CN106459881A - 乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法 - Google Patents

乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酵母菌属的产乳酸微生物，其丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低且醛脱氢酶(ALD)和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高，以及通过培养该微生物由该微生物培养基生产乳酸的方法。

Description

乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法
技术领域
本发明涉及产乳酸重组酵母菌属(Saccharomyces sp.)微生物，以及通过培养其由含微生物的培养基生产乳酸的方法。
背景技术
一般来说，乳酸是具有包括食品添加剂如食品防腐剂、香精、或酸化剂等广泛应用的重要有机酸，并已广泛用于工业目的，如化妆品工业、化学工业、五金工业、电子工业、纺织工业、染色纺织品工业和制药工业等。另外，乳酸是聚乳酸的必需成分，聚乳酸是生物可降解塑料之一，因此，对乳酸的需求已显著提高。其也用作生产很多化合物的重要原料，化合物包括聚乳酸、乙醛、聚丙二醇、丙烯酸、2,3-五硫酮等。特别地，D型乳酸是用于生产立构复合物PLA的必需成分，该立构复合物PLA是生产高耐热PLA的必需光学异构体。
特别地，用于生产乳酸的方法包括传统化学合成法和生物发酵法。当经由化学合成法生产乳酸时，乳酸以外消旋混合物的形式生产，该外消旋混合物由50％的D型乳酸和50％的L型乳酸构成，控制该组成比例是困难的，因此，由此生产的聚乳酸可以变为具有低熔点的无定形聚合物，从而对发展其使用施加限制。在另一方面，根据所用的菌株，生物发酵法能够选择性地生产D型乳酸或L型乳酸。因此，由于后者可以生产特定异构体的乳酸，其在商业上是优选的。
同时，通过引入用于转化为D型乳酸的酶的基因，已做出尝试经由使用具有D型乳酸生产能力的酵母菌属微生物的各种基因操作以提高乳酸生产率。具体来说，已做出尝试通过加强乳酸脱氢酶(LDH)活性同时降低丙酮酸脱羧酶(PDC)活性、醛脱氢酶(ALD)活性和/或乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性以提高乳酸生产率(美国专利申请公开第2012-021421号，第2010-0248233号和第2006-0148050号)。然而，由于产乳酸菌株的低细胞生长，总发酵生产率是低的。
发明详述
技术问题
因此，本发明人做出许多努力以获得乳酸生产率提高和有效细胞生长同时PDC活性降低的微生物。结果是，已确认其中PDC同种型活性被控制、醛脱氢酶活性和乙酰辅酶A活性提高的菌株能够提高乳酸产量，促进菌株的细胞生长，从而提高整体的乳酸发酵生产率，这使得本发明得以完成。
技术手段
本发明的一个目的是提供乳酸生产率提高的酵母菌属微生物。
本发明的另一个目的是提供使用酵母菌属微生物生产乳酸的方法。
发明效果
本发明涉及通过控制PDC同种型活性、提高醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性、使用乳酸发酵生产率提高的微生物。因此，其可以广泛用于乳酸发酵生产工业。
附图说明
图1是示出酵母菌属微生物的乳酸生产途径、醇发酵途径和乙酰辅酶A生产途径之间关系的示意图。
发明最佳技术方案
在本发明的第一方面，为了实现上述目的，提供了乳酸生产率提高的酵母菌属微生物，其中该微生物是突变的，使得(a)丙酮酸脱羧酶活性相比非突变产乳酸菌株降低；(b)醛脱氢酶活性和乙酰辅酶A合成酶活性相比非突变产乳酸菌株提高。
一般来说，产乳酸酵母菌属微生物经由乳酸脱氢酶(LDH)利用丙酮酸作为底物而生产乳酸。使用丙酮酸作为普通底物的代表性代谢途径，醇发酵途径和乙酰辅酶A生产途径被阻断。降低PDC活性对乳酸生产和其产率提高可能是有用的，然而，当降低水平达到一定水平时，产生了不足量的胞质乙酰辅酶A，其反过来阻断细胞生长，因此不能实现正常发酵。因此，本发明人通过提高整体的乳酸发酵生产率开发了乳酸生产率提高的酵母菌属微生物，其中通过将乙酰辅酶A途径调节在最低水平而维持微生物的生长率并提高乳酸产量。
本文使用的术语“丙酮酸脱羧酶(PDC)”指具有能够介导从丙酮酸制备碳酸和乙醛反应的活性的蛋白质，但并不限于其任何衍生物或具有相同活性的同种型。已经知道该蛋白质涉及醇发酵步骤，大多存在于酵母和植物中。本发明的丙酮酸脱羧酶可以固有存在于酵母菌属微生物中，或可以是PDC1、PDC5和/或PDC6，或特别地酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC1、PDC5和/或PDC6，但不限于此。该蛋白质可以包括其任何变体或类似物，只要其是生物学相同的且具有与该蛋白质的相当活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，PDC1可以由SEQ ID NO.71的氨基酸序列构成，PDC5可以由SEQ ID NO.72的氨基酸序列构成，PDC6可以由SEQ IDNO.73的氨基酸序列构成。该蛋白质可以包括具有与上列氨基酸序列中的每一个大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％同源性的氨基酸序列。由基因密码子简并引起的、编码相同氨基酸序列的上列序列的任何变体也可以包括在本发明中。
本文使用的术语“同源性”指多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的相似性，是代表具有与本发明氨基酸序列或核苷酸序列相同序列的序列的单元，具有等于或大于上述可能性的可能性。这种同源性可以通过用肉眼比对两种给定序列确定，更确切地说，其可以使用序列比对程序测定，该序列比对程序是容易得到的，其通过将待比对序列并排排列以解释同源性程度。本领域已知的序列比对程序包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和包含CLUSTALW的软件等。
关于通过允许PDC1缺陷而生产乳酸已报道了大量实例，PDC1显示乳酸生产中的主要活性(Appl Microbiol Biotechnol.2009,82(5):883-90)。在这种情况下，因为PDC6很少被表达，实际的PDC活性看起来是由于PDC5基因的表达。根据报道，单独的PDC1缺陷不会阻碍野生型菌株的细胞生长，相比野生型约60％至70％的PDC活性可以保留，因此在菌株中并没有观察到明显的表型变化(J Bacteriol.1990,172(2):678-685)。
作为替代方案，可以制备具有PDC1和PDC5基因同时双缺陷的菌株，PDC1和PDC5基因在酵母中显示主要的PDC活性。在这种情况下，在缺乏共底物例如乙酸或醇时可以使用糖源例如糖原实施乳酸发酵。然而，由于PDC活性的快速降低，导致酵母菌株生长速度降低，因而降低了乳酸发酵生产率(Biosci Biotechnol Biochem.2006,70(5):1148-1153)。
同时，为了经由与PDC竞争丙酮酸的LDH途径最大化乳酸，可以制备具有PDC1、PDC5和PDC6同时三重缺陷的菌株。在这种情况下，可以最大化乳酸发酵产量，但是由于在葡萄糖存在下诱导的分解代谢物抑制，乙醇和乙酸的代谢能力也可以被抑制，因而降低了细胞生长，最终导致发酵生产率降低(Curr Genet.2003/43(3)/139-160)。
特别地，本发明的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低可以i)使PDC1活性失活，降低PDC5活性；或ii)降低PDC1活性，使PDC5活性失活。
在本发明的示例性实施方案中，基于其中PDC1活性被灭活的酿酒酵母菌株制备了四种菌株，其包括通过替代PDC5基因启动子而降低PDC5活性的菌株、通过恢复PDC1活性而导致PDC5基因缺陷的菌株、导致PDC1和PDC5基因双重缺陷的菌株和导致PDC1、PDC5和PDC6基因三重缺陷的菌株。在因此制备的菌株中，具有三重基因缺陷的菌株表现出很少经历细胞生长。
本文使用的术语“醛脱氢酶(ALD)”指具有从乙醛主要制备乙酸的活性的蛋白质，作为具有通过醛氧化制备羧酸或酰基的活性的蛋白质，但本发明不限于其衍生物或具有相同活性的同种型。本发明的醛脱氢酶可以源自酵母菌属微生物，或可以是ALD2和/或ALD3。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的ALD2和/或ALD3，但不限于此，可以包括其任何变体或类似物，只要其是生物学相同的并具有与蛋白质的相当活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从本领域已知的数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，PDC1可以由IDNO.74的氨基酸序列SEQ构成，PDC1可以由SEQ IDNO.75的氨基酸序列构成。该蛋白质可以包括与氨基酸序列具有大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％同源性的氨基酸序列。由基因密码子简并引起的、编码相同氨基酸序列的序列的任何变体也可以包括在本发明中。
本文使用的术语“乙酰辅酶A合成酶(ACS)”指具有催化乙酸和CoA硫酯化结合ATP分解反应的活性的蛋白质，但本发明中不限于具有相同活性的衍生物或同种型。已经知道，该蛋白质存在于微生物、植物和动物等中。本发明的乙酰辅酶A合成酶可以源自酵母菌属微生物，或可以是ACS1。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的ACS1，但不限于此，可以包括其任何变体或类似物，只要其是生物学相同的并具有与蛋白质的相当活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，ACS1可以由SEQ ID NO.76的氨基酸序列构成，可以包括与氨基酸序列具有大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％同源性的氨基酸序列。由基因密码子简并引起的、编码相同氨基酸序列的序列的蛋白质突变体也可以包括在本发明中。
在本发明的一个示例性实施方案中，基于相比非突变微生物PDC活性降低的菌株，制备了其中ALD2和ACS活性或ALD3和ACS活性提高的菌株。特别地，基于经由PDC1缺陷具有PDC1灭活的菌株和通过用具有低表达能力的启动子替代PDC5基因启动子而降低的PDC5活性，制备了ALD和ACS活性提高的菌株。更特别地，制备了酵母菌属微生物的菌株，其中PDC1活性被灭活，PDC5活性降低，选自ALD2和ALD3中的至少一种的活性提高，且ACS1的活性提高。因此，确认了菌株的生长率、D-乳酸生产率和其产量显著提高。
本发明酶活性的术语“灭活”指用于灭活酶活性的方法，其包括抑制酶表达或使得酶表达不能表现其原有活性的任何方法。该方法可以包括由同源性重组引起的部分基因缺失或全部基因缺失，由外源基因插入相关基因引起的酶表达抑制，由酶基因启动子序列替代或修饰导致的酶表达抑制，或由酶替代或修饰引起的成为失去其原有功能的失活酶的突变等，但不限于此。
本文所用的术语酶活性“降低”指用于降低酶活性的方法，包括用于降低酶表达水平或降低正被表达的酶活性的任何方法。该方法可以包括由酶基因启动子序列的替代或修饰导致的表达降低，或由酶的替代或修饰导致的成为活性降低的酶的突变等，但不限于此。
本文所用的术语酶活性“提高”指插入含有酶基因的质粒，染色体上编码酶的基因拷贝数增加，或由酶基因启动子序列的替代或修饰或突变导致的酶活性提高等，但不限于此。
本文所用的术语“酵母微生物”指属于通过出芽增殖的真菌类(Eumycetes)微生物，但不限于此，只要其参与乳酸生产途径、醇生产途径和/或乙酰辅酶A生产途径中的任一种。依据酵母的形状，该酵母微生物可以分类为酵母菌属、毕赤酵母属(Pichia sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)和复膜孢酵母属(Saccharomycopsis sp.)，特别地，包括不同种类的酵母菌属可以用于本发明。特别地，微生物可以选自贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、Saccharomyces bulderi、Saccharomycescariocanus、Saccharomyces cariocus、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、Saccharomyces dairenensis、葡萄酒酵母(Saccharomycesellipsoideus)、真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)、少孢酵母(Saccharomycesexiguus)、Saccharomyces florentinus、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomyces martiniae、Saccharomycesmonacensis、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、奇异酵母(Saccharomycesparadoxus)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)、Saccharomycesspencerorum、图列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、Saccharomyces zonatus，更特别地，其可以是酿酒酵母。
通过制备基于酿酒酵母的PDC活性降低、ALD和ACS活性提高的微生物，确认了显著乳酸生产提高的酵母菌属代表性实例。
本发明的微生物可以包括还是灭活的醇脱氢酶(ADH)。
本文使用的术语“醇脱氢酶”指具有催化从醇去除氢而制备醛或酮的逆反应活性的蛋白质，但不限于具有相同活性的衍生物或同种型。本发明的醇脱氢酶可以源自酵母菌属，或可以是ADH1。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的ADH1，但不限于此，可以包括其任何变体或类似物，只要其是生物学相同的并具有与蛋白质的相当活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，ADH1可以由SEQID NO.77的氨基酸序列构成，可以包括具有与氨基酸序列大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％同源性的氨基酸序列。由基因密码子简并引起的、编码相同氨基酸序列的序列的蛋白质突变体也可以包括在本发明中。
本发明的微生物可以包括还是灭活的D-乳酸脱氢酶(DLD)。
本文使用的术语“D-乳酸脱氢酶”指具有通过D-乳酸脱氢制备丙酮酸的活性的蛋白质，但不限于具有相同活性的同种型。本发明的D-乳酸脱氢酶可以源自酵母菌属。特别地，该蛋白质可以是酿酒酵母的DLD1，但不限于此，可以包括其任何变体或类似物，只要其是生物学相同并具有与蛋白质相当的活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，DLD1可以由SEQ ID NO.78的氨基酸序列构成，可以包括具有与氨基酸序列大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％同源性的氨基酸序列。由基因密码子简并引起的、编码相同氨基酸序列的序列的任何变体也可以包括在本发明中。
在本发明中，将具有ADH1缺陷的菌株、使用进一步由丙酮酸制得的醛作为底物的醇发酵途径中涉及的酶、DLD1缺陷、分解所产生的乳酸的酶用于精确地测量乳酸发酵细胞行为根据乙酸生产途径的调节的变化。在本发明的示例性实施方案中，其中PDC、ALD和ACS活性被调节的菌株显示了乳酸发酵生产率的显著提高。结果总结在表12中。
在另一方面，本发明提供了使用本发明微生物用于生产乳酸的方法。
特别地，在本发明的示例性实施方案中，本发明提供了用于生产乳酸的方法，其包括培养本发明的微生物和从包含微生物的培养基中收集乳酸。
可以使用本领域已知的适当培养基和培养条件实施培养。根据所用的菌株，本领域技术人员可以容易地调节培养方法。培养方法的实例包括批次型、连续型、批次给料型，但不限于此。培养方法中使用的培养基应该适当地满足具体菌株的需要。
本发明使用的培养基包含作为主要碳源的蔗糖或葡萄糖，含有高浓度蔗糖的糖蜜也可以用作碳源。可以不同地以适当量使用其他碳源。包括蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浆和大豆小麦的有机氮源，以及包括元素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵的无机氮源可以用作氮源。这些氮源可以或单独使用或结合使用。可以向培养基添加磷源，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或对应的含钠盐。另外，培养基可以包含金属盐，如硫酸镁和硫酸铁。另外，培养基可以用氨基酸、维生素和适当前体补充。这些培养基或前体可以通过批次型或连续型方法加入到培养物中。
在培养期间，可以适当地添加化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、磷酸和硫酸以调节培养物的pH。另外，可以添加消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯以抑制培养物中泡沫形成。另外，为了维持培养物处于有氧条件，可以将氧气或含氧气体可以注入培养物中，为了维持培养物处于厌氧和微氧条件，可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入培养物中而不注入任何气体。
培养物的温度可以维持在20℃至40℃，特别地在25℃至35℃，更特别地在30℃。该培养可以连续进行直至获得所需量的所需材料，特别地进行10小时至100小时。
根据培养方法，例如批次型、连续型或批次给料型，在本发明培养过程中生成的乳酸可以通过本领域已知的适当方法从培养基中收集。
发明技术方案
下文中，将结合示例性实施方案更详细地描述本发明。然而，本文公开的示例性实施方案仅出于举例目的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：制备产乳酸菌株
为了制备产乳酸菌株，使从EUROSCARF获得的酿酒酵母CEN.PK2-1D经受基因操作，该酿酒酵母CEN.PK2-1D是代表性野生型酵母。
特别地，其中醇脱氢酶1(ADH1)和丙酮酸脱羧酶1(PDC1)有缺陷以最小化醇合成途径的丙酮酸损失，D-乳酸脱氢酶1(DLD1)有缺陷以阻断D型乳酸分解途径的菌株被用作基础菌株。
DLD1并非是可以对生长改进具有直接影响的关键因素，但已知作为能够使用NAD+作为D-乳酸脱氢酶将D-乳酸转化为丙酮酸的主要酶。因此，基于在DLD1中具有基因缺陷的菌株、消耗其所制备乳酸的酶构建随后的菌株，以比较将在本发明中制备的D型乳酸生产酵母的全部发酵生产率。结果是，比较了发酵生产率。
在本发明中，使用了一般分子克隆用于基因操作。
首先，为了删除酵母菌株中的ADH1和PDC1基因，使用质粒pWAL100和pWBR100，参考Lee TH等人(J.Microbiol.Biotechnol.(2006),16(6),979-982)的文献公开内容进行实验。使用合适的引物(对应于SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8的核苷酸序列)经由PCR制备引入到载体质粒的每个插入物。
另外，为了删除DLD1基因，将标志基因HIS3通过双交叉引入并使其具有缺陷。使用对应于SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的核苷酸序列的引物制备其中使用的DNA片段。
用于基因操作的该引物总结于下表1。
表1.用于制备基础酵母菌株的引物
基于具有三种基因如ADH1、PDC1和DLD1缺陷的菌株，引入特别地用于D-乳酸生产的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)。为了使源自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，Lb.plantarum)的1dhD包括在源自酿酒酵母的TEF1启动子和CYC1终止子之间，然后将D-LDH分别克隆进入5’和3’末端具有XhoI和SpeI限制性酶切位点的载体。具体来说，通过SacI/PvuII的双酶切制备该插入物，将该载体从DNA片段通过绿豆核酸酶末端平齐，该DNA片段由p-δ-neo双酶切为BamHI/NotI。最后，将该载体用Sac I处理，从而获得具有SacI粘性末端和BamHI衍生平齐末端的的载体。
通过连接所获得的载体和插入物完成载体pTL573的构建。质粒pTL573包含源自植物乳杆菌的ldhD基因，且其被设计使得其可以包括基因多拷贝随机插入到酿酒酵母CEN.PK2-1D pdc1Δadh1Δdld1Δ菌株的反转录转座子元件之间的δ-序列的部分区域。为了相应基因的多重插入，通过用SalI酶切质粒pTL573构建能够在δ-序列上引起交叉的DNA片段。通过将DNA片段经由转化引入亲本菌株中，从5mg/mL G418的最大浓度的YPD平板(1％的酵母提取物、2％的细菌蛋白胨、2％的葡萄糖)获得多个菌落。最终，确认了为了提供产D-乳酸能力，将由此获得的菌株植物乳杆菌衍生的D-LDH多重插入，并指定为CC02-0064菌株。
实施例2：制备PDC5活性降低的突变菌株
基于实施例1制备的CC02-0064菌株，制备具有替代的PDC5启动子的突变菌株。在该过程中，根据Lee T.H.等人公开的方法进行盒制备和菌株选择的过程(Development ofreusable split URA3-marked knockout vectors forbudding yeast,Saccharomycescerevisiae.J Microbiol Biotechnol,2006,16:979-982)。
特别地，通过分别用SCO1、SCO2、ACS1、IDP2和FBA1启动子替代CC02-0064菌株的PDC5启动子而制备总共五种新菌株，随后，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO.11至SEQ IDNO.36的引物制备启动子替代的盒。
用于启动子替代的该引物总结于下表2。
表2.用于制备启动子替代的菌株的引物
由此制备的新菌株分别指定为CC02-0167、CC02-0168、CC02-0169、CC02-0170和CC02-0174。相应的菌株及其遗传特性总结于下表3中。
表3.PDC5启动子突变的菌株
菌株 遗传特性
CC02-0167 CC02-0064PDC5启动子::KlURA3-SCO1启动子
CC02-0168 CC02-0064PDC5启动子::KlURA3-SCO2启动子
CC02-0169 CC02-0064PDC5启动子::KlURA3-AC S1启动子
CC02-0170 CC02-0064PDC5启动子::KlURA3-IDP2启动子
CC02-0174 CC02-0064PDC5启动子::KlURA3-IDP2启动子
实施例3：评价PDC5活性降低的突变菌株的乳酸发酵
对实施例2制备的PDC5启动子突变的菌株进行乳酸发酵评价。就这一点而言，制备特定培养基用于乳酸发酵评价。
特别地，为了制备合成的复合培养基(SC培养基)，其是用于酵母的限制性培养基，根据制造商的方案，不含氨基酸的0.67％的酵母氮基作为基础与氨基酸dropout mix(Sigma)混合，根据需要加入基础中排除的氨基酸。另外，将380mg/L的亮氨酸加入到生成物中，尿嘧啶、色氨酸和组氨酸分别以76mg/L的浓度加入。还加入8％的葡萄糖作为碳源和1％的CaCO3作为中和剂。由此制备的培养基用于评价酵母菌株的乳酸发酵。
在实施例2制备的PDC5启动子突变的菌株中，用相比原始PDC5启动子的较弱启动子替代的突变菌株不能生长，而用较强启动子替代的突变菌株显示了生长提高。特别地，用相比PDC5启动子的较弱启动子SCO1、SCO2、IDP2或ACS1启动子替代的突变菌株不能生长，使得启动子用FBA1启动子替代的菌株成为仅有的待评价菌株。对于可测量的CC02-0064和CC02-0174菌株的乳酸发酵评价结果总结于下表4中。
表4.评价PDC5启动子突变的菌株的乳酸发酵
如以上评价所示，确认了相比原始菌株(CC02-0064)，在促进乙酰辅酶A生产的途径期间，其中用FBA1启动子替代野生型PDC5启动子的菌株显示了细胞生长率及其乳酸生产率提高。然而，当比较分别在24小时和48小时收集的样本结果时，确认了通过仅增强单个PDC活性而不增强参与随后乙酰辅酶A生产途径的ALD和ACS活性，细胞生长率和乳酸生长率的提高根据时间持续降低。在本发明的实例中，通过增强PDC活性，葡萄糖消耗的提高为10.3％，最大乳酸生产浓度为47.3g/l。因此，乳酸生产率的总提高为13.7％。
实施例4：制备具有PDC5基因缺陷的菌株
除了实施例2制备的具有PDC1基因缺陷和PDC5活性降低的菌株，制备具有PDC5基因缺陷和PDC1活性降低的菌株，从而确认PDC途径在相应菌株中是否减弱。
特别地，为了PDC5基因缺陷的目的，基于CC02-0064菌株，将对应于核苷酸序列SEQID NO:37至SEQ ID NO:40的引物用于制备PDC5基因缺陷盒。通过与实施例1的文献描述的相同方法制备有缺陷的菌株。用于实施例4的引物总结于下表5中。
表5.用于制备具有PDC5缺陷的菌株的引物
由此制备的具有PDC5基因缺陷的菌株指定为CC02-0450(CC02-0064,pdc5Δ)。
实施例5：基于具有PDC5缺陷的菌株制备PDC1启动子突变的菌株
基于实施例4制备的CC02-0450菌株，制备具有替代的PDC1启动子的菌株。就这一点而言，制备其中PDC1缺陷被恢复的菌株CC02-0451(CC02-0450，PDC1p-PDC1)作为对比组，制备PDC1活性降低的菌株CC02-0452(CC02-0450，IDP1p-PDC1)作为实验组。
以将PDC1p-PDC1-CYC1t和pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1的载体包含在菌株中的这种方式制备每个菌株，通过在酵母中将靶基因盒克隆到pRS406载体中且没有酵母复制原点而构建该PDC1p-PDC1-CYC1t和pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1的载体。
特别地，使用具有核苷酸序列SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的引物，和酵母染色体DNA作为模板进行PCR，从而获得包含PDC1基因的产物。随后，使用具有核苷酸序列SEQ IDNO:43和SEQ ID NO:44的引物获得CYC1终止子的序列。另外，使用对应于核苷酸序列SEQ IDNO:41和SEQ ID NO:44的引物和PDC1和CYC1终止子序列分别作为模板经由PCR获得连接PDC1和CYC1终止子的DNA片段。用SpeI和XhoI限制性内切酶处理PDC1-CYC1终止子的DNA片段和pRS406载体，然后将其连接获得pRS406-PDC1-CYC1t的质粒载体。同时，为了将启动子区域引入由此获得的质粒载体中，通过具有核苷酸序列SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47和SEQ ID NO:48的引物分别使用染色体DNA作为模板经由PCR的引物融合获得其中PDC1启动子和IDP2启动子被分别并入的质粒载体。将包含每个启动子和pRS406-PDC1-CYC1t质粒的DNA片段酶切并连接，从而分别制备pRS406-PDC1p-PDC1-CYC1t和pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1t的质粒载体，其是酵母染色体插入所需的质粒，设计为使得通过PDC1启动子和IDP2启动子控制基因表达。
用于实施例5的引物总结于表6中。
表6.用于制备具有PDC5缺陷和PDC1活性降低的菌株的引物
两个由此制备的质粒载体分别用StuI酶切，并立即插入菌株中。最终的菌株分别指定为CC02-0451(CC02-0450，PDC1p-PDC1)和CC02-0452(CC02-0450，IDP2p-PDC1)。由此制备的菌株及其遗传特性总结于表7中。表7.具有PDC5缺陷和PDC1活性降低的菌株
菌株 遗传特性
CC02-0450 CC02-0064pdc5Δ
CC02-0451 CC02-0450PDC1p-PDC1-CYC1t
CC02-0452 CC02-0450PDC1p-PDC1-CYC1t
实施例6：制备具有PDC基因双重或三重缺陷的菌株
旨在由PDC家族基因制备具有PDC1基因单个缺陷、具有PDC1和PDC5基因双重缺陷以及具有PDC1、PDC5和PDC6基因三重缺陷的菌株。将实施例1制备的CC02-0064菌株用作具有PDC1基因单个缺陷的菌株。使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:56的引物制备PDC5缺陷的盒，并将其插入CC02-0064以制备具有PDC1和PDC5基因双重缺陷的菌株。随后，由此制备的菌株指定为CC02-0256。另外，基于具有PDC1和PDC5基因双重缺陷的菌株，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:64的引物，制备具有PDC1、PDC5和PDC6基因三重缺陷的菌株，指定为CC02-0257。
通过在实施例1公开的文献中描述的相同方法进行缺陷盒制备和菌株选择过程。用于实施例6的引物总结于表8中。
表8.用于制备具有PDC基因双重或三重缺陷的菌株的引物
由此制备的菌株及其遗传特性总结于表9中。
表9.具有PDC基因双重或三重缺陷的菌株
菌株 遗传特性
CC02-0256 CC02-0064 pdc5Δ
CC02-0257 CC02-0256 pdc6Δ
实施例7：制备ALD和ACS1过表达菌株
为了制备ALD和ACS1过表达菌株，制备ALD2、ALD3和ACS1过表达的质粒。
特别地，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的引物制备ALD2的开放阅读框(ORF)，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的引物制备ALD3的ORF，使用对应于核苷酸序列SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的引物制备ACS1的ORF。另外，通过SpeI、XhoI或EcoRI限制性内切酶制备基于p414ADH、p415ADH和p416ADH质粒的重组载体p415ADH-ALD2、p415ADH-ALD3、p414ADH-ACS1和p416ADH-ACS1。用于实施例7的引物总结于下表10中。
表10.用于制备ALD和ACS1过表达菌株的引物
经由通过p415ADH-ALD2、p414ADH-ACS1的组合，p415ADH-ALD3、p414ADH-ACS1的组合，p415ADH-ALD2、p416ADH-ACS1的组合，或p415ADH-ALD3、p416ADH-ACS1的组合的酵母转化，将由此制备的重组质粒引入包括CC02-0064、CC02-0168、CC02-0170、CC02-0256、CC02-0257、CC02-0451和CC02-0452的菌株中。然而，在具有PDC基因三重缺陷的CC02-0257菌株中没有获得转化株，在该菌株中没有PDC活性被抑制。
由此制备的菌株及其遗传特性总结于表11中。
表11.ALD和ACS过表达菌株
菌株 遗传特性
CC02-0225 CC02-0064p415ADH，p416ADH
CC02-0226 CC02-0064p415ADH-ALD2，p416ADH-ACS1
CC02-0227 CC02-0064p415ADH-ALD3，p416ADH-ACS1
CC02-0356 CC02-0168p414ADH，p415ADH
CC02-0275 CC02-0168p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0276 CC02-0168p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
CC02-0357 CC02-0170p414ADH，p415ADH
CC02-0277 CC02-0170p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0278 CC02-0170p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
CC02-0444 CC02-0256p415ADH，p416ADH
CC02-0361 CC02-0256p415ADH-ALD2，p416ADH-ACS1
CC02-0362 CC02-0256p415ADH-ALD3，p416ADH-ACS1
CC02-0453 CC02-0451p414ADH，p415ADH
CC02-0454 CC02-0451p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0455 CC02-0451p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
CC02-0456 CC02-0452p414ADH，p415ADH
CC02-0457 CC02-0452p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD2
CC02-0458 CC02-0452p414ADH-ACS1，p415ADH-ALD3
实施例8：评价酵母菌株的乳酸发酵
对实施例7制备的ALD和ACS1过表达菌株的乳酸发酵能力进行评价。
特别地，出于乳酸发酵评价目的，将酵母接种到含有25ml实施例3制备的培养基的每个烧瓶中，在30℃有好氧条件下培养71小时。分析存在于发酵液中的D型乳酸量，并进行酶分析(乙酸，R-Biopharm，德国)以确定其中存在的乙酸量。
以上实验结果总结于下表12中。
表12.评价ALD和ACS过表达菌株的生长率、乳酸发酵、副产物和生产产率等
如表12中所证实的，相比具有正常PDC5活性的菌株，通过IDP2启动子或SCO2启动子PDC5活性降低的菌株具有乙酸、副产物累积的急剧降低，即确认了乙酸的极少检出。在这种情况下，根据PDC5启动子替代，其中ALD和ACS活性没有提高的菌株的最终细胞浓度倾向于降低。相反，其中PDC5表达降低且ALD和ACS活性提高的菌株显示出最终细胞浓度提高。因此，确认了细胞生长的提高。特别地，基于其中PDC5启动子用IDP2替代的CC02-0170菌株制备的、ALD和ACS活性提高的CC02-0277和CC02-0278菌株显示出随着ALD和ACS活性提高而改进的生长率、生产的乳酸浓度、其生产产量和发酵生产率。
总之，其中PDC5用IDP2的弱表达替代的菌株具有乙酸累积的降低，最终OD比显示出PDC5正常表达的菌株高1.3倍。另外，证实了当ALD和ACS在ADH1启动子控制下共表达时，葡萄糖消耗及其速率提高，最终产量百分比分别从56％或59％增至66％或67％，显示出提高的产量。
特别地，通过比较应用于PDC5弱表达的两种启动子，确认了在分别具有SCO2启动子和IDP2启动子的两种菌株中乳酸生产率均得到提高。然而，在总细胞浓度、葡萄糖消耗及其速率方面，可以认为具有IDP2启动子的菌株是菌株的最优化形式。
实施例9：评价具有PDC1和PDC5基因双重缺陷且ALD和ACS活性提高的酵母菌株的 乳酸发酵
由于已经明确证实了细胞生长和产量提高的效果是PDC5活性降低的结果，实施评价以确定在乳酸生产中额外PDC基因缺陷的效果。用于每种菌株的评价方法与实施例8描述的方法相同，培养进行了74小时。
由此获得的实验结果总结于下表13中。
表13.具有PDC1和PDC5基因双重缺陷的菌株的乳酸发酵评价结果
如表13中所证实的，具有PDC1和PDC5基因双重缺陷的菌株中乙酸盐浓度明显降低，然而也观察到生产的D-乳酸浓度降低，这是由于细胞生长和葡萄糖消耗降低。另外，由PDC1和PDC5基因双重缺陷导致的PDC途径几乎失活的菌株在细胞生长、葡萄糖消耗及其生产率上没有任何提高，尽管该菌株表现出ALD和ACS的活性提高。
实施例10：评价菌株使用蔗糖的乳酸发酵，菌株中PDC途径减弱
为了使用蔗糖的发酵评价，将其中PDC途径减弱的产乳酸酵母菌株、实施例8和9评价的相同菌株用于证实乳酸生产效果。就这一点而言，使用蔗糖替代葡萄糖作为碳源。以与实施例8相同的方式实施评价方法。
由此获得的实验结果总结于下表14中。
表14.具有PDC1和PDC5基因双重缺陷或PDC5活性降低的菌株的乳酸发酵评价结果
如实施例8和9用于相同的方式，通过提高其中PDC途径减弱的菌株中ALD和ACS活性，蔗糖替代葡萄糖用于菌株使得生长和发酵产量的提高效果，显示了与使用葡萄糖作为碳源的实施例8中菌株结果的相同模式。因此，本发明证实了，已在本发明中证实的发酵产量和生长提高的效果归结于PDC活性降低和ALD和ACS活性提高，并不限于所用糖的类型。
总结以上结果，证实了相比非突变菌株，当菌株以PDC途径减弱且ALD和ACS活性提高的方式突变时，乳酸生产率提高，同时维持其生长率。
由前述可知，本发明所属领域技术人员会能够理解，在不改变本发明的技术构思或本质特征的情况下，本发明可以以其他具体形式具体化。就这一点而言，本文公开的示例性实施方案仅出于举例目的，而不应该解释为限制本发明的范围。相反，本发明意在不仅涵盖示例性实施方案，还涵盖可以包括于所附权利要求定义的本发明的精神和范围的各种替代、修改、等同物和其他实施方案。
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<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADH1 上游正向引物
<400> 1
cgggatccac tgtagcccta gacttgatag cc 32
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADH1 上游反向引物
<400> 2
ataagaatgc ggccgctgta tatgagatag ttgattgtat gctt 44
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADH1 下游正向引物
<400> 3
gactagtgcg aatttcttat gatttatgat ttttatt 37
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADH1 下游反向引物
<400> 4
acatgccatg gaagcatgca cgtatacact tgagtaa 37
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDC1 上游正向引物
<400> 5
cgggatccat tatgtatgct cttctgactt ttcgt 35
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDC1 上游反向引物
<400> 6
ataagaatgc ggccgctttg attgatttga ctgtgttatt ttgc 44
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDC1 上游正向引物
<400> 7
cgggatccgc gatttaatct ctaattatta gttaaag 37
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDC1 下游反向引物
<400> 8
ataagaatgc ggccgctttc aatcattgga gcaatcattt taca 44
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DLD1-HIS3 上游连接引物
<400> 9
gcgtagttgg ccccaactgg tgcagtaata cgttttaaga gcttggtgag 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DLD1-HIS3 下游连接引物
<400> 10
cgtgaagggt gaaaaaggaa aatcagatac ctacataaga acacctttgg 50
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_PDC5_UP_676
<400> 11
gtcagcattg acacgttcga tt 22
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_KlURA3-PDC5_UP
<400> 12
tctacccaga atcacttctt tcgagagatt gtcataatc 39
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_PDC5_UP-AL_KlURA3
<400> 13
caatctctcg aaagaagtga ttctgggtag aagatcgg 38
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_AL_KlURA3
<400> 14
gagcaatgaa cccaataacg aaatctt 27
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_BR_KlURA3
<400> 15
cttgacgttc gttcgactga tgag 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_PDC5_DOWN_522
<400> 16
caagtcaacc aagttagctg gc 22
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_SCO1p-BR_KlURA3
<400> 17
ctctcctaat agacgtggtg tcaccatgaa cgacaattct taa 43
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_SCO1p_500
<400> 18
cgttcatggt gacaccacgt ctattaggag agccattc 38
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_PDC5_DOWN_500-SCO1p
<400> 19
aaggttattt cagacatctt ttctacgttt gctgtttttt c 41
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_SCO1p-PDC5_DOWN_500
<400> 20
cagcaaacgt agaaaagatg tctgaaataa ccttaggtaa at 42
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_SCO2p-BR_KlURA3
<400> 21
atcgaataag taacaagcgt gtcaccatga acgacaattc ttaa 44
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_SCO2p_500
<400> 22
cgttcatggt gacacgcttg ttacttattc gataacgc 38
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_PDC5_DOWN_500-SCO2p
<400> 23
aaggttattt cagacatttt actctcgctt cccaaattcc 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_SCO2p-PDC5_DOWN_500
<400> 24
ggaagcgaga gtaaaatgtc tgaaataacc ttaggtaaat 40
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_IDP2p-BR_KlURA3
<400> 25
taaaaataaa tagatagacg tgtgtcacca tgaacgacaa ttcttaa 47
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_IDP2p_500
<400> 26
cgttcatggt gacacacgtc tatctattta tttttataac tc 42
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_PDC5_DOWN_500-IDP2p
<400> 27
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_IDP2p-PDC5_DOWN_500
<400> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 30
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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cgttcatggt gacactgggt cattacgtaa ataatgatag 40
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aaggttattt cagacatttt gaatatgtat tacttggtta tggt 44
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ccaagtaata catattcaaa atgtctgaaa taaccttagg taaat 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gagctcggat ccaaggaaat aaagcaaata acaataacac c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ggatccacta gtgctaatta acataaaact catgattcaa cg 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R-BRPDC5-NcoI
<400> 40
cagctgccat ggtattctaa ataagatgta aggccttgta at 42
<210> 41
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_PDC1
<400> 41
ataactagta tgtctgaaat tactttgggt aaatattt 38
<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_PDC1
<400> 42
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_CYC1t
<400> 44
atactcgagg caaattaaag ccttcgagcg tcc 33
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_PDC1p
<400> 46
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<210> 47
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 47
aaagagctca cgtctatcta tttattttta taactcc 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_IDP2p
<400> 48
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 44
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<220>
<223> R_NotI-PDC5_DOWN
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ataagaatgc ggccgctatt ctaaataaga tgtaaggcct tgta 44
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<213> 人工序列
<220>
<223> F_PDC5_UP
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<220>
<223> F_BR_KlURA3
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<220>
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<400> 56
tattctaaat aagatgtaag gccttgta 28
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<213> 人工序列
<220>
<223> F_BamHI-PDC6_UP
<400> 57
cgggatcctg ttatagagtt cacaccttat tcaca 35
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_NotI-PDC6_UP
<400> 58
ataagaatgc ggccgctttg ttggcaatat gtttttgcta tatta 45
<210> 59
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_BamHI-PDC6_DOWN
<400> 59
cgggatccgc cattagtagt gtactcaaac gaat 34
<210> 60
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_NotI-PDC6_DOWN
<400> 60
ataagaatgc ggccgcgatg cagaatgagc acttgttatt tat 43
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_PDC6_UP
<400> 61
tgttatagag ttcacacctt attcaca 27
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_AL_KlURA3
<400> 62
gagcaatgaa cccaataacg aaatctt 27
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_BR_KlURA3
<400> 63
cttgacgttc gttcgactga tgag 24
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_PDC6_DOWN
<400> 64
gatgcagaat gagcacttgt tatttat 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_SpeI_ALD2
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<211> 50
<212> DNA
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<220>
<223> R_XhoI_ALD2
<400> 66
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<210> 67
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_SpeI_ALD3
<400> 67
caagctggcc gctctagaac tagtatgcct accttgtata ctgatatcga 50
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_XhoI_ALD3
<400> 68
acataactaa ttacatgact cgagttattt atccaatgaa agatccacat 50
<210> 69
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F_SpeI_ACS1
<400> 69
tccaagctgg ccgctctaga actagtatgt cgccctctgc cgtaca 46
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R_EcoRI_ACS1
<400> 70
tatcgataag cttgatatcg aattcttaca acttgaccga atcaattaga 50
<210> 71
<211> 563
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 PDC1
<400> 71
Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln
1 5 10 15
Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn
35 40 45
Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile
50 55 60
Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser
65 70 75 80
Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu
85 90 95
His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu
100 105 110
Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met
115 120 125
Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr
130 135 140
Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln
145 150 155 160
Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val
165 170 175
Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn
180 185 190
Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val
195 200 205
Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg
210 215 220
His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe
225 230 235 240
Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His
245 250 255
Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val
260 265 270
Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr
305 310 315 320
Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Thr
325 330 335
Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg
340 345 350
Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu
355 360 365
Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val
370 375 380
Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe
385 390 395 400
Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly
405 410 415
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile
420 425 430
Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln
435 440 445
Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro
450 455 460
Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu
485 490 495
Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val
500 505 510
Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn
515 520 525
Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Ile Met Leu Pro Val Phe Asp
530 535 540
Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ala Lys Gln
<210> 72
<211> 563
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 PDC5
<400> 72
Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Ser Gln
1 5 10 15
Val Asn Cys Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Glu Val Lys Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn
35 40 45
Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile
50 55 60
Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser
65 70 75 80
Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu
85 90 95
His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu
100 105 110
Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met
115 120 125
Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Asn
130 135 140
Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Thr Thr Gln
145 150 155 160
Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val
165 170 175
Pro Ala Lys Leu Leu Glu Thr Pro Ile Asp Leu Ser Leu Lys Pro Asn
180 185 190
Asp Ala Glu Ala Glu Ala Glu Val Val Arg Thr Val Val Glu Leu Ile
195 200 205
Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Ala Ser Arg
210 215 220
His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Met Asp Leu Thr Gln Phe
225 230 235 240
Pro Val Tyr Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ala Ile Asp Glu Gln His
245 250 255
Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Arg Pro Glu Val
260 265 270
Lys Lys Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Ile Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Ile Lys Ile Arg Asn Ala Thr
305 310 315 320
Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Ala Leu Gln Lys Leu Leu Asp Ala
325 330 335
Ile Pro Glu Val Val Lys Asp Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg
340 345 350
Val Pro Ile Thr Lys Ser Thr Pro Ala Asn Thr Pro Met Lys Gln Glu
355 360 365
Trp Met Trp Asn His Leu Gly Asn Phe Leu Arg Glu Gly Asp Ile Val
370 375 380
Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe
385 390 395 400
Pro Thr Asp Val Tyr Ala Ile Val Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly
405 410 415
Phe Thr Val Gly Ala Leu Leu Gly Ala Thr Met Ala Ala Glu Glu Leu
420 425 430
Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln
435 440 445
Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro
450 455 460
Tyr Ile Phe Val Leu Asn Asn Asn Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Gly Pro His Ala Glu Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu
485 490 495
Ala Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Arg Asn Tyr Glu Thr His Arg Val
500 505 510
Ala Thr Thr Gly Glu Trp Glu Lys Leu Thr Gln Asp Lys Asp Phe Gln
515 520 525
Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp
530 535 540
Ala Pro Gln Asn Leu Val Lys Gln Ala Gln Leu Thr Ala Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ala Lys Gln
<210> 73
<211> 563
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 PDC6
<400> 73
Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln
1 5 10 15
Val Asn Val Asn Thr Ile Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Asp Gly Leu Arg Trp Ala Gly Asn
35 40 45
Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile
50 55 60
Lys Gly Leu Ser Val Leu Val Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser
65 70 75 80
Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu
85 90 95
His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu
100 105 110
Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met
115 120 125
Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ser Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Glu Ile Asp Arg Leu Ile Arg Thr Thr Phe Ile Thr Gln
145 150 155 160
Arg Pro Ser Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Lys Val
165 170 175
Pro Gly Ser Leu Leu Glu Lys Pro Ile Asp Leu Ser Leu Lys Pro Asn
180 185 190
Asp Pro Glu Ala Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Val Leu Glu Leu Ile
195 200 205
Gln Asn Ser Lys Asn Pro Val Ile Leu Ser Asp Ala Cys Ala Ser Arg
210 215 220
His Asn Val Lys Lys Glu Thr Gln Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe
225 230 235 240
Pro Ala Phe Val Thr Pro Leu Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His
245 250 255
Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Gln Asp Val
260 265 270
Lys Gln Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Asn Val Val Glu Phe His Ser Asp Tyr Val Lys Val Lys Asn Ala Thr
305 310 315 320
Phe Leu Gly Val Gln Met Lys Phe Ala Leu Gln Asn Leu Leu Lys Val
325 330 335
Ile Pro Asp Val Val Lys Gly Tyr Lys Ser Val Pro Val Pro Thr Lys
340 345 350
Thr Pro Ala Asn Lys Gly Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu
355 360 365
Trp Leu Trp Asn Glu Leu Ser Lys Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Ile
370 375 380
Ile Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Ile Phe
385 390 395 400
Pro Lys Asp Ala Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly
405 410 415
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile
420 425 430
Asp Pro Asn Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln
435 440 445
Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro
450 455 460
Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Gly Pro His Ala Glu Tyr Asn Glu Ile Gln Thr Trp Asp His Leu
485 490 495
Ala Leu Leu Pro Ala Phe Gly Ala Lys Lys Tyr Glu Asn His Lys Ile
500 505 510
Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Ala Leu Thr Thr Asp Ser Glu Phe Gln
515 520 525
Lys Asn Ser Val Ile Arg Leu Ile Glu Leu Lys Leu Pro Val Phe Asp
530 535 540
Ala Pro Glu Ser Leu Ile Lys Gln Ala Gln Leu Thr Ala Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ala Lys Gln
<210> 74
<211> 506
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 ALD2
<400> 74
Met Pro Thr Leu Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Pro Gln Leu Lys Ile Ser
1 5 10 15
Leu Lys Gln Pro Leu Gly Leu Phe Ile Asn Asn Glu Phe Cys Pro Ser
20 25 30
Ser Asp Gly Lys Thr Ile Glu Thr Val Asn Pro Ala Thr Gly Glu Pro
35 40 45
Ile Thr Ser Phe Gln Ala Ala Asn Glu Lys Asp Val Asp Lys Ala Val
50 55 60
Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Asp Asn Val Trp Ser Lys Thr Ser Ser
65 70 75 80
Glu Gln Arg Gly Ile Tyr Leu Ser Asn Leu Leu Lys Leu Ile Glu Glu
85 90 95
Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Ala Gly Lys Pro
100 105 110
Tyr His Ser Asn Ala Lys Gly Asp Leu Ala Gln Ile Leu Gln Leu Thr
115 120 125
Arg Tyr Phe Ala Gly Ser Ala Asp Lys Phe Asp Lys Gly Ala Thr Ile
130 135 140
Pro Leu Thr Phe Asn Lys Phe Ala Tyr Thr Leu Lys Val Pro Phe Gly
145 150 155 160
Val Val Ala Gln Ile Val Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Ala Met Ala Cys
165 170 175
Trp Lys Leu Gln Gly Ala Leu Ala Ala Gly Asn Thr Val Ile Ile Lys
180 185 190
Pro Ala Glu Asn Thr Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Phe Ala Thr Leu Ile
195 200 205
Lys Lys Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly Tyr
210 215 220
Gly Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Ala Ser His Met Asp Ile Asp Lys
225 230 235 240
Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Lys Val Gly Gly Phe Val Leu Glu Ala
245 250 255
Ser Gly Gln Ser Asn Leu Lys Asp Val Thr Leu Glu Cys Gly Gly Lys
260 265 270
Ser Pro Ala Leu Val Phe Glu Asp Ala Asp Leu Asp Lys Ala Ile Asp
275 280 285
Trp Ile Ala Ala Gly Ile Phe Tyr Asn Ser Gly Gln Asn Cys Thr Ala
290 295 300
Asn Ser Arg Val Tyr Val Gln Ser Ser Ile Tyr Asp Lys Phe Val Glu
305 310 315 320
Lys Phe Lys Glu Thr Ala Lys Lys Glu Trp Asp Val Ala Gly Lys Phe
325 330 335
Asp Pro Phe Asp Glu Lys Cys Ile Val Gly Pro Val Ile Ser Ser Thr
340 345 350
Gln Tyr Asp Arg Ile Lys Ser Tyr Ile Glu Arg Gly Lys Arg Glu Glu
355 360 365
Lys Leu Asp Met Phe Gln Thr Ser Glu Phe Pro Ile Gly Gly Ala Lys
370 375 380
Gly Tyr Phe Ile Pro Pro Thr Ile Phe Thr Asp Val Pro Gln Thr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Leu Gln Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Val Val Ser Lys
405 410 415
Phe Thr Asn Tyr Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Asp Thr Cys Tyr
420 425 430
Gly Leu Ala Ser Ala Val Phe Thr Lys Asp Val Lys Lys Ala His Met
435 440 445
Phe Ala Arg Asp Ile Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Ser Ser Asn
450 455 460
Asp Glu Asp Val Thr Val Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Ile
465 470 475 480
Gly Arg Glu Leu Gly Gln Ser Gly Val Asp Thr Tyr Leu Gln Thr Lys
485 490 495
Ala Val His Ile Asn Leu Ser Leu Asp Asn
500 505
<210> 75
<211> 506
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 ALD3
<400> 75
Met Pro Thr Leu Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Pro Gln Leu Lys Ile Ser
1 5 10 15
Leu Lys Gln Pro Leu Gly Leu Phe Ile Asn Asn Glu Phe Cys Pro Ser
20 25 30
Ser Asp Gly Lys Thr Ile Glu Thr Val Asn Pro Ala Thr Gly Glu Pro
35 40 45
Ile Thr Ser Phe Gln Ala Ala Asn Glu Lys Asp Val Asp Lys Ala Val
50 55 60
Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Asp Asn Val Trp Ser Lys Thr Ser Ser
65 70 75 80
Glu Gln Arg Gly Ile Tyr Leu Ser Asn Leu Leu Lys Leu Ile Glu Glu
85 90 95
Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Ala Gly Lys Pro
100 105 110
Phe His Ser Asn Ala Lys Gln Asp Leu Ala Gln Ile Ile Glu Leu Thr
115 120 125
Arg Tyr Tyr Ala Gly Ala Val Asp Lys Phe Asn Met Gly Glu Thr Ile
130 135 140
Pro Leu Thr Phe Asn Lys Phe Ala Tyr Thr Leu Lys Val Pro Phe Gly
145 150 155 160
Val Val Ala Gln Ile Val Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Ala Met Ala Cys
165 170 175
Arg Lys Met Gln Gly Ala Leu Ala Ala Gly Asn Thr Val Ile Ile Lys
180 185 190
Pro Ala Glu Asn Thr Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Phe Ala Thr Leu Ile
195 200 205
Lys Lys Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Val Ile Pro Gly Tyr
210 215 220
Gly Ser Val Val Gly Lys Ala Leu Gly Thr His Met Asp Ile Asp Lys
225 230 235 240
Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Lys Val Gly Gly Ser Val Leu Glu Ala
245 250 255
Ser Gly Gln Ser Asn Leu Lys Asp Ile Thr Leu Glu Cys Gly Gly Lys
260 265 270
Ser Pro Ala Leu Val Phe Glu Asp Ala Asp Leu Asp Lys Ala Ile Glu
275 280 285
Trp Val Ala Asn Gly Ile Phe Phe Asn Ser Gly Gln Ile Cys Thr Ala
290 295 300
Asn Ser Arg Val Tyr Val Gln Ser Ser Ile Tyr Asp Lys Phe Val Glu
305 310 315 320
Lys Phe Lys Glu Thr Ala Lys Lys Glu Trp Asp Val Ala Gly Lys Phe
325 330 335
Asp Pro Phe Asp Glu Lys Cys Ile Val Gly Pro Val Ile Ser Ser Thr
340 345 350
Gln Tyr Asp Arg Ile Lys Ser Tyr Ile Glu Arg Gly Lys Lys Glu Glu
355 360 365
Lys Leu Asp Met Phe Gln Thr Ser Glu Phe Pro Ile Gly Gly Ala Lys
370 375 380
Gly Tyr Phe Ile Pro Pro Thr Ile Phe Thr Asp Val Pro Glu Thr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Leu Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Val Val Ser Lys
405 410 415
Phe Thr Asn Tyr Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Asp Thr Cys Tyr
420 425 430
Gly Leu Ala Ser Ala Val Phe Thr Lys Asp Val Lys Lys Ala His Met
435 440 445
Phe Ala Arg Asp Ile Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Gln Thr Asn
450 455 460
Gln Glu Glu Ala Lys Val Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Ile
465 470 475 480
Gly Arg Glu Ser Gly Asp Thr Gly Val Asp Asn Tyr Leu Gln Ile Lys
485 490 495
Ser Val His Val Asp Leu Ser Leu Asp Lys
500 505
<210> 76
<211> 713
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 ACS1
<400> 76
Met Ser Pro Ser Ala Val Gln Ser Ser Lys Leu Glu Glu Gln Ser Ser
1 5 10 15
Glu Ile Asp Lys Leu Lys Ala Lys Met Ser Gln Ser Ala Ala Thr Ala
20 25 30
Gln Gln Lys Lys Glu His Glu Tyr Glu His Leu Thr Ser Val Lys Ile
35 40 45
Val Pro Gln Arg Pro Ile Ser Asp Arg Leu Gln Pro Ala Ile Ala Thr
50 55 60
His Tyr Ser Pro His Leu Asp Gly Leu Gln Asp Tyr Gln Arg Leu His
65 70 75 80
Lys Glu Ser Ile Glu Asp Pro Ala Lys Phe Phe Gly Ser Lys Ala Thr
85 90 95
Gln Phe Leu Asn Trp Ser Lys Pro Phe Asp Lys Val Phe Ile Pro Asp
100 105 110
Pro Lys Thr Gly Arg Pro Ser Phe Gln Asn Asn Ala Trp Phe Leu Asn
115 120 125
Gly Gln Leu Asn Ala Cys Tyr Asn Cys Val Asp Arg His Ala Leu Lys
130 135 140
Thr Pro Asn Lys Lys Ala Ile Ile Phe Glu Gly Asp Glu Pro Gly Gln
145 150 155 160
Gly Tyr Ser Ile Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Cys Gln Val
165 170 175
Ala Gln Val Leu Thr Tyr Ser Met Gly Val Arg Lys Gly Asp Thr Val
180 185 190
Ala Val Tyr Met Pro Met Val Pro Glu Ala Ile Ile Thr Leu Leu Ala
195 200 205
Ile Ser Arg Ile Gly Ala Ile His Ser Val Val Phe Ala Gly Phe Ser
210 215 220
Ser Asn Ser Leu Arg Asp Arg Ile Asn Asp Gly Asp Ser Lys Val Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Asp Glu Ser Asn Arg Gly Gly Lys Val Ile Glu Thr Lys
245 250 255
Arg Ile Val Asp Asp Ala Leu Arg Glu Thr Pro Gly Val Arg His Val
260 265 270
Leu Val Tyr Arg Lys Thr Asn Asn Pro Ser Val Ala Phe His Ala Pro
275 280 285
Arg Asp Leu Asp Trp Ala Thr Glu Lys Lys Lys Tyr Lys Thr Tyr Tyr
290 295 300
Pro Cys Thr Pro Val Asp Ser Glu Asp Pro Leu Phe Leu Leu Tyr Thr
305 310 315 320
Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly Val Gln His Ser Thr Ala Gly
325 330 335
Tyr Leu Leu Gly Ala Leu Leu Thr Met Arg Tyr Thr Phe Asp Thr His
340 345 350
Gln Glu Asp Val Phe Phe Thr Ala Gly Asp Ile Gly Trp Ile Thr Gly
355 360 365
His Thr Tyr Val Val Tyr Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Cys Ala Thr Leu
370 375 380
Val Phe Glu Gly Thr Pro Ala Tyr Pro Asn Tyr Ser Arg Tyr Trp Asp
385 390 395 400
Ile Ile Asp Glu His Lys Val Thr Gln Phe Tyr Val Ala Pro Thr Ala
405 410 415
Leu Arg Leu Leu Lys Arg Ala Gly Asp Ser Tyr Ile Glu Asn His Ser
420 425 430
Leu Lys Ser Leu Arg Cys Leu Gly Ser Val Gly Glu Pro Ile Ala Ala
435 440 445
Glu Val Trp Glu Trp Tyr Ser Glu Lys Ile Gly Lys Asn Glu Ile Pro
450 455 460
Ile Val Asp Thr Tyr Trp Gln Thr Glu Ser Gly Ser His Leu Val Thr
465 470 475 480
Pro Leu Ala Gly Gly Val Thr Pro Met Lys Pro Gly Ser Ala Ser Phe
485 490 495
Pro Phe Phe Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Asp Pro Asn Thr Gly Glu
500 505 510
Glu Leu Asn Thr Ser His Ala Glu Gly Val Leu Ala Val Lys Ala Ala
515 520 525
Trp Pro Ser Phe Ala Arg Thr Ile Trp Lys Asn His Asp Arg Tyr Leu
530 535 540
Asp Thr Tyr Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Tyr Tyr Phe Thr Gly Asp Gly
545 550 555 560
Ala Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Trp Ile Leu Gly Arg Val Asp
565 570 575
Asp Val Val Asn Val Ser Gly His Arg Leu Ser Thr Ala Glu Ile Glu
580 585 590
Ala Ala Ile Ile Glu Asp Pro Ile Val Ala Glu Cys Ala Val Val Gly
595 600 605
Phe Asn Asp Asp Leu Thr Gly Gln Ala Val Ala Ala Phe Val Val Leu
610 615 620
Lys Asn Lys Ser Ser Trp Ser Thr Ala Thr Asp Asp Glu Leu Gln Asp
625 630 635 640
Ile Lys Lys His Leu Val Phe Thr Val Arg Lys Asp Ile Gly Pro Phe
645 650 655
Ala Ala Pro Lys Leu Ile Ile Leu Val Asp Asp Leu Pro Lys Thr Arg
660 665 670
Ser Gly Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg Lys Ile Leu Ala Gly Glu
675 680 685
Ser Asp Gln Leu Gly Asp Val Ser Thr Leu Ser Asn Pro Gly Ile Val
690 695 700
Arg His Leu Ile Asp Ser Val Lys Leu
705 710
<210> 77
<211> 348
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 ADH1
<400> 77
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
35 40 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210> 78
<211> 587
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 DLD1
<400> 78
Met Leu Trp Lys Arg Thr Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Ile Ala Gln
1 5 10 15
Pro Arg Gly Arg Leu Val Arg Arg Ser Cys Tyr Arg Tyr Ala Ser Thr
20 25 30
Gly Thr Gly Ser Thr Asp Ser Ser Ser Gln Trp Leu Lys Tyr Ser Val
35 40 45
Ile Ala Ser Ser Ala Thr Leu Phe Gly Tyr Leu Phe Ala Lys Asn Leu
50 55 60
Tyr Ser Arg Glu Thr Lys Glu Asp Leu Ile Glu Lys Leu Glu Met Val
65 70 75 80
Lys Lys Ile Asp Pro Val Asn Ser Thr Leu Lys Leu Ser Ser Leu Asp
85 90 95
Ser Pro Asp Tyr Leu His Asp Pro Val Lys Ile Asp Lys Val Val Glu
100 105 110
Asp Leu Lys Gln Val Leu Gly Asn Lys Pro Glu Asn Tyr Ser Asp Ala
115 120 125
Lys Ser Asp Leu Asp Ala His Ser Asp Thr Tyr Phe Asn Thr His His
130 135 140
Pro Ser Pro Glu Gln Arg Pro Arg Ile Ile Leu Phe Pro His Thr Thr
145 150 155 160
Glu Glu Val Ser Lys Ile Leu Lys Ile Cys His Asp Asn Asn Met Pro
165 170 175
Val Val Pro Phe Ser Gly Gly Thr Ser Leu Glu Gly His Phe Leu Pro
180 185 190
Thr Arg Ile Gly Asp Thr Ile Thr Val Asp Leu Ser Lys Phe Met Asn
195 200 205
Asn Val Val Lys Phe Asp Lys Leu Asp Leu Asp Ile Thr Val Gln Ala
210 215 220
Gly Leu Pro Trp Glu Asp Leu Asn Asp Tyr Leu Ser Asp His Gly Leu
225 230 235 240
Met Phe Gly Cys Asp Pro Gly Pro Gly Ala Gln Ile Gly Gly Cys Ile
245 250 255
Ala Asn Ser Cys Ser Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Tyr Gly Thr Met Lys
260 265 270
Glu Asn Ile Ile Asn Met Thr Ile Val Leu Pro Asp Gly Thr Ile Val
275 280 285
Lys Thr Lys Lys Arg Pro Arg Lys Ser Ser Ala Gly Tyr Asn Leu Asn
290 295 300
Gly Leu Phe Val Gly Ser Glu Gly Thr Leu Gly Ile Val Thr Glu Ala
305 310 315 320
Thr Val Lys Cys His Val Lys Pro Lys Ala Glu Thr Val Ala Val Val
325 330 335
Ser Phe Asp Thr Ile Lys Asp Ala Ala Ala Cys Ala Ser Asn Leu Thr
340 345 350
Gln Ser Gly Ile His Leu Asn Ala Met Glu Leu Leu Asp Glu Asn Met
355 360 365
Met Lys Leu Ile Asn Ala Ser Glu Ser Thr Asp Arg Cys Asp Trp Val
370 375 380
Glu Lys Pro Thr Met Phe Phe Lys Ile Gly Gly Arg Ser Pro Asn Ile
385 390 395 400
Val Asn Ala Leu Val Asp Glu Val Lys Ala Val Ala Gln Leu Asn His
405 410 415
Cys Asn Ser Phe Gln Phe Ala Lys Asp Asp Asp Glu Lys Leu Glu Leu
420 425 430
Trp Glu Ala Arg Lys Val Ala Leu Trp Ser Val Leu Asp Ala Asp Lys
435 440 445
Ser Lys Asp Lys Ser Ala Lys Ile Trp Thr Thr Asp Val Ala Val Pro
450 455 460
Val Ser Gln Phe Asp Lys Val Ile His Glu Thr Lys Lys Asp Met Gln
465 470 475 480
Ala Ser Lys Leu Ile Asn Ala Ile Val Gly His Ala Gly Asp Gly Asn
485 490 495
Phe His Ala Phe Ile Val Tyr Arg Thr Pro Glu Glu His Glu Thr Cys
500 505 510
Ser Gln Leu Val Asp Arg Met Val Lys Arg Ala Leu Asn Ala Glu Gly
515 520 525
Thr Cys Thr Gly Glu His Gly Val Gly Ile Gly Lys Arg Glu Tyr Leu
530 535 540
Leu Glu Glu Leu Gly Glu Ala Pro Val Asp Leu Met Arg Lys Ile Lys
545 550 555 560
Leu Ala Ile Asp Pro Lys Arg Ile Met Asn Pro Asp Lys Ile Phe Lys
565 570 575
Thr Asp Pro Asn Glu Pro Ala Asn Asp Tyr Arg
580 585

Claims (7)

1.一种乳酸生产率提高的分离酿酒酵母微生物，其中所述微生物是经修饰的，使得：
a)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低；
b)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的醛脱氢酶(ALD)和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述丙酮酸脱羧酶选自PDC1、PDC5和PDC6中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的微生物，其中所述微生物是经修饰的以：
i)使PDC1活性失活，降低PDC5活性；或
ii)降低PDC1活性，使PDC5活性失活。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述醛脱氢酶选自ALD2和ALD3中的至少一种，乙酰辅酶A合成酶为ACS1。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中醇脱氢酶(ADH)还是失活的。
6.根据权利要求1所述的微生物，其中D-乳酸脱氢酶(DLD)还是失活的。
7.一种生产乳酸的方法，其包括：
a)在培养基中培养根据权利要求1至6中任一项所述的微生物；
b)从步骤a)的所述培养基或所述微生物回收乳酸。
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