KR102460532B1 - 글루타치온과 알데하이드탈수소효소를 생산하는 사카로마이세스 세레비지에 권피1,2,3 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루타치온(GSH)과 아세트알데하이드 탈수소효소(Acetaldehyde dehydrogenase)를 생산하는 효모 균주에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 글루타치온과 아세트알데하이드 탈수소효소를 동시에 생산하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae Kwon P-1 KCTC 13925BP)와 사카로마이세스 세레비지에 Kwon P-2 KCTC14122BP 그리고 사카로마이세스 세레비지에 Kwon P-3 KCTC14123BP 효모 균주에 대한 것이다.

Description

글루타치온과 알데하이드탈수소효소를 생산하는 사카로마이세스 세레비지에 권피1,2,3{Saccharomyces cerevisiae Kwon P-1,2,3 which produce Aldehyde dehydrogenase and Glutathione}
본 발명은 글루타치온(GSH)과 아세트알데하이드 탈수소효소(Acetaldehyde dehydrogenase)를 생산하는 효모 균주에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 글루타치온과 아세트알데하이드 탈수소효소를 동시에 생산하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae Kwon P-1 KCTC 13925BP)와 사카로마이세스 세레비지에 Kwon P-2 KCTC14122BP 그리고 사카로마이세스 세레비지에 Kwon P-3 KCTC14123BP 효모 균주에 대한 것이다.
글루타치온 (Glutathione, L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)은 세포내 존재하는 생리활성물질로서 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine)의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로서, 동물, 식물 및 미생물의 세포내에서 0.1~10mM의 농도로 존재하며, 세포의 총 비단백질성 활성분의 90% 이상을 차지하고 있다.
생체 내에서 글루타치온(glutathione)은 백혈구 생성을 통한 면역 활성 증가를 야기함으로써 중요한 항바이러스제의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, GST (glutathione S-transferase)의 기질로 작용하여 생체에 해로운 비 생체물질(xenobiotics)과 같은 독성물질을 콘쥬게이션(Conjugation) 형태로 결합하여 해독 작용에 중요한 역할을 한다.
또한 글루타치온은 세포 내에서 산화작용으로 세포막, 핵산과 세포구조들을 손상시켜 괴사시키는 것을 막아주고, 노화의 원인인 활성 산소 종(Reactive oxygen species, ROS)의 독성을 완화시켜 주는 역할을 한다. 이때 활성 산소 종은 다양한 생체 물질 대사작용에서 형성되며, 슈퍼옥사이드(superoxide), 과산화물(peroxide), 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)등이 포함되고, 물질의 생체 대사산물로 생성되는 내인성 활성 산소 종과 담배, 방사능 등의 외인성 활성 산소 종으로 구분 할 수 있다.
활성 산소 종에 기인한 산화적 스트레스는 인지기능에 손상을 줄 수 있고(Liu et al. 2002), 정자의 DNA를 파괴하여 남성 불임의 원인이 되며(Wright et al. 2014), 세포단백질, 지질 및 핵산을 손상시켜 암을 유발할 수 있고, 생리적 기능을 저하시켜 각종 질병과 노화의 원인 인자로 작용한다. 따라서 우리 몸은 질병예방, 면역 증진, 노화방지 등의 역할을 하는 항산화제가 매우 중요하며, 세포 내에서 항산화 역할을 하는 글루타치온의 기능은 효소학, 약물학, 치료, 독물학, 내분비학 및 미생물학을 포함하는 많은 의학 분야에서 주목받고 있다.
이러한 글루타치온은 기본적으로 체내에서 합성되지만, 질병발생, 면역력 약화, 노화등 비정상적인 상태가 진행될수록 인체 내 절대적 함량이 적어져서 건강을 악화시킨다. 따라서 외부에서 공급되는 글루타치온은 세포내 활성 산소 종을 제거하여 건강을 유지하고 노화를 늦출 수 있다.
이러한 글루타치온의 인체내 생리 활성 요인에 의하여 현재 글루타치온은 식품, 화장품, 사료 및 의약품 용도로 사용되고 있으며 점점 사용량이 증가하고 있는 추세이다.
한편, 글루타치온의 생산은 현재 식용 가능한 미생물을 이용하여 생산하지만 미생물이 생산할 수 있는 글루타치온의 고유한 함량은 매우 낮아 돌연변이 및 재조합 기술로 미생물의 글루타치온 함량을 증대 시켜 이를 이용한 발효 기법에 의하여 고함량 글루타치온 생산균주로 대량으로 생산하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
따라서 글루타치온 고함량 균주 개발은 경제적 가치를 높이는 근원적인 소재를 개발하는 것으로 글루타치온을 건강식품, 의약품, 사료등 광범위하게 사용할 수 있게 하는 시장 경합력을 가질 수 있게 해준다. 하지만 유전자 재조합 기술에 의한 균주 개발은 현재 이슈가 되고 있는 GMO 논의에서 자유로울 수가 없어 그 사용범위가 제한되지만, 돌연변이 기술에 의한 균주 육종은 사용에 제한이 없어 여러 가지 용도로 광범위하게 사용할 수 있다. 따라서 돌연변이 기술을 이용한 고 함량의 글루타치온 생산 균주 육종은 매우 필요한 기술이다.
한편, 한국은 경제성장과 함께 음주로 사용하는 알코올의 소비가 급증하고 있고 이로 인한 국민건강 관리는 중요한 이슈이고, 과도한 알코올의 섭취가 국민의 건강 및 사회경제적 측면에서 큰 사회적 문제로 대두되고 있다. 보건복지부와 질병관리본부의 조사 결과에 의하면 2016년 기준 국내 20세 이상 성인의 경우 월간 1회 이상 음주한 비율이 약 75%로 보고되고 있고, 매년 그 비율이 증가하고 있다. 뿐만 아니라 WHO의 국가별 알코올 소비량 조사 결과, 2016년 기준 만 15세 이상 국민의 알코올 소비량은 1인당 평균 11.9L로 세계 알코올 평균 소비량보다 4.8L 높은 수준으로 음주량 소비는 세계 17위에 해당하였고 서태평양권 나라에서는 1위를 기록하였다.
특히, 한국 국민 중 알코올 섭취에 의한 생성되는 체내 알데하이드(Aldehyde)의 과량 잔존은 심혈관계 질환, 당뇨, 신경퇴행성 질환, 상부 소화 및 호흡기관암, 방사선 피부염, 판코니 빈혈, 말초신경손상, 염증, 골다공증 및 노화와 같은 산화 작용에 기인한 질병을 초래한다고 보고된 바 있다(Chen et al. 2014).
또한, 음주로 인한 사회경제적 손실규모가 대부분의 국가에서 GDP 대비 약 0.5-2.7%에 이르는 것 보고되고 있고 우리나라 경우, 2000년 한해 음주로 인한 사회경제비용이 14조 9,352억 원으로 추정되었으며 그 중 질병, 사고, 숙취에 의한 생산성 감소 및 손실액이 6조 2,845억 원으로 추정된다는 보고가 있다(정우진 et al. 2006).
이러한 사회적 문제를 해결하기 위하여 에탄올의 독성을 경감시키거나 독성의 발현을 저해할 수 있는 많은 물질에 대한 연구와 실험이 진행되고 있으며, 그 결과물은 다양한 건강보조식품 관련 제품으로 개발되고 있다. 체내로 유입된 알코올은 위장 또는 소장에서 흡수되어 혈관 내로 들어가서 간장으로 옮겨져서 분해되고 해독된다.
간세포에 존재하는 알코올 탈수소효소(ADH, Alcohol Dehydrogenase)가 알콜을 먼저 아세트알데히드(Acetaldehyde)로 산화시키면, 아세트알데히드는 다시 간세포에 있는 아세트알데히드 탈수소효소(ALDH, ALdehyde DeHydrogenase)에 의해 아세트산(Acetate)으로 분해되어 전신의 근육이나 지방조직으로 옮겨져 최종적으로는 탄산가스와 물로 분해된다. 에탄올의 최초 대사산물인 아세트알데하이드는 에탄올에 비해 반응성이 매우 높고 독성이 강하여 숙취 및 알코올성 간 장애의 주요 원인이 된다.
사람이 가지고 있는 알데하이드 탈수소효소는 19 종류가 보고된 바 있으며(Marchitti et al. 2007, 2008), 이 중 미토콘드리아에 주로 존재하는 아세트알데하이드 탈수소효소2 (Acetaldehyde Dehydrogenase 2)는 효소공학적으로 분석한 결과, 아세트알데하이드를 효소의 기질로 분석했을 때, 다른 종류의 알데하이드를 기질로 사용했을 때 보다 가장 낮은 Km 값(~0.2 μM)을 가져서 알콜에서 유래된 아세트알데하이드를 가장 잘 산화시켜서 제거하는 것으로 나타났다.
생체 내 에탄올 대사에서 생성된 숙취 원인 물질인 아세트알데하이드를 아세트산으로 가장 효과적으로 전환함으로 알데하이드를 제거하는 것을 인체 건강에 매우 중요하다(Eriksson et al. 1977, Klyosov et al. 1996-1). 또한 아세트알데하이드 탈수소효소2는 아세트알데하이드 뿐만 아니라 지방족 알데하이드, 방향족 알데하이드, 폴리사이클릭 알데하이드와 같은 알데하이드의 대사과정에도 이용되어 체내 독성물질을 제거한다(Klyosov et al. 1996-2).
대표적인 예로 산화적 스트레스 과정에서 발생되는 산화 알데하이드 물질인 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE)과 malondialdehyde (MDA)을 제거하고, 담배 연기와 자동차 매연에서 발생하는 acrolein를 제거하는 역할을 한다(Chen et al. 2010, Yoval-Sanchez et al. 2012). 인체내 아세트알테하이드 탈수소효소 2 효소의 발현이 적거나 이 효소의 487번째 아미노산 잔기가 글루타민산에서 라이신으로 변이된 사람은 얼굴이 붉어지는 홍조현상을 보이는 등, 적은 양의 알코올에도 민감한 반응을 보일 뿐만 아니라 전환을 못하기 때문에 음주시 혈중 아세트알데하이드의 농도가 높다(Yoshida et al. 1984).
특히 아세트알데하이드 탈수소효소 2의 동형접합체인 ALDH2-2를 가지고 있는 경우 음주에 취약하다고 많은 연구를 통해 알려져 있으며, 이러한 유전적 변이는 서양인에게는 거의 나타나지 않지만 한국인, 중국인, 일본인에게서는 전체 인구의 50%에서 발견되고 있다 (Brooks et al. 2009).
알데하이드 탈수소효소 2에 대한 연구개발은 의료용 목적으로 체내 알데하이드 탈수소효소 2의 촉진제 및 억제제에 대한 연구가 활발히 연구됨으로써 알데하이드 탈수소효소 2의 중요성이 강조되고 있지만 (Budas et al. 2009, Chen et al. 2014, M.zel et al. 2018), 알데하이드 탈수소효소 2의 고함량 미생물 육종이나 대량 생산 기술 개발에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다.
알데하이드 탈수소효 2 고효율 생산 균주 개발은, 대장균(E. coli)을 숙주로 한 단백질 발현 시스템을 이용하여 인간형 알데하이드 탈수소효소 1과 2 단백질을 발현시켰고, 이중 30% 만이 활성이 있는 가용성 형태의 효소로 발현하여 단지 2-4 mg/L의 단백질을 생산한 것으로 보고된 바 있으며(Zheng et al. 1993), 쥐(Rat) 알데하이드 탈수소효소 2의 경우 95%가 활성이 있는 가용성 단백질로 발현되었으나, 1-2 mg/L의 매우 적은 단백질을 생산한 것으로 보고되었다(Jeng et al. 1991).
그러나, 법적 제한이 작아서 활용이 용이한 돌연변이 방법을 이용한 아세트알데하이드 탈수소효소 2의 생산량을 증가 시킨 사례는 보고되지 아니하고 있다. 따라서 아세트알테하이드 탈수소효소 2의 사용 범위 확대를 위해 돌연변이 방법에 의한 고활성 알데하이드 탈수소효소 2를 가진 미생물을 개발이 시급히 요구된다.
일반적으로 미생물 균주로부터 목적 산물의 생산성을 증가시키기 위한 균주 육종방법은 유전자 재조합기술이나 돌연변이 기술 등이 많이 사용되고 있지만, 유전자 재조합 기술에 의한 균주 개량의 경우 법적 제한 요소가 많고, 적용 범위에도 한계가 있어서 돌연변이 유발 방법을 매우 유리하다.
균주 개량을 위한 돌연변이 유발 방법은 일반적으로 Ethylmethanesulfonate (EMS) 또는 Methylnitronitrosoguanidine(NTG)와 같은 화학물질이나 자외선(UV) 등을 이용하여 균주의 유전자에 돌연변이를 유발시켜 특성을 변화시킨 후 목적 산물의 생산에 적합한 선택 요소(Selection factor)를 가하여 원하는 형질을 적응(Adaptation)하여 원하는 돌연변이체를 유도하여 선별할 수 있다.
생체 유전자는 구아닌(Guanine)과 사이토신(Cytosine)의 유전자 결합 짝은 3중 수소결합으로, 아데닌(Adenine)과 티민(Thymine)은 2중 수소결합으로 쌍을 이루어져 있고 유전정보를 저장하고 있는 유전자의 염기서열은 3중, 2중 수소결합 때문에 반드시 구아닌은 시이토신과, 아데닌과 티민과 짝이 되어 구성되어 있다.
화학물질을 돌연변이 유발원으로 사용할 시는 주로, 화학적 유발제인 EMS나 NTG을 사용할 시는 구아닌을 알킬화 하여 O-6-ethyl Guanine을 형성해 결국 3중 결합을 방해하고 최종 티민과 2중 결합을 형성하게 되어 이 부분의 유전자 염기 짝이 바뀌어 질수 있게 된다.
이렇게 유전자 염기가 바뀐 상태에서 DNA복제가 일어나면 티민 부분은 아데닌과 쌍을 이루어 구아닌, 사이토신 부분이 아데닌 티민으로 치환(Nahafi et al. 2013)되고 이렇게 되면 돌연변이가 일어난다.
또한, 적응에 의한 돌연변이체 선발은 메틸 글라이옥살(Methylglyoxal)은 해당과정 및 아미노아세톤 순환에서 합성된 독성 물질로 글라이옥살 환원효소(Glyoxal reductase)에 의해 젖산으로 전환되는데 이 시스템에 글루타치온이 조효소로 관여하는 성질을 이용하여 글라이옥살을 첨가한 배지를 사용하여 글루타치온 생산성이 높은 균주로 유도하게 된다.
즉, 글루타치온이 부족하면 이 시스템이 작동되지 않아 민감성이 증가하고, 글루타치온이 과잉 생산되면 저항성이 증가될 수 있다. 결과적으로 글루타치온 과잉 생산 균주 선별을 위한 선별 요소로서 메틸 글라이옥살이 사용될 수 있게 된다(Ohtake et al. 1990)(Hamad et al. 2018).
아세트알테하이드 탈수소효소 2를 많이 생산하는 돌연변이 유도체는 라이신(Lycine)을 배지에 첨가하여 선별할 수 있다. 라이신은 음전하의 세균 막과 작용한 후 세포막의 구조를 무너트려 균체의 성장을 억제 시킬 뿐만 아니라 또한 세포내부로 투과 후 핵산과 작용하여 단백질 합성을 저해 기능함으로써 미생물 성장을 억제 시킨다.
따라서 고농도 라이신이 함유된 조건에서 자랄수 있는 내성 균주는 균주의 단백질의 합성 능력을 증가 시킬 수 있어 결국, 아세트알데하이드 탈수소효소 2 을 과량으로 생산하는 균주 선별 방법으로 사용 할 수 있을 것이다.
그러나 이상에서 살펴본 바와 같이, 인체내에 쌓이는 여러 유해물질 중 특히 활성산소 종이나 다양한 아세트알데하이드 류 들과 같은 화학물질을 제거하기 위해서는 글루타치온과 아세트알데하이드 탈수소효소를 동시에 사용하면 효율성이 높지만, 지금까지의 조사에서는 글루타치온과 아세트알데하이드 탈수소효소를 동시에 생산하는 균주는 개발은 보고되지 아니하였다.
본 발명에서는 알데하이드 탈수소효소 2과 글루타치온을 동시에 고효율로 생산할 수 있는 균주를 1차 화학 돌연변이 방법을 사용하여 돌연 변이주를 만들고, 2차 선택 요소(Selection factor)적응(Adaptation) 변이주를 선발하여 개발하였다.
Ethylmethanesulfonate(EMS) 또는 Methylnitronitrosoguanidine(NTG)를 사용한 화학적 방법을 1차 사용하였고, 2차 선발 시는 지금까지 시도된 바가 없는 메틸글라이옥살 과 라이신의 2가지 적응시험으로 글루타치온과 아세트알테하이드 탈수소효소 2를 동시에 과량으로 생산주를 최종 선별하였다.
글루타치온과 아세트알테하이드 탈수소효소 2를 동시에 과량 생산하는 돌연변이 균주는 식품, 건강식품, 사료. 화장품 및 의약용사용에 문제가 없는 GRAS (Generally Recognized As Safe)로 보고되고 있고, 이미 생산 효율은 낮지만 글루타치온과 아세트알데하이드 탈수소효소를 모두 생산하는 균주로 알려진 야생 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 선발하여 사용하였다.
이렇게 돌연변이를 통하여 글루타치온의 생산 능력이 증가되고, 동시에 아세트알데하이드 탈수소효소 2 생산 능력도 증가된 새로운 개량 균주인 사카로마이세스 세레비지애 속(Saccharomyces cerevisiae sp.)을 확보함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
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본 발명의 목적은 야생 사카로마이시스 세레비지에 효모를 돌연변이시켜서 글루타치온과 알데하이드 탈수소효소 2의 동시 생산 능력을 증가시키는 돌연변이 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 글루타치온과 알데하이드 탈수소효소 2 를 동시에 고효율 생산 능력을 나타내는 사카로마이시스 세레비지에 KwonP-1 (Saccharomyces cerevisiae KwonP-1: KCTC13925BP) 돌연변이 효모 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 야생 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 돌연변이시켜 배양한, 글루타치온과 알데하이드 탈수소효소 2의 동시 생산 능력이 우수하면서 Methylglyoxal 내성이 강한, 신규한 효모인 기탁번호 KCTC14122BP의 Saccharomyces cerevisiae KwonP-2을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 야생 사카로아이시스 세레비지에 효모를 돌연변이 시켜 제조한, 라이신(Lysine) 내성이 강한 신규 균주 KCTC14123BP Saccharomyces cerevisiae KwonP-3을 제공하는 것이다.
이상과 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루타치온 및 아세트알데하이드 탈수소효소2 동시 생산 능력을 증가시킨 변이 미생물를 만들기 위해서, 야생 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)중, 미량이지만 글루타치온 및 아세트알데하이드 탈수소효소 2를 생산할 수 있는 균주를 선발 사용하였다.
이러한 기준으로 선발한 야생 효모를 인위적으로 화학 돌연변이 시킨 후, 다시 글루타치온을 과량 생산하는 균주는 메틸글라이옥살 적응 변이주, 아세트 알데하이드 탈수소효소2 과량 생산 균주 선발은 라이신 적응 변이주 선발 방법으로 하여, 최종적으로 글루타치온과 아세트 알데하이드 탈수소효소 2를 동시에 과량으로 생산하는 사카로마이세스 세레비지에를 선발하였다.
이하, 본 발명의 돌연변이 유도 방법과 선발된 돌연변이 효모를 보다 구체적으로 설명한다.
사카로마이세스 세레비지애 KwonP-1 돌연변이 균주(KCTC13925BP)는, 국산 막걸리, 누룩등 에서 선발된 야생 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주 250종들 중에서, 비록 미량이지만 글루타치온 및 아세트 알데하이드 탈수소효소 2 를 동시에 생산하는 균주를 20종 선발한 다음, 동시 생산성이 가장 높은 균주를 1종 최종 선발하였다.
그 이후, 선발된 20종의 균주에 NTG(Nitrosoguanidine) 또는 EMS (Ethyl-methane-sulfonate) 처리하여 화학 돌연변이를 유발한 돌연변이 미생물들 글루타치온의 생산성을 높이기 위해서 메틸글라이옥살 농도, 이에 제한되지는 않으나, 5 내지 15mM, 바람직하게는 10 mM 농도에 대한 적응성이 높은 내성 효모 미생물을 1차 선별하였다.
그 후, 다시 2차 선별은 아세트 알데하이드 탈수소효소2의 생산성이 높은 미생물 선발을 위해 라이신에 대한 적응 내성을 가지는 신규한 효모 돌연변이 균주를 선별하기 위해, 이에 제한되지는 않으나, 3 내지 5 %, 바람직하게는 3 % 농도의 라이신에서 내성을 가진 효모 미생물을 선발하였다. 최종적으로 글루타치온과 아세트 알데하이드 탈수소효소 2의 동시 생산성이 높은 사카로마이세스 세레비지에 KwonP-1(Saccharomyces cerevisiae KwonP-1)을 선발하였다.
상기 사카로마이세스 세레비지애 KwonP-1은 국제기탁기관에 수탁번호 KCTC13925BP 로 기탁되었으며, 우수한 글루타치온 생산 및 아세트 알데하이드 탈수소효소 2의 생산 능력을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지애 KwonP-1 돌연변이균주(KCTC13925BP)는 사카로마이세스 세레비지애 야생형 균주들 중 비록 미량이지만 글루타치온 생산 및 아세트 알데하이드 탈수소효소 2의 동시 생산 능력이 있는 선발 균주에 NTG(nitrosoguanidine) 또는 EMS(Ethyl-methane-sulfonate)를 처리하여 돌연변이를 유발하고, 상기 균주로부터 메틸글라이옥살에 대한 내성을 지니고, 라이신에 대한 내성을 가진 균주를 선별한 것으로서, 글루타치온과 알데하이드 탈수소효소2 생성능이 최초 선발된 야생균주에 비해 2가지 물질의 생산성이 우수함을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 메틸 글라이옥살의 처리 농도에 따른 사카로마이세스 세레비지애 야생형 균주의 생존율 곡선(curve)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 NTG의 처리 농도에 따른 사카로마이세스 세레비지애 야생형 균주의 생존율 곡선(curve)을 나타낸 그래프이고 파란색은 24시간 배양한 야생 사카로마이세스 세레비지애의 생존율이고 주황색은 야생 사카로마이세스 세레비지애를 배양해서 OD값이 0.5가 된 후 사용하였다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 EMS의 처리 농도에 따른 사카로마이세스 세레비지애 야생형 균주의 생존율 곡선(curve)을 나타낸 그래프이고 파란색은 24시간 배양한 야생 사카로마이세스 세레비지애의 생존율이고 주황색은 야생 사카로마이세스 세레비지애를 배양해서 OD값이 0.5가 된 후 사용하였다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 사카로마이세스 세레비지애의 돌연변이 균주로부터 생성된 글루타치온의 농도 분포 결과를 나타낸 그래프이다. 이때 가로축은 균체당 글루타치온 함량을 나타내고 세로축은 콜로니(colony) 갯수를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 라이신의 처리 농도에 따른 사카로마이세스 세레비지애 야생형 균주의 생존율 곡선(curve)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 사카로마이세스 세레비지애 돌연변이 균주로부터 생성된 알데하이드 탈수소효소2의 농도 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 이때 가로축의 숫자는 사카로마이세스 세레비지애 각각의 돌연변이 균주를 의미하는 것이며 세로축은 사카로마이세스 세레비지애 돌연변이 균주의 알데하이드 탈수소효소2의 활성을 사카로마이세스 세레비지애 야생균주의 알데하이드 탈수소효소 2의 활성과 비교하여 상대적인 알데하이드 탈수소 효소2의 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 사카로마이세스 세레비지애의 돌연변이 균주 KwonP-1의 세포형태를 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 8은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 사카로마이세스 세레비지애의 야생형 균주의 세포형태를 광학현미경으로 관찰한 도이다.
이하, 다음의 실시예들을 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
글루타치온 생산 능력이 향상된 균주 선별
글루타치온 생산 능력이 향상된 신규한 돌연변이 균주를 선별하고자, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 야생균주에 돌연변이를 유도하기 위한, EMS (Ethyl-methane-sulfonate) 또는 NTG(nitrosoguanidine)를 처리하고, 메틸글라이옥살(methylglyoxal)에 대한 내성을 평가하여 최종적으로 글루타치온 생성능이 향상된 균주를 선별하였다. 구체적으로는 아래와 같이 실험을 수행하였다.
실시예 1-1: 메틸글라이옥살(methylglyoxal)에서 사카로마이세스 세레비지애( Saccharomyces cerevisiae ) 야생형 균주의 생존율 분석
글루타치온 생성능이 향상된 신규한 효모 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하기 위해서 메틸 글라이옥살에 대한 내성 균주를 선별하기 전 생존률을 측정하여 처리농도의 범위를 결정한 후 처리 농도를 선정하고자 하였다. 이때, 야생에서 선별된 사카로마이세스 세레비지애를 모 균주로서 사용하였다.
구체적으로, 먼저 돌연변이주의 내성 균주를 선별하기 위하여, 상기 준비한 효모 균주의 메틸 글라이옥살 처리 농도를 달리하여 생존율을 조사하였다. 이를 위하여 상기 균주를 YPD 배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코오스)에 접종하여 30 ℃에서 OD600nm (Optical Density at 600nm)값이 0.5가 될 때까지 성장시킨 후 균체를 회수하였다. 상기 회수한 균체를 각각 0 mM, 5 mM, 10 mM 및 15 mM 농도의 메틸글라이옥살이 첨가된 YPD 한천 배지(한천 1.5 % 첨가)에 도말하여 접종한 후 배양하였다. 이때, 회수한 균체는 0.1M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)로 세척한 후 OD600nm 값을 1.0으로 조절하여 메틸 글라이옥살이 첨가된 YPD 한천 배지에 도말하였다. 도말 후, 30℃에서 48시간 동안 배양하여 상기 균주의 생존율 그래프로 작성하였다.
그 결과, 하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 메틸 글라이옥살을 10 mM 농도로 처리 시 99.995 % 사멸율이 확인되었고, 메틸 글라이옥살을 15 mM 농도로 처리 시 시험미생물 100 %가 사멸하였다.
이에, 글루타치온 생성능이 향상된 신규한 돌연변이 균주를 선별하기 위해, 상기 결과를 바탕으로 야생형 균주의 메틸 글라이옥살 내성 균주를 선별하기 위해서는 메틸 글라이옥살이 10 mM 농도로 첨가된 YPD 한천 배지를 사용하였다.
실시예 1-2: 글루타치온 생성능이 우수한 돌연변이 후보 균주 선별을 위한 돌연변이 조건 확립
상기 실시예 1-1에서 글루타치온 생성능이 향상된 신규한 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하였다. 구체적으로, 야생형 균주의 메틸글라이옥살 내성 균주 선별을 위해, YPD 한천 배지에 메틸 글라이옥살을 10 mM 농도로 첨가하였다.
이에, 야생형 균주로부터 글루타치온 생산이 우수한 돌연변이 균주를 선별하기 위하여 EMS (Ethyl-methane-sulfonate; 에틸-메탄-설포네이트) 또는 NTG(Nitrosoguanidine)의 처리 농도별 생존율 곡선을 작성하였다.
구체적으로, 야생형 균주를 YPD 배지에 접종하여 OD600nm 값이 0.5가 될 때까지, 또한 24시간 배양한 후, 2가지 배양액을 대상으로 하여 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 침전된 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)을 사용하여 2회 세척하고 원심분리한 후, 최종적으로 OD600nm 값이 1.0이 되도록 0.1M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)로 희석하여 사용하였다. 이후, 돌연변이를 유도하기 위해 원심분리 후 회수된 균체에 1 %, 2 %, 3 %, 그리고 4 % 농도의 NTG가 포함된 0.1M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 첨가하여, 30 ℃의 온도 조건에서 30분간 NTG를 처리하였다. 상기 NTG가 처리된 돌연 변이주를 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체를 회수한 후, 0.1 M 시트릭 버퍼(citiric buffer, pH5.5)를 사용하여 2회 세척하였다. 상기 세척된 균체에 1 ㎖의 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 첨가하여 혼합한 후 YPD 한천 배지에 도말하였다.
한편, 돌연변이를 유도하기 위한 물질인 EMS 처리에 의한 메틸 글라이옥살 내성 돌연변이 균주 선별을 위해, 상기 NTG 처리 조건과 동일한 조건에서 성장한 효모 야생형 균주를 1 ㎖ 취하여 원심 분리하였다. 상기 원심분리 후 회수된 균체에 1 %, 2 %, 3 %, 그리고 4 % 농도의 EMS가 포함된 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 첨가하여, 30 ℃의 온도 조건에서 60 분간 EMS를 미생물에 처리하였다. 상기 EMS가 처리된 돌연 변이주를 4,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 균체를 회수한 후, 0.1 M 시트릭 버퍼(citiric buffer, pH5.5)를 사용하여 2 회 세척하였다. 상기 세척된 균체에 1 ㎖의 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 첨가하여 혼합한 후 YPD 한천 배지에 도말하였다.
그 결과, 하기 도 3 에 나타낸 바와 같이 EMS는 24 시간 배양 후 3% 농도로 처리 시 99.4%의 사멸을 확인되었다. 그리고 도 2에 나타낸 바와 같이 NTG는 24시간 배양 후 1% 농도로 처리 시 99.7%의 사멸을 나타내었다.
이에, 글루타치온 생성능이 향상된 신규한 효모 돌연변이 균주를 선별하기 위해, 상기 결과를 바탕으로 야생형 균주의 글루타치온 내성 균주 선별을 위한 최적의 NTG, EMS 처리 농도를 각각 1%, 3%로 선정하였다.
실시 예 1-3: 글루타치온 생성능이 우수한 돌연변이 후보 균주 선별
상기 실시 예 1-2, 1-3에서 글루타치온 생성능이 향상된 신규한 효모 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하였다. 구체적으로, 효모 야생형 균주의 메틸 글라이옥살 내성 균주 선별을 위해, YNB 한천 배지에 메틸 글라이옥살을 10 mM 농도로 첨가하기로 하였고, 돌연변이를 위해 NTG 1%, EMS 3% 조건을 확립하였다.
이에, 야생형 균주로부터 글루타치온 생산이 우수한 돌연변이 균주를 선별하기 위하여, 메틸 글라이옥살 내성 돌연변이 균주를 선별하고, 이를 YPD 배지에서 균체를 성장시켜 글루타치온 농도를 측정하여 균체내 글루타치온 함량(%, g/g-cell)으로 표기 하였다.
구체적으로, 야생형 균주를 YPD 배지에 접종하여 24 시간 배양한 후, 배양액을 수득하여 4,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 이후, 상기 회수한 균체를 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 사용하여 2회 세척하고, 최종적으로 OD600nm 값이 1.0이 되도록 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)로 희석하여 사용하였다. 돌연변이를 유도하기 위해 각각 EMS 3%를 포함한 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)에 10분간, NTG 1%를 포함한 0.1M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)에 30 분간 처리 한 후 돌연 변이된 미생물을 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체를 회수한 후, 0.1M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 첨가하여 혼합한 후 10 mM 농도의 메틸 글라이옥살이 첨가된 YPD 한천 배지에 도말하였다. 도말하여 배양한 후, 생존된 균주를 회수하였으며, 이를 YPD 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 이때 배양 조건으로, 배양 온도는 30℃ 이였으며, 교반 속도는 160 rpm 이였다. 48 시간 동안 배양한 후, 글루타치온의 농도를 측정하여 균체내 글루타치온 함량(%, g/g-cell)으로 표기 하였다
이때, 글루타치온의 농도 분석을 위해 배양된 균체를 원심분리하고, 침전된 균체에 1 mL의 물을 첨가하여 2시간동안 85℃에서 1,000 rpm으로 교반하여 추출하였다. 추출한 후, 원심분리기를 이용하여 균체를 제거하고 상등 액을 0.22㎛ 필터로 여과하여 회수하였다. HPLC(Shimazu LC-20AD) 분석을 통해, 상기 회수한 여과액에 포함되어 있는 글루타치온의 농도를 측정하였다. 한편, 글루타치온 농도는 글루타치온의 표준곡선을 이용하여 분석하였으며, HPLC 분석 조건은 C18 컬럼을 사용하여 분석하였다. 이동상 용매(2.02 g/L Sodium 1-heptanesulfonate monohydrate, 6.8 g/L Potassium dihydrogen phosphate, pH 3.0, 메탄올 혼합)를 1 ㎖/min 유속으로 흘려 자외선 검출기 210 ㎚ 파장에서 검출된 글루타치온의 농도를 측정하였다.
총 130 돌연변이 균주가 생성되어 각각의 돌연변이 균주의 글루타치온 농도를 분석한 결과, 도 4에서와 같이 균체내 글루타치온 함량이 0.3%에서 0.5% 미만인 돌연변이균주는 70종 이었으며, 0.5%에서 0.7%미만인 돌연변이균주는 30종 이었으며, 0.7%에서 0.85% 미만인 돌연변이 균주는 23종 이었으며, 0.85%에서 1.1% 미만 인 돌연변이주는 7종 이었다. 즉 EMS 또는 NTG 처리에 의한 메틸 글라이옥살 내성 균주의 글루타치온 생성 능력은 48.6%가 야생형 균주의 균체내 글루타치온 함량인 0.42%에 비하여 우수하게 나타났으며, 이중 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 7종의 돌연변이 균주가 모 균주에 비하여 2 배 이상 향상된 글루타치온 생성 능력을 나타내었다.
이를 근거로 EMS 처리에 의한 메틸 글라이옥살 내성 돌연변이 균주 중 가장 글루타치온 생성능이 좋은 사카로마이세스 세레비지애 ems c7을 글루타치온 생성능이 우수한 돌연변이 최종 후보 균주로 선별하였다.
이하, 실시 예 2 에서는 NTG 처리를 이용한 돌연변이를 사용하여 상기 선별한 후보 균주 의 알데하이드 탈수소효소 2의 생성 능을 향상시켰다.
EMS 또는 NTG 처리에 의한 효모의 메틸글라이옥살 내성 돌연변이 균주의 배양 결과
No. 균주명 돌연변이 처리법 글루타치온 함량
(%)
대조군
(Control)		 Saccharomyces cerevisiae WT ­ 0.42
실험군 1 Saccharomyces cerevisiae ems c7 EMS / 메틸글라이옥살 내성 0.95
실험군 2 Saccharomyces cerevisiae ems d5 EMS / 메틸글라이옥살 내성 0.88
실험군 3 Saccharomyces cerevisiae ems d6 EMS / 메틸글라이옥살 내성 0.92
실험군 4 Saccharomyces cerevisiae ems e1 EMS / 메틸글라이옥살 내성 0.93
실험군 5 Saccharomyces cerevisiae ems e3 EMS / 메틸글라이옥살 내성 0.85
실험군 6 Saccharomyces cerevisiae ntg g6 NTG / 메틸글라이옥살 내성 0.86
실험군 7 Saccharomyces cerevisiae ntg h1 NTG / 메틸글라이옥살 내성 0.88
알데하이드 탈수소효소 2 (ALDH2) 생성능이 향상된 균주 선별
알데하이드 탈수소효소 2의 생성능이 향상된 신규한 돌연변이 균주를 선별하고자, 실시예 1에서 선발된 글루타치온의 생산량이 가장 높은 사카로마이세스 세레비지애 ems c7를 라이신(Lysine)에 대한 내성을 평가하여 최종적으로 알데하이드 탈수소효소 2의 생성능이 향상된 균주를 선별하였다. 구체적으로 하기와 같이 실험을 수행하였다.
실시예 2-1: 라이신(Lysine)에서 사카로마이세스 세레비지애 ems c7 균주의 생존율 분석
알데하이드 탈수소효소 2 생성능이 향상된 신규한 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하기 위해, 글루타치온 돌연 변이주 사카로마이세스 세레비지애 ems c7의 라이신에 대한 내성 균주를 선별하기 위한 최적의 라이신 처리 농도를 선정하고자 하였다. 이때, 글루타치온 생성능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 ems c7를 준비하였으며, 이 균주를 모 균주로서 사용하였다.
구체적으로, 사카로마이세스 세레비지애 돌연변이주의 라이신 내성 균주를 선별하기 위하여, 상기 준비한 사카로마이세스 세레비지애 ems c7 균주의 라이신 처리 농도에 따른 생존율을 조사하였다. 이를 위하여 상기 균주를 YPD 배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코오스)에 접종하여 30 ℃에서 OD600nm 값이 0.5가 될 때까지 성장시킨 후 균체를 회수하였다. 상기 회수한 균체를 각각 0%, 3%, 4%, 5%, 6% 및 7% 농도의 라이신이 첨가된 YPD 한천 배지(한천 1.5% 첨가)에 도말하였다. 이때, 회수한 균체는 0.1M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)로 세척한 후 OD600nm 값을 1.0으로 조절하여 라이신이 첨가된 YPD 한천 배지에 도말하였다. 도말 후, 30 ℃에서 48시간 동안 배양하여 상기 균주의 생존율 곡선(curve)를 작성하였다.
그 결과, 하기 도 5에 나타낸 바와 같이, 라이신을 3% 농도로 처리 시 87.5% 사멸을 확인되었다.
이에, 알데하이드 탈수소효소 2 생성능이 향상된 신규한 돌연변이 균주를 선별하기 위해, 상기 결과를 바탕으로 사카로마이세스 세레비지애 ems c7 균주의 라이신 내성 균주 선별을 위한 최적의 라이신 처리 농도를 3% 로 선정하고, 라이신이 3% 농도로 첨가된 YPD 한천 배지를 사용하여 선별하였다.
실시예 2-2: 알데하이드 탈수소효소 2 생성능이 우수한 돌연변이 후보 균주 선별
상기 실시예 1-2, 2-1에서 알데하이드 탈수소효소 2 활성이 향상된 신규한 효모 돌연변이 균주를 선별하기 위한 실험 조건을 확립하였다. 구체적으로, 돌연변이 사카로마이세스 세레비지애 ems c7 균주의 라이신 내성 균주 선별을 위해, YPD 한천 배지에 라이신을 3 % 농도로 첨가하기로 하였고, 돌연변이를 위해 NTG 1% 조건을 확립하였다.
이에, 사카로마이세스 세레비지애 ems c7 균주로부터 글루타치온 생산이 우수한 돌연변이 균주를 선별하기 위하여, 라이신 3%가 포함된 YPD 배지에서 균체를 성장시켜 알데하이드 탈수소효소 2 농도를 측정하였다.
구체적으로, 효모 야생형 균주를 YPD 배지에 접종하여 24시간 배양한 후, 배양액을 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 사용하여 2회 세척하고, 최종적으로 OD600nm 값이 1.0이 되도록 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 추가하여 희석하였다. 돌연변이를 유도하기 위해 각각 NTG 1 %를 포함한 0.1M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)에 10 분간 처리 한 후 돌연 변이주를 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체를 회수한 후, 0.1 M 시트릭 버퍼(Citiric buffer, pH5.5)를 첨가하여 혼합한 후 3% 농도의 라이신이 첨가된 YPD 한천 배지에 도말하였다. 도말하여 배양한 후, 생존된 균주를 회수하였으며, 이를 YPD 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 이때 배양 조건으로, 배양 온도는 30 ℃ 이였으며, 교반 속도는 160 rpm 이였다. 48 시간 동안 배양한 후, 알데하이드 탈수소효소 2의 활성을 측정하였다.
하지만, 알데하이드가 휘발성이고 생산되는 량이 미량이라 기존의 방법으로 측정 같은 시료에 대한 편차가 많아서 안정된 아세트알데하이드 측정방법의 정립이 필요하고 이를 근거로 한 정확한 새로운 효소역가 측정방법의 개발은 만들어진 아세트알데하이드 탈수소효소의 QC(Quality Control)에 절대적으로 필요하여 실시 예3에서 새로운 방법을 개발하였다.
새로운 아세트알데하이드 탈수소효소 역가 측정방법 확립과 돌연변이 균주의 효소역가 측정
기존 알데하이드 탈수소효소의 활성을 측정하는 방법으로 파장 340nm에서의 NAD(P)+ 흡광도를 측정하는 방법이 널리 사용되나 이는 조효소의 변화량을 살펴보기 때문에 간접적인 결과라 할 수 있어 사용할 수 없었다. 따라서 효소의 기질에 대한 직접적인 효소의 Km 값을 측정하기 위하여 본 발명자들은 알데하이드의 정량을 위해 HPLC 분석방법을 이용하였다. 단, 효소 ALDH2 에 의해 소모되는 아세트알데히드는 매우 적은 양이고, 아세트알데히드는 상온에서도 휘발성이 강하기 때문에 반응산물에서 직접 정량하는 것은 기술적으로 어려움이 있다는 문제점이 있다.
이에, 문제점을 해결하기 위해서 발명자들은 아세트알데히드에 일정량의 비율로 Dinitrophenylhydrazine (DNPH)를 첨가하여 일정 농도에서 반응시키면 아세트알데하이드-하이드라존 (AcH-DNPH)를 화합물이 형성되고, 이는 HPLC용 C18 칼럼에 이동상 Acetonitrile와 water를 용매로 전개하여 360 nm에서 검출되어 정량할 수 있다는 참고문헌(Guan. et. al, 2012)을 근거로 알데하이드 탈수소효소의 반응에 의하여 감소된 알데하이드의 양을 분석하였다. 효소 반응액으로는 50 mM Potassium phosphate buffer (pH 8.0), 1 mM의 아세트알데하이드, 측정 미생물lysate 10 μL에 효소의 Cofactor 1 mM NADP+를 각각 첨가한 후 30℃에서 반응 후 여기에 10 mM DNPH 50 μl를 첨가한 후 22 ℃에서 1 시간동안 아세트알데하이드-하이드라존 (AcH-DNPH) 라벨링을 진행하였다. 라벨링은 3 M Sodium acetate(pH 9)를 첨가함으로써 반응을 종료 시키고 2배 부피의 Acetonitrile을 첨가함으로써 아세트알데하이드-DNPH 화합물이 녹아있는 층을 분리한 후 HPLC에 주입하여 분석하였다. 라벨링된 알데하이드의 농도는 Aldehyde-DNPH(Sigma-Aldrich)의 물질표준곡선을 이용하여 분석하였으며, HPLC 분석 조건은 C18 컬럼을 사용하여 용매(Acetonitrile, water)를 1 ㎖/min 유속으로 흘려 자외선 검출기 360 ㎚ 파장에서 얻어 분석하였다. 이때 알데하이드 탈수소효소2의 1 unit은 분당 감소된 아세트알데하이드-DNPH의 농도 1mM을 1unit로 하였으며, 알데하이드 탈수소효소2의 활성은 단백질 mg 당 unit로 나타내었다.
알데하이드 탈수소효소2의 농도를 분석한 결과, 하기 도 6에서 나타낸 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지애 ems c7 균주의 NTG 처리에 의한 라이신 내성 균주의 알데하이드 탈수소효소2 생성 능력은 라이신 내성 돌연 변이주의 약 42%가 초기 모균주 와 사카로마이세스 세레비지애 ems c7(모균주보다 110% 우수) 보다 우수하게 나타났고 4 종(#4, #8,#16,#21)은 140%이상 생산능이 향상된 것으로 나타났다. 이때 알데하이드 탈수소효소 2 생성 능력이 우수한 4종의 글루타치온 함량은 #4번 돌연변이 균주는 0.9%, #8번 돌연변이 균주는 0.96%, #16번 돌연변이 균주는 0.93%, #21번 돌연변이 균주는 0.92%로 라이선 처리에 의해서도 글루타치온 생성 능력의 변화는 없었다.
상기 알데하이드 탈수소효소2 활성이 모균주에 비하여 1.4 배 이상 향상된 돌연 변이주 4 종에 대한 결과를 표 2에 나타내었다. 이를 근거로 NTG 처리에 의한 라이신 내성 돌연변이 사카로마이세스 세레비지애 #8을 알데하이드 탈수소효소2 생성능이 우수한 돌연변이 균주로 선별하였으며 사카로마이세스 세레비지애 Kwon P-1이라 명명하였다.
NTG처리에 의한 효모의 라이신 내성 돌연변이 균주의 알데하이드 탈수소효소2 활성
No. 균주명 돌연변이 처리법 ALDH2 활성 (Unit/mg-protein)
대조군 1
(Control 2)		 Saccharomyces cerevisiae WT ­ 0.10
대조군 2
(Control 1)		 Saccharomyces cerevisiae ems c7 EMS / 메틸글라이옥살 내성 0.11
실험군 4 Saccharomyces cerevisiae #4 NTG /메틸글리옥살,라이신 내성 0.15
실험군 8 Saccharomyces cerevisiae #8 NTG /메틸글리옥살, 라이신 내성 0.16
실험군 16 Saccharomyces cerevisiae #16 NTG / 메틸글리옥살,라이신 내성 0.14
실험군 21 Saccharomyces cerevisiae #21 NTG / 메틸글리옥살, 라이신 내성 0.14
글루타치온과 알데하이드 탈수소효소 2 생성능이 우수한 돌연변이의 형태 변화
상기 실시예 2-2 에서 글루타치온과 알데하이드 탈수소효소 2 생성능이 향상된 신규한 효모 돌연변이 균주를 선별하였고, 형태 변화를 관찰하기 위하여 광학현미경을 사용하여 돌연변이 균주를 관찰하였다. 돌연변이 균주 사카로마이세스 세레비지애 KownP-1의 세포 형태를 도 7에 나타내었고 야생형 균주 효모 야생형의 형태를 도 8에 나타내었다. 광학현미경 관찰 결과 돌연변이 균주 사카로마이세스 세레비지애 KwonP-1의 세포 직경이 60% 이상 증가한 결과를 확인하였고 세포내 소기관인 액포의 크기가 비대해지는 특징을 확인하였다. 이상의 실시예에서 본 특허의 사카로마이세스 세레비지애 Kwon P-1는 세포의 크기가 60% 증가하고 액포가 큰 독특한 형태적 특징은 특허 건을 침해한 도용을 방지할 수 있는 중요한 수단으로 사용할 수 있는 특정화된 형태이다.
사카로마이세스 세레비지애 Kwon P-1을 이용한 글루타치온과 알데하이드 탈수소효소 2 의 동시생산
사카로마이세스 세레비지애 Kwon P-1를 멸균된 YPD 액체배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코오스)에 접종하여 배양 온도는 30℃ 이였으며, 교반 속도는 160 rpm으로 16 시간 동안 배양한 종자배양(Seed culture)하였다. 본 배양은 멸균된 YPD 멸균액체 배지에 1% 수준으로 접종하고 종자배양과 동일한 조건으로 48시간 배양 후 배양액의 글루타치온 농도과 알데하이드 탈수소효소 2 활성을 측정하였다. 동일한 조건으로 20개의 플라스크를 사용해서 20차례 반복배양 실험을 한 결과, 표 3과 같은 균체내 글루타치온 함량과 알데하이드 탈수소효소 2 활성 결과를 얻었다. 특허 균주인 사카로마이세스 세레비지애 Kwon P-1은 글루타치온과 알데하이드 탈수소효소 2를 동시에 생산할 수 있고, 20차례 반복실험의 평균생산 값은 균체내 글루타치온 함량은 0.97% 이였으며, 알데하이드 탈수소효소 2의 활성은 0.173 Unit/mg-protein 인 것을 확인하였다. 이는 특허 균주 사카로마이세스 세레비지애 Kwon P-1 돌연변이 균주가 모균에 비하여 글루타치온 함량은 2.3배, 알데하이드 탈수소효소 2는 1.7배 생산능력이 증가함을 나타낸 결과이다.
플라스크 액체배양으로 사카로마이세스 세레비지애 Kwon P-1의 글루타치온 과 알데하이드 탈수소효소 2 동시 생산 확인
Flask No. 플라스크 배양 후 생산된 양
글루타치온 함량
(%) 		ALDH 2 활성
(Unit/mg-protein)
1 0.95 0.16
2 0.98 0.18
3 0.93 0.15
4 1.00 0.19
5 0.98 0.17
6 0.97 0.19
7 0.95 0.21
8 0.96 0.16
9 0.94 0.17
10 0.98 0.18
11 0.99 0.19
12 1.00 0.16
13 0.98 0.15
14 0.94 0.18
15 0.96 0.17
16 0.96 0.18
17 0.98 0.16
18 0.99 0.15
19 0.97 0.21
20 1.02 0.15
평균 0.972 0.173
한국생명공학연구원 KCTC13925BP 20190822 한국생명공학연구원 KCTC14122BP 20200130 한국생명공학연구원 KCTC14123BP 20200130

Claims (7)

1) 알데히드탈수소 효소와 글루타치온을 모두 생산하는 야생 효모 균주를 에틸메탄설포네이트(EMS) 또는 니트로소구아니딘(NGD)으로 처리하여 돌연변이 효모를 유도하는 제1단계,
2) 상기 제1단계에서 얻어진 돌연변이 효모 균주들로부터, 메틸글리옥살 적응력이 우수한 돌연변이 효모 균주를 선택하는 제2단계,
3) 상기 제2단계에서 선택된 메틸글리옥살 적응력을 나타내는 돌연변이 효모 균주들중에서 라이신에도 적응력을 나타내는 돌연변이 효모를 선택하는 제3단계를 포함하는 방법으로 제조되는, 사카로마이세스 세레비지에 Kwon P-1 KCTC13925BP 돌연변이 효모.
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1) 알데히드탈수소 효소와 글루타치온을 모두 생산하는 야생 효모 균주를 에틸메탄설포네이트(EMS) 또는 니트로소구아니딘(NGD)으로 처리하여 돌연변이 효모를 유도하는 제1단계,
2) 상기 제1단계에서 얻어진 돌연변이 효모 균주들로부터, 메틸글리옥살 적응력이 우수한 돌연변이 효모 균주를 선택하는 제2단계,
3) 상기 제2단계에서 선택된 메틸글리옥살 적응력을 나타내는 돌연변이 효모 균주들중에서 라이신에도 적응력을 나타내는 돌연변이 효모를 선택하는 제3단계를 포함하는, 사카로마이세스 세레비지에 Kwon P-1 KCTC13925BP 돌연변이 효모 제조 방법.
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