵母属、毕赤酵母属(Pichia sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)和复膜孢酵母属 (Saccharomycopsis sp.)，特别地，包括不同种的酵母属可以用于本发明。特别地，微生物可以选自贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母 (Saccharomyces boulardii)、Saccharomyces bulderi、Saccharomycescariocanus、 Saccharomyces cariocus、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、薛瓦酵母 (Saccharomyces chevalieri)、Saccharomyces dairenensis、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、Saccharomyces florentinus、克鲁弗酵母 (Saccharomyceskluyveri)、Saccharomyces martiniae、Saccharomyces monacensis、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces spencerorum、图列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)和Saccharomyces zonatus，更特别地，其可以是酿酒酵母。
基于酿酒酵母，通过制备PDC活性降低、ALD活性和ACS活性提高的微生物，证实了乳酸生产显著提高，所述酿酒酵母是酵母属的代表性实例。
本发明的微生物还可以包含失活的醇脱氢酶(ADH)。
本文所用的术语“醇脱氢酶”指具有催化逆反应的活性的蛋白质，但不限于具有相同活性的衍生物或同种型，所述逆反应是从醇去除氢而制备醛或酮。本发明的醇脱氢酶可以源自酵母属，或可以是ADH1。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的ADH1，但不限于此，并且可以包括其任何变体或类似物，只要它们是生物学相同的并具有与蛋白质相当的活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，ADH1可以由SEQ ID NO：77的氨基酸序列构成，并且与该氨基酸序列相比，可以包括同源性大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％的氨基酸序列。由基因密码子简并获得的、编码相同氨基酸序列的该序列的蛋白质突变体也可以包括在本发明中。
本发明的微生物还可以包含失活的D-乳酸脱氢酶(DLD)。
本文所用的术语“D-乳酸脱氢酶”指具有通过D-乳酸脱氢产生丙酮酸的活性的蛋白质，但不限于具有相同活性的同种型。本发明的D-乳酸脱氢酶可以源自酵母属，特别是DLD1。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的DLD1，但不限于此，并且可以包括其任何变体或类似物，只要它们是生物学相同并具有与蛋白质相当的活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，DLD1可以由SEQ ID NO：78 的氨基酸序列构成，并且与该氨基酸序列相比，可以包括同源性大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％的氨基酸序列。由基因密码子简并获得的、编码相同氨基酸序列的该序列的任何变体也可以包括在本发明中。
在本发明中，将ADH1缺陷和DLD1缺陷的菌株用于精确地测量D-乳酸发酵细胞性能根据乙酸产生途径的调节的变化，所述ADH1是涉及使用进一步由丙酮酸产生的醛为底物的醇发酵途径的酶，所述DLD1是分解所产生的乳酸的酶。在本发明的示例性实施方案中，其中PDC活性、ALD活性和ACS 活性被调节的菌株显示了乳酸发酵生产率的显著提高。结果总结在表12中。
在另一方面，本发明提供了使用本发明的微生物生产乳酸的方法。
特别地，在本发明的示例性实施方案中，本发明提供了用于生产乳酸的方法，其包括在培养基中培养本发明的微生物，以及从微生物或包含微生物的培养基中收集乳酸。
可以使用本领域已知的适当培养基和培养条件进行培养。根据所用的菌株，本领域技术人员可以容易地调节培养方法。培养方法的实例包括间歇型、连续型、以及流加型，但不限于此。培养方法中使用的培养基应该适当地满足具体菌株的需要。
本发明所用的培养基包含作为主要碳源的蔗糖或葡萄糖，含有高浓度蔗糖的糖蜜也可以用作碳源。其他碳源可以以适当的量不同地使用。有机氮源和无机氮源可以用作氮源，所述有机氮源包括蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浆和大豆小麦，所述无机氮源包括单质、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独使用或结合使用。可以向培养基添加磷源，例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或对应的含钠盐。另外，培养基可以包含金属盐，例如硫酸镁和硫酸铁。另外，培养基可以用氨基酸、维生素和适当前体补充。这些介质或前体可以通过间歇型或连续型方法加入到培养物中。
在培养期间，可以适当地添加化合物以调节培养物的pH，所述化合物例如氢氧化铵、氢氧化钾、磷酸和硫酸。另外，可以添加消泡剂以抑制培养物中的泡沫形成，所述消泡剂例如聚乙二醇脂肪酸酯。另外，为了维持培养物处于有氧条件，可以将氧气或含氧气体注入培养物中，为了维持培养物处于厌氧和微氧条件，可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入培养物中而不注入任何空气。
培养物的温度可以维持在20℃至40℃，特别地在25℃至35℃，更特别地在30℃。该培养可以连续进行直至获得所期望量的所期望物质，特别地进行10小时至100小时。
根据培养方法，例如间歇型、连续型或流加型，在本发明的培养过程中所生产的乳酸可以通过本领域已知的适当方法从微生物或含有/不含有微生物的培养基中收集。
发明的实施方案
在下文中，将结合随附的示例性实施方案更详细地描述本发明。然而，本文公开的示例性实施方案仅出于举例说明的目的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：制备产乳酸菌株
为了制备产乳酸菌株，对酿酒酵母CEN.PK2-1D进行基因操作，该酿酒酵母CEN.PK2-1D是从EUROSCARF获得的代表性野生型酵母。
特别地，醇脱氢酶1(ADH1)和丙酮酸脱羧酶1(PDC1)是缺陷的以最小化醇合成途径的丙酮酸损失、且D-乳酸脱氢酶1(DLD1)是缺失的以阻断D型乳酸分解途径的菌株被用作基础菌株。
DLD1不是可以对生长改善具有直接影响的关键因素，但已知是能够使用NAD+作为D-乳酸脱氢酶将D-乳酸转化为丙酮酸的主要酶。因此，基于在 DLD1中具有基因缺陷的菌株来构建随后的菌株，以比较将在本发明中制备的产D型乳酸酵母的总发酵生产率，DLD1是消耗其所制备的乳酸的酶。结果是，比较了发酵生产率。
在本发明中，使用了一般分子克隆用于基因操作。
首先，为了删除酵母菌株中的ADH1基因和PDC1基因，使用质粒pWAL100和pWBR100，参考Lee TH等人(J.Microbiol.Biotechnol.(2006)， 16(6)，979-982)的参考文献所公开的内容进行实验。使用合适的引物(对应于 SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的核苷酸序列)经由PCR制备引入到载体质粒的每个插入片段。
另外，为了删除DLD1基因，将标志基因HIS3通过双交换引入并使其有缺陷。使用对应于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的核苷酸序列的引物来制备本文所用的DNA片段。
用于基因操作的引物总结于下表1。
表1.用于产生基础酵母菌株的引物
基于在3种基因例如ADH1、PDC1和DLD1中具有缺陷的菌株，引入用于D-乳酸生产特别需要的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)。然后，为了使源自植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，Lb.plantarum)的1dhD包括在源自酿酒酵母的TEF1启动子和CYC1终止子之间，将D-LDH克隆到在5’和3’末端分别具有XhoI和SpeI限制性酶切位点的p413TEF1载体中。具体地，通过 SacI/PvuII的双酶切来制备该插入片段，从DNA片段通过绿豆核酸酶使该载体是平末端的，该DNA片段由p-δ-neo双酶切为BamHI/NotI。最后，将该载体用SacI处理，从而获得具有SacI黏性末端和源自BamHI的平末端的载体。
通过连接所获得的载体和插入片段来完成pTL573载体的构建。质粒 pTL573包含源自植物乳杆菌的1dhD基因，且将其设计为使得其可以包括随机插入到酿酒酵母CEN.PK2-1D pdclΔ adhlΔ dldlΔ菌株的反转录转座子元件之间的δ-序列的部分区域的基因的多拷贝。为了相应基因的多重插入，通过用SalI酶切质粒pTL573来构建能够在δ-序列上诱导单交换的DNA片段。通过将DNA片段经由转化引入亲本菌株中，从最大浓度为5mg/mL G418的YPD板(1％的酵母提取物、2％的细菌蛋白胨和2％的葡萄糖)获得多个菌落。最终，证实了为了提供产D-乳酸的能力，由此获得的菌株被多重插入，所述菌株即源自植物乳杆菌的D-LDH，并指定为CC02-0064菌株。
实施例2：制备PDC5活性降低的突变菌株
基于实施例1制备的CC02-0064菌株，制备具有替换的PDC5启动子的突变菌株。在该过程中，根据Lee T. H.等人(Development of reusable split URA3-marked knockoutvectors for budding yeast，Saccharomyces cerevisiae.J Microbiol Biotechnol，2006，16：979-982)公开的方法进行表达盒的制备和菌株的选择的过程。
特别地，通过分别用SCO1、SCO2、ACS1、IDP2和FBA1启动子替换 CC02-0064菌株的PDC5启动子而制备总共5种新菌株，随后，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO：11至SEQ IDNO：36的引物来制备启动子替换的表达盒。
用于启动子替换的引物总结于下表2。
表2.用于制备启动子替换的菌株的引物
由此制备的新菌株分别指定为CC02-0167、CC02-0168、CC02-0169、 CC02-0170和CC02-0174。相应的菌株及其遗传特性总结于下表3中。
表3.PDC5启动子突变的菌株
菌株 遗传特性
CC02-0167 CC02-0064 PDC5 启动子：：K1URA3-SCO1 启动子
CC02-0168 CC02-0064 PDC5 启动子：：K1URA3-SCO2 启动子
CC02-0169 CC02-0064 PDC5 启动子：：K1URA3-ACS1 启动子
CC02-0170 CC02-0064 PDC5 启动子：：K1URA3-IDP2 启动子
CC02-0174 CC02-0064 PDC5 启动子：：K1URA3-FBA1 启动子
实施例3：评价PDC5活性降低的突变菌株的乳酸发酵
对实施例2制备的PDC5启动子突变的菌株进行乳酸发酵评价。为此，制备特定培养基用于评价乳酸发酵。
特别地，为了制备合成的复合培养基(SC培养基)，其是用于酵母的限制性培养基，根据制造商的方案，将不含氨基酸的0.67％的酵母氮作为基本培养基与氨基酸dropout混合液(Sigma)混合，根据需要加入基本培养基中不含的氨基酸。另外，将380mg/L的亮氨酸加入到生成物中，将尿嘧啶、色氨酸和组氨酸分别以76mg/L的浓度加入。还加入作为碳源的8％的葡萄糖和作为中和剂的1％的CaCO3。将由此制备的培养基用于评价酵母菌株的乳酸发酵。
在实施例2制备的PDC5启动子突变的菌株中，用弱于原始PDC5启动子的启动子替换的突变菌株不能生长，而用较强启动子替换的突变菌株显示出改善的生长。特别地，用弱于PDC5启动子的SCO1、SCO2、IDP2或ACS1 启动子替换的突变菌株不能生长，使得其启动子用FBA1启动子替换的菌株成为仅有的待评价菌株。对于可测量的CC02-0064和CC02-0174菌株的乳酸发酵评价结果总结于下表4中。
表4.评价PDC5启动子突变的菌株的乳酸发酵
如以上评价所示，证实了在促进乙酰辅酶A产生的途径期间，相比原始菌株(CC02-0064)，其中用PDC的FBA1启动子替换野生型PDC5启动子的 CC02-0174菌株显示了提高的细胞生长率及其乳酸生产率。然而，当对分别在24小时和48小时收集的样本结果进行比较时，证实了通过仅增强单个 PDC活性而不增强ALD活性和ACS活性，其细胞生长率和乳酸生产率的提高随时间持续降低，ALD和ACS参与随后乙酰辅酶A产生途径。在本发明的实例中，通过增强PDC活性，葡萄糖消耗的提高为10.3％，最大乳酸产生浓度为47.3g/l。因此，乳酸生产率总计提高13.7％。
实施例4：制备具有PDC5基因缺陷的菌株
除了实施例2制备的具有PDC1基因缺陷和降低的PDC5活性的菌株，制备具有PDC5基因缺陷和降低的PDC1活性的菌株，从而确认PDC途径在相应菌株中是否减弱。
特别地，为了达到PDC5基因缺陷的目的，基于CC02-0064菌株，对应于核苷酸序列SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：40的引物被用于制备PDC5基因缺陷表达盒。通过与实施例1的文献所描述的相同方法制备有缺陷的菌株。用于本实施例的引物总结于下表5中。
表5.用于制备具有PDC5缺陷的菌株的引物
由此制备的具有PDC5基因缺陷的菌株指定为CC02-0450(CC02-0064， pdc5Δ)。
实施例5：基于具有PDC5缺陷的菌株制备PDC1启动子突变的菌株
基于实施例4制备的CC02-0450菌株，制备具有替换的PDC1启动子的菌株。为此，制备其中PDC1缺陷被恢复的菌株CC02-0451(CC02-0450， PDC1p-PDC1)作为对比组，制备PDC1活性降低的菌株CC02-0452(CC02-0450， IDP1p-PDC1)作为实验组。
以将pRS406-PDC1p-PDC1-CYC1t和pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1t的载体包含在菌株中的方式制备每个菌株，其中通过将目标基因表达盒克隆到不具有酵母的复制起始点的pRS406载体中而构建该载体。
特别地，使用具有核苷酸序列SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的引物，和酵母染色体DNA作为模板进行PCR，从而获得包含PDC1基因的产物。随后，使用具有核苷酸序列SEQ IDNO：43和SEQ ID NO：44的引物获得CYC1 终止子的序列。另外，经由PCR获得连接PDC1和CYC1终止子的DNA片段，该PCR使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：44的引物和PDC1和CYC1终止子序列分别作为模板。通过用SpeI和XhoI限制性内切酶处理PDC1-CYC1终止子的DNA片段和pRS406载体、然后将其连接来获得pRS406-PDC1-CYC1t的质粒载体。同时，为了将启动子域引入由此获得的质粒载体中，经由使用染色体DNA作为模板的PCR，分别通过具有核苷酸序列SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48 的引物的引物融合获得其中PDC1启动子和IDP2启动子被分别引入的质粒载体。将包含每个启动子和pRS406-PDC1-CYC1t质粒的DNA片段用SacI 和SpeI酶切并连接，从而分别制备pRS406-PDC1p-PDC1-CYC1t和 pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1t的质粒载体，其是酵母染色体插入所需的质粒，被设计为使得通过PDC1启动子和IDP2启动子控制基因表达。
在本实施例中使用的引物总结于表6中。
表6.用于制备具有PDC5缺陷和降低的PDC1活性的菌株的引物
由此制备的2个质粒载体分别用StuI酶切，并立即插入菌株中。最终的菌株分别指定为CC02-0451(CC02-0450，PDC1p-PDC1)和 CC02-0452(CC02-0450，IDP2p-PDC1)。由此制备的菌株及其遗传特性总结于表7中。
表7.具有PDC5缺陷和降低的PDC1活性的菌株
菌株 遗传特性
CC02-0450 CC02-0064 pdc5Δ
CC02-0451 CC02-0450 PDC1p-PDC1-CYC1t
CC02-0452 CC02-0450 IDP2p-PDC1-CYC1t
实施例6：制备在PDC基因中具有双重或三重缺陷的菌株
旨在由PDC基因家族制备在PDC1基因中具有单个缺陷、在PDC1和 PDC5基因中具有双重缺陷以及在PDC1、PDC5和PDC6基因中具有三重缺陷的菌株。将实施例1制备的CC02-0064菌株用作在PDC1基因中具有单个缺陷的菌株。使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：56的引物制备PDC5缺陷的表达盒，并将其插入CC02-0064以制备在PDC1和PDC5基因中具有双重缺陷的菌株。随后，由此制备的菌株指定为CC02-0256。另外，基于在PDC1和PDC5基因中具有双重缺陷的菌株，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：64的引物，制备在PDC1、PDC5和PDC6 基因中具有三重缺陷的菌株，指定为CC02-0257。
通过在实施例1公开的文献中描述的相同方法进行缺陷表达盒的制备和菌株的选择过程。在本实施例中使用的引物总结于表8中。
表8.用于制备在PDC基因中具有双重或三重缺陷的菌株的引物
由此制备的菌株及其遗传特性总结于表9中。
表9.在PDC基因中具有双重或三重缺陷的菌株
菌株 遗传特性
CC02-0256 CC02-0064 pdc5Δ
CC02-0257 CC02-0256 pdc6Δ
实施例7：制备ALD和ACS1过表达菌株
为了制备ALD和ACS1过表达菌株，制备ALD2、ALD3和ACS1过表达的质粒。
特别地，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66的引物制备ALD2的开放阅读框(ORF)，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO：67和 SEQ ID NO：68的引物制备ALD3的ORF，以及使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70的引物制备ACS1的ORF。另外，通过SpeI、XhoI 或EcoRI限制性内切酶制备p415ADH-ALD2、p415ADH-ALD3、 p414ADH-ACS1和p416ADH-ACS1，其是基于p414ADH、p415ADH和 p416ADH质粒的重组载体。在本实施例中使用的引物总结于下表10中。
表10.用于制备ALD和ACS1过表达菌株的引物
经由通过p415ADH-ALD2、p414ADH-ACS1的组合，p415ADH-ALD3、 p414ADH-ACS1的组合，p415ADH-ALD2、p416ADH-ACS1的组合，或p415ADH-ALD3、p416ADH-ACS1的组合的酵母转化，将由此制备的重组质粒引入包括CC02-0064、CC02-0168、CC02-0170、CC02-0256、CC02-0257、 CC02-0451和CC02-0452的菌株中。然而，在PDC基因中具有三重缺陷的 CC02-0257菌株中没有获得转化株，在该菌株中PDC活性没有被抑制。
由此制备的菌株及其遗传特性总结于表11中。
表11.ALD和ACS1过表达菌株
菌株 遗传特性
CC02-0225 CC02-0064 p415ADH，p416ADH
CC02-0226 CC02-0064 p415ADH-ALD2，p416ADH-ACS1
CC02-0227 CC02-0064 p415ADH-ALD3，p416ADH-ACS1
CC02-0356 CC02-0168 p414ADH，p415ADH
CC02-0275 CC02-0168 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0276 CC02-0168 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
CC02-0357 CC02-0170 p414ADH，p415ADH
CC02-0437 CC02-0170 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0278 CC02-0170 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
CC02-0444 CC02-0256 p415ADH，p416ADH
CC02-0361 CC02-0256 p415ADH-ALD2，p416ADH-ACS1
CC02-0362 CC02-0256 p415ADH-ALD3，p416ADH-ACS1
CC02-0453 CC02-0451 p414ADH，p415ADH
CC02-0454 CC02-0451 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0455 CC02-0451 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
CC02-0456 CC02-0452 p414ADH，p415ADH
CC02-0457 CC02-0452 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0458 CC02-0452 p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
实施例8：评价酵母菌株的乳酸发酵
对实施例7制备的ALD和ACS1过表达菌株的乳酸发酵能力进行评价。
特别地，将酵母接种到含有25ml的实施例3中为了评价乳酸发酵制备的培养基的每个烧瓶中，在30℃的需氧条件下培养71小时。分析存在于发酵液中的D型乳酸量，并用HPLC进行酶分析(乙酸，R-Biopharm，德国)以确定其中存在的乙酸量。
以上实验结果总结于下表12中。
表12.评价ALD和ACS过表达菌株的生长率、乳酸发酵、副产物和产量等
如表12中所证实的，相比具有正常PDC5活性的菌株，通过IDP2启动子或SC02启动子而PDC5活性降低的菌株具有急剧降低的副产物乙酸累积，即证实了乙酸被极少检出。在这种情况下，根据PDC5启动子替换，其中ALD 活性和ACS活性没有提高的菌株的最终细胞浓度倾向于降低。相反，其中 PDC5表达降低且ALD和ACS活性提高的菌株显示出最终细胞浓度提高。因此，证实了细胞生长的提高。特别地，ALD和ACS活性提高的CC02-0437 和CC02-0278菌株随着ALD和ACS活性提高显示出提高的生长率、产生的 D-乳酸浓度、其产量、以及发酵生产率，所述CC02-0437和CC02-0278菌株是基于其中PDC5启动子用IDP2替换的CC02-0170菌株制备的。
总之，其中PDC5用IDP2的弱表达替换的菌株具有降低的乙酸累积，且最终OD是显示出PDC5正常表达的菌株的1.3倍。另外，证实了当ALD 和ACS在ADH1启动子的控制下共表达时，葡萄糖消耗及其速率提高，最终产量百分比分别从56％增至66％，或从59％增至67％，显示出提高的产量。
特别地，通过比较应用于PDC5弱表达的2种启动子，证实了在分别具有SC02启动子和IDP2启动子的2种菌株中，乳酸生产率均得到提高。然而，在总细胞浓度、葡萄糖消耗及其速率方面，可以认为具有IDP2启动子的菌株是菌株的最优形式。
因此，证实了其生长率、D-乳酸生产浓度、产量、以及发酵生产率的CC02-0437菌株(登记号KCCM 11489P)于2013年11月22日被保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，其是布达佩斯条约承认的国际保藏单位。
实施例9：评价在PDC1和PDC5基因中具有双重缺陷且ALD和ACS活性提高的酵母菌 株的乳酸发酵
由于已经明确证实了细胞生长和产量提高的效果是PDC5活性降低的结果，进行评价以确定在乳酸产生中额外PDC基因缺陷的效果。用于每个菌株的评价方法与实施例8中描述的方法相同，培养进行74小时。
由此获得的实验结果总结于下表13中。
表13.在PDC1和PDC5基因中具有双重缺陷的菌株的乳酸发酵的评价结果
如表13中所证实的，在PDC1和PDC5基因中具有双重缺陷的菌株中，乙酸浓度明显降低，然而也观察到产生的D-乳酸浓度降低，这是由于细胞生长和葡萄糖消耗降低。另外，由PDC1和PDC5基因的双重缺陷导致的PDC 途径几乎失活的菌株在细胞生长、葡萄糖消耗及其生产率上没有任何提高，尽管该菌株表现出ALD和ACS活性提高。
实施例10：评价其中PDC途径被减弱的菌株使用蔗糖的乳酸发酵
为了评价使用蔗糖的发酵，将其中PDC途径被减弱的产乳酸酵母菌株用于证实乳酸生产效果，该菌株是与实施例8和9所评价的相同菌株。为此，使用蔗糖代替葡萄糖作为碳源。以与实施例8相同的方式实施评价方法。
由此获得的实验结果总结于下表14中。
表14.在PDC1和PDC5基因中具有双重缺陷或PDC5活性降低的菌株的乳酸发酵评价结果
与实施例8和9使用相同的方式，使用蔗糖代替葡萄糖用于菌株，通过提高其中PDC途径被减弱的菌株中的ALD和ACS活性来实现生长和发酵产量提高的效果，这显示与使用葡萄糖作为碳源的实施例8中的菌株结果的相同模式。因此，本发明证实了由于PDC活性降低和ALD和ACS活性提高的发酵产量和生长的提高效果不限于所用糖的类型，该效果在本发明中得到了证实。
总结以上结果，证实了相比未经突变的菌株，当菌株以丙酮酸脱羧酶 (PDC)途径被减弱且醛脱氢酶(ALD)和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高的方式突变时，乳酸生产率提高，同时维持其生长率。
由前述可知，本发明的所属领域技术人员能够理解，在不改变本发明的技术构思或本质特征的情况下，本发明可以以其他具体形式实施。就这一点而言，本文公开的示例性实施方案仅出于举例目的，而不应该解释为限制本发明的范围。相反，本发明意在不仅涵盖示例性实施方案，还涵盖可以包括于所附权利要求定义的本发明的精神和范围的各种替代方案、修改方案、等同方案和其他实施方案。
PCT/RO/134表

Claims (7)

1.一种乳酸生产率提高的经分离的酿酒酵母微生物，其中所述微生物是经修饰的，使得：
a)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低；
b)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述丙酮酸脱羧酶选自PDC1、PDC5和PDC6中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的微生物，其中所述微生物是经修饰的以：
i)使PDC1活性失活，降低PDC5活性；或
ii)降低PDC1活性，使PDC5活性失活。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述醛脱氢酶选自ALD2和ALD3中的至少一种，所述乙酰辅酶A合成酶是ACS1。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中还使醇脱氢酶(ADH)失活。
6.根据权利要求1所述的微生物，其中还使D-乳酸脱氢酶(DLD)失活。
7.一种生产乳酸的方法，其包括：
a)在培养基中培养根据权利要求1至6中任一项所述的微生物；
b)从步骤a)的所述培养基或微生物回收乳酸。
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