WO2010001862A1 - 有機酸の製造方法 - Google Patents

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yeast
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大西徹
松下響
多田宣紀
石田亘広
嶋村隆
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トヨタ自動車株式会社
株式会社豊田中央研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an organic acid using a yeast that produces an organic acid such as lactic acid.
  • Non-patent Document 1 Oshima
  • Non-patent Document 2 R. Patnaik et al., Nat. Biotechnol. 20 (2002), pp) 707-712
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 2003-500062
  • the present invention provides an organic acid fermentation efficiency by a simple method, without performing mutation breeding, DNA recombinant breeding, or the like when producing the organic acid by fermentation using a yeast that produces the organic acid. It aims at providing the method of improving.
  • the yeast that produces organic acid is treated in an organic acid-containing medium adjusted to a low pH, thereby producing the organic acid of the yeast. It has been found that the efficiency is greatly improved, and the present invention has been completed.
  • the yeast having the ability to produce an organic acid is treated with an organic acid-containing medium adjusted to a low pH, and after the step a, the yeast is treated. And b for producing an organic acid by the fermentation used.
  • the said step a has the step c which produces an organic acid by fermentation using the said yeast, and an organic acid containing culture medium with the organic acid produced in the said step c May be adjusted to a low pH. That is, the present invention can be applied to, for example, continuous culture in which yeast is treated with an organic acid-containing medium adjusted to a low pH with an organic acid between the fermentation process in step c and the fermentation process in step b.
  • the yeast in the method for producing an organic acid according to the present invention, in the step c, the yeast produces the yeast by neutralizing the organic acid produced by the yeast during fermentation with the yeast by adding an alkali and stopping or reducing the alkali addition.
  • the organic acid-containing medium can be adjusted to a low pH by the organic acid to be produced. That is, the organic acid for adjusting the medium to a low pH may be added from the outside of the culture system, but the organic acid produced by the yeast may be used.
  • the organic acid-containing medium may contain an organic acid liberated by adding an inorganic acid to a medium containing an organic acid salt. That is, as described above, when an organic acid produced by yeast is neutralized and contained in the medium in the form of an organic acid salt, the organic acid can be liberated by adding an inorganic acid (for example, a strong acid). it can. Thereby, the organic acid containing medium for processing yeast can be prepared.
  • the organic acid-containing medium may be adjusted to a low pH by adding an organic acid from the outside.
  • the at least 1 sort (s) of organic acid chosen from the group which consists of lactic acid, a succinic acid, and pyruvic acid can be mentioned.
  • a yeast belonging to the genus Saccharomyces particularly a yeast belonging to the strain of Saccharomyces cerevisiae.
  • a mutant strain into which a lactate dehydrogenase gene has been introduced as the yeast. That is, lactic acid is preferably used as the organic acid to be produced in the method for producing an organic acid according to the present invention.
  • the ability to produce organic acids in yeast that produces organic acids can be improved very easily, and the productivity of organic acids by fermentation can be greatly improved.
  • the yeast that produces an organic acid is treated with an organic acid-containing medium adjusted to a low pH prior to the fermentative production of the target organic acid.
  • the yeast that produces an organic acid may be a yeast that originally has an organic acid-producing ability, or a yeast that has been given an organic acid-producing ability by a genetic engineering technique or the like.
  • yeast As an example of yeast, the yeast which belongs to Saccharomyces genus, Shizosaccharomyces genus, Candida genus, Pichia genus, Hansenula genus, Torulopsis genus, Yarrowia genus, Kluyveromyces genus, Zygosaccharomyces genus, Yarrowia genus, Issatchenkia genus can be mentioned. Among them, it is preferable to use yeast belonging to the strain of Saccharomyces cerevisiae.
  • the organic acid produced by the yeast is preferably lactic acid, but is not limited thereto.
  • pyruvic acid, succinic acid, citric acid, fumaric acid, malic acid, acetic acid, 3-hydroxypropionic acid, malon Organic acids such as acid, propionic acid, aspartic acid, glutamic acid, itaconic acid, levulinic acid, ascorbic acid and gluconic acid can be produced.
  • wild-type yeast whose main metabolite is ethanol needs to undergo metabolic modification in order to confer organic acid production ability.
  • lactic acid-producing ability is imparted to yeast, it can be handled by a method of transforming a gene involved in lactic acid biosynthesis.
  • genes involved in lactic acid biosynthesis include lactate dehydrogenase genes described in JP-A-2003-259878, and genes derived from lactic acid bacteria (J. ⁇ Ind. Microbiol. Biotechnol. 31, 209-215, Table 2005-518197), genes derived from giant bacteria (Bacillus megaterium) (special table 2005-518197), genes derived from mold (Rhizopus) (J.JInd. Microbiol. Biotechnol. 30, 22-275), cattle Genes derived from (Appl. Environ. Microbiol. 67, 5621-5625) and the like can be exemplified.
  • examples of usable genes include prokaryotic organisms such as lactic acid bacteria, eukaryotic organisms such as fungi, and lactate dehydrogenase derived from higher eukaryotic organisms such as plants, animals, and insects.
  • yeast introduced with a lactate dehydrogenase gene described in JP-A-2003-259878 as yeast having lactic acid-producing ability. Since the lactate dehydrogenase gene is optimized for expression in yeast, L-lactic acid can be produced with high efficiency when transformed into yeast. Examples of transformed microorganisms include recombinant yeast (Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65 (9); 4211-4215).
  • the treatment for the yeast is a treatment for bringing the organic acid-containing medium having a low pH into contact with the yeast.
  • low pH means that the medium is in an acidic condition, that is, less than pH 7.0, preferably pH 4.0 or less, more preferably pH 3.5 or less.
  • the optimum pH for culturing and fermentation is 5.0 to 6.0 in ethanol fermentation.
  • the low pH is preferably set in a range in which the yeast to be treated does not die.
  • the lower limit of the pH of the medium for treating the Saccharomyces cerevisiae mutant introduced with the LDH gene is preferably pH 2.0.
  • the medium for treating yeast contains an organic acid and is adjusted to a low pH.
  • the organic acid for adjusting the medium to a low pH include at least one organic acid selected from the group consisting of lactic acid, succinic acid, and pyruvic acid.
  • the organic acid is not limited to these examples, for example, acetic acid, formic acid, benzoic acid, citric acid, D-glucuronic acid, oxalic acid, fumaric acid, malic acid, 3-hydroxypropionic acid, malonic acid, Examples include propionic acid, aspartic acid, glutamic acid, itaconic acid, levulinic acid, ascorbic acid, and gluconic acid.
  • the organic acid-containing medium may be prepared by adding the above-mentioned organic acid to the medium composition described later, but a strong acid such as sulfuric acid is added to the composition containing the organic acid salt. In this case, the organic acid may be liberated.
  • the organic acid is liberated from the organic acid salt as long as it is stronger than the target organic acid.
  • the medium composition is not particularly limited.
  • the assimilating carbon source of the fermentation medium any conventionally known assimilating carbon source of yeast having the ability to produce an organic acid can be used, and as long as the yeast grows and produces an organic acid, the yeast to be used is used. It is suitably selected according to the type of Examples of the assimilating carbon source include glucose, maltose, sucrose, sugar beet, corn steep liquor, and sugars from cellulosic materials.
  • a nitrogen source of the fermentation medium for example, yeast extract, heptone, whey and the like are used, but in order to make a medium that is inexpensive and does not burden the purification process, no nitrogen source is added or an ammonium salt such as ammonium sulfate is used. It is preferable to use inorganic nitrogen or urea.
  • an inorganic nutrient source for example, potassium phosphate, magnesium sulfate, Fe (iron), Mn (manganese) compound, and the like can be used, but they are not indispensable components.
  • the yeast When the yeast is treated with a medium adjusted to a low pH, for example, when a medium having a pH of 3.0 with lactic acid is used, it is preferably 2 hours or longer. Note that the treatment time can be further shortened if the pH of the medium is lower.
  • the treatment temperature varies depending on the type of yeast, but is usually about 20 to 40 ° C. In addition, you may process at high temperature exceeding 40 degreeC depending on the kind of yeast. Alternatively, the yeast may be treated by stirring or shaking the medium adjusted to a low pH.
  • the organic acid-producing ability of the yeast can be improved.
  • the organic acid production ability is the organic acid concentration contained in the medium when the organic acid is produced using untreated yeast, and the organic acid contained in the medium when the organic acid is produced using the yeast after the treatment described above. Evaluation can be made by comparing the acid concentration.
  • the production of the organic acid using the yeast described above may be performed by batch culture, continuous culture, or semi-batch culture.
  • Batch culture is a method in which a new medium is prepared for each of a plurality of cultures, yeast is inoculated therein, and the medium is not added until the production of the organic acid is completed.
  • Continuous culture is also referred to as perfusion culture, and is a culture method in which a medium is supplied to the culture system at a constant rate, and at the same time, the same amount of culture medium is withdrawn.
  • Semi-batch culture is a method of culturing while continuously or intermittently adding the medium itself or specific components in the medium during the culture.
  • the yeast described above may be used in a state of being supported on a solidified carrier.
  • any of these methods by performing the treatment using the organic acid-containing medium adjusted to the low pH described above before starting the fermentation production of the organic acid using the yeast, the production of the organic acid by fermentation production. Efficiency can be greatly improved.
  • addition of neutralizing agents such as ammonia, Ca (OH) 2 , CaCO 3 and NaOH in order to prevent the pH from being changed to the acidic side by the organic acid produced during the culture ( Alkali addition) may be performed. Since the yeast treated with the medium adjusted to the low pH described above has improved acid resistance, it is possible to fermentatively produce organic acids without maintaining the pH in a neutral region using a neutralizing agent.
  • the organic acid production ability of yeast can be improved in the next fermentation production of organic acid by adjusting the medium to low pH with organic acid at the end of fermentation production of organic acid.
  • the method for producing an organic acid according to the present invention can be applied to a production method for performing fermentation production of an organic acid multiple times, and by adjusting to a low pH with an organic acid at the end of each fermentation production, The ability to improve the organic acid production ability of yeast can be improved.
  • the pH can be lowered by stopping the alkali addition or reducing the addition amount.
  • An organic acid-containing medium adjusted to a low pH can be prepared.
  • the organic acid when an organic acid salt is contained in the medium by adding alkali, the organic acid can be liberated into the medium by adding a strong acid such as sulfuric acid, and an organic acid-containing medium adjusted to a low pH is prepared. be able to.
  • the organic acid is liberated from the organic acid salt as long as it is stronger than the target organic acid.
  • the temperature condition is not particularly limited, but is about 20 to 40 ° C. However, even higher temperatures are possible depending on the yeast used.
  • the reaction time required for organic acid production is not particularly limited, and the reaction is carried out at any production reaction time as long as the effect of the present invention is recognized. Moreover, since the reaction time required for organic acid production is inversely proportional to the inoculation amount of bacterial cells, the reaction time can be adjusted by examining the inoculation amount. Optimization of these conditions can be easily determined by those skilled in the art.
  • Example 1 As a lactic acid-producing yeast, a lactic acid dehydrogenase 4 copy-introduced strain prepared in JP-A-2006-006271 is used as a parent strain, and a strain into which a 2-copy lactic acid dehydrogenase gene is further introduced (lactic acid dehydrogenase gene 6 A copy-introduced strain).
  • TDH3P-U 5'-ATA TAT GGA TCC GGT AGA ATC ATT TTG AAT AA-3 '(SEQ ID NO: 1), BDHHI site added to TDH3 promoter sequence
  • TDH3P-D 5'-ATA TAT GAA TTC TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG-3 ′ (SEQ ID NO: 1), EcoRI site added to TDH3 promoter sequence
  • the amplified TDH3 promoter sequence digested with restriction enzymes BamHI and EcoRI was referred to as a TDH3P fragment.
  • G418 resistance gene fragment was amplified by PCR using genomic DNA of E. coli K-12 strain genome as a template. PCR primers were G418ORF-U (5'-ATA TAT GAA TTC ATG CAT ATT CAA CGG GAA AC -3 '(SEQ ID NO: 3), G418 resistance gene sequence with restriction enzyme EcoRI site added) and G418ORF-D (5'- ATA TAT CTT AAG TTA CAA CCA ATT AAC CAA TTC-3 '(SEQ ID NO: 4), a restriction enzyme AflII site was added to the G418 resistance gene sequence). The amplified G418 resistance gene sequence digested with restriction enzymes EcoRI and AflII was called G418 fragment.
  • the DNA fragment of the CYC1 terminator region was amplified by PCR using the genomic DNA of yeast NBRC2260 strain as a template.
  • PCR primers are CYC1T-U (5'-ATA TAT CTT AAG ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3 '(SEQ ID NO: 5), AflII site added to CYC1 terminator sequence), CYC1T-D (5'ATA TAT CCG CGG GTT ACA TGC GTA CAC GCG -3 '(SEQ ID NO: 6), SacII site added to CYC1 terminator sequence) was used.
  • the amplified CYC1 terminator sequence digested with restriction enzymes AflII and SacII was called a CYC1T fragment.
  • the TDH3P fragment, G418 fragment, and CYC1T fragment obtained by the above operation were sequentially ligated to the multicloning site of the pBluescriptII + SK + vector in this order to construct a G418 resistance marker cassette.
  • the obtained vector was digested with restriction enzymes SacI and EcoRV, and treated with the end-modifying enzyme T4 DNAasepolymerase to cut out the G418 resistance marker cassette, and the blunted end was called a G418 resistance marker cassette fragment.
  • chromosomal transfer vector pBG418-LDHKCB (Construction of chromosomal transfer vector pBG418-LDHKCB) A chromosomal transfer vector for introducing the LDH gene between the PDC6 gene and the CTT1 gene in chromosome 7 was prepared as follows.
  • DNA fragment of PDC6 gene 5 'upstream sequence was amplified by PCR using genomic DNA of yeast NBRC2260 strain as a template. PCR primers were PDC6-U (5'-ATA TAT GAG CTC GTT GGC AAT ATG TTT TTG C-3 '(SEQ ID NO: 7), SacI site added to the 5' upstream sequence of PDC6) and PDC6-D (5'- ATA TAT GCG GCC GCT TCC AAG CAT CTC ATA AAC C-3 '(SEQ ID NO: 8), NotI site was added to the 5' upstream sequence of PDC6.
  • the amplified PDC6 gene 5 'upstream sequence digested with restriction enzymes SacI and NotI was called a PDC6 fragment.
  • DNA fragments of the CTT1 gene 5 'upstream sequence were amplified by PCR using the genomic DNA of yeast NBRC2260 strain as a template.
  • PCR primers are CTT1-U (5'-ATA TAT GGG CCC GAT GTC GTA CGA TCG CCT GCA C-3 '(SEQ ID NO: 9), ApaI site added to the 5' upstream sequence of CTT1) and CTT1-D (5 ' -ATA-TAT-GGT-ACC-GGG-CAA-GTA-ACG-ACA-AGA-TTG-3 '(SEQ ID NO: 10), KpnI site added to 5' upstream sequence of CTT1).
  • a product obtained by digesting the amplified CTT1 gene 5 'upstream sequence with restriction enzymes ApaI and KpnI was called a CTT1 fragment.
  • the plasmid pBTrp-PDC1-LDHKCB prepared in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-259878 was digested with BamHI and PstI and excised from the LDHKCB expression cassette fragment (PDC1 promoter, LDH gene, TDH3 terminator Fragments linked in this order).
  • LDHKCB expression cassette fragment PDC1 promoter, LDH gene, TDH3 terminator Fragments linked in this order.
  • Each fragment (PDC6 fragment, LDHKCB expression cassette fragment, G418 resistance marker cassette fragment and CTT1 fragment) obtained by the above operation is sequentially ligated to the multiple cloning site of pBluescriptII + SK + vector to construct a chromosome introduction type vector pBG418-LDHKCB did.
  • This strain was sporulated with a spore formation medium (1% potassium phosphate, 0.1% yeast extract, 0.05% glucose, 2% glucose agar), and doubled using homothallic properties.
  • a strain in which the gene of interest was introduced into both diploid chromosomes was obtained and designated as a PDC1p-LDH6 copy strain.
  • Lactic acid was measured using biosensors BF-4 and BF-5 (Oji Scientific Instruments). As a result of measuring lactic acid, Table 1 shows the results of measuring the medium pH after acid treatment and the medium pH at the end of culture.
  • the lactic acid concentration was improved in the treatment section of lactic acid 400 mM or more and succinic acid 400 mM or more. Also, pyruvic acid, which has a higher ability to acidify the medium at a low concentration, improved the lactic acid concentration even at 100 mM.
  • the above PDC1p-LDH6 copy strain was inoculated into YPD medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) containing 0.1% calcium carbonate, and 150 ° C / min (shaking width 35mm) for 22 hours at 30 ° C. After culturing, the lactic acid was treated with 600 mM and further cultured for 5 hours. In addition, the bacteria which were cultured for 27 hours without lactic acid treatment were used as controls.
  • Fermentation medium (pH 12%, potassium dihydrogen phosphate 0.04%, magnesium sulfate 0.04%, calcium carbonate lees 0.1%, 0.5%, 1.0%, 2.0%, 4.0% or 5.0%) Put 20ml into a 100ml flask, inoculate the above two types of cultures to a concentration of 4%, and ferment at 120rpm / min (shaking width 35mm) at 34 ° C to produce lactic acid The amount was examined. The fermentation test was completed in 16 hours of fermentation. All sugars were consumed at the time of 16 hours of fermentation, except for the treatment area of 0.1% calcium carbonate.
  • biosensors BF-4 and BF-5 (Oji Scientific Instruments) were used. The results are shown in FIG.
  • the lactic acid concentration in the figure showed the highest concentration up to 16 hours of fermentation.
  • the pH shows the data at the highest concentration of lactic acid.
  • the lactic acid concentration of the bacterium treated with 600 mM lactic acid was higher in all treatment sections than the untreated bacterium.
  • the pH of the fermentation broth was in the range of 2.4 to 5.1. From this result, it became clear that the fermentation ability improvement effect by organic acid stress is not related to the control pH during fermentation.
  • the same effect can be obtained by reducing the pH of the culture medium by reducing the pH of the culture medium with only the organic acid produced by the bacteria by reducing the amount of medium additives with high buffering capacity such as yeast extract and peptone from the culture medium.
  • medium additives with high buffering capacity such as yeast extract and peptone from the culture medium.
  • the PDC1p-LDH6 copy strain was inoculated in a modified YPD medium (yeast extract 0.5%, peptone 1%, glucose 3%), and cultured at 150 rpm / min (shaking width 35 mm) at 30 ° C. for 33 hours.
  • calcium carbonate was added at 8, 24, and 29 hours after the start of culture to prepare a treatment group in which the pH reduction of the culture medium was suppressed, and a treatment group cultured in a YPD medium (no calcium carbonate added).
  • Bacteria cultured in the modified YPD medium had a pH lowered to 3.0, but treated with calcium carbonate added to the modified YPD medium (1) (concentrations of 0.1%, 0.2%, and 0.1% after 8, 24, and 29 hours, respectively) Min. Of calcium carbonate added) decreased to pH 3.3 after 24 hours, but reached pH 4.3 at the end of the culture.
  • the pH is 6.4 at the end of the culture. It was.
  • the pH decreased to 3.8, but reached pH 4.2 at the end of the culture (FIG. 2).
  • lactic acid was detected, so it was considered that the main cause of the pH decrease was lactic acid (see Table 2).
  • Viable cell autoanalyzer Vi-CELL (Beckman Coulter) was used to count the number of viable cells.
  • Example 2 the organic acid treatment time for the PDC1p-LDH6 copy strain used in Example 1 was examined. Specifically, PDC1p-LDH6 copy strain was inoculated into YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) containing 0.1% calcium carbonate, and 30 rpm at 150 rpm / min (shaking width 35 mm). Culturing was carried out at 21 ° C. for 21 hours. Thereafter, 600 mM lactic acid was added as an organic acid treatment, and further cultured for 30 minutes to 5 hours. As a control, bacteria cultured for 21 hours without lactic acid treatment were used.
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose
  • the lactic acid concentration was significantly improved in the treated group of lactic acid treatment for 2 hours or more compared to the untreated group, so the time required for organic acid stress should be 2 hours or more.
  • the time required for organic acid stress should be 2 hours or more.
  • lactic acid was used as the organic acid, and was evaluated in an experimental system in which the medium pH at the end of the culture was 3.0. Depending on the type of organic acid and the pH at the end of the culture, it is necessary for organic acid stress. Can be understood as different times.
  • Example 3 the desirable pH of organic acid treatment for the PDC1p-LDH6 copy strain used in Example 1 was examined.
  • the PDC1p-LDH6 copy strain was grown using a 1 L jar manufactured by Biot Co., Ltd. while controlling the pH at 5.2, 4.5, 4.0, or 3.5.
  • the fermentation test was performed using the microbial cells processed by various pH, and the influence with respect to the fermentation test of pH at the time of lactic acid stress provision was examined by measuring the production amount of lactic acid.
  • Cell growth in 1L jar (with lactic acid stress) was performed using YPD medium, stirring speed 450rpm, aeration volume 1vvm (volume per volume per minute), and culturing at 30 ° C for 17 hours did.
  • the pH was controlled with lactic acid and sodium hydroxide.
  • Comparative Example 1 In this comparative example, a medium adjusted to a low pH using an inorganic acid instead of an organic acid or a medium added with an organic acid salt having the same molar concentration as the concentration effective with the organic acid (not adjusted to a low pH) A fermentation test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the medium was used. That is, in this comparative example, sulfuric acid was added as an inorganic acid to 20 mM or 40 mM, the pH was measured, and further cultured for 5 hours. Thus, the PDC1p-LDH6 copy strain was treated with a medium having a low pH with sulfuric acid.

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Abstract

　有機酸を生産する酵母を用いて当該有機酸を発酵により生産する際に、変異育種やDNA組換え育種等を実施せずとも、簡便な方法により有機酸の発酵効率を向上させる。 　有機酸を生産する酵母を、低pHに調整した有機酸含有培地中にて処理することによって、当該酵母の有機酸の生産効率が大幅に向上する。

Description

有機酸の製造方法
　本発明は、乳酸等の有機酸を生産する酵母を用いた有機酸の製造方法に関する。
　一般的に微生物を用いて有機酸を発酵生産する場合、中和剤によりpHを中性に制御して発酵を行う。しかし、同方法で生産される有機酸は塩の状態であり、精製工程で脱塩する必要があることから、製造コスト上昇に繋がる。そこで、酸性条件下で有機酸発酵を行うことが考えられるが、好酸菌の生育は酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸により阻害されることが知られており（非特許文献１：大島泰郎監修「極限微生物ハンドブック」第231項）、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)のクエン酸発酵の場合を除いて、有機酸を高効率に生産する菌はほとんど知られていない。この問題を解決する方法として、有機酸を高効率で生産する株について変異育種により酸耐性を付与する方法（非特許文献２：R. Patnaik et al., Nat. Biotechnol. 20 (2002), pp. 707-712）や、耐酸性強いが生産能力が低い菌株を親株として収率向上を狙った代謝改変を施す方法（特許文献１：特表2003－500062号公報）が開示されているが、その効果は不十分である。
　このように、変異育種法や遺伝子工学的手法によって微生物を改変といった手法により、有機酸の生産性を向上させる試みがなされているものの、これら微生物の改変手法は、煩雑であり、また確実に所望の特性を得られるとは限らない。
特表2003－500062号公報 大島泰郎監修「極限微生物ハンドブック」第231項 R. Patnaik et al., Nat. Biotechnol. 20 (2002), pp. 707-712
　そこで、本発明は、有機酸を生産する酵母を用いて当該有機酸を発酵により生産する際に、変異育種やDNA組換え育種等を実施せずとも、簡便な方法により有機酸の発酵効率を向上させる方法を提供することを目的とするものである。
　上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、有機酸を生産する酵母を、低pHに調整した有機酸含有培地中にて処理することによって、当該酵母の有機酸の生産効率が大幅に向上することを見いだし、本発明を完成するにいたった。
　すなわち、本発明に係る有機酸の製造方法は、有機酸を生産する能力を有する酵母を、低pHに調整した有機酸含有培地にて処理するステップａと、上記ステップａの後、上記酵母を用いた発酵により有機酸を産生するステップｂとを有するものである。
　なお、本発明に係る有機酸の製造方法において、上記ステップａは、上記酵母を用いた発酵により有機酸を産生するステップｃを有し、上記ステップｃにおいて産生された有機酸により有機酸含有培地を低pHに調整してもよい。すなわち、ステップｃの発酵工程と、ステップｂの発酵工程の間に有機酸によって低pHに調整した有機酸含有培地にて酵母を処理するといった、例えば連続培養に本発明を適用することができる。
　また、本発明に係る有機酸の製造方法において上記ステップｃでは、上記酵母による発酵に際して上記酵母が生産する有機酸をアルカリ添加により中和し、アルカリ添加を停止又は減少することで、上記酵母が生産する有機酸によって有機酸含有培地を低pHに調整することができる。すなわち、培地を低pHに調整するための有機酸は、培養系の外部から添加するのではなく、上記酵母の産生する有機酸を利用しても良い。
　さらに、本発明に係る有機酸の製造方法において、上記有機酸含有培地は、有機酸塩を含有する培地に無機酸を添加することで遊離した有機酸を含有ものであってもよい。すなわち、上述のように、酵母が生産する有機酸をアルカリ中和して有機酸塩の状態として培地に含む場合には、無機酸（例えば強酸）を添加することで有機酸を遊離させることができる。これにより、酵母を処理するための有機酸含有培地を準備することができる。
　一方、本発明に係る有機酸の製造方法において、上記有機酸含有培地は、外部から有機酸を添加して低pHに調整したものであってもよい。
　なお、上記培地を低pHに調整するための有機酸としては、乳酸、コハク酸及びピルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機酸を挙げることができる。
　本発明に係る有機酸の製造方法においては、上記酵母がSaccharomyces 属に属する酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeの菌株に属する酵母を使用することが好ましい。本発明に係る有機酸の製造方法において上記酵母としては、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された変異株を使用することが好ましい。すなわち、本発明に係る有機酸の製造方法において生産対象の有機酸として乳酸とすることが好ましい。
　本発明によれば、有機酸を生産する酵母における有機酸の生産能を、非常に簡便に向上させることができ、発酵法による有機酸の生産性を大幅に改善することができる。
乳酸ストレス付与と発酵試験のpHとの関係を示す特性図である。 各種培地における、菌自体が生産する有機酸によるpHの変化を示す特性図である。 菌自体が生産する有機酸によるpHストレスを付与した際の発酵試験の結果を示す特性図である。なお、縦軸に示す濃度（％）は、発酵18時間後の発酵液組成における濃度である。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-170854号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明では、有機酸を生産する酵母を、目的物質である有機酸の発酵生産に先立って、低pHに調整された有機酸含有培地にて処理する。ここで、有機酸を生産する酵母としては、本来的に有機酸生産能を有する酵母であっても良いし、遺伝子工学的手法等によって有機酸生産能を付与された酵母であっても良い。酵母の一例としては、Saccharomyces属、Shizosaccharomyces属、Candida属、Pichia属、Hansenula属、Torulopsis属、Yarrowia属、Kluyveromyces属、Zygosaccharomyces属、Yarrowia属、Issatchenkia属に属する酵母を挙げることができる。中でも、Saccharomyces cerevisiaeの菌株に属する酵母を使用することが好ましい。さらに、乳酸脱水素酵素遺伝子（LDH遺伝子）を１コピー又は複数コピー導入したSaccharomyces cerevisiae変異株であって、乳酸生産能が付与された変異株を使用することが好ましい。また、酵母が生産する有機酸としては、乳酸であることが好ましいが、これに限定されず、例えばピルビン酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、酢酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、アスコルビン酸、グルコン酸等の有機酸を生産対象とすることができる。
　なお、主要代謝産物がエタノールである野性型酵母については、有機酸の生産能を付与するために代謝改変を行う必要がある。例えば、酵母に乳酸生成能を付与する際には、乳酸の生合成に関与する遺伝子を形質転換する方法で対応することが可能である。
　乳酸の生合成に関与する遺伝子としては、特開2003-259878号公報に記載されている乳酸脱水素酵素遺伝子や、乳酸菌由来の遺伝子（J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31, 209-215、特表2005-518197号）、巨大菌（バチルス メガテリウム）由来の遺伝子（特表2005-518197号）、カビ（リゾプス属）由来の遺伝子（J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 22-275）、ウシ由来の遺伝子（Appl. Environ. Microbiol. 67, 5621-5625）等を例示することができる。その他に、使用可能な遺伝子としては、乳酸菌等の原核生物、カビ等の真核生物、植物や動物並びに昆虫等の高等真核生物に由来する乳酸脱水素酵素を挙げることができる。
　特に、乳酸生成能を有する酵母としては、特開2003-259878号公報に記載されている乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した酵母を使用することが好ましい。当該乳酸脱水素酵素遺伝子は、酵母における発現が最適化されているため、酵母に形質転換されるとL-乳酸を高効率で生産することができる。なお、形質転換微生物の例としては、組み換え酵母(Appl. Environ. Microbiol.,1999,65(9);4211-4215)などを挙げることができる。
　また、当該酵母への処理とは、低pHとされた有機酸含有培地と酵母とを接触させる処理である。ここで、低pHとは、培地が酸性条件であることを意味し、すなわちpH7.0未満を意味し、好ましくはpH4.0以下、より好ましくはpH3.5以下を意味する。なお、Saccharomyces cerevisiaeの場合、エタノール発酵においては、培養・発酵の最適ｐHは5.0から6.0であり、pH4.0以下で培養・発酵を行うと、著しく菌の増殖・エタノール生産が阻害される。さらに、処理対象の酵母によっては、強酸性条件で死滅する虞がある。したがって、低pHとしては、処理対象の酵母が死滅しない範囲とすることが好ましい。例えば、LDH遺伝子を導入したSaccharomyces cerevisiae変異株を処理する培地のpHの下限としては、pH2.0とすることが好ましい。
　ここで、酵母を処理する培地は、有機酸を含有し、低pHに調整されている。培地を低pHに調整するための有機酸としては、乳酸、コハク酸及びピルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機酸が挙げられる。しかし、有機酸としては、これらの例示に限定されず、例えば、酢酸、ギ酸、安息香酸、クエン酸、D-グルクロン酸、シュウ酸、フマル酸、リンゴ酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、アスコルビン酸、グルコン酸等を挙げることができる。
　また、有機酸含有培地は、後述する培地組成に対して外部から上述した有機酸を添加することで準備しても良いが、有機酸塩を含有する組成に対して硫酸等の強酸を添加することで有機酸を遊離させたものであってもよい。ここで、有機酸塩から有機酸を遊離させるには、対象とする有機酸より強酸であれば特に限定されない。
　酵母を処理するための培地において、培地組成としては特に限定されない。例えば、発酵培地の資化炭素源としては、有機酸生成能力を有する酵母の資化炭素源として従来公知のものがいずれも使用でき、酵母が生育し有機酸を生成する限りにおいて、使用する酵母の種類に応じて適宜選択される。資化炭素源としては、例えばグルコース、マルトース、スクロース、糖みつ、コーンスティープリカー及びセルロース系物質からの糖類などが用いられる。また、発酵培地の窒素源としては、例えば酵母エキス、ヘプトン及びホエーなどが用いられるが、安価で精製工程に負担がかからない培地にするには、窒素源を添加しない、もしくは硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩などの無機態窒素や尿素を使用することが好ましい。さらに、無機物栄養源として、例えばリン酸カリウム、硫酸マグネシウムやＦｅ（鉄）、Ｍｎ（マンガン）化合物などを使用することが可能であるが、必至な成分ではない。
　上記酵母を低pHに調整された培地で処理する際には、例えば、乳酸によりpHを3.0とした培地を用いる場合、２時間以上であることが好ましい。なお、培地のpHがより低くなれば処理時間はより短縮することができる。また、処理温度は、酵母の種類によって異なるが、通常約２０～４０℃程度で行われる。なお、酵母の種類によっては４０℃を超える高温で処理しても良い。また、低pHに調整された培地を撹拌したり、振とうするなどして、上記酵母を処理してもよい。
　以上のように、有機酸生産能を有する酵母に対して、低pHに調整された培地で処理することによって、当該酵母の有機酸生産能を向上させることができ、更には当該酵母の耐酸性を向上させることができる。有機酸生産能は、未処理の酵母を用いて有機酸を生産したときの培地に含まれる有機酸濃度と、上述した処理後の酵母を用いて有機酸を生産したときの培地に含まれる有機酸濃度とを比較することで評価することができる。
　また、上述した酵母を用いた有機酸の製造は、回分式培養で行ってもよいし、連続式培養で行っても良いし、半回分式培養で行っても良い。回分式培養とは、複数回の培養について一回ごとに新たな培地を準備し、そこへ酵母を植菌し、有機酸の生産終了まで培地を添加しない方法である。連続式培養とは、灌流培養とも称され、一定の速度で培養系に培地を供給し、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。半回分式培養とは、培養中に培地自体や培地中の特定の成分を連続的又は断続的に添加しながら培養する方法である。また、いずれの方式を採用した場合も、上述した酵母は固体化担体に担持された状態で使用してもよい。
　これらいずれの方式においても、上記酵母を用いて有機酸の発酵生産を開始するに先立って上述した低pHに調整した有機酸含有培地を用いた処理を行うことによって、発酵生産による有機酸の生産効率を大幅に向上させることができる。また、いずれの方式においても、培養中に生産された有機酸によってpHが酸性側に変化することを防止するため、アンモニア、Ca(OH)2、CaCO3及びNaOH等の中和剤の添加（アルカリ添加）を行っても良い。なお、上述した低pHに調整した培地により処理した酵母は耐酸性が向上しているため、中和剤を用いてpHを中性領域に維持しなくとも有機酸の発酵生産が可能である。
　また、上述したいずれの方式においても、有機酸の発酵製造の終了時に培地を有機酸により低pHに調整することで、次回の有機酸の発酵製造において、酵母の有機酸生産能を向上させることができる。すなわち、本発明に係る有機酸の製造方法は、有機酸の発酵製造を複数回にわたって行う製造方法に適用することができ、各回の発酵製造において終了時に有機酸により低pHに調整することで、酵母の有機酸生産能を向上させることができる
　有機酸の発酵製造時に上述したアルカリ添加により中和する場合には、アルカリ添加を停止するか添加量を減少することによってpHを低下させることができ、低pHに調整した有機酸含有培地を準備することができる。また、アルカリ添加によって培地に有機酸塩を含有する場合には、硫酸等の強酸を添加することによって有機酸を培地中に遊離させることができ、低pHに調整した有機酸含有培地を準備することができる。ここで、有機酸塩から有機酸を遊離させるには、対象とする有機酸より強酸であれば特に限定されない。
　なお、上述した酵母を用いて有機酸を発酵製造する際、温度条件としては特に限定されないが約２０～４０℃程度とする。しかし、使用する酵母によっては、更に高い温度でも可能である。有機酸生成に要する反応時間に関しても特に限定されず、本発明の効果が認められる限り任意の生成反応時間で実施される。また、有機酸生成に要する反応時間は菌体の接種量に反比例するので、接種量を検討すれば、反応時間は調整可能である。これらの条件の最適化は当業者においては容易に定めることのできるものである。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、乳酸生産酵母として、特開2006-006271で作製された乳酸脱水素酵素4コピー導入株を親株とし、さらに2コピー乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した株（乳酸脱水素酵素遺伝子6コピー導入株）を作製した。
（G418耐性マーカーカセットの構築）
　酵母NBRC2260株のゲノムDNAを鋳型として、TDH3プロモーター領域のDNA断片をPCRで増幅した。PCRプライマーはTDH3P-U（5’-ATA TAT GGA TCC GGT AGA ATC ATT TTG AAT AA-3’（配列番号１）、TDH3プロモーター配列にBamHIサイトを付加）、TDH3P-D（5’-ATA TAT GAA TTC TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG -3’（配列番号１）、TDH3プロモーター配列にEcoRIサイトを付加）を使用した。増幅されたTDH3プロモーター配列を制限酵素BamHIおよびEcoRIで消化したものをTDH3P断片と称した。
　大腸菌K-12株ゲノムのゲノムDNAを鋳型として、G418耐性遺伝子断片をPCRで増幅した。PCRプライマーはG418ORF-U（5’-ATA TAT GAA TTC ATG CAT ATT CAA CGG GAA AC -3’（配列番号３）、G418耐性遺伝子配列に制限酵素EcoRIサイトを付加）とG418ORF-D（5’-ATA TAT CTT AAG TTA CAA CCA ATT AAC CAA TTC-3’（配列番号４）、G418耐性遺伝子配列に制限酵素AflIIサイトを付加）を使用した。増幅されたG418耐性遺伝子配列を制限酵素EcoRIおよびAflIIで消化したものをG418断片と称した。
　酵母NBRC2260株のゲノムDNAを鋳型として、CYC1ターミネーター領域のDNA断片をPCRで増幅した。PCRプライマーはCYC1T-U（5’-ATA TAT CTT AAG ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3’（配列番号５）、CYC1ターミネーター配列にAflIIサイトを付加）、CYC1T-D（5’ATA TAT CCG CGG GTT ACA TGC GTA CAC GCG -3’（配列番号６）、CYC1ターミネーター配列にSacIIサイトを付加）を使用した。増幅されたCYC1ターミネーター配列を制限酵素AflIIおよびSacIIで消化したものをCYC1T断片と称した。
　上記操作で得られたTDH3P断片、G418断片およびCYC1T断片を、この順番で並ぶように順次pBluescriptII SK+ベクターのマルチクローニングサイトに連結してG418耐性マーカーカセットを構築した。得られたベクターを制限酵素SacIおよびEcoRVで消化、及び末端修飾酵素T4 DNA polymerase処理してG418耐性マーカーカセットを切り出し、末端を平滑化したものをG418耐性マーカーカセット断片と称した。
（染色体導入型ベクターpBG418-LDHKCBの構築）
　7番染色体中のPDC6遺伝子とCTT1遺伝子の間にLDH遺伝子を導入するための染色体導入型ベクターを下記の通り作製した。
　酵母NBRC2260株のゲノムDNAを鋳型として、PDC6遺伝子5’上流配列のDNA断片をPCRで増幅した。PCRプライマーはPDC6-U（5’-ATA TAT GAG CTC GTT GGC AAT ATG TTT TTG C-3’（配列番号７）、PDC6の5’上流配列にSacIサイトを付加）とPDC6-D（5’-ATA TAT GCG GCC GCT TCC AAG CAT CTC ATA AAC C-3’（配列番号８）、PDC6の5’上流配列にNotIサイトを付加）を使用した。増幅されたPDC6遺伝子5’上流配列を制限酵素SacIおよびNotIで消化したものをPDC6断片と称した。
　酵母NBRC2260株のゲノムDNAを鋳型として、CTT1遺伝子5’上流配列のDNA断片をPCRで増幅した。PCRプライマーはCTT1-U（5’-ATA TAT GGG CCC GAT GTC GTA CGA TCG CCT GCA C-3’（配列番号９）、CTT1の5’上流配列にApaIサイトを付加）とCTT1-D（5’-ATA TAT GGT ACC GGG CAA GTA ACG ACA AGA TTG-3’（配列番号１０）、CTT1の5’上流配列にKpnIサイトを付加）を使用した。増幅されたCTT1遺伝子5’上流配列を制限酵素ApaIおよびKpnIで消化したものをCTT1断片と称した。
　特開2003-259878（特願2002-65879）号公報で作製されたプラスミドpBTrp-PDC1-LDHKCBについてBamHIおよびPstIにより消化して切り出したものをLDHKCB発現カセット断片（PDC1プロモーター、LDH遺伝子、TDH3ターミネーターがこの順番に連結された断片）と称した。上記操作で得られた各断片（PDC6断片、LDHKCB発現カセット断片、G418耐性マーカーカセット断片およびCTT1断片）を、順次pBluescriptII SK+ベクターのマルチクローニングサイトに連結して、染色体導入型ベクターpBG418-LDHKCBを構築した。
（LDH6コピー導入株の作製）
　酢酸リチウム法(Ito et al., J.Bacteriol., 153, 163-168(1983))にて、pG418-LDHKCBベクターを制限酵素SacIおよびKpnIで消化した断片を用い、特開2006-006271号公報で作製されたPDC1p-LDH４コピー株を形質転換した。10μg/ml G418を含むYPD培地で選抜後、導入遺伝子をPCRにて確認し、形質転換体を得た。
　この株を胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体両方に目的の遺伝子が導入されている株を取得し、これをPDC1p-LDH6コピー株とした。
（乳酸ストレス付与と発酵試験）
　上記PDC1p-LDH6コピー株について、炭酸カルシウム0.1％を含むYPD培地（イーストエキストラクト 1％、ペプトン 2％、グルコース2％）に植菌し、150rpm/分（震とう幅35mm）で30℃22時間培養を行い、乳酸、コハク酸又はピルビン酸を所定濃度となるように添加してpHを測定し、さらに5時間培養した。
　発酵培地（濃度糖12%、りん酸二水素カリウム0.04%、硫酸マグネシウム0.04%、炭酸カルシウム0.4％）20mlを100ml容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度が4%になるように接種し、120rpm/分（震とう幅35mm）・34℃で発酵を行い、乳酸の生産量を検討した。なお、発酵16時間の時点で全ての処理区は糖を全て消費したか、残糖がある処理区も乳酸濃度が減少し始めていたことから、発酵試験は終了した。
　乳酸の測定はバイオセンサBF-4及びBF-5（王子計測機器）を用いた。乳酸を測定した結果、酸処理後の培地pH及び培養終了時の培地pHを測定した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から判るように、発酵試験の結果、乳酸400mM以上、コハク酸400ｍM以上の処理区で乳酸濃度が向上した。また、低濃度でより培地を酸性化する能力の高いピルビン酸は100mMでも乳酸濃度が向上した。
（乳酸ストレス付与と発酵試験のpH）
　上記PDC1p-LDH6コピー株について、炭酸カルシウム0.1％を含むYPD培地（イーストエキストラクト 1％、ペプトン 2％,グルコース2％）に植菌し、150rpm/分（震とう幅35mm）で30℃22時間培養を行い、乳酸600mM処理を行い、さらに5時間培養した。なお、乳酸処理をしないで27時間培養した菌を対照とした。
　炭酸カルシウムの濃度を変えることでpHを変えた発酵培地（濃度糖12%、りん酸二水素カリウム0.04%、硫酸マグネシウム0.04%、炭酸カルシウム 0.1%、0.5％、1.0%、2.0%、4.0%又は5.0%）20mlを100ml容のフラスコに入れ、上記2種類の培養菌を濃度が4%になるように接種し、120rpm/分（震とう幅35mm）・34℃で発酵を行い、乳酸の生産量を検討した。なお、発酵16時間で発酵試験を終了した。発酵16時間の時点で炭酸カルシウム0.1%の処理区を除き、糖を全て消費した。
　乳酸の測定はバイオセンサBF-4及びBF-5（王子計測機器）を用いた。結果を図１に示す。なお、図の乳酸濃度は発酵16時間までの最高濃度を示した。pHは乳酸が最高濃度時のデータを示した。
　発酵試験の結果、乳酸600mMを処理した菌のほうが、無処理の菌と比較して、全ての処理区で乳酸濃度が上回った。なお、発酵液のpHは2.4から5.1の範囲となった。本結果より、有機酸ストレスによる発酵能力向上効果は、発酵時の制御pHと関係ないことが判明した。
（菌自体が生産する有機酸によるpHストレス付与と発酵試験）
　培養培地から酵母エキスやペプトンなど緩衝能力が高い培地添加物を削減し、菌が生産する有機酸のみで培養培地のpHを下げることで、外部より有機酸添加してpHを下げると同様な効果が期待できるか検討した。改変YPD培地（イーストエキストラクト 0.5％、ペプトン 1％、グルコース3％）に、上記PDC1p-LDH6コピー株を植菌し、150rpm/分（震とう幅35mm）で30℃33時間培養を行った。対照として、培養開始8・24・29時間後に炭酸カルシウムを添加し、培養培地のpH低下を抑えた処理区と、YPD培地で培養した処理区（炭酸カルシウム添加なし）を用意した。
　改変YPD培地で培養した菌はpHが3.0まで低下したが、改変YPD培地に炭酸カルシウムを添加した処理区（1）（8・24・29時間後に、各0.1%・0.2%・0.1%の濃度分の炭酸カルシウムを添加）では、24時間後にpH3.3まで低下したものの、培養終了時にはpH4.3となった。改変YPD培地に炭酸カルシウムを添加した処理区（2）（8・24・29時間後に、各0.1%・0.3%・0.2%の濃度分の炭酸カルシウムを添加）では培養終了時にはpH6.4となった。YPD培地で培養した場合、pHは3.8まで低下したが、培養終了時にはpH4.2となった（図２）。なお、培養終了時の培地の乳酸濃度を測った結果、乳酸が検出されたことから、pH低下の主因は乳酸によるものと考えられた（表２参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　発酵培地（濃度糖13.8%、炭酸カルシウム0.5％、りん酸二水素カリウム0.04%、硫酸マグネシウム0.04%）20mlを100ml容のバッフル付きフラスコに入れ、上記培養菌体の濃度が4%になるように接種し、120rpm/分（震とう幅35mm）・34℃で発酵を行い、18時間後の発酵液組成を調べた（図３）。発酵試験の結果、改変YPD培地で培養した菌が最も高い乳酸濃度となった。乳酸・グルコース・エタノールの測定はバイオセンサBF-4及びBF-5（王子計測機器）を用いた。さらに、発酵18時間後の生細胞数を計測した結果、細胞数は培養開始時の30-50%程度とばらついたが、乳酸発酵能力と生細胞数との相関性はなかった。生細胞数の計測は生死細胞オートアナライザーVi-CELL（ベックマンコールター）を使用した。
　本結果から、発酵能力向上に必要な有機酸ストレスとして、一定濃度の有機酸が培地中にあれば、有機酸を外部から添加して培地を低pHに調整する必要性はなく、その効果はpHに依存すること判明した。
〔実施例２〕
　本実施例では、実施例１で使用したPDC1p-LDH6コピー株に対する有機酸処理の時間を検討した。具体的に、PDC1p-LDH6コピー株を、炭酸カルシウム0.1％を含むYPD培地（イーストエキストラクト 1％、ペプトン 2％,グルコース2％）に植菌し、150rpm/分（震とう幅35mm）で30℃、21時間培養を行った。その後、有機酸処理として乳酸600mMを添加し、さらに30分から5時間培養した。なお、対照としては、乳酸処理をしないで21時間培養した菌とした。
　次に、発酵培地（濃度糖13%、りん酸二水素カリウム0.04%、硫酸マグネシウム0.04%、炭酸カルシウム0.4％）20mlを100ml容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度が4%になるように接種し、120rpm/分（震とう幅35mm）・34℃で発酵を行い、乳酸の生産量を検討した。発酵17時間後に測定した乳酸濃度及びグルコース濃度の結果を表３に示す。なお、17時間以上発酵を継続しても乳酸濃度が上昇することはなかった。乳酸及びグルコースの測定はバイオセンサBF-4及びBF-5（王子計測機器）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から判るように、発酵試験の結果、乳酸処理2時間以上の処理区で、無処理区に対し著しく乳酸濃度が向上したことから、有機酸ストレスに必要な時間は2時間以上とすることが好ましいことが判明した。なお、本実施例では、有機酸として乳酸を用い、培養終了時の培地pHが3.0である実験系で評価したものであり、有機酸の種類や培養終了時のpHによって、有機酸ストレスに必要な時間は異なってくるものと理解できる。
〔実施例３〕
　本実施例では、実施例１で使用したPDC1p-LDH6コピー株に対する有機酸処理の望ましいpHを検討した。具体的に、上記PDC1p-LDH6コピー株について、バイオット社製の1Lジャーを用い、pHを5.2、4.5、4.0若しくは3.5に制御して増殖させた。このように、各種pHで処理された菌体を用いて発酵試験を行い、乳酸の生産量を測定することで、乳酸ストレス付与時のpHの発酵試験に対する影響を検討した。なお、1Lジャーにおける菌体増殖（乳酸ストレス付与）は、YPD培地を用い、撹拌数450rpm、通気量1vvm（volume per volume per minute（単位体積あたりのガス通気量））、30℃で17時間培養した。pH制御は乳酸と水酸化ナトリウムで行った。
　発酵培地（グルコース13%、リン酸二水素カリウム0.01%、硫酸マグネシウム0.01%、炭酸カルシウム0.4%）20mLを100mL容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度がそれぞれ1%となるように接種し、120rpm（振とう幅35mm）、34℃で発酵を行い、乳酸の生産量を検討した。
　乳酸の測定は、バイオセンサBF-4及びBF-5（王子計測機器社製）を用いた。結果を表４に示す。なお、表４の乳酸濃度は、発酵54時間までの最高濃度を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　発酵試験の結果、菌体増殖時に培地におけるpHを低い値にするほど、最高乳酸濃度がより向上する傾向があった。その効果は、pH4.5でも確認でき、pH3.0が最も効果が高かった。
〔比較例１〕
　本比較例では、有機酸に代えて無機酸を用いて低pHに調整した培地又は有機酸で効果があった濃度と同モル濃度の有機酸塩を添加した培地（低pHに調整していない培地）を用いた以外は実施例１と同様にして、発酵試験を行った。すなわち、本比較例では、無機酸として硫酸を20mM又は40mMとなるように添加してpHを測定し、さらに5時間培養した。このように硫酸により低pHとした培地によってPDC1p-LDH6コピー株を処理した。次に、発酵培地（濃度糖12%、りん酸二水素カリウム0.04%、硫酸マグネシウム0.04%、炭酸カルシウム0.4％）20mlを100ml容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度が4%になるように接種し、120rpm/分（震とう幅35mm）・34℃で発酵を行い、乳酸の生産量を検討した。なお、発酵16時間の時点で全ての処理区は糖を全て消費したか、残糖がある処理区も乳酸濃度が減少し始めていたことから、発酵試験は終了した。乳酸の測定はバイオセンサBF-4及びBF-5（王子計測機器）を用いた。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表１と表５とを比較すると、有機酸で低pHとした培地によって処理した場合には乳酸の生産性が向上したのに対して、無機酸で低pHとした培地や、有機酸塩を含有するpHを低下させない培地によって処理した場合には乳酸の生産性は低下していた。本比較例から、有機酸を生産する酵母に対して、低pHに調整した有機酸含有培地で処理することで、当該酵母の有機酸生産能が向上することが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 　有機酸を生産する能力を有する酵母を、低pHに調整した有機酸含有培地にて処理するステップａと、
    　上記ステップａの後、上記酵母を用いた発酵により有機酸を産生するステップｂとを有することを特徴とする有機酸の製造方法。
  2. 　上記ステップａは、上記酵母を用いた発酵により有機酸を産生するステップｃを有し、上記ステップｃにおいて産生された有機酸により上記有機酸含有培地を低pHに調整することを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
  3. 　上記ステップｃでは、上記酵母による発酵に際して上記酵母が生産する有機酸をアルカリ添加により中和し、アルカリ添加を停止又は減少することで、上記酵母が生産する有機酸によって上記有機酸含有培地を低pHに調整することを特徴とする請求項２記載の有機酸の製造方法。
  4. 　上記有機酸含有培地に含まれる有機酸は、外部添加されたものであることを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
  5. 　上記有機酸含有培地に含まれる有機酸は、乳酸、コハク酸及びピルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機酸であることを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
  6. 　上記有機酸含有培地は、有機酸塩を含有する培地に無機酸を添加することで遊離した有機酸を含有することを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
  7. 　上記酵母がSaccharomyces 属に属する酵母であることを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
  8. 　上記酵母がSaccharomyces cerevisiaeの菌株に属する酵母であることを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
  9. 　上記酵母は、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された変異株であることを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
  10. 　酵母が生産する有機酸が乳酸であることを特徴とする請求項１記載の有機酸の製造方法。
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