BR112016026286B1 - Micro-organismo com produtividade aumentada de ácido láctico e processo para produzir ácido láctico utilizando o mesmo - Google Patents

Abstract

MICRO-ORGANISMO COM PRODUTIVIDADE AUMENTADA DE ÁCIDO LÁCTICO E PROCESSO PARA PRODUZIR ÁCIDO LÁCTICO UTILIZANDO O MESMO. A presente invenção refere-se a Saccharomyces sp. capaz de produzir ácido láctico, que apresenta uma atividade diminuída da piruvato descarboxilase (PDC) e atividades aumentadas da aldeído desidrogenase (ALD) e da acetil- CoA sintetase (ACS), e a um método de produção de ácido láctico a partir do meio de cultura obtido por cultura do micro-organismo.

Description

[001] [Campo Técnico]

[002] A presente invenção refere-se a um microrganismo recombinante de Saccharomyces sp. produtor de ácido láctico e a um método para produzir ácido láctico a partir do meio de cultura que contém o microrganismo por cultura do mesmo.

[003] [Antecedentes]

[004] O ácido láctico é um ácido orgânico importante, com uma vasta gama de aplicações incluindo como aditivo alimentar, por exemplo, como conservante de alimentos, fragrância ou acidificante, etc., e tem sido muito utilizado para fins industriais, tais como cosmética, química, metais, eletrónica, tecidos, tingimento de têxteis, indústria farmacêutica, etc. Além disso, o ácido láctico é um ingrediente essencial do ácido poliláctico, um dos plásticos biodegradáveis. Por estas razões, a procura por ácido láctico tem aumentado significativamente. É também um material importante utilizado na produção de muitos compostos químicos, incluindo ácido poliláctico, acetaldeído, polipropilenoglicol, ácido acrílico, 2,3-pentationa, etc. Especificamente, o ácido láctico do tipo D é um ingrediente essencial para produzir o estereocomplexo PLA, que é um isómero ótico necessário para a produção do PLA altamente resistente ao calor.

[005] Especificamente, o método de produção de ácido láctico inclui uma síntese química convencional e um processo de fermentação biológica. Pela via da síntese química, o ácido láctico é produzido na forma de uma mistura racémica constituída por 50% de ácido láctico do tipo D e 50% de ácido láctico do tipo L, sendo no entanto difícil controlar a razão da composição. Como tal, o ácido poliláctico produzido por esta via pode tornar-se um polímero amorfo com um baixo ponto de fusão, restringindo assim o desenvolvimento da sua utilização. Por outro lado, o processo de fermentação biológica permite produzir seletivamente ácido láctico do tipo D ou ácido láctico do tipo L conforme a estirpe utilizada. Este processo é preferido comercialmente uma vez que é possível produzir uma determinada isoforma de ácido láctico.

[006] Têm-se feito tentativas para melhorar a produtividade do ácido láctico através de várias manipulações de genes, utilizando um microrganismo de Saccharomyces sp. com capacidade de produção de D-ácido láctico e introduzindo um gene de uma enzima para conversão em ácido láctico do tipo D. Especificamente, tentou-se melhorar a produtividade de ácido láctico através do reforço da atividade de ácido láctico desidrogenase (LDH) e da redução das atividades de piruvato descarboxilase (PDC), aldeído desidrogenase (ALD) e/ou acetil-CoA sintetase (ACS) (Publicações de Pedido de Patente dos EUA n.°s 2012 - 021421, 2010 - 0248233 e 2006 - 0148050). Contudo, a produtividade total da fermentação foi baixa devido ao baixo crescimento celular da estirpe produtora de ácido láctico.

[007] Consequentemente, os presentes inventores dedicaram grandes esforços à obtenção de um microrganismo com uma produtividade de ácido láctico melhorada e um crescimento celular eficiente, em simultâneo com uma atividade de PDC diminuída. Como resultado, confirmou-se que as estirpes nas quais se controlou as atividades dos isótipos da PDC e se aumentou as atividades da aldeído desidrogenase e da acetil-CoA eram capazes de aumentar a eficiência de produção do ácido láctico e facilitar o crescimento celular das estirpes, melhorando assim a produtividade global da fermentação láctica, e deram assim por concluída a presente invenção.

[008] [Divulgação]

[009] [Problema técnico]

[010] Um objetivo da presente invenção é proporcionar um microrganismo de Saccharomyces sp. com uma produtividade de ácido láctico melhorada.

[011] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para a produção de ácido láctico utilizando o microrganismo Saccharomyces sp.

[012] [Solução técnica]

[013] Num primeiro aspeto da presente invenção, para alcançar os objetivos atrás descritos, é proporcionado um microrganismo de Saccharomyces sp. com produtividade de ácido láctico melhorada, em que o microrganismo sofreu mutações de tal modo que (a) a atividade de piruvato descarboxilase é inferior à de uma estirpe não modificada produtora de ácido láctico; e (b) as atividades de aldeído desidrogenase e de acetil-CoA sintetase são melhores do que a de uma estirpe não modificada produtora de ácido láctico.

[014] Geralmente, um microrganismo de Saccharomyces sp. produtor de ácido láctico produz ácido láctico por via da ácido lático desidrogenase (LDH) usando piruvato como substrato. A via da fermentação etanólica e a via de produção de acetil-CoA, ou seja, as vias metabólicas representativas que utilizam piruvato como substrato comum, foram bloqueadas. A redução na atividade da PDC pode ser útil para produzir ácido láctico e para melhorar o seu rendimento, no entanto, quando é diminuída a partir de um certo nível, não se produz quantidade suficiente de acetil-CoA citosólica, o que por sua vez bloqueia o crescimento celular e não é alcançada fermentação normal. Em conformidade, o presente inventor desenvolveu um microrganismo de Saccharomyces sp. com produtividade aumentada de ácido láctico através da melhoria da produtividade geral da fermentação láctica, em que a taxa de crescimento do microrganismo foi mantida com um rendimento melhorado da produtividade do ácido láctico por regulação a um nível mínimo da via da acetil-CoA.

[015] O termo "piruvato descarboxilase" (PDC) aqui utilizado refere-se a uma proteína detentora de uma atividade capaz de mediar uma reação responsável pela produção de ácido carbónico e acetaldeído a partir de piruvato, mas não está limitada a qualquer seu derivado ou a um isótipo com a mesma atividade. É sabido que esta proteína está envolvida numa etapa de fermentação alcoólica, e está presente principalmente em leveduras e plantas. A piruvato descarboxilase da presente invenção pode estar intrinsecamente presente num microrganismo de Saccharomyces sp. ou pode ser PDC1, PDC5 e/ou PDC6, ou especificamente PDC1, PDC5 e/ou PDC6 de Saccharomyces cerevisiae, mas não lhes está limitada. A proteína pode incluir quaisquer variantes ou seus análogos, desde que sejam biologicamente iguais e possuam atividades correspondentes à da proteína. As sequências de aminoácidos da proteína podem ser obtidas a partir de uma base de dados conhecida, etc., por exemplo, do GenBank no NCBI, etc., sem lhes estar limitadas. Especificamente, a PDC1 pode consistir numa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, a PDC5 numa sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, e a PDC 6 numa sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73. A proteína pode incluir sequências de aminoácidos tendo uma homologia de mais de 70%, especificamente mais de 80%, mais especificamente mais de 90%, e ainda mais especificamente mais de 95%, com cada uma das sequências de aminoácidos atrás listadas. Qualquer variante das sequências atrás listadas que codifique as mesmas sequências de aminoácidos e que resulte da degeneração do código genético pode também ser incluída na presente invenção.

[016] O termo "homologia" aqui utilizado refere-se a um grau de semelhança entre uma pluralidade de sequências de nucleótidos ou sequências de aminoácidos, e é uma unidade que representa uma sequência que possui as mesmas sequências que as sequências de aminoácidos ou as sequências de nucleótidos da presente invenção, com uma probabilidade igual ou maior do que a probabilidade anterior. Essa homologia pode ser determinada comparando as duas sequências dadas a olho nu, mas é de preferência determinada utilizando um programa de comparação de sequências (que é fácil de obter), que interpreta o grau de homologia organizando as sequências para serem comparadas lado a lado. Os programas de comparação de sequências conhecidos na técnica incluem FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST e um software contendo o CLUSTAL W, etc.

[017] Foram descritos inúmeros exemplos da produção de ácido láctico quando é permitido um defeito na PDC1, a qual apresenta uma atividade importante na produção de ácido láctico (Appl Microbiol Biotechnol. 2009, 82(5):883-90). Neste caso, uma vez que a PDC6 é raramente expressa, a atividade da PDC parece ser devida à expressão do gene da PDC5. Tal como relatado, o defeito na PDC1 por si só não impede o crescimento celular de uma estirpe de tipo selvagem, e além disso pode ser mantida cerca de 60-70% da atividade da PDC em comparação com a do tipo selvagem, não se observando deste modo nenhuma alteração fenotípica significativa na estirpe (J Bacteriol. 1990, 172(2):678-685).

[018] Como alternativa, pode ser preparada uma estirpe com um duplo defeito simultâneo em ambos os genes, da PDC1 e da PDC5, os quais exibem atividade de PDC importante em leveduras. Neste caso, a fermentação láctica pode ser realizada utilizando uma fonte de açúcar, tal como glicogénio, na ausência de um cossubstrato, tal como ácido acético ou etanol. Contudo, isto resulta numa diminuição na taxa de crescimento da estirpe de levedura devido a uma diminuição rápida na atividade da PDC, reduzindo assim a produtividade da fermentação láctica (Biosci Biotechnol Biochem. 2006, 70(5):1148-1153).

[019] Por outro lado, a fim de maximizar o ácido láctico pela via da LDH, a qual concorre com a PDC pelo piruvato, pode ser preparada uma estirpe com um triplo defeito simultâneo em PDC1, PDC5 e PDC6. Neste caso, a eficiência da fermentação láctica pode ser maximizada, mas as capacidades metabólicas do etanol e do ácido acético podem ser ainda mais inibidas devido à repressão catabólica induzida na presença de glicose, reduzindo assim o crescimento celular e conduzindo eventualmente a uma diminuição na produtividade da fermentação (Curr Genet. 2003, 43(3): 139-160).

[020] Especificamente, a redução na atividade de piruvato descarboxilase (PDC) da presente invenção pode i) inativar a atividade de PDC1 e diminuir a atividade de PDC5; ou ii) diminuir a atividade de PDC1 e inativar a atividade de PDC5.

[021] Numa forma de realização exemplificativa da presente invenção, quatro estirpes diferentes, nomeadamente, uma estirpe com uma atividade de PDC5 reduzida pela substituição do promotor do gene da PDC5, uma estirpe que causou um defeito no gene t da PDC5 por recuperação da atividade de PDC1, uma estirpe que causou um duplo defeito nos genes da PDC1 e da PDC5, e uma estirpe que causou um triplo defeito nos genes da PDC1, PDC5 e PDC6, foram preparadas com base numa estirpe de Saccharomyces cerevisiae na qual a atividade de PDC1 foi inativada. Entre as estirpes assim preparadas, demonstrou-se que a estirpe com um defeito triplo nos genes raramente experimenta crescimento celular.

[022] O termo "aldeído desidrogenase (ALD)" aqui utilizado refere-se tanto a uma proteína com atividade de produção sobretudo de ácido acético a partir de acetaldeído, como a uma proteína com atividade de produção de ácido carboxílico ou de um grupo acilo pela oxidação de aldeído, mas não se limitando a um seu derivado ou a um isótipo com a mesma atividade, na presente invenção. A aldeído desidrogenase da presente invenção pode ser derivada de um microrganismo de Saccharomyces sp., ou pode ser ALD2 e/ou ALD3. Especificamente, a proteína pode ser ALD2 e/ou ALD3 de Saccharomyces cerevisiae, mas sem lhes estar limitada, e pode incluir qualquer variante ou um seu análogo desde que sejam biologicamente iguais e possuam atividades correspondentes à da proteína. As sequências de aminoácidos da proteína podem ser obtidas a partir de uma base de dados, etc., conhecida na técnica, por exemplo, do GenBank no NCBI, etc., sem lhes estar limitadas. Especificamente, a ALD2 pode consistir numa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, e a ALD3 pode consistir numa sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75. A proteína pode incluir sequências de aminoácidos tendo uma homologia de mais de 70%, especificamente mais de 80%, mais especificamente mais de 90%, e ainda mais especificamente mais de 95%, com as sequências de aminoácidos. Qualquer variante das sequências que codifique as mesmas sequências de aminoácidos e que resulte da degeneração do código genético pode também ser incluída na presente invenção.

[023] O termo “acetil-CoA sintetase (ACS)” aqui utilizado refere-se a uma proteína que possui atividade catalisadora da tioesterificação do ácido acético e CoA em conjugação com uma reação de decomposição do ATP, mas não está limitada a um derivado ou isótipo com a mesma atividade, na presente invenção. Sabe-se que a proteína está presente em microrganismos, plantas e animais, etc. A acetil-CoA sintetase da presente invenção pode ser derivada de um microrganismo de Saccharomyces sp., ou pode ser a ACS1. Especificamente, a proteína pode ser a ACS1 de Saccharomyces cerevisiae, mas sem lhes estar limitada, e pode incluir qualquer variante ou um seu análogo desde que sejam biologicamente iguais e possuam atividades correspondentes à da proteína. As sequências de aminoácidos da proteína podem ser obtidas a partir de uma base de dados conhecida, etc., por exemplo, do GenBank no NCBI, etc., sem lhe estar limitadas. Especificamente, a ACS1 pode consistir numa sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76, e pode incluir sequências de aminoácidos com uma homologia de mais de 70%, especificamente mais de 80%, mais especificamente mais de 90%, e ainda mais especificamente mais de 95%, com a sequência de aminoácidos. Qualquer proteína modificada da sequência codificante das mesmas sequências de aminoácidos, que resulte da degeneração do código genético, pode também ser incluída na presente invenção.

[024] Numa forma de realização exemplificativa da presente invenção, foram preparadas estirpes com atividades aumentadas de ALD2 e ACS, ou atividades aumentadas de ALD3 e ACS, com base na estirpe com uma atividade de PDC reduzida em comparação com a de um microrganismo não modificado. Especificamente, prepararam-se estirpes com atividades aumentadas de ALD e ACS, baseadas na estirpe com a PDC1 inativada por um defeito na PDC1 e com a atividade de PDC5 diminuída por substituição do promotor do gene da PDC5 por um promotor com baixa capacidade de expressão. Mais especificamente, prepararam-se estirpes de microrganismo de Saccharomyces sp. em que a atividade da PDC1 foi inativada, a atividade da PDC5 foi reduzida, a atividade de pelo menos uma entre ALD2 e ALD3 foi aumentada, e a atividade de ACS1 foi aumentada. Por conseguinte, confirmou-se que a taxa de crescimento das estirpes, a taxa de produção do L-ácido láctico e o seu rendimento eram significativamente melhorados.

[025] O termo "inativação" de uma atividade enzimática da presente invenção refere-se a um método para inativar atividades enzimáticas, incluindo qualquer método que iniba a expressão de uma enzima ou permita a expressão de uma enzima incapaz de exibir as suas atividades originais. O método pode incluir deleção parcial de um gene ou deleção do gene inteiro através de recombinação homóloga, inibição de uma expressão enzimática através da inserção de um gene estranho no gene em causa, inibição de uma expressão enzimática por substituição ou modificação de uma sequência promotora do gene da enzima, ou uma mutação numa enzima inativa tendo uma perda nas suas funções originais causada por uma substituição ou modificação da enzima, etc., mas não lhes está limitado.

[026] O termo "redução" aqui utilizado relativamente a uma atividade enzimática refere-se a um método para diminuir a atividade de uma enzima, que inclui qualquer método para diminuir o nível de expressão de uma enzima ou diminuir a atividade de uma enzima que está a ser expressa. O método pode incluir uma diminuição numa expressão através de uma substituição ou modificação de uma sequência promotora do gene da enzima, ou uma mutação numa enzima com atividade diminuída por uma substituição ou modificação da enzima, etc., mas não lhes está limitado.

[027] O termo "aumento" aqui utilizado relativamente a uma atividade enzimática refere-se a uma inserção de um plasmídeo contendo os genes de uma enzima, a um aumento no número de cópias de genes que codificam uma enzima num cromossoma, ou a um aumento numa atividade enzimática através de substituição ou modificação, ou de uma mutação de uma sequência promotora de um gene da enzima, etc., mas sem lhes estar limitado.

[028] O termo "microrganismo de levedura" aqui utilizado refere-se a um microrganismo pertencente a Eumycetes que prolifera por germinação, mas não é limitado a este desde que esteja envolvido em qualquer uma das vias de produção de ácido láctico, via de produção de álcool e/ou via de produção da acetil-CoA. O microrganismo de levedura pode ser classificado como Saccharomyces sp., Pichia sp., Candida sp. e Saccharomycopsis sp. consoante a forma da levedura, e especificamente o Saccharomyces sp., que inclui várias espécies, pode ser aplicado na presente invenção. Especificamente, o microrganismo pode ser selecionado do grupo constituído por Saccharomyces bayanus, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces bulderi, Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces cariocus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces dairenensis, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces martiniae, Saccharomyces monacensis, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces spencerorum, Saccharomyces turicensis, Saccharomyces unisporus, Saccharomyces uvarum, e Saccharomyces zonatus, e mais especificamente, pode ser Saccharomyces cerevisiae.

[029] A preparação do microorganismo com atividade de PDC diminuída e atividades de ALD e ACS melhoradas com base em Saccharomyces cerevisiae, um exemplo representativo de Saccharomyces sp., confirmou um aumento significativo na produção de ácido láctico.

[030] O microrganismo da presente invenção pode incluir álcool desidrogenase (ADH) que deve ser adicionalmente inativada.

[031] O termo "álcool desidrogenase” (ADH) aqui utilizado refere-se a uma proteína detentora de uma atividade catalisadora de uma reação inversa responsável pela produção de aldeído ou cetona por remoção de hidrogénio de álcool, mas não está limitada a qualquer seu derivado ou a um isótipo com a mesma atividade. A álcool desidrogenase da presente invenção pode ser derivada de Saccharomyces sp., ou pode ser a ADH1. Especificamente, a proteína pode ser a ADH1 de Saccharomyces cerevisiae, mas sem lhe estar limitada, e pode incluir qualquer variante ou um seu análogo desde que sejam biologicamente iguais e possuam atividades correspondentes à da proteína. As sequências de aminoácidos da proteína podem ser obtidas a partir de uma base de dados conhecida, etc., por exemplo, do GenBank no NCBI, etc., sem lhes estar limitadas. Especificamente, a ADH1 pode ser composta de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, e pode incluir sequências de aminoácidos tendo uma homologia de mais de 70%, especificamente mais de 80%, mais especificamente mais de 90%, e ainda mais especificamente mais de 95%, com a sequência de aminoácidos. Qualquer proteína modificada da sequência que codifica as mesmas sequências de aminoácidos e que resulta da degeneração do código genético pode também ser incluída na presente invenção.

[032] O microrganismo da presente invenção pode incluir D-ácido láctico desidrogenase (DLD), a qual deve ser adicionalmente inativada.

[033] O termo “D-ácido láctico desidrogenase” aqui utilizado refere-se a uma proteína tendo uma atividade de produção de piruvato pela anidrização do D-ácido láctico, mas não está limitado a um isótipo com a mesma atividade. A D-ácido láctico desidrogenase da presente invenção pode ser derivada de Saccharomyces sp. Especificamente, a proteína pode ser a DLD1 de Saccharomyces cerevisiae, mas sem lhe estar limitada, e pode incluir qualquer variante ou um seu análogo desde que sejam biologicamente iguais e possuam atividades correspondentes à da proteína. As sequências de aminoácidos da proteína podem ser obtidas a partir de uma base de dados conhecida, etc., por exemplo, do GenBank no NCBI, mas sem lhes estarem limitadas. Especificamente, a DLD1 pode consistir numa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, e pode incluir sequências de aminoácidos tendo uma homologia de mais de 70%, especificamente mais de 80%, mais especificamente mais de 90%, e ainda mais especificamente mais de 95%, com a sequência de aminoácidos. Qualquer variante da sequência codificante das mesmas sequências de aminoácidos, que resulte da degeneração do código genético, pode também ser incluída na presente invenção.

[034] Na presente invenção, estirpes com um defeito na ADH1, uma enzima envolvida na via de fermentação alcoólica que utiliza aldeído como substrato, o qual é adicionalmente produzido a partir de piruvato, e um defeito na DLD1, uma enzima que decompõe o ácido láctico produzido, foram utilizadas para determinar com precisão as alterações nos desempenhos das células de fermentação láctica de acordo com a regulação da via de produção de ácido acético. Numa forma de realização exemplificativa da presente invenção, as estirpes nas quais as atividades de PDC, ALD e ACS foram reguladas apresentaram um aumento significativo na produtividade da fermentação láctica. Os resultados estão resumidos na Tabela 12.

[035] Noutro aspeto, a presente invenção proporciona um método para produzir ácido láctico que utiliza o microrganismo da presente invenção.

[036] Especificamente, numa forma de realização exemplificativa da presente invenção, a presente invenção proporciona um método para produzir ácido láctico que inclui a cultura do microrganismo da presente invenção e a recolha de ácido láctico do meio de cultura que contém o microrganismo.

[037] A cultura pode ser realizada utilizando um meio apropriado e sob condições de cultura conhecidas na técnica. De acordo com as estirpes utilizadas, o processo de cultura pode ser facilmente ajustado por uma pessoa competente na especialidade. Exemplos de métodos de cultura incluem do tipo descontínuo, tipo contínuo e tipo semicontínuo, mas não lhes estão limitados. O meio utilizado no processo de cultura deve satisfazer adequadamente os requisitos de uma específica estirpe.

[038] O meio utilizado na presente invenção contém sacarose ou glicose como fonte de carbono principal, e melaços contendo uma concentração elevada de sacarose pode também ser utilizado como fonte de carbono. Outras fontes de carbono podem ser utilizadas em diversas quantidades adequadas. Como fontes de azoto podem ser utilizadas fontes orgânicas, tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de maceração de milho, soja e trigo, e fontes inorgânicas, tais como azoto elementar, sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. Estas fontes de azoto podem ser utilizadas por si só ou em combinação. Ao meio, podem ser adicionadas fontes de fósforo tais como dihidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico ou sais correspondentes contendo sódio. Além disso, o meio pode conter sais metálicos tais como sulfato de magnésio e sulfato de ferro. Além disso, o meio pode ser suplementado com aminoácidos, vitaminas e precursores apropriados. Estes meios ou precursores podem ser adicionados a culturas por um método do tipo descontínuo ou do tipo contínuo.

[039] Durante o processo de cultura, compostos tais como hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adequadamente adicionados para ajustar o pH da cultura. Além disso, pode adicionar-se um agente antiespumante, tal como éster poliglicólico de ácido gordo, para inibir a formação de espumas na cultura. Além disso, para manter a cultura numa condição aeróbica, pode injetar-se oxigénio ou gás contendo oxigénio na cultura, e para manter a cultura em condições anaeróbicas e microaeróbicas, podem ser injetados gases de azoto, hidrogénio ou dióxido de carbono na cultura sem injetar qualquer gás.

[040] A temperatura da cultura pode ser mantida entre 20 e 40 °C, especificamente entre 25 e 35 °C, e mais especificamente a 30 °C. A cultura pode ser continuada até se obter a quantidade desejada do material desejado e especificamente durante 10 a 100 horas.

[041] O ácido láctico produzido nos processos de cultura da presente invenção pode ser recolhido do meio de cultura por um método apropriado conhecido na técnica, dependendo do método de cultura, por exemplo, tipo descontínuo, tipo contínuo ou tipo semidescontínuo.

[042] [Efeitos Vantajosos]

[043] A presente invenção refere-se à utilização de um microrganismo com uma produtividade de fermentação láctica melhorada pelo controlo das atividades dos isótipos da PDC e pelo aumento das atividades de aldeído desidrogenase (ALD) e acetil-CoA sintetase (ACS). Por conseguinte, pode ser amplamente utilizado nas indústrias de produção de fermentação láctica.

[044] [Breve Descrição das Figuras]

[045] A FIG. 1 é um diagrama esquemático que ilustra a relação entre a via de produção do ácido láctico de um microrganismo de Saccharomyces sp., a via de fermentação alcoólica e a via de produção de acetil-CoA.

[046] [Melhor Modo de Realização da Invenção]

[047] Em seguida, a presente invenção será descrita em pormenor através das formas de realização exemplificativas anexas. No entanto, as formas de realização exemplificativas aqui descritas são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitativas do âmbito da presente invenção.

[048] Exemplo 1: Preparação de uma estirpe produtora de ácido láctico

[049] Para preparar estirpes produtoras de ácido láctico, Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D, uma levedura do tipo selvagem representativa obtida de EUROSCARF, foi sujeita a manipulação genética. a. Especificamente, como estirpe de base utilizou-se uma estirpe na qual a álcool desidrogenase 1 (ADH1) e a piruvato descarboxilase 1 (PDC1) eram defeituosas para minimizar a perda de piruvato para a via de síntese de álcool, e a D-ácido láctico desidrogenase 1 (DLD1) era defeituosa para bloquear a via de decomposição do ácido láctico de tipo D.

[050] A DLD1 não é um fator crucial com impacto direto na melhoria do crescimento, mas sabe-se que é uma enzima importante capaz de converter o D-ácido láctico em piruvato utilizando NAD+ como D-ácido láctico desidrogenase. Como tal, construiu-se uma subsequente estirpe baseada na estirpe com defeitos genéticos na DLD1, uma enzima que consome o ácido láctico preparado pela mesma, para comparar a produtividade da fermentação completa da levedura produtora de ácido láctico do tipo D que se pretende preparar na presente invenção. Consequentemente, comparou-se a produtividade da fermentação.

[051] Na presente invenção, recorreu-se a clonagem molecular geral para a manipulação dos genes.

[052] Em primeiro lugar, para eliminar os genes da ADH1 e da PDC1 das estirpes de levedura, realizou-se um teste de acordo com Lee TH, et al. (J. Microbiol. Biotechnol. (2006), 16 (6), 979-982), utilizando os plasmídeos pWAL100 e pWBR100. Cada inserto introduzido nos vetores plasmídicos foi preparado utilizando iniciadores adequados (correspondentes às sequências de nucleótidos de SEQ ID NOS: 1 a 8) via PCR.

[053] Além disso, para a deleção do gene da DLD1, o gene marcador HIS3 foi introduzido por sobrecruzamento duplo, tornando-o defeituoso. Os fragmentos de ADN aqui utilizados foram preparados utilizando iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos de SEQ ID NOS: 9 e 10. Os iniciadores utilizados na manipulação de genes estão resumidos na Tabela 1 a seguir.

[054] Tabela 1

[055] Iniciadores utilizados na produção da estirpe de levedura de base

[056] A D-ácido áctico desidrogenase (D-LDH) especificamente requerida para a produção de D-ácido láctico foi introduzida com base na estirpe com defeitos nos três genes, nomeadamente ADH1, PDC1 e DLD1.

[057] A D-LDH foi então clonada num vetor com sítios para enzimas de restrição de XhoI e SpeI nos terminais 5’ e 3', respetivamente, a fim de incluir 1dhD derivado de Lactobacillus plantarum (Lb. Plantarum) entre o promotor de TEF1 derivado de S. Cerevisiae e o terminador de CYC1. Especificamente, o inserto foi preparado por digestão dupla de Sac I/Pvu II, e o vetor foi clivado com extremidades cegas pela nuclease de feijão-mungo do fragmento de ADN, que foi digerido duas vezes de p-δ-neo em BamH I/Not I. Por fim, o vetor foi tratado com Sac I para se obter um vetor com uma extremidade coesiva de SacI e uma extremidade cega derivada de BamH I.

[058] A construção do vetor pTL573 foi completada pela ligação do vetor obtido com o inserto. O plasmídeo pTL573 contém o gene ldhD derivado de Lb. Plantarum e foi concebido de modo a poder incluir uma inserção aleatória de múltiplas cópias de genes no domínio parcial da sequência δ, entre o elemento retrotransponível da estirpe S.cerevisiae CEN.PK2-1D pdc1Δ adh1Δ dld1Δ. Para a inserção múltipla de um gene correspondente, foram construídos fragmentos de ADN capazes de induzir um sobrecruzamento único na sequência δ por digestão do plasmídeo pTL573 com Sal I. Ao introduzir os fragmentos de ADN numa estirpe parental através de transformação, obtiveram-se colónias múltiplas na placa de YPD (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona e 2% de glicose) a uma concentração máxima de 5 mg/ml de G418. Por fim, confirmou- se que a estirpe assim obtida, a D-LDH derivada de Lb. plantarum, tinha sido inserida de forma múltipla com o objetivo de proporcionar capacidade produtora de D-ácido láctico e foi designada estirpe CC02-0064.

[059] Exemplo 2: Preparação de estirpes mutantes com atividade PDC5 diminuída

[060] Uma estirpe mutante com o promotor da PDC5 substituído foi preparada com base na estirpe CC02-0064 preparada no Exemplo 1. Durante o processo, os processos de preparação da cassete e de seleção da estirpe foram conduzidos de acordo com o método revelado em Lee T H. et al. (Development of reusable split URA3-marked knockout vectors for budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol Biotechnol, 2006, 16:979-982).

[061] Especificamente, um total de cinco novas estirpes foram preparadas substituindo o promotor da PDC5 da estirpe CC02-0064 pelos promotores de SCO1, SCO2, ACS1, IDP2, e FBA1 respetivamente, e, subsequentemente, prepararam-se cassetes com o promotor substituído utilizando iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos de SEQ ID NOS: 11 a 36.

[062] Os iniciadores utilizados na substituição do promotor encontram-se resumidos na Tabela 2 a seguir.

[063] Tabela 2

[064] Iniciadores utilizados na preparação de estirpes de promotor substituído

[065] As novas estirpes assim preparadas foram designadas CC02-0167, CC02-0168, CC02-0169, CC02-0170 e CC02-0174, respetivamente. As correspondentes estirpes e as suas características genéticas estão resumidas a seguir na Tabela 3.

[066] Tabela 3 Estirpes modificadas no promotor da PDC5

[067] Exemplo 3: Avaliação da fermentação láctica das estirpes modificadas com atividade de PDC5 diminuída

[068] Uma avaliação da fermentação láctica foi conduzida para as estirpes modificadas no promotor da PDC5 preparadas no Exemplo 2. Para isso, preparou-se um meio específico para a avaliação da fermentação láctica.

[069] Especificamente, de modo a preparar um meio sintético complexo (meio SC), um meio limitante para levedura, misturou-se 0,67% de base azotada de levedura sem aminoácidos servindo de base com “Dropout Mix” (Sigma) de aminoácidos de acordo com o protocolo do fabricante, e adicionou-se os aminoácidos excluídos da base conforme necessário. Além disso, acrescentou- se 380 mg/l de leucina e adicionou-se uracilo, triptofano, e histidina a uma concentração de 76 mg/l, respetivamente. Adicionou-se também 8% de glicose como fonte de carbono e 1% de CaCO3 como agente de neutralização. O meio assim preparado foi utilizado para avaliar a fermentação láctica pelas estirpes de levedura.

[070] Entre as estirpes modificadas no promotor da PDC5 preparadas no Exemplo 2, as estirpes mutantes substituídas com um promotor mais fraco do que o promotor da PDC5 original não cresceram, enquanto as estirpes mutantes substituídas com um promotor mais forte apresentaram maior crescimento. Especificamente, as estirpes mutantes substituídas com os promotores de SCO1, SCO2, IDP2 ou ACS1, que são promotores mais fracos do que o promotor da PDC5, não cresceram, deixando as estirpes cujo promotor foi substituído com o promotor de FBA1 as únicas estirpes a serem avaliadas. Os resultados da avaliação da fermentação láctica pelas estirpes CC02-0064 e CC02-0174, que eram mensuráveis, estão resumidos a seguir na Tabela 4.

[071] Tabela 4

[072] Avaliação da fermentação láctica pelas estirpes modificadas no promotor da PCD5

[073] Como se pode ver pela avaliação anterior, foi confirmado que na via que promove a produção de acetil-CoA, a estirpe em que o promotor da PDC5 de tipo selvagem foi substituído com o promotor de FBA1 apresentou melhorias na taxa de crescimento celular e na produtividade de ácido láctico em comparação com a estirpe original (CC02-0064). No entanto, quando os resultados das amostras recolhidas às 24 horas e 48 horas, respetivamente, foram comparados entre si, confirmou-se que as melhorias na taxa de crescimento celular e na produtividade de ácido láctico continuavam a diminuir com o tempo como resultado de um mero reforço de uma única atividade de PDC e sem aumento das atividades de ALD e ACS, as quais estão envolvidas na subsequente via produtora de acetil-CoA. Num exemplo da presente invenção, a melhoria no consumo de glicose pelo reforço da atividade de PDC foi de 10,3%, e a concentração máxima de produção de ácido láctico foi de 47,3 g/l. Por conseguinte, a melhoria global na produtividade de ácido lático foi de 13,7%.

[074] Exemplo 4: Preparação de uma estirpe com um defeito no gene PDC5.

[075] Para além da estirpe com um defeito no gene da PDC1 e diminuição na atividade de PDC5 preparada no Exemplo 2, foi também preparada uma estirpe com um defeito no gene da PDC5 e diminuição na atividade de PDC1 para deste modo confirmar se a via PDC estava ou não atenuada na correspondente estirpe.

[076] Especificamente, com a finalidade de um defeito no gene da PDC5, utilizaram-se iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 37 a 40 a fim de preparar a cassete do defeito no gene da PDC5 baseada na estirpe CC02-0064. A estirpe defeituosa foi preparada pelo mesmo método descrito na literatura do Exemplo 1. Os iniciadores utilizados no Exemplo 4 encontram-se resumidos a seguir na Tabela 5.

[077] Tabela 5

[078] Iniciadores utilizados na preparação da estirpe com defeitos na PDC5

[079] A estirpe assim preparada com um defeito no gene da PDC5 foi designada CC02-0450 (CC02-0064, pdc5Δ).

[080] Exemplo 5: Preparação de estirpes modificadas no promotor da PDC1 baseadas na estirpe com um defeito na PDC5

[081] Uma estirpe com o promotor da PDC1 substituído foi preparada com base na estirpe CC02-0450 preparada no Exemplo 4. Para isso, uma estirpe CC02-0451 (CC02-0450, PDC1p- PDC1), em que o defeito no gene da PDC1 foi recuperado, foi preparada para servir como grupo de comparação, e uma estirpe CC02-0452 (CC02-0450, IDP1p-PDC1) com atividade PDC1 diminuída foi preparada para servir como grupo de teste.

[082] Cada estirpe foi preparada de modo que os vetores de PDC1p- PDC1- CYC1t e pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1, que foram construídos por clonagem de uma cassete do gene alvo num vetor pRS406 sem uma origem de replicação na levedura, fossem incluídos na estirpe.

[083] Especificamente, PCR foi conduzida utilizando iniciadores com sequências nucleotídicas de SEQ ID NOS: 41 e 42 com ADN cromossómico da levedura servindo como molde, para se obter deste modo um produto incluindo o gene da PDC1. Subsequentemente, uma sequência terminadora de CYC1 foi obtida usando iniciadores com sequências de nucleótidos das SEQ ID NOS: 43 e 44 Além disso, fragmentos de ADN de ligação da PDC1 ao terminador de CYC1 foram obtidos por PCR utilizando iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos das SEQ ID NOS: 41 e 44, com a PDC1 e as sequências terminadoras de CYC1, respetivamente, servindo como molde. Um vetor plasmídico de pRS406-PDC1-CYC1t foi obtido por tratamento de fragmentos de ADN do terminador PDC1-CYC1 e do vetor pRS406 com as enzimas de restrição Spe l e Xho l, seguido pela sua ligação. Por outro lado, para a introdução do domínio promotor nos vetores plasmídicos assim obtidos, vetores plasmídicos com promotores da PDC1 e promotores da IDP2 respetivamente incorporados foram obtidos por fusão de iniciadores tendo as sequências de nucleótidos das SEQ ID NOS: 45 e 46, e 47 e 48, respetivamente, por meio de PCR e utilizando ADN cromossómico como molde. Fragmentos de ADN incluindo cada promotor e plasmídeo pRS406-PDC1-CYC1t foram digeridos e ligados, para deste modo se preparar vetores plasmídicos de pRS406-PDC1p-PDC1-CYC1t e pRS406- IDP2p-PDC1-CYC1t, respetivamente, que são plasmídeos necessários para a inserção cromossómica em levedura e concebidos para que a expressão de genes seja controlada pelo promotor da PDC1 e pelo promotor da IDP2.

[084] Os iniciadores utilizados no Exemplo 5 estão resumidos na Tabela 6.

[085] Tabela 6

[086] Iniciadores utilizados na preparação das estirpes com um defeito na PDC5 e atividade da PDC1 diminuída

[087] Os dois vetores plasmídicos assim preparados foram digeridos por Stu I, respetivamente, e imediatamente inseridos nas estirpes. As estirpes finais foram designadas CC02-0451(CC02-0450, PDC1p-PDC1) e CC02-0452(CC02- 0450, IDP2p-PDC1), respetivamente. As estirpes assim preparadas e as suas características genéticas estão resumidas na Tabela 7 a seguir.

[088] Tabela 7 Estirpes com defeito na PDC5 e atividade da PDC1 diminuída

[089] Exemplo 6: Preparação de estirpes com defeitos duplos ou triplos em genes da PDC

[090] Estirpes com um único defeito no gene da PDC1, um defeito duplo nos genes da PDC1 e da PDC5, e um defeito triplo nos genes da PDC1, PDC5 e PDC6 foram preparadas a partir de genes da família da PDC. A estirpe CC020064 preparada no Exemplo 1 foi utilizada como a estirpe de um único defeito no gene da PDC1. Uma cassete para o defeito da PDC5 foi preparada utilizando iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 49 a 56, e foi inserida na CC02-0064 para se obter uma estirpe com defeitos duplos, nos genes da PDC1 e da PDC5. Posteriormente, a estirpe assim preparada foi designada CC02-0256. Além disso, uma estirpe com um defeito triplo nos genes de PDC1, PDC5 e PDC6 foi preparada baseada na estirpe com defeitos duplos nos genes de PDC1 e PDC5, utilizando iniciadores correspondentes à sequência de nucleótidos das SEQ ID NOS: 57 a 64 e foi designada CC02-0257.

[091] O processo de preparação da cassete do defeito e de seleção de estirpes foi realizado pelo mesmo método descrito na literatura descrito no Exemplo 1. Os iniciadores utilizados no Exemplo 6 encontram-se resumidos na Tabela 8.

[092] Tabela 8

[093] Iniciadores utilizados na preparação de estirpes com defeitos duplos ou triplos em genes da PDC

[094] As estirpes assim preparadas e as suas características genéticas estão resumidas na Tabela 9.

[095] Tabela 9 Estirpes com defeitos duplos ou triplos em genes da PDC

[096] Exemplo 7: Preparação de estirpes que sobre-expressam ALD e ACS1

[097] Para a preparação de estirpes que sobre-expressam ALD e ACS1, foram preparados plasmídeos sobre-expressando ALD2, ALD3 e ACS1.

[098] Especificamente, uma grelha de leitura aberta (ORF) de ALD2 foi preparada utilizando iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 65 e 66, em que uma ORF de ALD3 foi preparada utilizando iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 67 e 68, e em que uma ORF de ACS1 foi preparada utilizando iniciadores correspondentes às sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 69 e 70. Além disso, p415ADH-ALD2, p415ADH-ALD3, p414ADH-ACS1 e p416ADH-ACS1, que eram vetores recombinantes baseados nos plasmídios p414ADH, p415ADH e p416ADH, foram preparados com as enzimas de restrição SpeI, XhoI ou EcoRI. Os iniciadores utilizados no Exemplo 7 encontram-se resumidos na Tabela 10 a seguir.

[099] Tabela 10

[100] Iniciadores utilizados na preparação de estirpes que sobre-expressam ALD e ACS1

[101] Os assim preparados plasmídeos recombinantes foram introduzidos nas estirpes que incluíam CC02-0064, CC02-0168, CC02-0170, CC02-0256, CC02-0257, CC02-0451, e CC02-0452 por uma transformação de levedura por combinação p415ADH-ALD2, combinação p414ADH-ACS1, combinação p415ADH-ALD3, p414ADH-ACS1, combinação p415ADH-ALD2, p416ADH- ACS1, ou combinação p415ADH-ALD3, p416ADH-ACS1. Contudo, não foi obtido nenhum transformante no caso da estirpe CC02-0257 com defeitos triplos nos genes da PDC, na qual nenhuma atividade de PDC era exibida.

[102] As estirpes assim preparadas e as suas características genéticas estão resumidas na Tabela 11.

[103] Tabela 11 Estirpes que sobre-expressam ALD e ACS

[104] Exemplo 8: Avaliação da fermentação láctica pelas estirpes de levedura

[105] Foi realizada uma avaliação da capacidade de fermentação láctica pelas estirpes que sobre-expressam ALD e ACS1, preparadas no Exemplo 7.

[106] Especificamente, a levedura foi inoculada em cada frasco contendo 25 ml do meio preparado no Exemplo 3 para efeitos de avaliação da fermentação láctica e foi cultivada sob condições aeróbicas a 30 °C durante para 71 horas. A quantidade de ácido láctico do tipo D presente no caldo de fermentação foi analisada e uma análise enzimática (Ácido acético, R-Biopharm, Alemanha) foi conduzida para determinar a quantidade de ácido acético presente no mesmo.

[107] Os resultados do teste anterior estão resumidos na Tabela 12 a seguir.

[108] Tabela 12

[109] Avaliação da taxa de crescimento, fermentação láctica, subprodutos e rendimento de produção, etc., para as estirpes que sobre-expressam ALD e ACS

[110] Conforme se pode ver pela Tabea 12, as estirpes com atividade de PDC5 diminuída pelo promotor de IDP2 ou pelo promotor de SCO2 apresentaram uma redução drástica na acumulação do subproduto acetato, isto é, foi confirmada pouca deteção de acetato em comparação com a estirpe com atividade normal de PDC5. Neste caso, a concentração final de células das estirpes nas quais as atividades de ALD e ACS não foram aumentadas tendia a diminuir com as substituições do promotor da PDC5. Pelo contrário, as estirpes nas quais a expressão de PDC5 foi reduzida e as atividades de ALD e ACS foram aumentadas, apresentaram um aumento na concentração final de células. Como tal, confirmou-se a melhoria no crescimento celular. Especificamente, as estirpes de CC02-0277 e CC02-0278 com atividades aumentadas de ALD e ACS, preparadas com base na estirpe CC02-0170 em que o promotor da PDC5 foi substituído por IDP2, apresentaram melhoria na taxa de crescimento, concentração de L-ácido lático produzido, rendimento de produção do mesmo, e produtividade de fermentação, com o aumento nas atividades de ALD e ACS.

[111] Em resumo, a estirpe onde PDC5 foi substituída com uma expressão fraca de IDP2 teve uma redução na acumulação de acetato e a DO final era 1,3 vezes maior do que a da estirpe com expressão normal de PDC5. Além disso, foi confirmado que quando ALD e ACS eram coexpressas sob controlo do promotor de ADH1, o consumo de glicose e a velocidade do mesmo aumentavam. Por último, a percentagem de rendimento aumentou de 56% ou 59% para 66% ou 67%, respetivamente, mostrando um rendimento melhorado.

[112] Especificamente, através da comparação dos dois tipos de promotores aplicados à fraca expressão da PDC5, foi confirmado que a produtividade do ácido láctico melhorou em ambas as estirpes, com promotor de SCO2 e promotor de IDP2, respetivamente. Contudo, a estirpe com o promotor de IDP2 pode ser considerada como a forma mais otimizada de uma estirpe em termos de concentração total de células, consumo de glicose e velocidade do mesmo.

[113] Exemplo 9: Avaliação da fermentação láctica pela estirpe de levedura com defeitos duplos nos genes PDC1 e PDC5 e aumento nas atividades de ALD e ACS

[114] Uma vez que os efeitos de crescimento celular e as melhorias de rendimento resultantes da atividade de PDC5 diminuída foram claramente confirmados, uma avaliação foi feita para determinar os efeitos de um defeito adicional no gene da PDC na produção de ácido láctico. O método de avaliação para cada estirpe foi igual ao método descrito no Exemplo 8, e a cultura foi conduzida durante 74 horas.

[115] Os resultados do teste anterior estão resumidos na Tabela 13 a seguir.

[116] Tabela 13

[117] Resultados da avaliação da fermentação láctica pelas estirpes com defeitos duplos nos genes PDC1 e PDC5

[118] Como se pode ver pela Tabela 13, a concentração de acetato era claramente inferior nas estirpes com defeitos duplos nos genes da PDC1 e PDC5, no entanto, uma redução na concentração de D-ácido láctico produzido foi também observada devido à redução no crescimento celular e no consumo de glicose. Além disso, a estirpe em que a via da PDC estava praticamente inativada como resultado dos defeitos duplos nos genes PDC1 e PDC5 não apresentou melhorias no crescimento celular, no consumo de glicose, e na sua produtividade, embora a estirpe demonstrasse atividades aumentadas de ALD e ACS.

[119] Exemplo 10: Avaliação da fermentação láctica pelas estirpes com a via da PDC atenuada, utilizando sacarose

[120] Para efeitos de avaliação de uma fermentação usando sacarose, as estirpes de levedura produtoras de ácido láctico tendo a via da PDC atenuada, as mesmas estirpes avaliadas nos Exemplos 8e9, foram utilizadas para confirmar o efeito da produção de ácido láctico. Para isso, utilizou-se sacarose como fonte de carbono em vez de glicose. O método de avaliação foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 8.

[121] Os resultados experimentais assim obtidos estão resumidos na Tabela 14 a seguir.

[122] Tabela 14

[123] Resultados da avaliação da fermentação láctica pelas estirpes com defeitos duplos nos genes da PDC1 e PDC5 ou atividade de PDC5 diminuída

[124] A utilização de sacarose em vez de glicose pelas estirpes, utilizada da mesma forma que nos Exemplos 8 e 9, permitiu efeitos melhorados no crescimento e rendimento da fermentação pelo aumento das atividades de ALD e ACS nas estirpes onde a via da PDC estava atenuada, mostrando o mesmo padrão de resultados que as estirpes no Exemplo 8, onde a glicose foi empregada como fonte de carbono. Por conseguinte, a presente invenção confirma que os efeitos melhorados no rendimento da fermentação e crescimento devido à diminuição da atividade de PDC e aumento das atividades de ALD e ACS, que foram confirmados na presente invenção, não estão limitados pelo tipo de açúcar utilizado.

[125] Para resumir os resultados anteriores, foi confirmado que quando as estirpes eram modificadas de modo que a via da PDC fosse atenuada e as atividades de ALD e ACS fossem melhoradas em comparação com as das estirpes não modificadas, a produção de ácido lático aumentava enquanto a sua taxa de crescimento mantinha-se.

[126] A partir do precedente, um perito na arte à qual pertence a presente invenção será capaz de compreender que a presente invenção pode ser concretizada noutras formas específicas sem ser necessário modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente invenção. A este respeito, as formas de realização exemplificativas aqui descritas são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitativas do âmbito da presente invenção. Pelo contrário, a presente invenção destina-se a abranger não só as formas de realização exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras formas de realização que podem ser incluídas dentro do espírito e âmbito da presente invenção tal como definida pelas reivindicações anexas.

Claims (5)

1. Micro-organismo isolado de Saccharomyces cerevisiae, que possui produtividade aumentada de ácido láctico, caracterizado por o microrganismo ser modificado de tal modo que: a) i) a atividade de PDC1 é inativada e a atividade de PDC5 é reduzida, ou ii) a atividade de PDC1 é reduzida e a atividade de PDC5 é inativada em comparação com a de uma estirpe produtora de ácido láctico não modificada; e b) as atividades de aldeído desidrogenase (ALD) e da acetil-CoA sintetase (ACS) do micro-organismo são aumentadas em comparação com as da estirpe produtora de ácido láctico não modificada, em que a atividade é reduzida por substituição ou modificação de uma sequência promotora do gene da enzima, ou mutação em uma enzima com atividade reduzida causada por uma substituição ou modificação da enzima; e em que a atividade é inativada por uma deleção de gene parcial ou deleção de um gene inteiro, uma inserção de um gene derivado estranho no gene relevante, substituição ou modificação de uma sequência promotora de gene da enzima ou uma mutação em uma enzima inativa possuindo uma perda em suas funções originais causada por uma substituição ou modificação da enzima, em que a proteína PDC1 consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, em que a proteína PDC5 consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, em que a proteína ALD consiste em uma sequência de aminoácidos de NO: 74 ou SEQ ID NO: 75, e em que a proteína ACS consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.

2. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a aldeído desidrogenase ser pelo menos uma selecionada do grupo constituído por ALD2 e ALD3, e a acetil-CoA sintetase ser a ACS1.

3. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a álcool desidrogenase (ADH) ser também inativada, em que a proteína ADH consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77.

4. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a D-ácido láctico desidrogenase (DLD) ser também inativada, em que a proteína DLD consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.

5. Processo para a produção de ácido láctico, caracterizado por compreender: a) cultura do micro-organismo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 no meio de cultura; e b) recuperação do ácido láctico do meio de cultura ou do micro-organismo do passo a).