WO2007043253A1 - 酵母及びｌ-乳酸の製造方法 - Google Patents

酵母及びｌ-乳酸の製造方法 Download PDF

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WO2007043253A1
WO2007043253A1 PCT/JP2006/317446 JP2006317446W WO2007043253A1 WO 2007043253 A1 WO2007043253 A1 WO 2007043253A1 JP 2006317446 W JP2006317446 W JP 2006317446W WO 2007043253 A1 WO2007043253 A1 WO 2007043253A1
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gene
yeast
mutant
lactic acid
seq
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PCT/JP2006/317446
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hideki Sawai
Kenji Sawai
Tomonori Sonoki
Satoko Hatahira
Original Assignee
Toray Industries, Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-lactic acid. Furthermore, the present invention relates to a yeast into which a gene encoding L-lactate dehydrogenase has been introduced. The present invention also relates to a method for producing L-lactic acid, comprising culturing yeast into which a gene encoding L-lactic acid dehydrogenase has been introduced.
  • Lactic acid which is a raw material for polylactic acid, has been conventionally produced by culturing microorganisms collectively referred to as V, so-called lactic acid bacteria.
  • Lactic acid bacteria are represented by the genus Lactobacillus and the genus Lactococcus. These lactic acid bacteria are excellent in the yield of lactic acid from sugar! /, But have low resistance to acid. Therefore, in order to accumulate a large amount of lactic acid, which is an acidic substance, calcium carbonate and hydroxide Cultivation must be carried out while neutralizing with an alkali such as ammonium or sodium hydroxide.
  • Patent Document 1 JP 2001-204464 A
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-204468
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Special Publication 2001-516584
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-93060
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-259878
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-006271
  • Non-Patent Document 1 Daniguchi Porro et al .: “Biotech nol.Prog”, 11: p294—298 (1955)
  • Non-Patent Document 2 Danilo Porro et al: “Applied and Environmental Microbiology;”, 65 (9): ⁇ 42 11 -4211 (1999)
  • Non-Patent Document 3 Satoshi Saitoh et al .: "Applied and Environmental Microbiology", 71 (5): p2789-2792 (2005)
  • the present invention is a yeast into which a gene encoding an L-lactate dehydrogenase derived from human or ripe is introduced.
  • the present invention is preferably a yeast into which a gene encoding L-lactate dehydrogenase derived from human (Homo sapiens) or Xenopus 1 aevis has been introduced.
  • the present invention preferably, (1) A fermented mother introduced with a gene coding for L-lactate dehydrogenase derived from human or rival, part of the DNA sequence of the wild-type PDR13 gene is mutated by deletion, insertion or substitution A yeast having a mutant PDR13 gene comprising a DNA sequence into which a part of the protein encoded by the gene is translated,
  • the mutant alcohol dehydrogenase exhibits a temperature sensitivity in which intracellular alcohol dehydrogenase activity disappears or decreases by changing the culture temperature, or
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing an example of a method for preparing a PCR fragment for chromosomal introduction of Lldh gene used in the present invention.
  • FIG. 2 is a construction diagram of plasmid pTRS 11, which is an example of an expression plasmid used in the present invention.
  • FIG. 3 is a structural diagram of plasmid pTRS57, which is an example of an expression plasmid used in the present invention.
  • the present invention is a yeast into which a gene encoding L-lactate dehydrogenase (L-Idh gene) derived from human or ripe is introduced.
  • L-Idh gene L-lactate dehydrogenase
  • the L ldh gene is a reduced nicotinamide adenine dinucleotide.
  • L-lactate dehydrogenase used in the present invention is not particularly limited as long as it is derived from humans or rikiru.
  • the human origin is the L-ldh gene derived from Homo sapiens, and those derived from the power frog are Rhacophoridae, Ranacoae, Ranaidae, Hylaidae, Hydraidae ( Microhylidae), toad (Bufonidae), Hyperoliidae, Pelobatinae, Discoglossidae, and Pipidae L-ldh genes.
  • the L-ldh gene is preferred.
  • LdhA gene There are three known isoforms, LdhA gene, ldhB gene, and ldhC gene, which encode L lactate dehydrogenase (L ldh gene) derived from humans or L.
  • L ldh gene L lactate dehydrogenase derived from humans or L.
  • the power that can be used in any case is preferably the ldhA gene.
  • the gene encoding the human-derived L-lactic acid dehydrogenase of the present invention is preferably an L ldh gene having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the L-lactic acid dehydrogenase derived from the force L of the present invention is preferably a L ldh gene having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the gene encoding the L-lactic acid dehydrogenase derived from humans or L. of the present invention includes genetic polymorphisms and mutated genes caused by mutagenesis.
  • genetic polymorphism means that the base sequence of a gene is partially changed due to a natural mutation on the gene.
  • Mutagenesis is the artificial mutation of genes. It means introducing. Mutagenesis includes, for example, a method using a site-directed mutagenesis kit (Mutan-K (Takarabio), or a random mutagenesis kit (BD Diversify PCR R andom Mutagenesis (CLONTECH)). There is.
  • the L-ldh gene derived from human or force L used in the present invention encodes a protein having an activity of converting NADH and pyruvate into NAD + and L-lactic acid, it is included in a part of the nucleotide sequence. It does not matter if there is a deletion or insertion.
  • the yeast into which the gene encoding the L-lactic acid dehydrogenase derived from human or ripe L of the present invention preferably has a mutant gene, so that the yield to sugar can be increased. L-lactic acid can be produced.
  • the yeast into which the gene encoding L-lactate dehydrogenase (L-ldh gene) derived from human or ripe L of the present invention is preferably deleted is part of the DNA sequence of the wild type PDR13 gene.
  • the base sequence of the wild-type PDR13 gene of the present invention is preferably a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 64.
  • the mutant PDR13 gene is preferably a yeast having a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the yeast into which the gene encoding the L-lactic acid dehydrogenase derived from humans or husks of the present invention is preferably a yeast that partially produces PDR13 protein.
  • Yeasts that partially produce PDR13 protein have a mutant PDR13 gene in which a mutation occurs in the gene that codes for PDR13 protein. Examples of the mutation include a mutation in which a part of chromosomal DNA encoding the yeast PDR13 protein is deleted, and a mutation in which one or more amino acids are deleted or substituted in the amino acid sequence of the protein. .
  • a part of the chromosomal DNA encoding the PDR13 protein is deficient means that at least 39 amino acid residues on the C-terminal side in the base sequence of the chromosomal DNA. Mention may be made of mutant DNA having mutations that cannot be translated. In the amino acid sequence of the PDR13 protein, a mutation in which at least 39 amino acids on the C-terminal side are deleted is PDR1
  • Site-directed mutagenesis includes a mutagenesis method using a site-specific mutagenesis kit (Mutan-K (manufactured by Takara Bio Inc.)), but the mutagenesis method in the present invention is limited to this. It ’s not something that ’s done.
  • the yeast into which the gene (L-ldh gene) encoding the L-lactate dehydrogenase derived from human or ripe L of the present invention has been introduced is preferably the amino acid sequence of wild-type alcohol dehydrogenase.
  • the yeast into which the gene encoding the L-lactate dehydrogenase derived from humans or L. of the present invention (L-ldh gene) is preferably introduced is that the wild-type alcohol dehydrogenase has a culture temperature. It is a yeast that exhibits temperature sensitivity in which intracellular alcohol dehydrogenase activity disappears or decreases by changing.
  • alcohol dehydrogenase is a protein having an activity of converting acetoaldehyde to ethanol.
  • Yeast has multiple isomers as genes encoding alcohol dehydrogenase.
  • ADH1, ADH2, ADH3, AD H4 are the isozymes of alcohol dehydrogenase genes registered in the Saccharomyces Genome Database.
  • ADH5, ADH6, ADH7, etc. are known. Of these, it is preferable to use the ADH1 gene! /.
  • the yeast into which the gene (L-ldh gene) encoding the L-lactate dehydrogenase derived from human or ripe L of the present invention is preferably introduced is the gene encoding pyruvate decarboxylase 1.
  • a part of the nucleotide sequence of the gene encoding wild-type pyruvate decarboxylase 5 A yeast having a mutant pyruvate decarboxylase 5 gene consisting of a deletion, insertion, substitution, and Z or added nucleotide sequence.
  • the yeast into which the gene (L-ldh gene) encoding the L-lactate dehydrogenase derived from human or ripe L of the present invention has been introduced is preferably one in which the PDC1 gene has been deleted. .
  • the PDC1 gene has been deleted.
  • pyruvate decarboxylase activity is reduced compared to the wild type PDC1 gene. It is known that deletion of both the PDC1 gene and the PDC5 gene can further reduce pyruvate decarboxylase activity, but extremely poor growth in a medium containing glucose.
  • pyruvate decarboxylase activity derived from the PDC5 gene can be moderately reduced, and the metabolic pathway to yeast ethanol is controlled. It will be possible.
  • the yeast of the present invention is preferably one in which the specific activity of pyruvate decarboxylase in the yeast cell is reduced to 1/3 or less of the specific activity in the wild-type yeast cell.
  • the specific activity of pyruvate decarboxylase in yeast cells can be reduced to one-third or less of the specific activity of wild-type yeast by deleting the PDC1 gene.
  • the specific activity of pyruvate decarboxylase in yeast cells can be measured by the method described below.
  • the yeast used in the present invention is not limited as long as it is a yeast into which an L-ldh gene derived from human or L. can be introduced, but the genus Saccharomyces and the genus Schizosaccharomyces are Examples include yeast power belonging to the genus Kluyveromyces. Saccharomyces cerevisiae is preferable, and specifically, NBRC10505 strain and NBRC10506 strain are preferable.
  • the method for producing the yeast of the present invention will be described more specifically, but the method for producing the yeast of the present invention can be carried out by various methods. First, each method used to create yeast will be described.
  • Cloning of the target gene can be achieved by using the PCR (Polymerase Chain Reaction) method to amplify the necessary genetic region based on known gene information, homology or enzyme from genomic libraries or cDNA libraries. For example, a method of crawling using activity as an index. In addition, based on known protein information, Synthetic methods are also possible.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a plasmid into which the cloned target gene is inserted a plasmid generally used in yeast can be used. Plasmids that are widely used in yeast have sequences necessary for autonomous replication in yeast cells, sequences required for autonomous replication in E. coli cells, yeast selection markers, and E. coli selection markers. . In addition, it is desirable that the expression plasmid for expressing the incorporated target gene also has a so-called regulatory sequence such as an operator, a promoter, a terminator, or an enhancer that regulates the expression of the target gene.
  • sequences necessary for autonomous replication in yeast cells are, for example, the yeast independent replication origin (ARS1) and a set of centromeric sequences or the replication origin of a 2 m plasmid in yeast.
  • the sequence necessary for replication is, for example, the ColEl replication origin of E. coli.
  • yeast selection markers include auxotrophic complementary genes such as URA3, LEU2, TRP1, and HIS3, or drug resistance genes such as G418 resistance gene or neomycin resistance gene.
  • selection markers for E. coli include antibiotic resistance genes such as ampicillin resistance gene or force namycin resistance gene.
  • the regulatory sequence is not particularly limited as long as it is a sequence capable of expressing the target gene, but is known to be highly expressed in the yeast! /, Alcohol dehydrogenase (ADH), Examples include the promoter and terminator region of genes encoding triose phosphate dehydrogenase (TDH), pyruvate decarboxylase (PDC), cytochrome C1 (CYC1), and the like.
  • ADH Alcohol dehydrogenase
  • TDH triose phosphate dehydrogenase
  • PDC pyruvate decarboxylase
  • CYC1 cytochrome C1
  • the expression plasmid is not limited to these.
  • Methods for introducing DNA such as the above plasmid, expression plasmid, linearized plasmid, linearized expression plasmid, PCR fragment, etc. into yeast include transformation, transduction, transformation, co-transfusion. And, for example, a method using lithium acetate (“Journal of bacteriology”, 1983, 153 ⁇ , pl63-168) and a protoplast method ( Satoshi Harashima et al., “Molecular Cell Biology”, 1984, 4 ⁇ , p771-77 8), etc. In addition, ALKALI CATION YE AST manufactured by BIO 101 It can also be carried out using TRANSFORMATION KIT etc. Among these, in the present invention, A method using a lithium acetate method is preferable, but is not limited thereto.
  • the method of culturing transformed yeast obtained by the above-described transformation method is described in, for example, "Methods in Yeast Genetics, 1990, MD Rose et al.” Any known method can be applied.
  • the selection medium may be any medium as long as it does not contain a nutrient corresponding to the marker gene used as an indicator for introduction of the plasmid, expression plasmid, and PCR fragment.
  • a medium containing the following thread and strain Yeast nitrogen base without amino acids (DIr 1 manufactured by O Company) 0.67%, glucose 2.0%, dropout mixture from which the marker gene is removed (see above) V, the force that can be used in the medium described in “Methods in Yeast Genetics”), but is not limited to this.
  • auxotrophic marker genes such as URA3, LEU2, TRP1, HIS3 (“Methods in Enzymology”, 101 ⁇ , p.202-211, G-418) and drug metabolites (“ Gene ”, 1083, 26 ⁇ , p 243-253) is not limited to this.
  • the method of introducing the L-ldh gene derived from a human or ripe L of the present invention into yeast is, for example, by cloning an L-ldh gene derived from a human or ripe L and using an expression plasmid incorporating the clawed gene.
  • Examples include, but are not limited to, a method of transforming yeast and a method of inserting the cloned gene into a target site on a chromosome by homologous recombination.
  • a plasmid capable of expressing the gene By introducing an L-ldh gene derived from human or r. Elegans downstream of the above expression plasmid promoter, a plasmid capable of expressing the gene can be obtained. By transforming yeast with the obtained L-ldh gene expression plasmid derived from human or frog, the yeast can be introduced into L-ldh gene derived from human or frog.
  • the yeast of the present invention is preferably a yeast in which a gene encoding L-lactate dehydrogenase has been introduced in a state in which it can be expressed downstream of the pyruvate decarboxylase 1 gene promoter on the chromosome. is there.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR fragment preferably contains a yeast selection marker.
  • PCR fragment used here can be prepared, for example, by the following steps (1) to (3), steps 1 to 3.
  • Figure 1 shows the outline.
  • Step 1 A plasmid in which a terminator is connected downstream of an L-ldh gene derived from a human or a strain of L is used as a saddle, and primers 1 and 2 are used as a set. -Fragment containing ldh gene and terminator is amplified by PCR. Primer 1 is designed to add a homologous sequence of 40 bp or more upstream of the target site, and Primer 1 is designed based on a sequence derived from a plasmid downstream from Terminator 1. Preferably, the sequence homologous upstream of the target site to be added to primer 1 is a sequence homologous upstream of the PDC1 gene.
  • Step 2 A fragment containing a yeast selection marker is amplified by PCR using a plasmid having a yeast selection marker, for example, pRS424, pRS426, etc. as a saddle and using primers 3 and 4 as a set.
  • Primer 3 is designed so that 30 bp or more of the sequence homologous to the sequence downstream of the PCR fragment terminator 1 in Step 1 is added.
  • Primer 4 has a sequence of 40 bp homologous downstream of the target site. Design to add the above.
  • the sequence homologous downstream of the target site to be added to primer 4 is a sequence homologous downstream of the PDC1 gene.
  • Step 3 The PCR fragment obtained in Steps 1 and 2 is mixed into a saddle shape, and PCR is performed with primers 1 and 4 as a set, so that both ends are upstream of the target site of introduction.
  • a PCR fragment containing the human- or L-derived L-ldh gene, terminine and a yeast selectable marker, to which a homologous sequence is added on both sides is obtained.
  • the PCR fragment Is a PCR fragment containing an L-ldh gene, terminator and marker gene derived from human or r. Elegans having homologous sequences added upstream and downstream of the PDC1 gene at both ends.
  • L-lactic acid can be produced in the culture medium by culturing the yeast into which the L-ldh gene derived from human or ripe L of the present invention has been introduced.
  • L-lactic acid can be produced in the medium by the above-described transformed yeast culture method.
  • L-lactate dehydrogenase activity refers to the activity of converting pyruvate and NADH into L-lactic acid and NAD +. L-Lactate dehydrogenase activity may be compared using specific activity as an index.
  • a yeast having the same L-ldh gene introduction method and genetic background is cultured under the same conditions, and the change in absorbance at 340 nm due to the decrease in NADH is measured using a protein that has also been cultured.
  • the specific activity of L-lactate dehydrogenase is expressed by Equation 1 by defining the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of NADH per minute at room temperature as 1 unit.
  • ⁇ 340 is the decrease in absorbance at 340 nm per minute
  • 6.22 is the NADH molar extinction coefficient.
  • the creation method is
  • [1] A method for selecting a yeast having an improved lactic acid production ability from a parent strain of a genetically modified yeast library in which an insertion mutation has been made by transposon on the chromosomal DNA of yeast, [2] A method for producing a yeast deficient in a part of the gene encoding PDR13 protein using a homologous recombination method, and the like, and
  • the parent strain referred to in the above method [1] refers to the original strain subjected to the above gene mutation treatment, and even if the parent strain is a wild-type yeast, an industrially useful modified mutation is provided. Yeast, cell fusion yeast, or recombinant yeast produced using genetic recombination technology.
  • the gene mutation library of [1] is prepared by using the transposon sequence provided using the Yeast mTn Plasmid Collection (manufactured by Open Biosystems).
  • a method of constructing a gene mutation library by preparing a DNA fragment with a transposon sequence inserted by restriction enzyme treatment from the inserted genome library and then introducing the DNA fragment into chromosomal DNA by homologous recombination twice. It is done.
  • the library described above cultivated transformed yeast obtained by introducing an expression plasmid of a gene encoding a lactic acid synthase into each strain of the library. And a method for quantifying the produced lactic acid. It is considered that the more lactic acid accumulates as the culture time elapses, the more lactic acid is produced.
  • a yeast introduced with the L-ldh gene can be used as a parent strain.
  • the type of L ldh to be introduced is not particularly limited, but it is preferable to use a L-ldh gene derived from a human, L. or Ushi having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. Can do.
  • FIG. 3 shows the structure of L-Ldh expression plasmid pTRS57 derived from ushi used in the present invention.
  • FIG. 2 is a construction diagram of plasmid pTRSll used in the present invention.
  • the expression pattern of the L-ldh gene is not particularly limited as long as the gene is linked under the control of a promoter capable of expressing the gene, such as expression by introduction into a chromosome or expression by a plasmid. .
  • a promoter capable of expressing the gene such as expression by introduction into a chromosome or expression by a plasmid.
  • the multi-copy expression plasmid pTRS57 linked to pRS426 and the human L-Ldh gene linked to pTRS 11 are linked to the structure of the L-Ldh gene derived from ushi.
  • a linked multicopy expression plasmid PTRS48 may be mentioned.
  • PTRS57 was introduced into each of the strains of the library according to a conventional method to produce transformed yeast, and the amount of lactic acid produced by culturing the transformed yeast and the parent strain subjected to transformation was measured. By doing so, it is possible to select a yeast having an improved lactic acid production capacity from the parent strain.
  • the culture of the transformed yeast having PTRS57 is not particularly limited as long as it is a culture method that expresses L-lactate dehydrogenase, but can be performed by the transformed yeast culture method.
  • the concentration of lactic acid in the culture solution can be quantified by a method using HPLC.
  • the culture solution is centrifuged to prepare a culture supernatant, and the supernatant is used as an analysis sample to measure the electrical conductivity using an anion exchange column for lactic acid analysis. Measure.
  • Yeast with improved lactic acid production ability obtained by the above method includes insertion of a transposon DNA fragment into a gene encoding PDR13 protein (hereinafter sometimes abbreviated as PDR13 gene) on chromosomal DNA. Hold Saccharomyces cerevisiae with a force of 21 and a force of 21 e
  • a yeast capable of homologous recombination on a chromosome by linear DNA is used.
  • the method to be used can be mentioned.
  • the linear DNA include linear DNA in which DNA having homology with the sequence in or near the PDR13 gene is arranged at both ends of the TRP1 gene.
  • a PDR13 gene part-deficient yeast is prepared. Can do.
  • the yeast of the present invention preferably has a mutant alcohol dehydrogenase consisting of an amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of wild-type alcohol dehydrogenase is substituted, deleted, inserted and Z or added. It is a yeast, and the mutant alcohol dehydrogenase exhibits temperature sensitivity in which intracellular alcohol dehydrogenase activity disappears or decreases by changing the culture temperature.
  • the yeast of the present invention is more preferably mutated by substitution, deletion, insertion and Z or addition of one to several amino acids of some amino acids of the amino acid sequence of wild-type alcohol dehydrogenase. It has a mutant alcohol dehydrogenase that also has amino acid sequence ability.
  • substitution, deletion, insertion, and addition mutations may be any single mutation or a combination of these.
  • the mutant alcohol dehydrogenase the primary amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 is preferred, wherein the mutant form of wild-type alcohol dehydrogenase encoded by the ADH1 gene is preferred. More preferably, it is a mutant type of wild-type alcohol dehydrogenase 1 consisting of a series. In addition, in the amino acid sequence of wild-type alcohol dehydrogenase 1 shown in SEQ ID NO: 39, one to several amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added. It is also more preferable that the mutant alcohol dehydrogenase has an amino acid sequence ability.
  • a preferred mutant alcohol dehydrogenase possessed by the yeast of the present invention is a mutant alcohol dehydrogenase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or SEQ ID NO: 42.
  • the temperature sensitivity of the mutant alcohol dehydrogenase possessed by the yeast of the present invention refers to the yeast strength S having a mutant alcohol dehydrogenase and a certain culture temperature compared to yeast having a wild type alcohol dehydrogenase. Shows the same level of alcohol dehydrogenase activity, but shows a property that the alcohol dehydrogenase activity disappears or decreases when the culture temperature is changed to a specific culture temperature or higher. Yeast is susceptible to observation by observing the growth rate on a sugar-containing medium because the ability of assimilation of sugar decreases when the activity of alcohol dehydrogenase decreases in the cell, and the growth rate on a sugar-containing medium is significantly slowed down.
  • the mutant alcohol dehydrogenase exhibits temperature sensitivity at a culture temperature of 30 degrees Celsius or higher, more preferably 32 degrees Celsius or higher, and even more preferably 34 degrees Celsius or higher.
  • yeast lacking the wild type ADH1 gene is prepared. Deletion can be performed by the deletion method of the target gene.
  • the AD HI locus responsible for the main alcohol activity in cells is deleted, the ability to assimilate glucose-containing sugars is reduced, and the growth rate on a sugar-containing medium is significantly slowed.
  • yeast with the temperature-sensitive mutant ADH1 gene will not grow. Therefore, negative screening of yeast introduced with the temperature-sensitive mutant ADH1 gene becomes possible.
  • the transformant is cultured at 25 degrees Celsius, and the grown yeast is confirmed to grow on a glucose-containing medium at 30 degrees, 34 degrees, and 37 degrees Celsius, and is sensitive to each temperature.
  • the culture temperature is not limited to this.
  • Methods for producing temperature-sensitive mutant yeast include natural field screening, treatment with drugs such as nitrosoguanidine and ethylmethanesulfonate, methods using mutations such as ultraviolet irradiation, and genetic engineering using PCR reactions. There is a method.
  • mutant ADH1 gene For the introduction of the mutant ADH1 gene thus obtained, a gap repair method ("Yeast Molecular Genetics Experimental Method", Society Press Center, 1996), that is, a mutant ADH1 gene DNA fragment, and When the ADH1 gene is cloned in a self-replicating plasmid and cloned into a yeast cell at the same time, the mutant ADH1 gene DNA fragment is homologous to both ends of the deletion. It is possible to utilize the fact that homologous recombination occurs in the sex sequence, repair of the deletion is performed, and at the same time, the plasmid is closed and the autonomous replication ability is restored.
  • the mutagenesis target region DNA obtained by cleaving the plasmid cloning the ADH1 gene with an appropriate restriction enzyme is deleted. Randomly introduced into the ADH1 gene region using an appropriate primer and a fragment amplified while introducing random mutations, and simultaneously introduced into yeast lacking ADH1 A circular plasmid in which the mutant ADH1 gene into which the mutation has been introduced is cloned is obtained.
  • a plasmid used for mutagenesis by the gap repair method a plasmid generally used in the above yeast can be used.
  • a plasmid having a low copy number in yeast cells such as YCp50, pRS315, pRS316, pAUR112 or pAUR123, can be used, but is not limited thereto.
  • the ADH1 gene region to be introduced has so-called regulatory sequences such as an operator, a promoter, a terminator, and an enhancer that regulate the expression of the gene present in the upstream and downstream regions of the gene. It is preferable to include it. In this way, a temperature-sensitive mutant AD HI gene cloned in a plasmid can be prepared.
  • the plasmid obtained by cloning the temperature-sensitive mutant ADH1 gene obtained above is obtained from the transformed yeast.
  • the acquisition method is not particularly limited, and a commercially available yeast plasmid recovery kit such as YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech) can be used.
  • the activity of alcohol dehydrogenase is determined by considering the conditions of temperature and pH to be measured in consideration of the environment in which each alcohol dehydrogenase isozyme catalyzes the reaction, and the substrate affinity for ethanol under that condition. It can be evaluated by measuring. For example, the enzymatic activity of alcohol dehydrogenase encoded by the ADH1 gene of Saccharomyces cerevisiae at a culture temperature of 34 degrees Celsius is measured using a culture disruption obtained at a culture temperature of 34 degrees Celsius. Adjust the pH to 8.8 using Tris-HCl buffer and measure the substrate as ethanol in an environment where the reaction temperature is 30 degrees Celsius.
  • the activity is the wavelength that results from the reduction reaction of ethanolic nicotinamide dinutaleotide (NAD +) to reduced nicotinamide dinucleotide (NADH), which occurs simultaneously with the ethanolic reaction of ethanol with acetaldehyde. It can be evaluated by observing the absorbance change at 340 nm.
  • the specific activity of alcohol dehydrogenase can be expressed by equation (2) by defining the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of NADH per minute at room temperature as 1 unit.
  • ⁇ 340 ⁇ is the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm per minute
  • 6.22 is the NADH molecular extinction coefficient of NADH at an optical path length of 1 cm.
  • Alcohol dehydrogenase activity was measured under the same conditions for the disrupted solution of mutant yeast cells and wild-type yeast cells of the present invention cultured at each culture temperature, and the ratio of alcohol dehydrogenase calculated was calculated. By comparing the activities, the temperature sensitivity of the mutant alcohol dehydrogenase at the culture temperature can be evaluated.
  • a yeast into which a gene (L-ldh gene) encoding an L-lactate dehydrogenase derived from human or r. Elegans has been introduced, comprising wild-type alcohol dehydrogenase A mutant alcohol dehydrogenase comprising a part of the amino acid sequence of the amino acid sequence substituted, deleted, inserted and Z or added, and the mutant alcohol dehydrogenase It is possible to produce yeast showing temperature sensitivity in which intracellular alcohol dehydrogenase activity disappears or decreases by changing the culture temperature.
  • Yeast pyruvate decarboxylase-encoding genes include a gene encoding pyruvate decarboxylase 1 (PDC1 gene) and a gene encoding pyruvate decarboxylase 5 (PDC5 gene). And three types of genes encoding pyruvate decarboxylase 6 (PDC 6 gene) are known. Among these, genes having a main function as pyruvate decarboxylase are PDC1 gene and PDC5 gene.
  • the yeast of the present invention is preferably a variant in which the PDC1 gene is deleted and a part of the base sequence of the wild-type PDC5 gene is deleted, inserted, substituted, and also has a Z or added base sequence ability. It has PDC5 gene.
  • the partial base deletion, insertion, substitution, and Z or addition mutation may be any single mutation or a combination thereof.
  • the yeast of the present invention is a gene in which the base sequence of the gene encoding wild-type pyruvate decarboxylase 5 consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 51.
  • the mutant PDC5 gene possessed by the yeast of the present invention is preferably a mutant of the wild-type PDC5 gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 51.
  • the gene encoding mutant pyruvate decarboxylase 5 is a gene having the nucleotide sequence shown in either SEQ ID NO: 52 or 53.
  • the mutant pyruvate decarboxylase 5 possessed by the yeast of the present invention is preferably temperature sensitive.
  • the temperature sensitivity of pyruvate decarboxylase 5 is similar to that of yeast with mutant pyruvate decarboxylase 5 at a certain culture temperature compared to yeast with wild type pyruvate decarboxylase 5. It exhibits pyruvate decarboxylase activity, but it has the property that pyruvate decarboxylase 5 disappears or decreases when the culture temperature is changed to a specific culture temperature or higher! ⁇ ⁇ .
  • mutant pyruvate decarboxylase 5 is a yeast that exhibits temperature sensitivity at 34 degrees Celsius or higher. [0091] Mutation is introduced into the PDC5 gene by modifying the DNA sequence of the PDC5 gene by a commonly used method.
  • the yeast with reduced enzyme activity can also be obtained by the method of preparing the ADH1 gene or a mutant having temperature sensitivity from these mutant strains.
  • Yeast in which pyruvate decarboxylase activity is not detected is significantly slowed down when glucose is the only carbon source. Utilizing this property, when pyruvate decarboxylase yeast with reduced enzyme activity is produced, pyruvate decarboxylase activity remains under non-restricted temperature conditions, and therefore exhibits growth ability comparable to that of wild-type yeast.
  • a mutant PDC5 gene having a desired drought temperature sensitivity can be obtained by preparing a mutant strain in which the growth ability is remarkably reduced by reducing the enzyme activity under the restriction temperature condition.
  • the method for producing A pdcl A pdc5 double-deletion yeast can be carried out by the above-described method for deleting a target gene, but is not limited thereto. If the yeast belongs to the genus Saccharomyces, the Apdcl single deletion strain and the A pdc5 single deletion strain are prepared using the method of deletion of the target gene, and a tetramolecular separation method from these diploids. A pdcl A pdc5 double deletion yeast can also be prepared by
  • a mutant PDC5 gene can be obtained by a method using a random mutation introduction kit BD Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (CLONTECH).
  • the mutant PDC5 gene thus obtained can be introduced by using the same gap repair method as described above ("Yeast Molecular Genetics Experimental Method", Academic Publishing Center, 1996). .
  • a mutant PDC5 gene DNA fragment and a plasmid capable of autonomous replication that clones the PDC5 gene, deleted and linearized in the PDC5 gene are simultaneously introduced into the A pdcl A pdc5 double deletion yeast.
  • a circular plasmid in which a mutant PDC5 gene having a random mutation introduced into the target region for mutagenesis is cloned is obtained.
  • a pdcl-modified pdc5 yeast having a mutant PCD5 gene and lacking the PDC1 gene will be described.
  • the plasmid obtained by cloning the mutant PDC5 gene obtained above is obtained from the transformed yeast.
  • the acquisition method is not particularly limited, but a commercially available yeast plasmid recovery kit such as YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech) can be used.
  • the PDC5 gene sequence of the obtained plasmid was deleted and linearized with a restriction enzyme that does not cut, and was prepared as described above.
  • ⁇ pdcl ⁇ pdc5 The target ⁇ pdcl modified pdc5 yeast can be obtained by transforming the double deletion yeast.
  • the specific activity of pyruvate decarboxylase was measured on the crushed material obtained by culturing each transformed cell obtained by the gap repair method, It can be selected as an indicator that it is changed compared to yeast having type PDC5 gene.
  • Selection of a transformed yeast cell having a mutant PDC5 gene having a reduced specific activity of pyruvate decarboxylase compared to a yeast having a wild-type PDC5 gene is carried out by selecting the pyruvin of a yeast having a mutant PDC5 gene. This can be performed by measuring the specific activity of acid decarboxylase and selecting cells having a decreased specific enzyme activity compared to yeast having the wild type PDC5 gene. Alternatively, a more preferable yeast can be selected by selecting a transformed yeast in which the mutant PDC5 gene exhibits temperature sensitivity.
  • Transformation of the plasmid obtained by cloning the mutant PDC5 gene obtained above Obtain from yeast.
  • the acquisition method is not particularly limited, and a commercially available yeast plasmid recovery kit such as YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech) can be used.
  • the PDC5 locus Recombination occurs in the homologous region between the DNA sequence adjacent to the DNA sequence of the linear plasmid and the marker gene used when PDC5 is deleted is replaced with the mutant PDC5 gene, and the target A pdcl modified P dc5 yeast can be obtained.
  • This can be done by applying the “pop-in-Zpop-out method” (described in “Methods in Enzymology”, 1987, 154, p. 164–174).
  • pyruvate decarboxylase activity in yeast cells can be compared using specific activity as an index. That is, the protein extracted from the yeast force cultured under the same conditions is used to measure the change in absorbance at a wavelength of 340 nm accompanying the decrease in NADH using the extract. At that time, the amount of enzyme that reduces 1 / z mol of NADH per minute at 30 ° C By defining the unit (Unit), the specific activity of pyruvate decarboxylase can be expressed by the following Equation 3. Where ⁇ is the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm per minute, 6.2
  • 2 is the molar molecular extinction coefficient of NADH at an optical path length of 1 cm. Measurement can be performed under the same conditions, and the enzyme activity can be compared based on the calculated specific activity of pyruvate decarboxylase.
  • Enzyme solution concentration (mg / ml)
  • Enzyme solution volume (ml)
  • X Optical path length (cm)
  • yeast into which a gene encoding L-lactate dehydrogenase derived from human or Xenopus laevis has been introduced, and a gene encoding pyruvate decarboxylase 1 And a part of the base sequence of the gene encoding wild type pyruvate decarboxylase 5 is deleted, inserted, substituted, and mutated pyruvate decarboxylase 5 gene consisting of a base sequence added or Can be produced.
  • the present invention is a yeast into which a gene encoding an L-lactate dehydrogenase derived from humans or r. Elegans has been introduced. At least any one of the following features (1) to (3): Also included are yeasts with more than one characteristic.
  • a fermented mother introduced with a gene encoding L-lactate dehydrogenase derived from human or R. elegans, wherein a part of the DNA sequence of the wild-type PDR13 gene is deleted, inserted or substituted
  • a yeast having a mutant PDR13 gene comprising a DNA sequence that is mutated and a part of the protein encoded by the gene is translated;
  • a yeast exhibiting temperature sensitivity at which the alcohol dehydrogenase activity in the cell disappears or decreases by changing the culture temperature
  • it can be prepared by using a yeast having one mutant gene as a parent strain and using the method for producing a yeast having another mutant gene disclosed above. More specifically, for example, when preparing a yeast having a mutant PDR13 and a mutant ADH1 gene, if a yeast having a mutant PDR13 gene is used as a parent strain and a yeast having a mutant ADH1 gene is prepared, the mutant Yeast having both type PDR13 and mutant ADH1 gene can be produced. Other combinations of mutant genes can be prepared in the same manner.
  • the yeast belongs to the genus Saccharomyces, it can also be prepared by a tetramolecular separation method from a diploid obtained by joining yeasts having each mutant gene. Specifically, for example, when preparing a yeast having a mutant PDR13 and a mutant ADH1 gene, a tetrad is separated from a diploid obtained by joining a yeast having a mutant PDR13 and a yeast having a mutant ADH1 gene. By the method, yeast having both mutant PDR13 and mutant ADH1 genes can be produced. Other combinations of mutant genes can be similarly prepared.
  • the present invention provides a more efficient method for producing L-lactic acid.
  • the method for producing L-lactic acid of the present invention may comprise culturing a yeast into which a gene (L-ldh gene) encoding the L-lactic acid dehydrogenase derived from human or ripe L of the present invention has been introduced. Prefer U ,.
  • the medium for culturing yeast contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the yeast.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • saccharides such as glucose, fructose and sucrose may be used as long as the yeast can assimilate, carbohydrates such as molasses, starch or starch hydrolyzate containing these saccharides may be used. it can.
  • Carbon sources are added together at the start of culture. Caro may be added, or divided or added continuously during cultivation, and is used at a concentration of lOg / l to 200 gZl.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and other ammonium or inorganic acid salts, peptone, meat extract, yeast extract, For example, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermentation cell digests, and the like can be used.
  • magnesium phosphate magnesium sulfate, sodium chloride salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. are used. be able to.
  • the culture can be carried out by shaking culture or stirring culture.
  • the oxygen supply conditions are not particularly limited, but can be performed under aerobic conditions or microaerobic conditions.
  • the culture temperature is usually 25 to 35 degrees Celsius, and the culture time is usually 24 hours to 5 days. It is desirable to maintain the pH of the culture medium during the culture at 2.5 to 5.0. This pH can be adjusted using an alkaline solution, ammonia, calcium carbonate, or the like.
  • the yeast of the present invention is pre-cultured, and the pre-culture solution is transferred to a new medium to perform main culture, thereby producing L-lactic acid in the culture solution.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the growth of the strain is not substantially inhibited and lactic acid can be produced, but is preferably a temperature in the range of 20 to 40 degrees Celsius, more preferably The temperature is in the range of 25 to 37 degrees, more preferably 30 to 34 degrees Celsius. Any method of standing, stirring or shaking can be employed for the culture.
  • lactic acid By culturing under the above conditions, 1-20% lactic acid can be obtained in the medium.
  • the method for measuring the obtained L-lactic acid is not particularly limited, and examples thereof include a method using HPLC and a method using an F-kit (Roche).
  • Lactic acid in the obtained culture broth can be purified by a method known in the art.
  • a fermentation solution obtained by centrifuging microorganisms is adjusted to pH 1 or less and extracted with potassium jetyl ether or ethyl acetate, a method of adsorbing, washing and elution on an ion exchange resin, and an alcohol in the presence of an acid catalyst.
  • a conventional ushi-derived L-lactate dehydrogenase is encoded by culturing a yeast introduced with a gene encoding L-lactate dehydrogenase derived from human or ripe L.
  • L-lactic acid can be produced at a higher sugar yield than culturing yeast into which the gene to be introduced has been introduced.
  • PCR methods include KOD-Plus polymerase (Toyobo) or LA
  • the L ldh gene having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as the human-derived L ldh gene
  • the Xenopus having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is used as the L ldh gene derived from Toru L. 'Lldh gene from Levis (Xenopus laevis) was used.
  • Cloning of the L-ldh gene derived from humans or R. cerevisiae was performed by PCR.
  • a human breast cancer cell line-derived cDNA was used as a PCR type to obtain a human L-ldh gene.
  • the human breast cancer cell line cDNA was prepared by culturing and collecting the human breast cancer cell line (MCF-7), then extracting the total RNA using TRIZOL Reagent (Invitrogen). CDNA was synthesized by reverse transcription using Superscript Choice System (Invitrogen) as a mold. Details of these operations followed the attached protocol. As a type of PCR that obtains the L ldh gene derived from Rhizopus, Xenopus laevis kidney cDNA library (manufactured by STRATAGENE) More prepared phagemid DNA was used. The phagemid DNA was prepared according to the attached protocol.
  • the human-derived L ldh gene amplification primer (SEQ ID NOs: 4 and 5) was prepared such that an Xhol recognition sequence was added to the 5 terminus and a Notl recognition sequence was added to the 3 terminus.
  • the L ldh gene amplification primer (SEQ ID NOs: 6 and 7) derived from Toru L was prepared such that a Sa II recognition sequence was added to the 5 terminal side and a Notl recognition sequence was added to the 3 terminal side, respectively.
  • the PCR-amplified fragment was purified, the end was phosphorylated with T4 polynucleotide Kinase (Takara Bio Inc.), and then ligated to PUC118 plasmid (cut with restriction enzyme Hindi and the cut surface was dephosphorylated). Ligation was performed using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takarano). A ligation solution was used to transform E. coli DH5a competent cells (Takarabio Co., Ltd.), and the cells were plated on an LB plate containing 50 ⁇ g ZmL of antibiotic ampicillin.
  • plasmid DNA was recovered and cut with the restriction enzymes Xhol and Notl or Sail and Notl, and a plasmid into which the L-1 dh gene derived from human or ripe was inserted was selected. All of these series of operations were performed according to the attached protocol.
  • an expression plasmid into which the L-Idh gene derived from human or L. was inserted was selected.
  • the expression plasmid incorporating the human-derived L ldh gene prepared in this manner is referred to as pTRS48
  • the expression plasmid incorporating the L ldh gene derived from L. is referred to as pTRS102.
  • a yeast into which a ushi-derived L ldh gene was introduced was prepared.
  • L ldh gene (SEQ ID NO: 3) derived from ushi was performed by PCR.
  • a protocol library provided with a cDNA library (manufactured by STRATAGENE) derived from ushi skeletal muscle is used.
  • the phagemid DNA prepared according to the procedure described above was used as a cage, and the same procedure as in Example 1 was performed.
  • the gene amplification primers (SEQ ID NOs: 8 and 9) were prepared such that an Xhol recognition sequence was added to the 5 terminus and a Notl recognition sequence was added to the 3 terminus.
  • an expression plasmid into which the ushi-derived L ldh gene was inserted was prepared in the same manner as the expression plasmid into which the human-derived L ldh gene was inserted in Example 1.
  • the expression plasmid incorporating the ushi-derived L-ldh gene prepared in this manner is referred to as pTRS49.
  • a strain in which the PDC 1 gene present on the genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae NBRC 10505 strain was replaced with the TRP1 gene (hereinafter abbreviated as A pdcl strain) was produced using the homologous recombination method.
  • a pdcl strain was prepared as follows. Plasmid P RS424 to ⁇ , PCR by 'sequence shown in SEQ ID NO: 12 upstream, 3' 5 TRP1 gene using also DNA sequences forces represented by SEQ ID NO: 10 and 11 as a primer set distribution downstream A DNA fragment to which the sequence shown in column number 13 was added was amplified. The amplified DNA fragment was purified, and 1 ⁇ g of the DNA was used to transform the NBRC10505 strain to a tributophane non-requirement. The transformant obtained is designated as SW029 strain.
  • Example 3 Introduction of Lldh gene expression plasmid derived from human or r. Elegans into yeast
  • the SW029 strain was transformed non-uracil-requiringly. did.
  • Confirmation of introduction of L-ldh gene expression plasmids derived from humans or frogs into the transformants obtained in this way was performed by extracting the genomes of the transformants and using them as PCR. .
  • the primers used for confirmation were the primers used when cloning each L-ldh gene (human-derived L-ldh gene: SEQ ID NO: 4, 5; 7) was used.
  • PTRS48 or pTRS102 obtained in Example 1 was used as an amplification cage, and oligonucleotides (human-derived L ldh gene: SEQ ID NOs: 14, 16 and L-el-derived L ldh gene: SEQ ID NOs: 15, 16) were used as a primer set.
  • oligonucleotides human-derived L ldh gene: SEQ ID NOs: 14, 16 and L-el-derived L ldh gene: SEQ ID NOs: 15, 16
  • Each DNA fragment was purified, and a mixture of the obtained 1.3-kb fragment containing the L-ldh gene and the 1.2-kb fragment containing the TRP1 gene was used as an amplification cage, and the oligonucleotide (human L-ldh gene, GAPDH terminator derived from human or r. Elegans by PCR using L ldh gene derived from SEQ ID NO: 14, 19 and L ldh gene derived from R. l .: SEQ ID NO. 15, 19) as a primer set. A DNA fragment of about 2.5 kb to which one and TRP1 genes were linked was amplified (corresponding to step 3 in Fig. 1).
  • NBRC10505 strain was transformed with the purified DNA fragment of about 2.5 kb and cultured in a medium without tributophan, so that the L ldh gene derived from human or r. A transformant introduced downstream of the PDC1 gene promoter was selected.
  • Transformation obtained as described above 3 ⁇ 4 force L-ldh gene derived from human or force L Confirmation of the yeast introduced downstream of the PDC1 gene promoter on the chromosome was performed as follows. First, the genome of the transformant was extracted and used as an amplified cocoon-shaped oligonucleotide (human L-ldh gene: SEQ ID NO: 14, 21, L-Ldh gene derived from T. L: SEQ ID NO: 15). , 21) was confirmed by PCR to obtain an amplified DNA fragment of approximately 2.8 kb. In the case of non-transformation, an amplified DNA fragment of about 2.1 kb can be obtained by the above PCR.
  • L5 strain is a transformed strain in which the human-derived L ldh gene is introduced downstream of the PDC1 gene promoter on the chromosome, and L ldh gene from L. is derived from the downstream of the PDC1 gene promoter on the chromosome.
  • the conversion will be B2 stock.
  • SW029ZPTRS48 strain SW029 / pTRS 102 strain and SW029ZPTRS49 strain obtained as in Example 3 and Comparative Example 2, L-lactic acid productivity test was performed.
  • lactic acid fermentation medium (hereinafter referred to as lactic acid fermentation medium) with the composition shown in Table 1. Remove uracil and remove the medium lOrn in a test tube, where there are small amounts of the SW029 / pTRS48 and SW029 / pTRS102 strains. And SW029ZPTRS49 strain were inoculated and cultured at 30 ° C (pre-culture). Next, lOOmL of fresh lactic acid fermentation medium excluding uracil was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, and each of the previous cultures was inoculated in total, and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours (preculture).
  • Reaction solution 5 mM p Toluenesulfonic acid, 20 mM Bistris, 0. ImM EDTA-2Na (flow rate 0.8 mL / min
  • Glucose Test ⁇ C (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • Table 2 shows the calculated yield of L-lactic acid versus sugar.
  • Example 5 Using the L5 and B2 strains obtained as in Example 4, the same method as in Example 5
  • the culture solution for 30 hours after the start of the main culture was centrifuged, the resulting supernatant was filtered through a membrane, and the amount of L-lactic acid was measured by HPLC under the same conditions as in Example 5.
  • Table 3 shows the yield of lactic acid based on sugar calculated from the measurement results.
  • the L ldh gene expression plasmid was obtained by culturing yeast in which the L ldh gene derived from human or r. Elegans was introduced downstream of the PD C 1 gene promoter on the chromosome. L-lactic acid could be produced at a sugar yield equivalent to or higher than that of culturing the introduced yeast.
  • LLdh enzyme solution L-lactic acid dehydrase enzyme solution
  • the concentration of the L Ldh enzyme solution obtained in (a) was determined using the BCA Protein Assay Kit (manufactured by PIER CE) based on a calibration curve prepared using ushi IgG (l. 38 mgZmL, BIO—RAD) as a standard. And diluted with sterile water so that each L Ldh enzyme solution was 0.5 mgZmL. Next, the 6-level mixture (excluding L Ldh enzyme solution and NADH) in the ratio shown in Table 4 was dispensed into a semi-micro cuvette, and the L-Ldh enzyme solution and NADH were mixed and mixed just before starting the measurement. .
  • 2xBR buffer is a buffer buffer prepared by adjusting 0.08M acetic acid, phosphoric acid, and boric acid solutions to pH 5, 6, and 7 with 5N NaOH.
  • yeast introduced with a gene encoding L-lactate dehydrogenase having a higher L-lactate dehydrogenase activity at pH 5-7 than L-derived L-lactate dehydrogenase activity.
  • L-lactic acid can be produced at a higher sugar yield than cultivating yeast introduced with the L ldh gene derived from ushi.
  • pdcl ⁇ strain A recombination strain (hereinafter abbreviated as pdcl ⁇ strain) was produced using homologous recombination.
  • the pdcl ⁇ ⁇ strain was produced as follows.
  • NBRC10505 strain DNA is represented by SEQ ID NO: 26 containing about 500 base pairs 5 'upstream of the PDC1 gene by PCR using a primer set that also has the base sequence ability represented by SEQ ID NOS: 24 and 25.
  • a DNA fragment consisting of the base sequence was amplified.
  • PCR using a primer set with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 27 and 28 was used to amplify a DNA fragment with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 containing 500 base pairs 3 ′ downstream of the PDC1 gene. did.
  • the amplified DNA fragment is purified, two equal amounts of the two DNA fragments are mixed, the mixture is used as a bowl, and PCR is performed using a primer set consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 24 and 28.
  • a DNA fragment consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 30 in which 5 ′ upstream 500 base pairs and 3 ′ downstream 500 base pairs of the PDC1 gene were linked was amplified.
  • the amplified DNA fragment was purified, the DNA was treated with the restriction enzyme Kpnl, and the resulting DNA fragment was ligated to the plasmid pRS416 (hereinafter abbreviated as ⁇ del -pRS416).
  • the pdc1-pRS416 plasmid DNA was deleted with the restriction enzyme EcoRV, and the NBRC10505 strain was transformed into uracil non-requirement using the DNA fragment lOOng.
  • the obtained transformant was applied to a medium supplemented with lgZL 5-fluororotinic acid, and a primer set consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 31 and 32 was obtained using the grown transformant genomic DNA as a saddle type. PCR was performed and strains lacking the PDC1 gene were selected.
  • PTRS57 is a multi-copy expression plasmid introduced into PRS424 with a structure in which Lushi-derived L-ldh gene is linked under the control of the ADH1 promoter.
  • Figure 3 shows the structure.
  • Example 9 Screening of L-lactic acid-producing ability-enhancing yeast strains using lactic acid production as an index
  • the recombinant strain prepared in Example 8 was used overnight at a temperature of 30 ° C using SC-Ura medium. Cultured with shaking. 10 ml of the culture solution was inoculated into 1 ml of SC-Ura medium and cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. After 40 hours from the start of the culture, the culture solution was centrifuged, and the lactic acid concentration in the supernatant was measured. For quantification of lactic acid, F-kit (L-lactic acid) manufactured by Ci'K International was used.
  • the pdrl3 :: mTn strain obtained in Example 9 had a transposon sequence inserted between the 1599th and 1560th bases from the start codon of the PDR13 gene on the genomic DNA.
  • PCR was performed using the plasmid PRS424 as a saddle and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 33 and 34 as a primer set, 5 'upstream of the TRP1 gene.
  • the DNA fragment added with the sequence shown in SEQ ID NO: 35 and the sequence shown in SEQ ID NO: 36 3 ′ downstream was amplified.
  • the PCR-amplified fragment was purified, and the DNAlO / zg was used to transform the pdcl ⁇ strain into the tributophane non-requirement.
  • the resulting transformant is designated as pdrl3-1599 strain.
  • the PTRS48 obtained in Example 1 was used to transform the pdrl3-1599 strain so that it did not require uracil.
  • the obtained transformant is designated as pdrl3-1599ZPTRS48 strain.
  • the prepared recombinant strain, pdrl3-1599ZpTRS48 was cultured with shaking in a 10 ml SC-Ura medium at a temperature of 30 ° C. 100 ⁇ l of the culture was inoculated into 10 ml of SC-Ura medium and cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. At 16 hours, 24 hours and 40 hours after the start of the culture, 1 ml of the culture solution was sampled, the culture solution was centrifuged, and the lactate concentration of the supernatant was measured. For determination of lactic acid F-kit (L-lactic acid) Ci'K International ) was used. The results are shown in Table 7.
  • a mutant pdr 13-100 strain in which the region from 1560 bases to 1716 bases of the PDR13 gene was deleted was produced, and lactic acid productivity was measured.
  • the pdcl A 0ZPTRS48 strain and the pdrl3-159 9ZPTRS48 strain were cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. using 10 ml of SC-Ura liquid medium.
  • the culture solution 100 1 was inoculated into 10 ml of a new SC-Ura liquid medium, and lml was sampled at 16 hours, 24 hours and 40 hours after the start of culture, and the amount of lactic acid produced was determined by the HPLC method described in Example 5. Quantified with.
  • the above region-deficient strain was prepared as follows. Using the plasmid pRS424 as a saddle and using the DNA with the nucleotide sequence shown by SEQ ID NOs: 33 and 37 as a primer set, the sequence shown as SEQ ID NO: 35 5 ′ upstream of the TRP1 gene and the sequence 3 ′ downstream A DNA fragment to which the sequence indicated by No. 38 was added was amplified. The PCR amplified fragment was purified, and 1 ⁇ g of the DNA was used to transform the pdcl ⁇ pd strain into a tributophane non-requirement. The obtained transformation is pdr 13-100. Next, pTRS48 was used to transform the pdrl3-100 strain non-uracilly. The resulting transformation ⁇ tt was pdrl3-100ZPTRS48 Shares.
  • the prepared recombinant strain, pdrl3-100ZpTRS48 was cultured with shaking in a 10 ml SC-Ura medium at a temperature of 30 ° C for 24 hours.
  • 10 ml of the culture solution was inoculated into 100 ml of SC-Ura medium and cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. for 24 hours.
  • 100 ml of the culture broth was inoculated into 2.0 L of SC-Ura medium and cultured at 30 ° C. using a mini jar amentor to quantify the amount of L-lactic acid produced. This culture was performed under the following conditions.
  • Fermenter Bioneer—N (manufactured by Maruhishi Biotechnology)
  • a yeast in which the ADH1 gene present on the genomic DNA of the NBRC10505 strain was replaced with the URA3 gene was produced using homologous recombination.
  • a DNA fragment to which the sequence shown in SEQ ID NO: 46 was added downstream was amplified.
  • the amplified DNA fragment was purified, and 1 ⁇ g of the DNA was used to transform the NBRC10505 strain into uracil non-requirement.
  • the obtained transformant is designated as A adhl strain.
  • a DNA fragment containing the genomic DNA of NBRC10505 strain as a saddle and containing 700 bp upstream of ADH1 gene, ADH1 structural gene, and 200 bp downstream using the primers shown in SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48 was amplified.
  • the gene amplification primers (SEQ ID NOs: 47 and 48) were prepared such that a Sacl recognition sequence was added to the 5 terminal side and a Smal recognition sequence was added to the 3 terminal side, respectively.
  • the amplified fragment was ligated with the HincII, BAP-treated fragment of pUCl18.
  • the intended plasmid pUC118-ADH1 was obtained according to a conventional method.
  • pUC118-ADH1 was cleaved with the restriction enzyme SaclZSmal, and the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis. An approximately 2 kb fragment was excised, and the excised gel force was also used for DNA fragment extraction. The extracted DNA fragment was inserted into pRS316 by ligation reaction to obtain the desired plasmid pRS316-ADH1.
  • pRS316-ADH1 was cleaved with restriction enzymes Ball and PflFI, and the ADH1 structural gene was deleted.
  • a circular plasmid was made. Perform agarose electrophoresis of the restriction enzyme reaction solution to cut out a fragment of approximately 7 kb, and extract the DNA fragment using the cut gel force. It was. Furthermore, ethanol precipitation was performed according to a conventional method.
  • a mutation-introduced ADH1 gene fragment for introducing a mutation by the gap repair method was prepared.
  • the fragments were prepared using the primers shown in SEQ ID NOs: 49 and 50 and a random mutation introduction kit BD Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (CLONTECH). The details followed the attached instructions.
  • the obtained fragment was subjected to ethanol precipitation according to a conventional method and concentrated to 200 ngZ1.
  • a ad hi strain was transformed into uracil non-requiring using 500 ng of the obtained open-circulation plasmid and lmg of the mutated ADH1 gene fragment. Since the A adhl strain used as the host is a strain with a reduced ability to assimilate sugar, it cannot grow quickly in a medium containing glucose. Therefore, after transformation, strains that had formed colonies on SC-Ura medium by day 2 were treated with alcohol at the temperature at which the mutant ADH1 gene on the introduced pRS316-ADH1 DNA was cultured. It was selected as a strain having dehydrogenase activity.
  • the selected transformant having pRS316_ADH1 was spread on SC-Ura medium so that there were about 100 colonies per plate, and cultured at 25 ° C for 48 hours.
  • the plates were replicated on 4 plates and cultured at 25 ° C, 30 ° C, 34 ° C, and 37 ° C, and the growth conditions were compared.
  • a colony that did not grow at 30 ° C, 34 ° C, or 37 ° C culture temperature was isolated as a strain in which ADH1 on the plasmid became temperature sensitive.
  • three strains, “pADHlts-1 strain”, “pADHlts-2 strain”, and “pADHlts-3 strain”, which are temperature sensitive at 34 ° C. were obtained.
  • plasmids were also extracted.
  • the extracted plasmid was used to transform Escherichia coli DH5a, and the plasmid was also obtained in the culture solution according to a conventional method.
  • the obtained plasmid was digested with the restriction enzyme SaclZSmal, and the AADH1 strain was transformed with the digestion solution.
  • the obtained culture broth was plated on a Y PAD plate medium and cultured at 25 ° C. for 48 hours.
  • the grown colonies are considered to have the ⁇ adhl locus recombined with the temperature-sensitive AD HI gene, and this is the temperature-sensitive ADH1 gene on the chromosome.
  • Integrated yeast ADHlts-1 strain, ADHlts-2 strain, ADHlts-3 strain
  • the DNA base sequence was determined for the temperature-sensitive ADHlts gene locus of the temperature-sensitive yeast ADH Its—1, ADHlts—2, and ADHlts—3, and the amino acid sequence was determined from the sequence. As a result, it was found that the amino acid primary sequences shown in SEQ ID NOs: 40, 41, and 42 were obtained.
  • Alcohol dehydrogenase activity of the yeast ADH Its-1 strain, ADHlts-2 strain, and ADHlts-3 strain having the temperature-sensitive mutant ADH1 gene obtained in Example 13 was measured.
  • Each strain was inoculated into 20 mL of YPD liquid medium and cultured at 30 ° C for 20 hours. These were collected, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) 2001 and glass beads (SIGMA, diameter 0.6 mm) 0.2 g were added, and vortexed at 4 ° C. for 30 minutes. After vortexing, the supernatant was collected by centrifugation.
  • the protein concentration was determined by using a standard curve prepared with Usuki IgG (l. 38 mg / mL, manufactured by Bio-Rad) using a standard BCA Protein Assay Kit (Pierce). Decide 7.
  • Example 14 According to the results of Example 14 and Comparative Example 5 shown in Table 11, the yeast (ADHIts-1 strain, ADHIts-2 strain, ADHIts-3 strain) obtained in Example 13 and having the temperature-sensitive mutant ADH1 gene was obtained. ), The alcohol dehydrogenase activity at 30 ° C was found to be lower than that of the wild strain (NBRC10505 strain).
  • Example 15 Lactic acid fermentation using yeast having a temperature-sensitive mutant ADH1 gene
  • Example 15 Lactic acid fermentation using yeast having a temperature-sensitive mutant ADH1 gene
  • a human-derived L ldh gene having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was used as the L ldh gene.
  • Example 12 Using the L5 strain having the wild-type alcohol dehydrogenase prepared in Example 4, a fermentation test using a jar fermenter was conducted in the same manner as in Example 15, and the L lactate production amount and ethanol production amount were calculated. It was measured. These results are shown in Table 12.
  • Example 16 Lactic acid fermentation by yeast having a temperature-sensitive mutant ADH1 gene at a culture temperature of 32 ° C
  • the alcohol dehydrogenase of the ADH Its-1-1-L strain was cultured at 32 ° C, which is a temperature sensitive, by a jamentor.
  • a fermentation test was performed, and the amount of L lactic acid produced was measured to determine the amount of lactic acid produced and the amount of ethanol produced by the yeast having the temperature-sensitive mutant ADH1 gene.
  • the culture temperature of the yeast (AD Hits-1-L strain, ADHlts-2-L strain, ADHlts-3-L strain) having the temperature-sensitive mutant ADH1 gene of the present invention is 30 °.
  • the amount of L-lactic acid produced increased compared to the culture at the same temperature (Comparative Example 6) of yeast having wild-type alcohol dehydrogenase (L5 strain). It was confirmed that the effect of reducing ethanol production was obtained.
  • Example 16 the culture (Example 16) of the yeast (ADHlts-1-L strain) having the temperature-sensitive mutant ADH1 gene of the present invention at a culture temperature of 32 ° C (Example 16), the fermentation test results at a culture temperature of 30 ° C ( It was confirmed that the production of L-lactic acid further increased from Example 15), and the effect of reducing the ethanol production was obtained.
  • the yeast lacking the PDC5 gene present on the genomic DNA of NBRC10506 It produced as follows. Plasmid P RS 406 as amplified ⁇ was amplified URA3 gene DNA fragment of 1. 3 kb by oligonucleotide (SEQ ID NO 54, 55) was used as a primer set PCR. The amplified DNA fragment was purified, and the NBRC10506 strain was transformed into uracil non-required using the DNA fragment. The resulting transformed cells should be an A pdc5 deletion strain in which the PDC5 gene on the genomic DNA is replaced with the URA3 gene.
  • amplification products obtained by PCR using genomic DNA as an amplification kit and oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 as primer sets were subjected to fagarose electrophoresis.
  • amplification product obtained by PCR using genomic DNA as an amplification kit and oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 as primer sets were subjected to fagarose electrophoresis.
  • a 1.2 kb amplification product is obtained.
  • a 1.9kb product is obtained. 1. Since a 2 kb product was obtained, the transformant was designated as SWO 11 strain lacking the PDC5 gene.
  • a pdcl A pdc5 double deletion strain was prepared as follows.
  • the obtained SWOl 1 strain and the SW029 strain obtained in Example 2 were joined to obtain diploid cells.
  • the diploid cells were ascending into ascending medium.
  • the ascomy was dissected with a micromanipulator, and each spore was grown in YPAG medium to obtain each haploid cell.
  • the auxotrophy of the obtained haploid cells was examined.
  • the desired ⁇ pdcl ⁇ pdc 5 double deletion strain should show uracil and tributophan non-requirement. As a result of examining the nutrient supply, uracil and tributophan were not required.
  • the obtained uracil and genomic DNA of a non-tryptophan-requiring strain were used as amplification strains, and the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59, and the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 were used. It was confirmed by PCR using a primer set that the PDC1 gene and the PDC5 gene were deleted. This ⁇ pdcl ⁇ pdc5 double deletion strain was designated as SW012 strain. It was confirmed that the SW012 strain did not grow using glucose as the sole carbon source.
  • a 1.3 kb HIS3 gene DNA fragment was amplified by PCR using the plasmid pRS403 as an amplification template and the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55 as a primer set.
  • the amplified DNA fragment was purified, and the NBRC10506 strain was transformed into the histidine non-requirement using the DNA fragment.
  • the resulting transformed cells should have the PDC5 gene on the genomic DNA replaced with the HIS3 gene!
  • amplification products obtained by PCR using the genomic DNA as an amplification template and the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 as primer sets were electrophoresed.
  • the transformant was designated as SW013 strain lacking pdc5.
  • a pdcl A pdc5 double deletion strain was prepared as follows. The obtained SW013 strain and the SW029 strain obtained in Example 2 were joined to obtain diploid cells. The diploid cells were ascending into ascending medium. The cysts were dissected with a micromanipulator, and each cyst was grown in YPAG medium to obtain each haploid cell. The auxotrophy of the obtained haploid cells was examined.
  • the desired ⁇ pdcl ⁇ pdc5 double deletion strain should show no histidine and tributophan requirements.
  • the obtained genomic DNA of histidine and tributophan non-requiring strains was used as an amplification type, and oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59, and SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57
  • oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59, and SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 It was confirmed that the PDC1 and PDC5 genes were deleted by PCR using the oligonucleotide represented by This A pdcl A pdc5 double deletion strain was designated as SW014 strain. It was confirmed that the SW014 strain did not grow using glucose as the sole carbon source.
  • a 2.7 kb amplified DNA fragment containing the PDC5 gene was obtained by PCR using the genomic DNA of BY4741 strain as a saddle and using the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 61 as a primer set.
  • the fragment was digested with Notl and inserted into the Notl gap of plasmid pRS316 previously digested with Notl.
  • the resulting plasmid pRS316-PDC5 was used to transform the SW013 strain into a uracil non-requirement. It was confirmed that the transformant recovered its growth ability using glucose as the sole carbon source and had the growth ability at 37 ° C.
  • plasmid PRS316-PDC5 was recovered by a conventional method, and the 2.7 kb nucleotide sequence inserted into pR S316 was determined by a conventional method, and pRS316-PDC5 contained the PDC5 gene. confirmed.
  • plasmid pRS316-PDC5 was used as an amplification cage, and SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63 As a primer set, a 1.7 kb amplified DNA fragment encoding PDC5 was obtained by PCR using the BD Diversify PCR Random Muta genesis Kit (Clontech). PCR using this kit increases the frequency of mutagenesis during DNA amplification, and the 1.7 kb fragment obtained above has a higher frequency of containing a fragment containing the mutation than the fragment obtained by normal PCR.
  • the SW014 strain was transformed into uracil non-required, and the SC-Ura medium was transformed. Transformants that grow by incubation at 25 ° C were selected.
  • the gap repair method homologous recombination occurs between the 1.7 kb fragment and the linear plasmid, and only cells that have acquired the circularized plasmid again grow.
  • the obtained transformant group was replicated in fresh SC-Ura medium and incubated at 34 ° C.
  • pdc5 temperature-sensitive mutations pdc5ts-9 and pdc5ts-11 Two strains of transformants that did not grow at 34 ° C among the replicated transformant groups were selected and designated as pdc5 temperature-sensitive mutations pdc5ts-9 and pdc5ts-11.
  • a plasmid was recovered from this transformant by a conventional method, and the nucleotide sequence corresponding to the 1.7 kb amplified DNA fragment was determined.
  • pdc5ts-9 is a single base substitution mutation in which the 1697th base of the structural gene DNA represented by SEQ ID NO: 52 is C-forced to T
  • pdc5ts-11 is a structural gene represented by SEQ ID NO: 53 It was a single base substitution mutation from the 701st base of DNA to T.
  • Each of the plasmids was designated as pRS316-pdc5ts9 and pRS316-pdc5tsll with the
  • Plasmids PRS316—pdc5ts9 and pRS316—pdc5tsll were deleted with Notl to obtain a 2.7 kb fragment containing the pdc5ts9 and pdc5tsll mutant genes. Using this fragment, the SW012 strain was transformed to require uracil, and a transformant that was incubated at 25 ° C. in 5-FOA medium to grow was selected. The obtained transformant group was replicated in fresh SC medium and kept at 34 ° C. Among the transformed transformant groups, transformants that did not grow at 34 ° C were selected and used as pdc5ts9 temperature sensitive mutant SWO15 and pdc5ts11 temperature sensitive mutant SWO16.
  • a small amount of each of the NBRC10505, SW029, SW015, and SW016 strains was taken from the agar medium, inoculated into 3 mL of YPD liquid medium, and cultured overnight (preculture).
  • the preculture was renewed, 1% inoculated into 20 mL of YPD liquid medium, and cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. for 24 hours using a lOOmL Sakaguchi flask (main culture). 10 mL of the main culture was collected by centrifugation, washed with 10 mL of phosphate buffer, and then suspended in 1 mL of phosphate buffer.
  • the concentration of PDC enzyme solution obtained in (a) above was determined using the BCA Protein Assay Kit (manufactured by PI ERCE) based on a calibration curve prepared using ushi IgG (l. 38 mgZmL, BIO-RAD) as a standard. And diluted with sterilized water so that each PDC enzyme solution was 2 mgZmL. Next, the mixture obtained by removing the PDC enzyme solution and NADH at the ratio shown in Table 13 was dispensed into a semi-micro cuvette, and the PDC enzyme solution and NADH were calorie mixed immediately before starting the measurement.
  • the PDC specific activity of the pdc5ts9 temperature-sensitive mutant strain SW015 and the pdc5tsl l temperature-sensitive mutant SW016 strain having the mutant PDC5 gene is less than lZ 3 of the NBRC10505 strain and lower than the SW029 strain.
  • a temperature-sensitive mutant yeast of the PDC5 gene it was possible to obtain a yeast with a reduced PDC specific activity.
  • Lactic acid fermentation tests were performed on the pdc5 temperature sensitive mutant obtained above.
  • the pdc5 temperature-sensitive mutant strain was transformed into a human-derived L ldhh.
  • the gene was introduced.
  • the lactic acid fermentation medium shown in Table 1 was used for the lactic acid fermentation test.
  • Optical purity (%) 100 X (L—D) Z (L + D)
  • L represents the concentration of L-lactic acid
  • D represents the concentration of D-lactic acid
  • Fermenter Bioneer— N (manufactured by Maruhishi Biotechnology)
  • strains SW015 and SW016 transformed with pTRS48 were cultured overnight in a test tube in 5 ml of lactic acid fermentation medium (pre-culture).
  • the culture broth was inoculated into 10 Oml of a fresh lactic acid fermentation medium and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours (preculture).
  • the preculture was inoculated into a fermentation apparatus and a lactic acid fermentation test was conducted. The results are shown in Table 15.
  • Lactic acid fermentation tests were performed on the pdc5 temperature sensitive mutant obtained above.
  • the L ldh gene expression plasmid pTRS102 obtained in Example 1 into the SW015 strain and the SW016 strain, the L ldh gene derived from the force L was introduced.
  • the lactic acid fermentation medium shown in Table 1 was autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • strains SW015 and SW016 transformed with pTRS102 were cultured overnight in a test tube in 5 ml of a lactate fermentation medium (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated into 100 ml of fresh lactic acid fermentation medium and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours (pre-culture).
  • the preculture was inoculated into a fermentation apparatus and a lactic acid fermentation test was conducted. The results are shown in Table 15.
  • Example 3 Furthermore, using SW029ZPTRS102 obtained in Example 3 as a control comparative example, a fermentation test was conducted under the same conditions as the pdc5 temperature-sensitive mutant. The test results are shown in Table 15.
  • the yeast of the present invention and the lactic acid obtained by the method for producing lactic acid using the yeast are brewed products such as liquor, miso, soy sauce, pickles and dairy products, soft drinks as sour substitutes for quenate and tartaric acid, It has a wide range of uses such as being used for pharmaceuticals. Furthermore, in the field of fats and oils, it is also suitably used as a raw material for polylactic acid and is an extremely useful substance. If lactic acid is produced using the yeast of the present invention and the method for producing lactic acid using the yeast, it is possible to efficiently produce lactic acid with a wide range of uses, so that lactic acid can be provided at a lower cost. It becomes possible.

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Abstract

　本発明の酵母は、ヒトまたはカエル由来のＬ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母である。 　本発明の酵母、およびその酵母を用いた乳酸の製造法を用いて乳酸を製造すれば、これら幅広い用途のある乳酸を効率的に製造することができることから、より安価に乳酸を提供することが可能となる。

Description

明 細 書
酵母及び L-乳酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、 L-乳酸の製造方法に関するものである。さらに、本発明は、 L 乳酸脱 水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母に関する。また、本発明は、 L 乳酸 脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母を培養することを含む L-乳酸の製 造方法に関するものである。
背景技術
[0002] 最近、資源を有効活用し、資源を使用後再利用することに社会の注目が集まり、 特に、植物を原料としたポリマーに注目が集まっている。その中でも、ポリ乳酸が、植 物原料のポリマーとして優れた性質を有することが明らかになってきている。
[0003] ポリ乳酸の原料である乳酸は、従来、 V、わゆる乳酸菌と総称される微生物を培養す ることにより製造されている。乳酸菌は、ラタトバチラス (Lactobacillus)属ゃラタトコッ カス（Lactococcus)属に代表されている。これらの乳酸菌は、糖からの乳酸の収率 には優れて!/、るものの酸に対する耐性が低 、ことから、酸性物質である乳酸を多量 に蓄積させるためには、炭酸カルシウムや水酸ィ匕アンモ-ゥム、あるいは水酸ィ匕ナト リウムなどのアルカリで中和をしながら、培養を行わなければならな 、。
[0004] し力しながら、この手段ではアルカリによる中和操作により、乳酸ナトリウムや乳酸力 ルシゥムなどの乳酸塩が生じるため、その後の精製工程において乳酸塩を乳酸に戻 す操作が必要になり、その処理にコストがかかっている。
[0005] そこで中和コスト低減を目的として、酸に耐性のある酵母に乳酸を生産させる試み が報告されている (特許文献 1〜5、非特許文献 1〜3参照)。酵母は、本来、乳酸生 産能を持たないことから、酵母による乳酸生産を可能にするためには、ピルビン酸を L-乳酸に変換する酵素である L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (以下、 L-ldh 遺伝子と略すことがある。 )を遺伝子組み換え技術を用い酵母に導入しなければなら ない。
[0006] 酵母に導入する L-ldh遺伝子は、これまでゥシ由来の L-ldh遺伝子が検討されて おり（特許文献 3、特許文献 5及び非特許文献 1〜3参照）、乳酸菌由来の L-ldh遺伝 子よりも適していることが報告されている。ゥシ由来の L-ldh遺伝子は、 L 乳酸の対 等収率が低ぐ更に対糖収率を向上させる必要があった (非特許文献 3参照)。また、 酵母が有する遺伝子を変異させることにより、 L 乳酸の生産効率を向上させる試み が行われている。しかし、酵母が有する遺伝子を変異させると、発酵時間が長くなる、 糖の消費速度の低下などの不具合がある (特許文献 3、特許文献 6参照)。
[0007] このように、酵母を用いた L 乳酸の製造は有用な方法である。しかし、更なる生産 効率を向上させることが望まれて 、た。
特許文献 1：特開 2001-204464号公報
特許文献 2：特開 2001-204468号公報
特許文献 3 :特表 2001- 516584号公報
特許文献 4 :特開 2003- 93060号公報
特許文献 5：特開 2003- 259878号公報
特許文献 6：特開 2006-006271号公報
非特許文献 1：ダニ口 ·ポロ（Danilo Porro)ら：「バイオテクノロジー プログレス (Biotech nol.Prog)」， 11： p294— 298 (1955)
非特許文献 2：ダニ口 ·ポロ（Danilo Porro)ら:「アプライド アンド エンバイォロンメンタ ノレ マイクロノくィォロシー (Applied and Environmental Microbiology;」， 65 (9) ： ρ42 11 -4211 (1999)
非特許文献 3 :サトシ'サイトウ（Satoshi Saitoh)ら:「アプライド アンド エンバイォロン メンタノレ マイクロノくィォロジー (Applied and Environmental Microbiology )」，71 (5) ： p2789 - 2792 (2005)
発明の開示
[0008] 本発明は、ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入 された酵母である。
[0009] 本発明は、好ましくは、ヒト（Homo sapiens)またはゼノプス ·レービス (Xenopus 1 aevis)由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母である。
[0010] また、本発明は、好ましくは、 (1)ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵 母であって、野生型 PDR13遺伝子の DNA配列の一部が欠失、挿入又は置換によ つて変異され、該遺伝子がコードするタンパク質の一部が翻訳される DNA配列から なる変異型 PDR13遺伝子を有する酵母、
(2)ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵 母であって、野生型アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列の一部が置換、欠失、挿 入及び Z又は付加されたアミノ酸配列力もなる変異型アルコール脱水素酵素を有し
、該変異型アルコール脱水素酵素が、培養温度を変えることにより細胞内のアルコー ル脱水素酵素活性が消失又は低下する温度感受性を示す酵母、または
(3)ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵 母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素 1をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン 酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び Z又 は付加された塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5遺伝子を有する酵母 である。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は、本発明で用いられる L ldh遺伝子染色体導入用 PCR断片作製方法 の一例を示す概念図である。
[図 2]図 2は、本発明で用いられる発現プラスミドの一例であるプラスミド pTRS 11の 構築図である。
[図 3]図 3、本発明で用いられる発現プラスミドの一例であるプラスミド pTRS57の構 築図である。
符号の説明
[0012] 1 導入目的箇所上流側相同配列 (付加部分）
2 共通配列
3 酵母用選択マーカー遺伝子
4 導入目的箇所上流側相同配列 (付加部分）
5 L— ldh遺伝子染色体導入用 PCR断片
発明を実施するための最良の形態 [0013] 本発明は、ヒトまたは力エル由来の L—乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L— Id h遺伝子）が導入された酵母である。
[0014] 本発明において、 L ldh遺伝子とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
(NADH)とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD + )と L 乳酸に、変換する活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を指す。
本発明で使用する L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L ldh遺伝子）として は、ヒトまたは力エル由来のものであれば特に限定されない。ヒト由来としては、ホモ' サピエンス（Homo sapiens)由来の L— ldh遺伝子であり、力エル由来としてはァォ ガエル科（Rhacophoridae)、ァカガエル科（Ranidae)、アマガエル科 (Hylidae)、 ジムグリガエル科（Microhylidae)、ヒキガエル科（Bufonidae)、クサガエル科（Hyp eroliidae)、スキアシガエル科（Pelobatinae)、スズガエル科（Discoglossidae)、コ モリガエル科（Pipidae)に属する力エル由来の L— ldh遺伝子が挙げられる。力エル 由来の L ldh遺伝子としては、これらの中でもコモリガエル科（Pipidae)に属する力 エル由来の L ldh遺伝子を用いることが好ましぐコモリガエル科に属する力エルの 中でも、アフリカッメガエル (Xenopus laevis)由来の L— ldh遺伝子であることが好 ましい。
[0015] ヒトまたは力エル由来の L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L ldh遺伝子） には、それぞれ、 ldhA遺伝子、 ldhB遺伝子、 ldhC遺伝子の 3種類のァイソフォーム が知られており、本発明ではそのいずれも使用しうる力 好ましくは ldhA遺伝子であ る。
[0016] 具体的には、本発明のヒト由来の L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L ldh 遺伝子）は、好ましくは、配列番号 1に示す核酸配列を有する L ldh遺伝子である。 また、本発明の力エル由来の L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L ldh遺伝 子）は、好ましくは、配列番号 2に示す核酸配列を有する L ldh遺伝子である。
[0017] 本発明のヒトまたは力エル由来の L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh 遺伝子）には、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。 本明細書では、遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基 配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を 導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット (Mutan-K( タカラバィォ社製)）を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR R andom Mutagenesis (CLONTECH社製））を用いる方法などがある。また、本発明で 使用するヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子は、 NADHとピルビン酸を NAD +と L 乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部 に欠失または挿入が存在して ヽても構わな 、。
[0018] 本発明のヒトまたは力エル由来の L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh 遺伝子）が導入された酵母は、好ましくは、変異遺伝子を有することにより、高い対糖 収率で L-乳酸を製造することができる。
本発明のヒトまたは力エル由来の L—乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh遺 伝子）が導入された酵母は、好ましくは、野生型 PDR13遺伝子の DNA配列の一部 が欠失、挿入又は置換によって変異され、野生型 PDR13遺伝子がコードするタンパ ク質の一部が翻訳される DNA配列力もなる変異型 PDR13遺伝子を有する酵母であ る。
[0019] 本発明の野生型 PDR13遺伝子の塩基配列は、好ましくは、配列番号 64に示す塩 基配列からなる遺伝子である。変異型 PDR13遺伝子は、好ましくは配列番号 22に 示す塩基配列からなる遺伝子を有する酵母である。また、野生型 PDR13遺伝子、ま たは、変異型 PDR13遺伝子がコードするタンパク質の一部力 配列番号 23に示す アミノ酸一次配列からなることが好まし 、。
[0020] 本発明のヒトまたは力エル由来の L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh 遺伝子）が導入された酵母は、好ましくは、 PDR13タンパク質を部分的に生産する 酵母である。 PDR13タンパク質を部分的に生産する酵母は、 PDR13タンパク質をコ ードする遺伝子に変異が生じている変異型 PDR13遺伝子を有する。変異としては、 例えば、酵母の PDR13タンパク質をコードする染色体 DNAの一部が欠損している 変異、およびタンパク質のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失または置換さ れた変異などを挙げることができる。
[0021] 本発明において、 PDR13タンパク質をコードする染色体 DNAの一部が欠損して いるとは、染色体 DNAの塩基配列において、少なくとも C末端側の 39アミノ酸残基を 翻訳せしめない変異を有する変異 DNAを挙げることができる。 PDR13タンパク質の アミノ酸配列において、少なくとも C末端側の 39アミノ酸が欠失した変異とは、 PDR1
3タンパク質をコードする染色体 DNAに対し、部位特異的変異導入法により導入可 能な数のアミノ酸が欠失した変異を 、う。
[0022] 部位特異的変異の導入は、部位特異的変異導入用キット (Mutan-K (タカラバイオ 社製)）を用いる変異導入方法が挙げられるが、本発明における変異導入方法はこ れに限定されるものではな 、。
[0023] 本発明のヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh遺 伝子）が導入された酵母は、好ましくは、野生型アルコール脱水素酵素のアミノ酸配 列の一部が置換、欠失、挿入及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなる変異型ァ ルコール脱水素酵素を有する。
[0024] 本発明のヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh遺 伝子）が導入された酵母は、好ましくは、野生型アルコール脱水素酵素が、培養温度 を変えることにより細胞内のアルコール脱水素酵素活性が消失又は低下する温度感 受性を示す酵母である。
[0025] 本発明においてアルコール脱水素酵素とは、ァセトアルデヒドをエタノールに変換 する活性を持つタンパク質である。
[0026] 酵母は、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子として、複数のァイソジーンを 持っている。本発明においては、生産に使用する酵母細胞内で最も高いアルコール 脱水素酵素活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を用いることが好ましい。
[0027] 具体的には、サッカロマイセス 'セレピシェ（Saccharomyces cerevisiae)では、サッカ ロマイセスゲノムデータベース (Saccharomyces Genome Database)に登録されている アルコール脱水素酵素遺伝子のァイソジーンとして、 ADH1、 ADH2、 ADH3、 AD H4、 ADH5、 ADH6、 ADH7等が知られている。これらのうち、 ADH1遺伝子を用 、ることが好まし!/、。
[0028] 本発明のヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh遺 伝子）が導入された酵母は、好ましくは、ピルビン酸脱炭酸酵素 1をコードする遺伝子 が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝子の塩基配列の一部が 欠失、挿入、置換及び Z又は付加された塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸 酵素 5遺伝子を有する酵母である。
[0029] 本発明のヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L-ldh遺 伝子）が導入された酵母は、好ましくは、 PDC1遺伝子を欠失させたものである。 PD C1遺伝子を欠失させることにより、ピルビン酸脱炭酸酵素活性は、 PDC1遺伝子野 生型と比較して低下する。 PDC1遺伝子、 PDC5遺伝子を共に欠失させると、ピルビ ン酸脱炭酸酵素活性をさらに低下させることができるが、グルコースを含む培地にお いては極めて生育が悪くなることが知られている。そこで、本発明においては、好まし くは、 PDC5遺伝子に変異を導入することで適度に PDC5遺伝子由来のピルビン酸 脱炭酸酵素活性を低下させることができ、酵母のエタノールへの代謝経路を制御す ることが可能になる。
[0030] 具体的には、本発明の酵母は、酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性が 野生型酵母細胞内の比活性の 3分の 1以下に低下したものが好ま U、。酵母細胞内 のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性は、 PDC1遺伝子を欠失させることにより、野生型 酵母の比活性の 3分の 1以下に低下させることが可能である。酵母細胞内のピルビン 酸脱炭酸酵素の比活性は、後記の方法により測定することができる。
[0031] 本発明で使用する酵母は、ヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子を導入しうる酵母 であれば制限はないが、サッカロミセス（Saccharomyces)属、シゾサッカロミセス（S chizosaccharomyces)属乂はクリベロミセス (Kluyveromyces)属に属する酵母力 挙げられる。好ましくは、サッカロミセス ·セレビセ（Saccharomyces cerevisiae)で あって、具体的には、 NBRC10505株、 NBRC10506株が好ましい。
[0032] 次に本発明の酵母の作成法をより具体的に説明するが、本発明の酵母の作成法 には様々な方法で、実施し得る。そこでまず、酵母の作成に用いる各々の方法につ いて説明する。
[0033] 目的遺伝子のクローユングには、既知の遺伝子情報に基づき、 PCR (Polymerase Chain Reaction)法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法や、ゲノムライブラ リーや cDNAライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローユングする方法 などが挙げられる。また、既知のタンパク質情報に基づき化学合成的又は遺伝子ェ 学的に合成する方法も可能である。
[0034] クローユングした目的遺伝子を^ aみ込むプラスミドとしては、酵母で汎用的に利用さ れるプラスミドを用いることができる。酵母で汎用的に利用されるプラスミドは、酵母細 胞内での自立的複製に必要な配列、大腸菌細胞内での自立的複製に必要な配列、 酵母選択マーカー及び大腸菌選択マーカーを有している。また、組み込んだ目的遺 伝子を発現させるための発現プラスミドは、 目的遺伝子の発現を調節するオペレータ 一、プロモーター、ターミネータ一又はェンハンサ一等のいわゆる調節配列をも有し ていることが望ましい。酵母細胞内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、酵母 の自立複製開始点 (ARS1)とセントロメァ配列のセットもしくは酵母の 2 mプラスミド の複製開始点であり、大腸菌内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、大腸菌 の ColEl複製開始点である。
[0035] 酵母選択マーカーとしては、 URA3、 LEU2、 TRP1、 HIS3等の栄養要求性相補 的遺伝子もしくは G418耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺 伝子が挙げられる。大腸菌の選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子又は力 ナマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
[0036] 調節配列としては、 目的の遺伝子を発現しうる配列であれば特に制限はな 、が、酵 母で高発現して 、ることが知られて!/、るアルコールデヒドロゲナーゼ (ADH)、トリオ ースリン酸デヒドロゲナーゼ (TDH)、ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC)、シトクロム C1 ( CYC1)などをコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネータ一領域が挙げら れる。しかしながら、発現プラスミドはこれらに限定さない。
[0037] 上記プラスミド、発現プラスミド、線状化プラスミド、線状化発現プラスミド、 PCR断片 などの DNAを酵母への導入する方法には、形質転換、形質導入、トランスフエクショ ン、コトランスフエクシヨンおよびエレクト口ポレーシヨン等の方法があり、具体的には、 例えば、酢酸リチウムを用いる方法（「ジャーナル ォブ バタテリォロジ一 (Journal of bacteriology)」、 1983年、 153卷、 pl63— 168)やプロトプラスト法（原島俊ら、モレ キユラ ~ ·セル'バイオロジー（「Molecular Cell Biologyj ) , 1984年、 4卷、 p771— 77 8)等の形質転換方法によって行い得る。また、 BIO 101社製の ALKALI CATION YE AST TRANSFORMATION KIT等を用いても実施し得る。これらのうち、本発明では、 酢酸リチウム法を利用した方法が好ましいが、これに限定されるものではない。
[0038] 上記形質転換方法によって得られた形質転換酵母の培養方法は、例えば、「メソッ ズ イン イースト ジエネテイクス（Methods In Yeast Genetics)、 1990年、 M.D.ローゼ (M.D. Rose)ら」等に記載されている公知の方法を適用できる。選択培地は、プラスミ ド、発現プラスミド、および PCR断片の導入の指標に利用するマーカー遺伝子に対 応する栄養分を含まない最小培地であればどのような培地でもよい。本発明では、好 適には以下の糸且成の培地： Yeast nitrogen base without amino acids (DIr1し O社製) 0.67%,グルコース 2.0%,マーカー遺伝子の栄養成分を除いた dropout mixture (前出 「メソッヅ イン イースト ジエネテイクス（Methods in Yeast Genetics)」）に記載されて V、る培地が用いられ得る力 これに限定されな!、。
[0039] また、 目的遺伝子の欠失方法としては、通常酵母に用いられる栄養要求性マーカ 一遺伝子や、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを用いた目的遺伝子座の相同組 換えにより行うことが可能である。例えば、 URA3、 LEU2, TRP1,HIS3等の栄養要 求性マーカー遺伝子（「メソッヅ イン ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology)」、 101卷、 p.202-211, G- 418)や薬剤而性遺伝子（「ジーン（Gene)」、 1083年、 26卷、 p 243-253)を利用することができる力 これに限定されない。
[0040] 本発明のヒトまたは力エル由来の L—ldh遺伝子を酵母に導入する方法は、例えば 、ヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子をクローユングし、クローユングした該遺伝子 を組み込んだ発現プラスミドで酵母を形質転換する方法、クローユングした該遺伝子 を染色体上の目的箇所に相同組換えで挿入する方法等が挙げられるが、これらに限 らない。
[0041] 上記発現プラスミドのプロモーター下流にヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子を 導入することにより、該遺伝子を発現可能なプラスミドが得られる。得られたヒトまたは 力エル由来の L-ldh遺伝子発現プラスミドで、後述する方法により酵母を形質転換す ることにより、ヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子を酵母に導入することができる。
[0042] 本発明の酵母は、好ましくは、 L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体 上のピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導 入された酵母である。 [0043] ヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子を染色体上の目的箇所に、好ましくはピルビ ン酸脱炭酸酵素 1遺伝子 (PDC1遺伝子）のプロモーターの下流に相同組み換えで 挿入する方法としては、ヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子の上流及び下流に、導 入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いて PCR( Polymerase Chain Reaction)を行い、得られた PCR断片を後述する方法により酵母 に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転 換酵母の選択を容易にするために、上記 PCR断片には酵母選択マーカーが含まれ ることが好ましい。
ここで用いる PCR断片を調整する方法は、例えば、下記（1)〜（3)のステップ 1〜3 の工程により行うことができる。その概略を図 1に示す。
[0044] (1)ステップ 1：ヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子の下流にターミネータ一がつ ながったプラスミドを铸型とし、プライマー 1, 2をセットとしてヒトまたは力エル由来の L -ldh遺伝子及びターミネータ一を含む断片を PCRで増幅する。プライマー 1は、導 入目的箇所の上流側に相同的な配列 40bp以上を付加するようデザインし、プライマ 一 2は、ターミネータ一より下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。好まし くは、プライマー 1に付加する導入目的箇所の上流側に相同的な配列は、 PDC1遺 伝子の上流に相同的な配列である。
[0045] (2)ステップ 2 :酵母選択マーカーを持つプラスミド、例えば pRS424、 pRS426等 を铸型として、プライマー 3, 4をセットとして酵母選択マーカーを含む断片を PCRで 増幅する。プライマー 3は、ステップ 1の PCR断片のターミネータ一より下流の配列と 相同性のある配列が 30bp以上を付加するようにデザインし、プライマー 4には、導入 目的箇所の下流側に相同的な配列 40bp以上を付加するようデザインする。好ましく は、プライマー 4に付加する導入目的箇所の下流側に相同的な配列は、 PDC1遺伝 子の下流に相同的な配列である。
[0046] (3)ステップ 3 :ステップ 1, 2で得られた PCR断片を混合したものを铸型とし、プライ マー 1, 4をセットとして PCRを行うことにより、両末端に導入目的箇所の上流側及び 下流側に相同的な配列が付加された、ヒトまたは力エル由来 L-ldh遺伝子、ターミネ 一及び酵母選択マーカーを含む PCR断片が得られる。好ましくは、前記 PCR断片 は、両末端に PDC1遺伝子の上流及び下流に相同的な配列が付加された、ヒトまた は力エル由来の L-ldh遺伝子、ターミネータ 及びマーカー遺伝子を含む PCR断 片である。
[0047] 上記で得られたヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子発現プラスミドまたは PCR断 片を酵母に導入し、酵母選択マーカーを導入した場合、そのマーカーを指標にして 形質転換酵母を得ることができる。
[0048] 本発明のヒトまたは力エル由来の L-ldh遺伝子が導入された酵母を培養することに より、培地中に L-乳酸を製造することができる。導入した発現プラスミドを酵母内に保 持させる場合は、上記形質転換酵母の培養法によって、培地中に L-乳酸を製造す ることができる。 本発明にお ヽて、 L-乳酸脱水素酵素活性とは、ピルビン酸と NAD Hを L-乳酸と NAD +に変換する活性を示す。 L-乳酸脱水素酵素活性は比活性を 指標として比較する場合がある。すなわち、 L-ldh遺伝子導入方法及び遺伝的バッ クグラウンドが同じ酵母を、同条件で培養し、培養菌体力も抽出したタンパク質を用 いて NADHの減少に伴う 340nmにおける吸光度の変化を測定する。その際に、室 温において 1分間当たりに 1 μ molの NADHを減少させる酵素量を 1単位 (Unit)と 定義する事により、 L-乳酸脱水素酵素の比活性は数式 1で表す。ここで、 Δ 340は 1 分間あたりの 340nmの吸光度の減少量、 6. 22は NADHのミリモル分子吸光係数 である。
[0049] [数 1] τ η Τ Τ Δ 340 X全反応液量 (ml)
L D H比活性 (Unit/mg) =
(酵素液 ¾度 .(mg/ml) X酵素液量 (ml)} x 6.22 X光路長 (cm)
(式 1 )
[0050] 次に、 PDR13タンパク質をコードする遺伝子の一部が変異を有する酵母の作製方 法を説明する。
[0051] 作成方法は、
[1]酵母の染色体 DNA上にトランスポゾンによる挿入変異を施した遺伝子変異酵母 ライブラリーを用いて、該ライブラリ一力 親株より乳酸生産能力が向上した酵母を選 択する方法、 [2]相同組み換え法などを用いて、 PDR13タンパク質をコードする遺伝子の一部が 欠損した酵母を製造する方法、および、
[3]相同組み換え法などを用いて、 PDR13タンパク質のアミノ酸配列において少な くとも C末端側の 39アミノ酸残基が翻訳されな ヽ欠失、置換もしくは挿入等の変異を 有するアミノ酸配列をコードする DNAを染色体上に有する微生物を製造する方法な どが挙げられる。
[0052] 上記の [1]の方法でいう親株とは、上記遺伝子変異処理に供した元株のことをいい 、親株は野生型酵母であっても、産業上有用な改良を施された変異酵母、細胞融合 酵母あるいは遺伝子組み換え技術を用いて作製した組み換え酵母であってもよ 、。
[0053] [1]の遺伝子変異ライブラリーの作製法としては、イースト ェムテイーェヌプラスミド コレクション（Yeast mTn Plasmid Collection) (オープン バイオシステムズ（ Open Biosystems)社製）を用いて提供されるトランスポゾン配列挿入ゲノムライブ ラリーより、トランスポゾン配列が挿入された DNA断片を制限酵素処理により調製し た後、該 DNA断片を二回相同組み換えにより染色体 DNAに導入することで遺伝子 変異ライブラリーを構築する方法が挙げられる。
[0054] 上記の遺伝子変異ライブラリーをスクリーニングソースとして用い、トランスポゾン配 列挿入部位を同定することにより、明確に限定された遺伝子領域への挿入変異が乳 酸酸生産能力に及ぼす影響を観察することができる。
[0055] 上記ライブラリ一力 の乳酸生産能力が向上した酵母を選択する方法としては、該 ライブラリーの各菌株に乳酸生成酵素をコードする遺伝子の発現プラスミドを導入し て得られる形質転換酵母を培養し、生成した乳酸を定量する方法を挙げることができ る。培養時間の経過と共に乳酸の蓄積が多いほど、乳酸の生成量が多いと考えられ る。
[0056] 上記ライブラリーからの乳酸生産能力が向上した酵母を選択するには、 L-ldh遺 伝子を導入した酵母を親株として実施できる。導入する L ldhの種類は特に制限さ れないが、好ましくは、配列番号 1、配列番号 2または配列番号 3に示す核酸配列を 有するヒト、力エルまたはゥシ由来の L— ldh遺伝子を用いることができる。
[0057] 図 3は、本発明で用いられるゥシ由来の L— Ldh発現用プラスミド pTRS57の構造 を示す図であり、図 2は、本発明で用いられるプラスミド pTRSl lの構築図である。
[0058] L-ldh遺伝子の発現様式としては、遺伝子を発現させることができるプロモーターの 支配下に該遺伝子が連結されて 、れば、染色体への導入による発現またはプラスミ ドによる発現など特に限定されない。例えば、アルコール脱水素酵素 1遺伝子プロモ 一ターの支配下に、ゥシ由来の L—Ldh遺伝子を連結した遺伝子構造を pRS426に 連結したマルチコピー発現プラスミド pTRS57、ヒト由来 L—Ldh遺伝子を pTRS 11 に連結したマルチコピー発現プラスミド PTRS48を挙げることができる。
[0059] ライブラリーの各菌株に PTRS57を常法に従い導入して形質転換酵母を作製し、 該形質転換酵母および形質転換に供した親株をそれぞれ培養することにより生成す る乳酸の生成量を測定することにより、親株より乳酸の生産能力が向上した酵母を選 択することができる。
[0060] PTRS57を有する形質転換酵母の培養は、 L 乳酸脱水素酵素が発現する培養 法であれば特に限定されな!ヽが、形質転換酵母の培養法により実施し得る。
[0061] 培養液中の乳酸濃度は、 HPLCを用いる方法で定量することができる。例えば、培 養液を遠心分離して培養液上清を調整し、該上清を分析サンプルとして乳酸分析用 陰イオン交換カラムを用い、電気伝導度を測定することで培養液の、乳酸濃度を定 量する。
[0062] 同一時間培養したとき、親株より高い乳酸生産性を示す酵母を選択することにより、 親株より乳酸生産能力が向上した酵母を取得することができる。
[0063] 上記方法にて取得される乳酸生産能力が向上した酵母としては、 PDR13タンパク 質をコードする遺伝子（以下、 PDR13遺伝子と略すことがある。）へのトランスポゾン DNA断片の挿入を染色体 DNA上に有するサッカロマイセス 'セレビセ（Saccharo myces cerevisiae)を φける lと力 21 eさる o
[0064] [2]相同組み換え法などを用いて、 PDR13タンパク質をコードする遺伝子の一部 が欠損した酵母を製造する方法としては、直鎖 DNAによる染色体上の相同組み換 えが可能な酵母を用いる方法を挙げることができる。直鎖 DNAとしては、例えば、 T RP1遺伝子の両端に PDR13遺伝子の内部または近傍の配列と相同性を有する D NAを配置した直鎖 DNAを挙げることができる。 [0065] 該直鎖 DNAを、直鎖 DNAによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母に常法 により導入し、トリブトファン要求性回復株を選択することにより、 PDR13遺伝子部分 欠失酵母を作製することができる。
[0066] [3]相同組み換え法などを用いて、 PDR13タンパク質のアミノ酸配列において少な くとも C末端側の 39アミノ酸残基が翻訳されな ヽ欠失、置換もしくは挿入等の変異を 有するアミノ酸配列をコードする DNAを染色体上に有する微生物を製造する方法と しては、 PDR13遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより、該遺伝子がコー ドするアミノ酸配列にぉ ヽて、少なくとも C末端側の 39アミノ酸残基が翻訳されな 、欠 失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする変異型遺伝子を作製し、相同 組み換え法を用いることにより、 PDR13遺伝子が変異型 PDR13遺伝子に置換され た染色体 DNAを有する酵母を作製する方法などを挙げることができる。
[0067] 上記 [1]、 [2]、 [3]に開示した方法をもちいることで、ヒトまたは力エル由来の L-乳 酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、野生型 PDR13遺伝 子の DNA配列の一部が欠失、挿入又は置換によって変異され、該遺伝子がコード するタンパク質の一部が翻訳される DNA配列力もなる変異型 PDR13遺伝子を有す る酵母を作製することができる。
[0068] 本発明の酵母は、好ましくは、 野生型アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列の一 部が置換、欠失、挿入及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなる変異型アルコー ル脱水素酵素を有する酵母であり、該変異型アルコール脱水素酵素が、培養温度を 変えることにより細胞内のアルコール脱水素酵素活性が消失又は低下する温度感受 性を示す。
[0069] 本発明の酵母は、より好ましくは、野生型アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列の 一部のアミノ酸の 1個ないし数個のアミノ酸力 置換、欠失、挿入及び Z又は付加に より変異されたアミノ酸配列力もなる変異型アルコール脱水素酵素を有する。ここで、 置換、欠失、挿入、付加の変異は、いずれか単独の変異であってもよぐ又はこれら の複数の組合せであってもよ 、。
[0070] 変異型アルコール脱水素酵素としては、 ADH1遺伝子によってコードされる野生型 アルコール脱水素酵素の変異型が好ましぐ配列番号 39に示されるアミノ酸一次配 列からなる野生型アルコール脱水素酵素 1の変異型であることが、さらに好ましい。ま た、変異型アルコール脱水素酵素が、配列番号 39に示される野生型アルコール脱 水素酵素 1のアミノ酸配列において、 1個から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及 び Z又は付加されたアミノ酸配列力もなる変異型アルコール脱水素酵素であることも 、さらに好ましい。
[0071] 本発明の酵母が有する好ましい変異型アルコール脱水素酵素は、配列番号 40、 配列番号 41又は配列番号 42に示されるアミノ酸配列からなる変異型アルコール脱 水素酵素である。
[0072] 本発明の酵母が有する変異型アルコール脱水素酵素の温度感受性とは、変異型 アルコール脱水素酵素を持つ酵母力 S、野生型アルコール脱水素酵素を持つ酵母に 比較して、ある培養温度では同程度のアルコール脱水素酵素活性を示すが、培養 温度を変化させて特定の培養温度以上になるとアルコール脱水素酵素活性の消失 又は低下を示す性質をいう。酵母は細胞内においてアルコール脱水素酵素の活性 が低下すると糖資化能力が低下し、糖含有培地での生育速度が著しく遅くなることか ら、糖含有培地での生育速度を観察することにより感受性の有無を判断することがで きる。 発明の酵母は、好ましくは、変異型アルコール脱水素酵素が、培養温度が摂 氏 30度以上、より好ましくは、摂氏 32度以上、さらにより好ましくは、摂氏 34度以上 で温度感受性を示す。
[0073] 次に、温度感受性を有する変異型アルコール脱水素酵素を有する酵母の作製方 法にっ ヽて、温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母の場合を例示して記載 する力 これは変異を導入する遺伝子が ADH1遺伝子に限定されることを意味する ものではなぐまた上記酵母の作製方法はこれに限られるものではない。
[0074] まず、野生型 ADH1遺伝子を欠失した酵母を作製する。欠失は上記目的遺伝子 の欠失方法によって実施し得る。酵母は細胞内で主要なアルコール活性を担う AD HI遺伝子座が欠失されるとグルコースを含む糖を資化する能力が低下し、糖含有 培地での生育速度が著しく遅くなる。この形質を利用し、ランダムに変異を導入した A DH1遺伝子群カゝら温度感受性変異型 ADH1遺伝子のスクリーニングを行うことがで きる。ランダム変異導入 ADH1遺伝子を導入した形質転換酵母群を、グルコース含 有培地上で通常の培養温度 (室温〜摂氏 30度)で培養すると、変異の導入により活 性が消失した ADH1遺伝子を持つ酵母は生育しなくなることから、生育性を観察す ることにより当該温度にお!ヽて活性を有する ADH 1遺伝子を持つた酵母のみを選抜 し得る。次に、選抜された酵母群を通常の培養温度以外 (摂氏 30度以上、もしくは室 温以下)でグルコース含有培地を用いて培養すると温度感受性変異型 ADH1遺伝 子を持った酵母は生育しなくなることから、温度感受性変異型 ADH1遺伝子が導入 された酵母のネガティブスクリーニングが可能となる。具体的には、例えば形質転換 体を摂氏 25度で培養し、生育した酵母について摂氏 30度、 34度、 37度におけるグ ルコース含有培地での生育を確認し、それぞれの温度につ 、て感受性を示す酵母 を作製することができるが、培養温度はこの限りではない。
[0075] 温度感受性変異酵母の作製方法は、自然界力 のスクリーニングや、ニトロソグァ 二ジン、ェチルメタンスルホネート等の薬剤処理、紫外線照射など突然変異を利用し た手法や、 PCR反応を利用した遺伝子工学的手法などがある。
[0076] 遺伝子工学的手法を利用した特定の遺伝子に変異を導入する方法としてはランダ ムに変異を導入する方法と部位特異的に変異を導入する方法がある。前者のランダ ム変異の導入方法としては、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis (CLONTECH社製) )、部位特異的に変異を導入する方法部位特異 的変異導入用キット (Mutan-K (タカラバイオ社製) )を用いる方法を用いることで変異 を有する遺伝子が調製される。これらの中でも、遺伝子工学的手法による作製方法 が好まし!/、が、この方法に限定されるわけではな！/、。
[0077] このように得られた変異型 ADH1遺伝子の導入には、ギャップ修復法（「酵母分子 遺伝学実験法」、学会出版センター、 1996年）、すなわち、変異型 ADH1遺伝子 D NA断片、および ADH1遺伝子をクローユングした自立複製能力があるプラスミドに おいて、 ADH 1遺伝子内に欠失して線状化したものを酵母細胞に同時に導入すると 、変異型 ADH1遺伝子 DNA断片と欠失部分両端の相同性配列で相同組み換えが 起こり、欠失部分の修復が行われ、同時にプラスミドが閉環され自立複製能力が復 帰することを利用することができる。具体的には、 ADH1遺伝子をクローユングしたプ ラスミドを適当な制限酵素により切断して得られる変異導入標的領域 DNAを削除し たプラスミドと、適当なプライマーを用いて ADHl遺伝子領域にっ 、てランダム変異 を導入しながら増幅した断片を用いて、同時に ADH1が欠失した酵母に導入するこ とにより、変異導入標的領域にランダム変異を導入された変異型 ADH1遺伝子がク ローニングされた環状プラスミドが得られる。
[0078] ギャップ修復法による変異導入に用いるプラスミドは、上記酵母で汎用的に利用さ れるプラスミドを使用し得る。好ましくは、酵母細胞内でのコピー数が少ない、例えば YCp50、 pRS315、 pRS316、 pAUR112または pAUR123等のプラスミドを使用 できるが、これに限定されない。この際、導入される ADH1遺伝子領域には、当該遺 伝子の上流域及び下流域に存在する当該遺伝子の発現を調節するオペレーター、 プロモーター、ターミネータ一およびェンハンサ一等の 、わゆる調節配列をも含むこ とが好ましい。このようにして、プラスミドにクローユングされた温度感受性変異型 AD HI遺伝子を作製することができる。
[0079] 次に、温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母の作製について説明する。
[0080] 上記で得られた、温度感受性変異型 ADH1遺伝子がクローユングされたプラスミド を形質転換酵母より取得する。取得の方法は特に限定されないが、市販の酵母ブラ スミド回収キット、例えば YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (クロンテック社） などを用いることができる。得られたプラスミドの ADH1遺伝子配列内を切断しな 、 制限酵素で消化、線状ィ匕したもので、上記のように作製した adhl欠失酵母を形質転 換すると、 ADH1遺伝子座に隣接する DNA配列と線状ィ匕プラスミドの DNA配列の 相同領域で組み換えがおこり、 ADH1を欠失した際に用いたマーカー遺伝子と温度 感受性変異型 ADH1遺伝子とが置換され、目的とする温度感受性変異型 ADH1遺 伝子を有する酵母を得ることができる。これは、「pop-inZpop-out法」（「メソッズ 'ィ ン'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology)」、 1987年、第 154卷、 p. 164 — 174」に記載)を応用することで実施できる。
[0081] アルコール脱水素酵素が温度感受性を示すことを確認する方法としては、感受性 温度下で培養した酵母細胞の破砕物について、アルコール脱水素酵素が触媒する エタノールからァセトアルデヒドへの酸化反応を観測し、野生型遺伝子を有する酵母 細胞に比較して変異型遺伝子を有する酵母細胞の破砕物の示す活性が低いことを 指標とする方法が挙げられる。
[0082] アルコール脱水素酵素の活性は、測定する温度及び pHの条件を各アルコール脱 水素酵素アイソザィムが反応を触媒する環境を考慮して決定し、その条件下におけ るエタノールに対する基質親和性を測定することによって評価しうる。例えば、サッカ ロマイセス 'セレピシェの ADH1遺伝子のコードするアルコール脱水素酵素の培養 温度摂氏 34度における酵素活性は、培養温度摂氏 34度にお ヽて培養し得られた 培養の破砕物を用いて、 pHをトリス塩酸緩衝液を用いて pH8. 8に調整し、反応温 度を摂氏 30度とした環境下で、基質をエタノールとして測定する。活性は、エタノー ルカもァセトアルデヒドへの酸ィ匕反応と同時に起こる、酸ィ匕型ニコチンアミドジヌタレ ォチド (NAD + )が還元型ニコチンアミドジヌクレオチド (NADH)に変わる還元反応 に起因する波長 340nmにおける吸光度変化を観測することによって評価され得る。 その際、室温において 1分間あたりに 1 μ molの NADHを減少させる酵素量を 1単位 (unit)と定義することによりアルコール脱水素酵素の比活性は式（2)であらわせる。 ここで、 Δ 340ηπιは 1分間当たりの波長 340nmの吸光度の減少量、 6. 22は光路長 lcmにおける NADHのミリモル分子吸光係数である。
[0083] [数 2]
アルコール脱水素酵素比活性 (mmol/min//i g) = Δ 340 Χ 反応液量— ( μ ΐ) X— 10-6
破砕液中のタンパク質濃度 (μ /μ 1) X 破砕液量 (μ ΐ) X 6.22 X 光路長 （cm)
[0084] 各培養温度において培養した本発明の変異型酵母細胞と野生型酵母細胞の破砕 液について、アルコール脱水素酵素活性の測定を同条件下で行い、算出されたァ ルコール脱水素酵素の比活性を比較することにより、該培養温度における変異型ァ ルコール脱水素酵素の温度感受性を評価することができる。
[0085] 上記に開示した方法を用いることで、ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素を コードする遺伝子 (L-ldh遺伝子）が導入された酵母であって、野生型アルコール脱 水素酵素のアミノ酸配列の一部が置換、欠失、挿入及び Z又は付加されたアミノ酸 配列からなる変異型アルコール脱水素酵素を有し、該変異型アルコール脱水素酵 素が、培養温度を変えることにより細胞内のアルコール脱水素酵素活性が消失又は 低下する温度感受性を示す酵母を作製することができる。
[0086] 酵母のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群 (PDC)としては、ピルビン酸 脱炭酸酵素 1をコードする遺伝子 (PDC1遺伝子）、ピルビン酸脱炭酸酵素 5をコード する遺伝子 (PDC5遺伝子)及びピルビン酸脱炭酸酵素 6をコードする遺伝子 (PDC 6遺伝子）の 3種類が知られている。これらのうち、ピルビン酸脱炭酸酵素としての主 要な機能を持つ遺伝子は、 PDC1遺伝子、および、 PDC5遺伝子である。
[0087] 本発明の酵母は、好ましくは、 PDC1遺伝子が欠失し、かつ、野生型 PDC5遺伝子 の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び Z又は付加された塩基配列力もなる変 異型 PDC5遺伝子を有するものである。ここで、一部塩基の欠失、挿入、置換及び Z 又は付加の変異は、いずれか単独の変異であってもよぐ又はこれらの複数の組合 せであってもよい。
[0088] 本発明の酵母は、より好ましくは、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝 子の塩基配列が、配列番号 51に示す塩基配列からなる遺伝子である。
[0089] 本発明の酵母が有する変異型 PDC5遺伝子としては、配列番号 51に示す塩基配 列からなる野生型 PDC5遺伝子の変異体であることが好ましい。本発明の酵母は、よ り好ましくは、変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝子が、配列番号 52又 は 53のいずれかに示す塩基配列力もなる遺伝子である。
[0090] 本発明の酵母が有する変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5は、温度感受性であること が好ましい。ここで、ピルビン酸脱炭酸酵素 5の温度感受性とは、変異型ピルビン酸 脱炭酸酵素 5を有する酵母が、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素 5を持つ酵母に比較し て、ある培養温度では同程度のピルビン酸脱炭酸酵素活性を示すが、培養温度を変 化させて特定の培養温度以上になるとピルビン酸脱炭酸酵素 5の消失又は低下を示 す性質を！ヽぅ。酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の活性が低下すると糖資化能 力が低下し、糖含有培地での生育速度が著しく遅くなることから、糖含有培地での生 育速度を観察することにより感受性の有無を判断することができる。 本発明におい ては、変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5が摂氏 34度以上で温度感受性を示す酵母で あることが好ましい。 [0091] PDC5遺伝子に変異を導入には、通常行われる方法により、 PDC5遺伝子の DN A配列を改変することで実現する。 PDC5遺伝子の改変の方法としては、 ADH1遺 伝子また、これら突然変異株群から温度感受性を有する突然変異株を作製する方法 でも、該酵素活性低下酵母を得ることができる。ピルビン酸脱炭酸酵素活性が検出さ れない酵母は、グルコースを唯一炭素源とした場合、著しく生育が遅くなる。この性質 を利用して、ピルビン酸脱炭酸該酵素活性低下酵母を作製すると非制限温度条件 下では、ピルビン酸脱炭酸酵素活性が残存して 、るため野生型酵母と同等程度の 生育能力を示す。制限温度条件下では該酵素活性が低下することで生育能力が著 しく低下する変異株を作製することで、望ま ヽ温度感受性を有する変異型 PDC5 遺伝子を得ることができる。
[0092] 次に、本発明のヒトまたは力エル由来の L—乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 (L ldh遺伝子）が導入された酵母においで、 PDC1遺伝子が欠失し、変異型 PDC5 遺伝子を有する酵母の作製方法を、より具体的に説明する。 まず、本発明の変異型 PDC5遺伝子のスクリーニングを行うために、 PDC1遺伝子と、 PDC5遺伝子の両方 を欠失させた A pdcl A pdc5二重欠失酵母を作製する。ここで、記号「Δ」は「欠失」 を意味する。
[0093] A pdcl A pdc5二重欠失酵母の作製の方法は、上記目的遺伝子の欠失方法によ つて実施し得るが、これに限定されない。酵母がサッカロマイセス属に属する酵母で あれば、目的遺伝子の欠失方法を用いて、 A pdcl単独欠失株、 A pdc5単独欠失 株を作製して、それらの 2倍体からの四分子分離法により A pdcl A pdc5二重欠失 酵母を作製することもできる。
[0094] 次に、変異型 PDC5遺伝子の作成方法につ ヽて述べる。作成の方法は、上記温度 感受性変異株の作製方法により実施し得る。 PCR反応を利用した遺伝子工学的手 法による作製方法を開示するが、この方法に限定されるわけではない。ランダム変異 導入用キット BD Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(CLONTECH社製)を用いる 方法により変異型 PDC5遺伝子を得ることができる。
[0095] このように得られた変異型 PDC5遺伝子の導入には、上記同様のギャップ修復法（ 「酵母分子遺伝学実験法」、学会出版センター、 1996年)を用いることで実施し得る 。すなわち、変異型 PDC5遺伝子 DNA断片、および、 PDC5遺伝子をクローユング した自立複製能力があるプラスミドにおいて、 PDC5遺伝子内に欠失して線状化した ものを同時に A pdcl A pdc5二重欠失酵母に導入することにより、変異導入標的領 域にランダム変異を導入された変異型 PDC5遺伝子）がクローユングされた環状ブラ スミドが得られる。
[0096] 次に、変異型 PCD5遺伝子を有し、 PDC1遺伝子が欠失した A pdcl 改変 pdc5 酵母の作製について説明する。上記で得られた、変異型 PDC5遺伝子がクローニン グされたプラスミドを形質転換酵母より取得する。取得の方法は特に限定されな 、が 、市販の酵母プラスミド回収キット、例えば YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Ki t (クロンテック社)などを用いることができる。次に「pop- inZpop- out法」を用いて、 得られたプラスミドの PDC5遺伝子配列内を切断しない制限酵素で消ィ匕、線状化し たもので、上記のように作製した Δ pdcl Δ pdc5二重欠失酵母を形質転換すること で、目的とする Δ pdcl 改変 pdc5酵母を得ることができる。
[0097] 次に、変異型 PDC5遺伝子の導入によって、細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活性 が変化した酵母の選抜方法につ!、て説明する。
[0098] ピルビン酸脱炭酸酵素活性が変化したことの確認方法としては、ギャップ修復法で えられた各々の形質転換細胞を培養した破砕物について、ピルビン酸脱炭酸酵素 比活性を測定し、野生型 PDC5遺伝子を有する酵母に比較して変化して ヽることを 指標として選抜できる。
[0099] 野生型 PDC5遺伝子を有する酵母に比べて、ピルビン酸脱炭酸酵素比活性が低 下した変異型 PDC5遺伝子を有する形質転換酵母細胞の選抜は、変異型 PDC5遺 伝子を有する酵母のピルビン酸脱炭酸酵素比活性を測定し、野生型 PDC5遺伝子 を有する酵母に比較して該酵素比活性が低下した細胞を選抜することで行うことがで きる。また、あるいは変異型 PDC5遺伝子が温度感受性を示す形質転換酵母を選抜 することによって、より好ましい酵母の選抜ができる。
[0100] 次に、変異型 PCD5遺伝子を有し、 PDC1遺伝子が欠失した A pdcl 改変 pdc5 酵母の作製について説明する。
[0101] 上記で得られた、変異型 PDC5遺伝子がクローユングされたプラスミドを形質転換 酵母より取得する。取得の方法は特に限定されないが、市販の酵母プラスミド回収キ ット、例えば YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (クロンテック社）などを用いる ことができる。得られたプラスミドの PDC5遺伝子配列内を切断しない制限酵素で消 ィ匕、線状ィ匕したもので、上記のように作製した A pdcl A pdc5二重欠失酵母を形質 転換すると、 PDC5遺伝子座に隣接する DNA配列と線状ィ匕プラスミドの DNA配列 の相同領域で組み換えがおこり、 PDC5を欠失した際に用いたマーカー遺伝子と変 異型 PDC5遺伝子とが置換され、目的とする A pdcl 改変 Pdc5酵母を得ることがで きる。これは、「pop- inZpop- out法」（「メソッズ 'イン'ェンザィモロジ一（Methods i n Enzymology)」、 1987年、第 154卷、 p. 164— 174」に記載）を応用することで 実施できる。
[0102] 上記で選抜した酵母の細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活性の評価方法を説明す る。該酵素活性は、以下（1)〜（3)に概略を示すブロンクらの方法（「イースト (Yeast )」、 1996年、第 12卷、 p. 1607-1633)を適時改変して測定することができる。
[0103] (1)：ピルビン酸脱炭酸酵素により基質ピルビン酸力 ァセトアルデヒドが生じる。
[0104]
(2)： (1)において生じたァセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素が還元型-コチ ンアミドジヌクレオチド (NADH)を補酵素としてエタノールに変換する。
[0105] (3)： (2)にお!/、てアルコール脱水素酵素がァセトアルデヒドをエタノールに変換す る際に減少する NADHの量を測定する。
[0106] ここで、（2)において減少したァセトアルデヒドの量は、（1)において生じたァセトァ ルデヒドの量と等しいとすると、（3)で測定した NADHの減少量と（1)におけるピルビ ン酸の減少量は等しいこととなる。すなわち、酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活 性は、上記反応系の NADH減少量力 測定できる。
[0107] また、酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活性は、比活性を指標として比較するこ とができる。すなわち、同条件下で培養した酵母力もタンパク質を抽出し、その抽出 液を用いて NADHの減少に伴う波長 340nmにおける吸光度の変化を測定する。そ の際に、 30°Cにおいて 1分間当たりに 1 /z molの NADHを減少させる酵素量を 1単 位 (Unit)と定義することにより、ピルビン酸脱炭酸酵素の比活性は、次の数式 3で表 すことができる。ここで、 Δ は 1分間あたりの波長 340nmの吸光度の減少量、 6. 2
340
2は光路長 lcmにおける NADHのミリモル分子吸光係数である。同条件下で測定を 行い、算出されたピルビン酸脱炭酸酵素の比活性により該酵素活性を比較すること ができる。
[0108] [数 3] ^^ Luai*- , . 、 Δ 34。Χ全反応液量 (ml)
PDC比沽性 (Unit/mg) = ―
酵素液濃度 (mg/ml) X酵素液量 (ml) X 6.22 X光路長 (cm)
…'（式 3)
[0109] 上記に開示した方法を用いることで、ヒト又はアフリカッメガエル由来の L—乳酸脱 水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素 1 をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝子の 塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び Z又は付加された塩基配列からなる変異 型ピルビン酸脱炭酸酵素 5遺伝子を有する酵母を作製することができる。
[0110] 本発明は、ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入 された酵母であるが、下記の（1)〜（3)の特徴のうち、少なくともいずれか 2つ以上の 特徴を持つ酵母も含まれる。
[0111] (1)ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵 母であって、野生型 PDR13遺伝子の DNA配列の一部が欠失、挿入又は置換によ つて変異され、該遺伝子がコードするタンパク質の一部が翻訳される DNA配列から なる変異型 PDR13遺伝子を有する酵母、
(2)ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵 母であって、野生型アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列の一部が置換、欠失、挿 入及び Z又は付加されたアミノ酸配列力もなる変異型アルコール脱水素酵素を有し
、該変異型アルコール脱水素酵素が、培養温度を変えることにより細胞内のアルコー ル脱水素酵素活性が消失又は低下する温度感受性を示す酵母、及び
(3)ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵 母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素 1をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン 酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び Z又 は付加された塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5遺伝子を有する。
[0112] 上記（1)〜（3)の特徴である変異遺伝子を少なくとも二つ以上含まれる酵母の作成 法を説明する。
[0113] 具体的には、一つの変異遺伝子を持つ酵母を親株として、上記に開示した別の変 異遺伝子を有する酵母の作成方法を用いることで作製することができる。更に具体的 には、例えば変異型 PDR13と変異型 ADH1遺伝子を併せ持つ酵母を作製する場 合には、変異型 PDR13遺伝子を有する酵母を親株として、変異型 ADH1遺伝子を 有する酵母を作成すれば、変異型 PDR13と変異型 ADH1遺伝子を併せ持つ酵母 を作製することができる。その他の変異遺伝子の組み合わせに関しても同様に作製 することができる。
[0114] また、酵母がサッカロマイセス属に属する酵母であれば、各々の変異型遺伝子を有 する酵母を接合した 2倍体からの四分子分離法により作製することもできる。具体的 には、例えば変異型 PDR13と変異型 ADH1遺伝子を併せ持つ酵母を作製する場 合には、変異型 PDR13を有する酵母と変異型 ADH1遺伝子を有する酵母を接合し た 2倍体から四分子分離法によって変異型 PDR13と変異型 ADH1遺伝子を同時に 併せ持つ酵母の作製ができる。その他の変異遺伝子の組み合わせに関しても同様 に作製することができる。
[0115] 本発明は、さら〖こ、効率的な L 乳酸の製造法を提供する。本発明の L-乳酸の製 造方法は、本発明のヒトまたは力エル由来の L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝 子 (L-ldh遺伝子）が導入された酵母を培養することを含むことが好ま U、。
[0116] 本発明の酵母を培養して L 乳酸を製造する方法において、酵母を培養する培地 としては、該酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該酵母の培養 を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
[0117] 炭素源としては、該酵母が資化しうるものであればよぐグルコース、フルクトース、 シユークロース等の糖類、これらの糖類を含有する糖蜜、デンプン又はデンプン加水 分解物などの炭水化物を用いることができる。炭素源は、培養開始時に一括して添 カロしてもよいし、又は培養中に分割して若しくは連続的に添加することもでき、 lOg/ l〜200gZlの濃度で用いられる。
[0118] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム等の無機酸または有機酸のアンモ-ゥム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ ーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種醱酵 菌体消化物等を用いることができる。
[0119] 無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、リン酸 第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシ ゥムなどを用いることができる。
[0120] 培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行うことができる。酸素供給条件は特に 限定されるものではな 、が、好気的条件下あるいは微好気条件下で行うことができる 。培養温度は摂氏 25〜35度がよぐ培養時間は、通常 24時間〜 5日間である。培養 中の培養液の pHは 2. 5〜5. 0に保持することが望ましぐこの pHの調整は、アル力 リ溶液、アンモニア、炭酸カルシウムなどを用いて行うことができる。
[0121] L-乳酸の製造に際しては、まず、本発明の酵母を前培養し、前培養液を新しい培 地に移して本培養することにより、培養液中に L-乳酸を製造することができる。培養 温度は、菌株の増殖が実質的に阻害されず乳酸を生産し得る範囲であれば特に制 限されるものでないが、好ましくは摂氏 20〜40度の範囲の温度であり、より好ましく は摂氏 25〜37度の範囲の温度であり、さらに好ましくは摂氏 30〜34度である。培養 には、静置、撹拌または振とうのいずれの方法も採用し得る。
[0122] 上記のような条件で培養することにより、培地中に 1〜20%の乳酸を得ることができ る。得られた L—乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、 HPLCを用いる方法や 、 F-キット（ロシュ社製)を用いる方法などがある。
[0123] 得られた培養液中の乳酸は、従来力も知られている方法によって、精製することが できる。例えば、微生物を遠心分離した発酵液を pHl以下にしてカもジェチルエー テルや酢酸ェチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出す る方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとして力 蒸留する方法 、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などがある。 [0124] 本発明によれば、ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が 導入された酵母を培養することにより、従来のゥシ由来の L-乳酸脱水素酵素をコード する遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対糖収率で L-乳酸を製造す ることができる。さらに、ヒトまたは力エル由来のヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水 素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、その酵母遺伝子に変異を導 入し、培養することにより、更に収率が向上させることが可能である。
実施例
[0125] 以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは例示であり本発 明を何等制限するものではない。
[0126] 下記、分子遺伝学的な実施の手法に関しては、特に断らないかぎり「「モレキュラー •クロー-ング 第 3版（Molecular cloning 3rd ed. )」、 1991年、（米国）」、「「メ ソッズ 'イン'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology)」、 1991年、（米国）、第 194卷」、「「メソッズ 'イン 'イースト'ジエネテイクス 2000年版（Method in Yeast Genetics 2000 Edition)」、 2000年、（米国）」に従った。
[0127] また、 PCR法は特に断らない限り、 KOD-Plus polymerase (東洋紡社製）または LA
-Taq (宝酒造社製)を用い、操作の詳細はそれぞれ付属のプロトコールに従った。
[0128] (実施例 1：ヒトまたは力エル由来の L ldh遺伝子発現プラスミドの作製）
本発明では、ヒト由来の L ldh遺伝子として、配列番号 1に示す核酸配列を有する L ldh遺伝子を使用し、また、力エル由来の L ldh遺伝子として、配列番号 2に示 す核酸配列を有するゼノプス 'レービス（Xenopus laevis)由来の L ldh遺伝子を 使用した。ヒトまたは力エル由来の L— ldh遺伝子のクローユングは PCR法により行つ た。ヒト由来の L— ldh遺伝子を取得する PCRの铸型として、ヒト乳ガン株化細胞由来 cDNAを使用した。ヒト乳ガン株化細胞力 の cDNAの調整は、ヒト乳ガン株化細胞 (MCF- 7)を培養回収後、 TRIZOL Reagent (Invitrogen社製）を用いて total RNAを 抽出し、得られた total RNAを铸型として Superscript Choice System (Invitrogen社製 )を用いた逆転写反応により cDNAの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞ れ付属のプロトコールに従つた。力エル由来の L ldh遺伝子を取得する PCRの铸 型としては、アフリカッメガエルの腎臓由来 cDNAライブラリー（STRATAGENE社製） より調製したファージミド DNAを使用した。ファージミド DNAの調整は付属のプロトコ 一ノレに従った。
[0129] ヒト由来の L ldh遺伝子増幅用プライマー（配列番号 4, 5)には、 5末端側には Xh ol認識配列、 3末端側には Notl認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製し、力 エル由来の L ldh遺伝子増幅用プライマー（配列番号 6, 7)には、 5末端側には Sa II認識配列、 3末端側には Notl認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。 PCR増幅断片を精製し、末端を T4 polynucleotide Kinase (タカラバイオ社製）によりリ ン酸化後、 PUC118プラスミド (制限酵素 Hindiで切断し、切断面を脱リン酸化処理 したもの）にライゲーシヨンした。ライゲーシヨンは、 DNA Ligation Kit Ver.2 (タカラノ ィォ社製)を用いて行った。ライゲーシヨン溶液で大腸菌 DH5 aのコンビテント細胞 ( タカラバィォ社製)を形質転換し、抗生物質アンピシリンを 50 μ gZmLを含む LBプ レートに蒔いてー晚培養した。生育したコロニーについて、プラスミド DNAを回収し、 制限酵素 Xhol及び Notl又は Sail及び Notlで切断し、ヒトまたは力エル由来の L—1 dh遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属の プロトコールに従い行った。
[0130] 上記ヒトまたは力エル由来の L—ldh遺伝子が挿入された pUCl 18プラスミドを制限 酵素 Xhol及び Notl又は Sail及び Notlで切断し、 DN A断片をァガロースゲル電気 泳動により分離、定法に従いヒトまたは力エル由来の L ldh遺伝子を含む断片を精 製した。得られた L—ldh遺伝子を含む断片を、図 2に示す発現プラスミド pTRS 1 1の XholZNotl切断部位にライゲーシヨンし、上記と同様な方法でプラスミド DNAを回 収し、制限酵素 Xhol及び Notlで切断することにより、ヒトまたは力エル由来の L— Id h遺伝子が挿入された発現プラスミドを選抜した。以後、このようにして作製したヒト由 来の L ldh遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを pTRS48、力エル由来の L ldh 遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを pTRS 102とする。
[0131] (比較例 1 : ゥシ由来 L ldh遺伝子発現プラスミドの作製）
比較対象として、ゥシ由来 L ldh遺伝子が導入された酵母を作成した。
[0132] ゥシ由来 L ldh遺伝子（配列番号 3)のクローユングは PCR法にて行った。 PCRに は、ゥシの骨格筋由来 cDNAライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコ一 ルに従い調製したファージミド DNAを铸型とし、実施例 1と同様に行った。なお、遺 伝子増幅用プライマー（配列番号 8, 9)には、 5末端側には Xhol認識配列、 3末端 側には Notl認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
[0133] 以下、実施例 1のヒト由来の L ldh遺伝子が挿入された発現プラスミドと同様な方 法でゥシ由来 L ldh遺伝子が挿入された発現プラスミドを作製した。以後、このよう にして作製したゥシ由来 L— ldh遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを pTRS49とす る。
[0134] (実施例 2 :pdcl遺伝子欠失株の作製）
サッカロミセス'セレビセ NBRC 10505株のゲノム DNA上に存在する PDC 1遺伝 子を TRP1遺伝子と置換した株（以下、 A pdcl株と略す。）を相同組み換え法を用い て作出した。 A pdcl株は、以下のようにして作製した。プラスミド PRS424を铸型にし 、配列番号 10および 11で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーセットとして 用いた PCRにより TRP1遺伝子の 5'上流に配列番号 12で示した配列、 3'下流に配 列番号 13で示した配列が付加した DNA断片を増幅させた。増幅した DNA断片を 精製し、該 DNA1 μ gを用いて NBRC10505株をトリブトファン非要求性に形質転換 した。得られた形質転赚を SW029株とする。
[0135] (実施例 3 :ヒトまたは力エル由来の L ldh遺伝子発現プラスミドの酵母への導入） 実施例 1で得られた PTRS48又は pTRS102を用いて、 SW029株をゥラシル非要 求性に形質転換した。このようにして得られた形質転^ へのヒトまたは力エル由来 の L— ldh遺伝子発現プラスミド導入の確認は、形質転赚カゝらゲノムを抽出し、これ を铸型とした PCRにより行った。確認用プライマーには、それぞれの L— ldh遺伝子 をクロー-ングした際に用いたプライマー（ヒト由来の L— ldh遺伝子:配列番号 4, 5、 力エル由来の L— ldh遺伝子:配列番号 6, 7)を使用した。その結果、 pTRS48又は pTRS 102により形質転換された株において、それぞれヒトまたは力エル由来の L 1 dh遺伝子が導入されていることを確認した。以下、上記 pTRS48又は pTRS102力 S 導入された形質転^ をそれぞれ SW029ZPTRS48株、 SW029ZρTRS102株 とする。
[0136] (比較例 2 :ゥシ由来の L ldh遺伝子発現プラスミドの酵母への導入） 比較例 1のようにして得られた PTRS49を用いて、 SW029をゥラシル非要求性に 形質転換した。また、ゥシ由来の L ldh遺伝子発現プラスミド導入の確認は実施例 3 と同様な方法で行い、プライマーとして配列番号 8, 9に示すオリゴヌクレオチドを用 いた。以下、上記 pTRS49が導入された形質転^ ¾を SW029ZPTRS49株とする
[0137] (実施例 4 :ヒトまたは力エル由来の L ldh遺伝子の酵母染色体への導入）
実施例 1で得られた PTRS48または pTRS102を増幅铸型とし、オリゴヌクレオチ ド（ヒト由来の L ldh遺伝子：配列番号 14, 16、力エル由来の L ldh遺伝子：配列 番号 15, 16)をプライマーセットとした PCRにより、ヒトまたは力エル由来の L— ldh遺 伝子及び GAPDHターミネータ一配列を含む約 1. 3kbの DNA断片を増幅した（図 1のステップ 1に相当）。ここで配列番号 14及び 15は、配列番号 17に示す PDC1遺 伝子の上流 60bpに相当する配列が付加されるようデザインした。
[0138] 次に、プラスミド pRS424を増幅铸型として、オリゴヌクレオチド (配列番号 18, 19) をプライマーセットとした PCRにより、酵母選択マーカーである TRP1遺伝子を含む 約 1. 2kbの DNA断片を増幅した（図 1のステップ 2に相当）。ここで、配列番号 19は 、配列番号 20に示す PDC1遺伝子の下流 60bpに相当する配列が付加されるようデ ザインした。
[0139] それぞれの DNA断片を精製し、得られた L— ldh遺伝子を含む各 1. 3kb断片、 T RP1遺伝子を含む 1. 2kb断片を混合したものを増幅铸型とし、オリゴヌクレオチド (ヒ ト由来の L ldh遺伝子：配列番号 14, 19、力エル由来の L ldh遺伝子：配列番号 15, 19)をプライマーセットとした PCR法によって、ヒトまたは力エル由来の L— ldh遺 伝子、 GAPDHターミネータ一及び TRP1遺伝子が連結された約 2. 5kbの DNA断 片を増幅した（図 1のステップ 3に相当）。
[0140] 上記約 2. 5kbの DNA断片を精製したものを用いて、 NBRC10505株を形質転換 し、トリブトファン非添加培地で培養することにより、ヒトまたは力エル由来の L ldh遺 伝子が染色体上の PDC1遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を選 択した。
[0141] 上記のようにして得られた形質転^ ¾力 ヒトまたは力エル由来の L— ldh遺伝子が 染色体上の PDC1遺伝子プロモーターの下流に導入された酵母であることの確認は 下記のように行った。まず、形質転 ·のゲノムを抽出し、これを増幅铸型とし、オリ ゴヌクレオチド (ヒト由来の L—ldh遺伝子：配列番号 14, 21、力エル由来の L— ldh遺 伝子：配列番号 15, 21)をプライマーセットとした PCRにより、約 2. 8kbの増幅 DNA 断片が得られることで確認した。なお、非形質転 ·では、上記 PCRによって約 2. 1 kbの増幅 DNA断片が得られる。以下、上記ヒト由来の L ldh遺伝子が染色体上の PDC1遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を L5株、力エル由来の L ldh遺伝子が染色体上の PDC1遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転 赚を B2株とする。
[0142] (実施例 5、比較例 3 :L 乳酸発酵試験 1)
実施例 3、比較例 2のようにして得られた SW029ZPTRS48株、 SW029/pTRS 102株及び SW029ZPTRS49株を用いて L 乳酸生産性テストを行った。
[0143] 表 1に示した組成の培地 (以下、乳酸発酵培地とする。 )力 ゥラシルを除 、た培地 lOrn を試験管【こ取り、そこ【こ少量の SW029/pTRS48株、 SW029/pTRS102 株及び SW029ZPTRS49株をそれぞれ植菌し、 30°Cでー晚培養した（前々培養） 。次に、ゥラシルを除いた新鮮な乳酸発酵培地 lOOmLを 500ml容三角フラスコにい れ、各前々培養液をそれぞれ全量植菌し、 30°Cで 24時間振とう培養した (前培養)。 続 、て、ゥラシルを除 、た乳酸発酵培地を 1L投入したミニジャーファメンター (丸菱 ノィォェンジ社製、容量 5L)に、前培養開始から 24時間後の前培養液をそれぞれ 全量植菌し、攪拌速度（120rpm)、通気量 (0. lLZmin)、温度（30°C)、 pH (pH5 )の条件で培養を行った (本培養)。本培養開始後 40時間の培養液を遠心分離し、 得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件で HPLCにより L 乳酸量を測定し た。
[0144] カラム： Shim— Pack SPR— H (島津社製）
移動相： 5mM p トルエンスルホン酸（流速 0. 8mL/min)
反応液： 5mM p トルエンスルホン酸、 20mMビストリス、 0. ImM EDTA- 2Na ( 流速 0. 8mL/ min
検出方法:電気伝導度 温度： 45°C。
グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬)を用いた。
[0145] 測定結果力 算出した L 乳酸の対糖収率を表 2に示す。
[0146] [表 1] グルコース 100 g
Yeast Nitrogen base
6.7 g
w/o amino acid(Diico社)
ロイシンを除く
152 mg
標準 19種アミノ酸
ロイシン 760 mg イノシトール 152 mg
P-ァミノ安息香酸 lo mg アデニン 40 mg ゥラシル 152 mg
単位（1/Liter)
[0147] [表 2]
Figure imgf000032_0001
[0148] 表 2の結果から、ヒトまたは力エル由来の L—ldh遺伝子が導入された酵母を培養す ることにより、ゥシ由来の L ldh遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い対 糖収率で L—乳酸を製造することができた。
[0149] (実施例 6： L 乳酸発酵試験 2)
実施例 4のようにして得られた L5株及び B2株を用いて、実施例 5と同様な方法で L
—乳酸生産性テストを行った。培地として、表 1に示した乳酸発酵培地を用いた。
[0150] 乳酸発酵培地 10mLを試験管に取り、そこに少量の B2株及び L5株を植菌し、 30
°Cで一晩培養した (前々培養)。次に、新鮮な乳酸発酵培地 lOOmLを 500ml容三 角フラスコにいれ、各前々培養液を全量植菌し、 30°Cで 24時間振とう培養した (前 培養)。続いて、乳酸発酵培地を 1L投入したミニジャーファメンター (丸菱バイオェン ジ社製、容量 5L)に、前培養開始カゝら 24時間後の前培養液を全量植菌し、攪拌速 度（120rpm)、通気量 (0. IL/min)、温度（30°C)、 pH (pH5)の条件で培養を行 つた (本培養)。本培養開始後 30時間の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾 過した後、実施例 5と同様な条件で HPLCにより L 乳酸量を測定した。測定結果か ら算出したし 乳酸の対糖収率を表 3に示す。
[0151] [表 3]
Figure imgf000033_0001
[0152] 表 2及び表 3の結果から、ヒトまたは力エル由来の L ldh遺伝子が染色体上の PD C 1遺伝子プロモーターの下流に導入された酵母を培養することにより、 L ldh遺伝 子発現プラスミドを導入した酵母を培養するのと同等以上の対糖収率で L 乳酸を 製造することができた。
[0153] (実施例 7、比較例 4 : L 乳酸脱水素酵素の活性）
実施例 3、比較例 2で得られた SW029ZPTRS48株， SW029ZpTRS102株及 び SW029ZPTRS49株を用いて、 pH5〜7におけるヒトまたは力エル由来の L 乳 酸脱水素酵素活性及びゥシ由来の L 乳酸脱水素酵素活性を比較した。
[0154] (a)菌体からのタンパク質抽出
SC— Ura培地 10mLを試験管に入れ、そこに少量の SW029ZpTRS48株， SWO 29ZPTRS102株及び SW029ZPTRS49株を植菌し、 30°Cでー晚培養した（前培 養）。次に、 SC— Ura培地 20mLを lOOmL容坂ロフラスコに入れ、そこに前培養液 を 2%植菌し、 24時間振とう培養した (本培養)。本培養液 10mLを遠心により集菌、 10mLのリン酸バッファーで洗浄後、 lmLのリン酸バッファーに懸濁した。上記菌体 懸濁液をエツペンドルフチューブに移し、さらに等量のガラスビーズ（SIGMA社製、 直径 0. 6mm)をカ卩え、 Micro Tube Mixer (TOMY社製）を用い 4°Cで菌体を破 砕した。上記のようにして菌体を破砕した後、遠心して得られる上清を L 乳酸脱水 素酵素液 (以下、 L Ldh酵素液と略す。）とした。
[0155] (b) L 乳酸脱水素酵素活性測定
(a)で得られた L Ldh酵素液の濃度を、ゥシ IgG (l. 38mgZmL、 BIO— RAD社 製）をスタンダードとして作製した検量線をもとに BCA Protein Assay Kit (PIER CE社製）により測定し、各 L Ldh酵素液が 0. 5mgZmLになるように滅菌水で希釈 した。次に、表 4に示した割合の 6水準の混合液 (L Ldh酵素液及び NADHを除く） をセミミクロキュベットに分注し、測定を始める直前に L— Ldh酵素液及び NADHをカロ え混合した。ここで、 2xBRバッファーとは、 0. 08M酢酸、リン酸、ホウ酸溶液を 5N NaOHで pH5, 6, 7にそれぞれ調節した緩衝バッファーである。
[0156] [表 4]
Figure imgf000034_0001
[0157] 各水準での 340nmにおける吸光度の減少を分光光度計（Ultrospec3300Pro アマシャム社製)で測定し、得られた Δ 340の値を式（1)にあてはめ、それぞれ比活 性を算出した。測定は pH5, 6, 7の 3水準で行った。上記測定において、比較対象と する L 乳酸脱水素酵素の比活性がゥシ由来の L 乳酸脱水素酵素の比活性よりも 、 pH3水準のうち 2水準以上で高い場合、その比較対象とする L 乳酸脱水素酵素 は、 pH5〜7においてゥシ由来の L—乳酸脱水素酵素活性よりも高い活性を持つと する。算出結果を表 5に示す。
[0158] [表 5] ピルビン酸ナトリウム ピルビン酸ナトリウム 酵母株 pH 濃度 0. 5mM 濃度 1 mM 実施例 7 SW029/pTRS48 5 1 . 77 2. 21 実施例 7 SW029/pTRS48 6 実施例 7 SW029/pTRS48 7 5. 80 5. 71 実施例 7 SW029/pTRS102 5 6. 56 実施例 7 SW029/pTRS102 6 8. 20 実施例 7 SW029/pTRS102 7 σ>
卜
σι
比較例 4 SW029/pTRS49 5 1 . 75 2. 1 6 比較例 4 SW029/pTRS49 6 6. 52 6. 46
00
比較例 4 SW029/pTRS49 7 6. 6
*- ω
[0159] この結果から、 pH5〜7において、ヒトまたは力エル由来の L 乳酸脱水素酵素活 性は、ゥシ由来の L—乳酸脱水素酵素の活性よりも高いことがわ力つた。また、表 2の 結果から、本発明のヒトまたは力エル由来の L ldh遺伝子が導入された酵母を培養 することにより、ゥシ由来の L ldh遺伝子が導入された酵母を培養することよりも高い 対糖収率で L—乳酸を製造することができることがわ力つた。
[0160] 表 2及び表 5の結果から、 pH5〜7における L 乳酸脱水素酵素活性がゥシ由来の L 乳酸脱水素酵素活性よりも高い L 乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入 された酵母を培養することにより、ゥシ由来の L ldh遺伝子が導入された酵母を培 養することよりも高い対糖収率で L 乳酸を製造することができる。
[0161] (実施例 8：トランスポゾン配列挿入による遺伝子変異株ライブラリーの作製）
NBRC 10505株のゲノム DNA上に存在する PDC 1遺伝子座を欠失した遺伝子組 み換え株（以下、 pdcl Δ Ο株と略す。）を相同組み換えを用いて作出した。 pdcl Δ Ο 株は、以下のようにして作出した。 NBRC10505株のゲノム DNAを铸型として、配列 番号 24および 25で表される塩基配列力もなるプライマーセットを用いた PCRにより、 PDC1遺伝子の 5'上流約 500塩基対を含む配列番号 26で表される塩基配列から なる DNA断片を増幅した。また、配列番号 27および 28で表される塩基配列力もなる プライマーセットを用いた PCRにより、 PDC1遺伝子の 3'下流 500塩基対を含む配 列番号 29で表される塩基配列力もなる DNA断片を増幅した。増幅した DNA断片を 精製し、 2種類の該 DNA断片を等量混合し、該混合液を铸型として、配列番号 24お よび 28で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いた PCRにより、 PDC1遺 伝子の 5'上流 500塩基対と 3'下流 500塩基対が連結した配列番号 30で表される 塩基配列からなる DNA断片を増幅した。増幅した DNA断片を精製し、該 DNAを制 限酵素 Kpnlで処理し、得られた DNA断片をプラスミド pRS416に連結した (以下、 ρ del - pRS416と略す）。 pdc 1— pRS416プラスミド DNAを制限酵素 EcoRVで消 化し、該 DNA断片 lOOngを用いて NBRC10505株をゥラシル非要求性に形質転 換した。得られた形質転換体を、 lgZLの 5—フルォロォロチン酸添加培地に塗布し 、生育してきた形質転換体のゲノム DNAを铸型として、配列番号 31および 32で表さ れる塩基配列からなるプライマーセットを用いて PCRを行い、 PDC1遺伝子が欠失し た株を選択した。
[0162] 次に、 pTRS57プラスミド DNAlOngを用いて pdcl Δ 0株をトリプトファン非要求性 に形質転換した。 PTRS57は、 ADH1プロモーターの支配下にゥシ由来の L—ldh 遺伝子を連結した構造を、 PRS424に導入したマルチコピー発現プラスミドであり、 図 3にその構造を示す。
[0163] 次に、 pTRS57により形質転換された株を宿主として、 Yeast mTn Plasmid C ollection(Open Biosystems社製）より調製したトランスポゾンライブラリーを制限 酵素 Notlで処理し、得られる DNA断片を用いてゥラシル非要求性に形質転換した
[0164] (実施例 9 :乳酸生産を指標とした L 乳酸生産能向上酵母株のスクリーニング） 実施例 8にて作製した組み換え株を、 SC— Ura培地を用いて 30°Cの温度で一晩 振とう培養した。 10 /z lの該培養液を lmlの SC— Ura培地に接種し、 30°Cの温度で 振とう培養した。培養開始 40時間後、培養液を遠心分離し、上清の乳酸濃度を測定 した。乳酸の定量には F— kit (L—乳酸） Ci'Kインターナショナル社製)を用いた。
[0165] その結果、表 6に示すように、親株である pdcl Δ Ο株に pTRS57を導入した株は 4 0時間で 3. 6gZlの乳酸を生成した。そこで、反応 40時間での乳酸の生成が pdcl A O/pTRS57株よりも多くなる株として、 PDR13遺伝子にトランスポゾンが挿入され た株（以下、 pdrl3 : :mTn株と略す)を選択した。
[0166] [表 6]
Figure imgf000037_0001
[0167] (実施例 10 : PDR13遺伝子挿入変異株の作製と L—乳酸生産能の評価）
DNA塩基配列解析の結果、実施例 9で取得した pdrl3 :： mTn株はトランスポゾン 配列が、ゲノム DNA上の PDR13遺伝子の開始コドンから 1599番目と 1560番目の 塩基間に挿入されていた。 PDR13遺伝子への挿入変異を再構築するために、ブラ スミド PRS424を铸型にし、配列番号 33および 34で表される塩基配列からなる DNA をプライマーセットとして用いた PCRにより、 TRP1遺伝子の 5'上流に配列番号 35で 示した配列、 3'下流に配列番号 36で示した配列が付加した DNA断片を増幅させた 。 PCR増幅断片を精製し、該 DNAlO /z gを用いて pdcl Δ Ο株をトリブトファン非要 求性に形質転換した。得られた形質転赚を pdrl3— 1599株とする。次に、実施例 1で得られた PTRS48を用いて pdrl3— 1599株をゥラシル非要求性に形質転換し た。得られた形質転^ を pdrl3— 1599ZPTRS48株とする。
[0168] 作製した組み換え株、 pdrl3— 1599ZpTRS48株を 10mlSC—Ura培地を用い て 30°Cの温度でー晚振とう培養した。 100 μ 1の該培養液を 10mlの SC— Ura培地 に接種し、 30°Cの温度で振とう培養した。培養開始 16時間後、 24時間後および 40 時間後に培養液をそれぞれ lmlサンプリングし、該培養液を遠心分離し、上清の乳 酸濃度を測定した。乳酸の定量には F— kit (L—乳酸） Ci'Kインターナショナル社製 )を用いた。結果を表 7に示す。
[0169] [表 7]
Figure imgf000038_0001
[0170] (実施例 11 : PDR13遺伝子部分欠失株の作製と L—乳酸生産能の評価）
PDR13遺伝子の 1560塩基から 1716塩基までの領域を、欠失した変異株 pdr 13 —100株を作出し、乳酸生産性を測定した。 pdcl A 0ZPTRS48株と pdrl3— 159 9ZPTRS48株を SC— Ura液体培地 10mlを用いて 30°Cの温度でー晚振とう培養 した。該培養液 100 1を 10mlの新しい SC— Ura液体培地に接種し、培養開始 16 時間後、 24時間後および 40時間後にそれぞれ lmlサンプリングし、乳酸の生産量を 実施例 5に記載した HPLCによる方法で定量した。
[0171] その結果、表 8に示すように、親株である pdcl A 0ZPTRS48株よりも乳酸生成量 が増加した。
[0172] [表 8]
Figure imgf000038_0002
[0173] 上記領域欠損株は以下のようにして作製した。プラスミド pRS424を铸型にし、配列 番号 33および 37で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、 TRP1遺伝子の 5'上流に配列番号 35で示した配列、 3'下流に配列番 号 38で示した配列が付加した DNA断片を増幅させた。 PCR増幅断片を精製し、該 DNA1 μ gを用いて pdcl Δ Ο株をトリブトファン非要求性に形質転換した。得られた 形質転^ を pdr 13— 100株とする。次に、 pTRS48を用いて、 pdrl3— 100株をゥ ラシル非要求性に形質転換した。得られた形質転 ^ttを pdrl3— 100ZPTRS48 株とする。
[0174] (実施例 12： PDR 13遺伝子部分欠失株の作製と L 乳酸生産能の評価）
プラスミド PRS423を铸型にし、配列番号 33および 37で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーセットとして用いた PCRにより、 HIS3遺伝子の 5'上流に配列番 号 35で示した配列、 3'下流に配列番号 38で示した配列が付加した DNA断片を増 幅させた。 PCR増幅断片を精製し、該 DNA1 μ gを用いて、実施例 2で得られた SW 029株をヒスチジン非要求性に形質転換した。得られた形質転換株を A pdr 13 10 0株とする。次に、 pTRS48を用いて A pdrl3— 100株をゥラシル非要求性に形質 転換した。得られた形質転赚を pdrl3— 100ZPTRS48株とする。
[0175] 作製した組み換え株、 pdrl3— 100ZpTRS48株を、 10mlSC—Ura培地を用い て 30°Cの温度で 24時間振とう培養した。 10mlの該培養液を 100mlの SC— Ura培 地に接種し、 30°Cの温度で 24時間振とう培養した。 100mlの該培養液を 2. 0Lの S C— Ura培地に接種し、 30°Cの温度でミニジャーフアーメンターを用いて培養し L— 乳酸の生産量を定量した。この培養は、以下の条件で行った。
[0176] ·醱酵装置： Bioneer—N (丸菱バイオェンジ社製）
•培養温度： 30°C
Figure imgf000039_0001
'撹拌速度： 800rpm
•pH : 5. 0
•中和剤： 2N NaOH溶液
その結果、表 9および表 10に示すように、親株である A pdclZpTRS48株よりも L 乳酸の生成量が増加した。
[0177] [表 9] 組み換え株名 4 0時間後の乳酸生成量
( g )
Δ p d r 1 3 1 0 0 3 2 . 9
Λ p d c 1 2 6 . 0 [0178] [表 10]
Figure imgf000040_0001
[0179] (実施例 13 :温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母の作製）
NBRC10505株のゲノム DNA上に存在する ADH1遺伝子を URA3遺伝子と置 換した酵母を相同組み換えを用いて作出した。プラスミド pRS313を铸型にし、配列 番号 43および配列番号 44で表される塩基配列力 なる DNAをプライマーセットとし て用いた PCRにより、 HIS3遺伝子の 5'上流に配列番号 45で示した配列、 3'下流 に配列番号 46で示した配列が付加した DNA断片を増幅させた。増幅した DNA断 片を精製し、該 DNA1 μ gを用いて NBRC10505株をゥラシル非要求性に形質転 換した。得られた形質転赚を A adhl株とする。
[0180] 次に、 NBRC10505株のゲノム DNAを铸型とし、配列番号 47と配列番号 48に示 すプライマーを使用して ADH1遺伝子の上流域 700bpと ADH1構造遺伝子、及び 下流域 200bpを含む DNA断片を増幅させた。遺伝子増幅用プライマー (配列番号 47, 48)は、 5末端側には Sacl認識配列、 3末端側には Smal認識配列がそれぞれ 付加されるようにして作製した。増幅した断片を pUCl 18の HincII,BAP処理断片 にライゲーシヨンした。定法に従い目的とするプラスミド pUC118— ADH1を得た。
[0181] 次に、 pUC118— ADH1を制限酵素 SaclZSmalによって切断し、反応溶液のァ ガロース電気泳動を行った。約 2kbの断片を切り出し、切り出したゲル力も DNA断片 の抽出を行った。抽出した DNA断片を pRS316にライゲーシヨン反応により挿入し、 目的とするプラスミド pRS316— ADH1を得た。
[0182] 次に、ギャップ修復法を用いてプラスミド上の ADH1遺伝子に変異を導入するため 、 pRS316— ADH1について制限酵素 Ballと PflFIを用いて切断し、 ADH1構造遺 伝子内が欠失した開環プラスミドを作製した。制限酵素反応溶液のァガロース電気 泳動を行い、約 7kbの断片を切り出し、切り出したゲル力も DNA断片の抽出を行つ た。さらに、常法に従ってエタノール沈殿を行った。
[0183] 続いて、ギャップ修復法によって変異を導入するための変異導入 ADH1遺伝子断 片を作製した。断片の作製は、配列番号 49及び 50に示すプライマーと、ランダム変 異導入用キット BD Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(CLONTECH社製)を使 用して行った。詳細は付属の指示書に従った。得られた断片は、常法に従ってェタノ ール沈殿を行い、 200ngZ 1に濃縮した。
[0184] 得られた開環プラスミド 500ngと変異導入 ADH1遺伝子断片 lmgを用いて、 A ad hi株をゥラシル非要求性に形質転換した。宿主とする A adhl株は、糖の資化能力 が低下した株であるため、グルコースを含む培地では早く生育することができな 、。 そこで、形質転換後、 SC— Ura培地上で 2日目までにコロニー形成した株を、導入さ れた pRS 316— ADH 1の DNA上にある変異型 ADH 1遺伝子が培養した温度にお いてアルコール脱水素酵素活性を有する株とみなして選抜した。
[0185] 選抜した pRS 316_ADH 1を有した形質転換体を SC— Ura培地上に 1プレート当 たり 100コロニー程度になるように撒布して 25°C、 48時間培養し、これを新しい SC— Ura平板培地 4枚にレプリカし、 25°C、 30°C、 34°C、 37°Cで培養し、生育状況を対 比比較した。 30°C、 34°C、 37°Cのいずれかの培養温度において生育しなくなるコロ ニーを、プラスミド上の ADH1が温度感受性になった株とみなして単離した。これら のうち、 34°Cで温度感受性になる酵母株である「pADHlts—l株」、「pADHlts— 2株」、「pADHlts— 3株」の 3株を取得した。
[0186] 得られた温度感受性 pADH Its株 3株について、それぞれ力もプラスミドを抽出した 。抽出されたプラスミドを用いて大腸菌 DH5 aの形質転換を行い、常法に従って培 養液力もプラスミドを取得した。得られたプラスミドを制限酵素 SaclZSmalによって 切断し、切断溶液を用いて AADH1株の形質転換を行った。得られた培養液は、 Y PAD平板培地に撒いて 25°C、 48時間培養した。 A adhl株はグルコースを含むプ レートでは生育しな!、ので、生育したコロニーは Δ adhl遺伝子座が温度感受性 AD HI遺伝子に組み換わって 、るとみなし、これを温度感受性 ADH1遺伝子が染色体 上にインテグレーションされた酵母 (ADHlts— 1株、 ADHlts— 2株、 ADHlts— 3 株)とした。 [0187] また、得られた温度感受性酵母 ADH Its— 1株、 ADHlts— 2株、 ADHlts— 3株 の持つ温度感受性 ADHlts遺伝子座について、 DNA塩基配列を決定し、その配 列からアミノ酸配列を決定したところ、それぞれ配列番号 40、 41、 42に示されるアミ ノ酸一次配列を持っていることが判明した。
[0188] (実施例 14：温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母のアルコール脱水素 酵素活性の測定）
実施例 13で得られた温度感受性変異型 ADH 1遺伝子を有する酵母 ADH Its— 1 株、 ADHlts— 2株、 ADHlts— 3株について、アルコール脱水素酵素活性を測定 した。各株をそれぞれ 20mLの YPD液体培地に接種し、 30°C、 20時間の培養を行 つた。これらを集菌し、 50mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0) 200 1およびガラスビ ーズ（SIGMA社製，直径 0. 6mm) 0. 2gを加え、 4°Cで 30分間ボルテックスを行った 。ボルテックス後、遠心分離により上清を採取した。それぞれの破砕液上清について 、ゥシ IgG (l. 38mg/mL,バイオラッド社製)をスタンダードとして作製した検量線 をもと〖こ BCA Protein Assay Kit (ピアス社製）により測定し、タンパク質濃度を決 し 7こ。
[0189] 次に、各株のアルコール脱水素酵素活性を測定した。活性測定は、 53mMリン酸 カリウム緩衝液 (PH7. 0)、 20mMピルビン酸ナトリウム、 0. 19mM還元型ニコチン アミドジヌクレオチド（NADH)、 0. 21mM チアミンピロリン酸、 5. 3mM 塩化マグ ネシゥムを含む反応液 190 1に、得られた上清 10 1を添カ卩し、添加後の波長 340 nmの吸光度の変化を分光光度計（Ultraspec3300Pro,アマシャムバイオサイェン ス社製)で測定した。得られた吸光度変化量を前記式（2)の Δ 340nmに当てはめ、 アルコール脱水素酵素活性をそれぞれのタンパク質濃度で割ることにより、各アルコ ール脱水素酵素比活性を算出した。この結果を表 11に示す。
[0190] (比較例 5：野生型酵母のアルコール脱水素酵素活性の測定）
次に、 NBRC10505について、実施例 14と同様にアルコール脱水素酵素活性を 測定した。この結果を表 11に示す。
[0191] [表 11] アルコール脱水素酵素比活性
株名 ^mmol/ mm/ β g protein
実施例 1 4 ADH1ts-l 0.0068
実施例 1 4 ADH1ts-2 0.0294
実施例 1 4 ADHIts - 3 0.007
比較例 5 NBRC 10505 0.1431
[0192] 表 11に示す実施例 14及び比較例 5の結果により、実施例 13で得られた温度感受 性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母 (ADHIts— 1株、 ADHIts— 2株、 ADHIts —3株）では、 30°Cにおけるアルコール脱水素酵素活性が野生株 (NBRC10505株 )に比較して低下していることが判明した。
[0193] (実施例 15 :温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母による乳酸発酵） 実施例 13で作製した形質転換体に L ldh遺伝子を導入し、得られた酵母を用 ヽ てミニジャーファメンターによる発酵試験を行い、 L—乳酸生産量を測定して温度感 受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母の乳酸生産量とエタノール生産量を測定し た。
[0194] 本実施例では、 L ldh遺伝子として、配列番号 1に示す核酸配列を有するヒト由来 の L ldh遺伝子を使用した。
[0195] 実施例 4と同様な方法で、ヒト由来の L— ldh遺伝子をそれぞれ ADHIts— 1株、 A DHlts— 2株、 ADHIts— 3株染色体上の PDC1遺伝子プロモーターの下流に導 入した形質転換株を作出した。また、ヒト由来の L ldh遺伝子が染色体上の PDC1 遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認も実施例 4と同様 な方法で行った。以下、上記ヒト由来の L— ldh遺伝子が染色体上の PDC1遺伝子 プロモーターの下流に導入された形質転赚を、それぞれ、 ADHIts— 1—L株、 A DHlts— 2— L株、 ADHIts— 3— L株とする。
[0196] 乳酸発酵培地を試験管に 10mLとり、そこに ADHIts— 1—L株、 ADHIts— 2— L株、 ADHIts— 3— L株を少量植菌し、 30°C、 120rpmでー晚、振盪培養を行い 前々培養液とした。次に、新鮮な乳酸発酵培地 lOOmLを 500mL容三角フラスコ〖こ いれ、各前々培養液を全量植菌し、 30°Cで 24時間振とう培養した (前培養)。続いて 、乳酸発酵培地 1Lを投入したミニジャーフアーメンターを用いて培養し L 乳酸の生 産量を定量した。ミニジャーフアーメンターを用いた培養は、以下の条件に従った。
[0197] ·醱酵装置： Bioneer—N (丸菱バイオェンジ社製）
•培養温度： 30°C
*通¼直： 0. lwm
'撹拌速度： 120rpm
•pH : 5. 0
•中和剤： IN NaOH溶液
培養開始後 40時間の培養液を採取し、 L 乳酸及びエタノール生産量の測定を 行った。また、エタノールの生産量の測定は、 Shimadzu GC- 2010キヤピラリー GC TC -1(GL science) 15 meter L. * 0.53 mm I.D., dl^l.5 mを用いて、水素炎イオン化検 出器により検出し、評価した。これらの結果を表 12に示す。
[0198] (比較例 6：野生型型 ADH1遺伝子を有する酵母による乳酸発酵）
次に、実施例 4で作製した野生型アルコール脱水素酵素を有する L5株を用いて実 施例 15と同様にジャーファメンターによる発酵試験を行 、、 L 乳酸生産量とエタノ ール生産量を測定した。これらの結果を表 12に示す。
[0199] (実施例 16：培養温度 32°Cでの温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母に よる乳酸発酵）
実施例 15で作製した形質転換体 ADH Its— 1— L株を用 、て、 ADH Its— 1— L 株の有するアルコール脱水素酵素が温度感受性を示す培養温度である 32°Cでジャ ーファメンターによる発酵試験を行い、 L 乳酸生産量を測定して温度感受性変異 型 ADH1遺伝子を有する酵母の乳酸生産量とエタノール生産量を測定した。
[0200] 乳酸発酵培地を試験管に 10mLとり、そこに ADHlts 1— L株を少量植菌し、 30 °C、 120rpmで一晩、振盪培養を行い前々培養液とした。次に、新鮮な乳酸発酵培 地 lOOmLを 500mL容三角フラスコにいれ、各前々培養液を全量植菌し、 30°Cで 2 4時間振とう培養した (前培養)。続いて、乳酸発酵培地 1Lを投入したミニジャーファ ーメンターを用いて培養し L 乳酸の生産量を定量した。この培養は、以下の条件に 従った o
[0201] ·醱酵装置： Bioneer—N (丸菱バイオェンジ社製）
•培養温度： 32°C
*通¼直： 0. lwm
'撹拌速度： 120rpm
•pH : 5. 0
•中和剤： IN NaOH溶液
培養開始後 40時間の培養液を採取し、 L—乳酸及びエタノール生産量の測定を 行った。これらの結果を表 12に示す。
[0202] [表 12]
Figure imgf000045_0001
[0203] 表 12に示すように、本発明の温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母 (AD Hits— 1— L株、 ADHlts— 2— L株、 ADHlts— 3— L株）の培養温度 30°Cにお ける培養 (実施例 15)では、野生型アルコール脱水素酵素を有する酵母 (L5株)の 同温度での培養 (比較例 6)に比較して、 L-乳酸生産量が上昇し、エタノール生産量 が低減する効果が得られたことが確認された。
[0204] また、本発明の温度感受性変異型 ADH1遺伝子を有する酵母 (ADHlts— 1— L株）の培養温度 32°Cにおける培養（実施例 16)では、培養温度 30°Cにおける発酵 試験結果 (実施例 15)よりさらに L-乳酸生産量が上昇し、エタノール生産量が低減 する効果が得られたことが確認された。
[0205] (実施例 17 : A pdcl、 A pdc5二重欠失株の作製）
NBRC10506株のゲノム DNA上に存在する PDC5遺伝子を欠失した酵母を下記 のように作製した。プラスミド PRS406を増幅铸型として、オリゴヌクレオチド (配列番 号 54, 55)をプライマーセットとした PCRにより 1. 3kbの URA3遺伝子 DNA断片を 増幅した。増幅した DNA断片を精製し、該 DNA断片を用いて NBRC10506株をゥ ラシル非要求性に形質転換した。得られた形質転換細胞はゲノム DNA上の PDC5 遺伝子が URA3遺伝子に置換されている A pdc5欠失株となっているはずである。そ れを確認するために、ゲノム DNAを増幅铸型として、配列番号 56及び配列番号 57 で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより得られた増幅産物を ァガロース電気泳動した。ゲノム DNA上の PDC5遺伝子が URA3遺伝子に置換さ れていた場合、 1. 2kbの増幅産物が得られる。一方、置換されていない場合、 1. 9k b産物が得られる。 1. 2kb産物が得られたことから、該形質転換体を PDC5遺伝子が 欠失された SWO 11株とした。 A pdcl A pdc5二重欠失株は下記のように作製した 。上記得られた SWOl 1株及び実施例 2で得られた SW029株を接合させ 2倍体細胞 を得た。該 2倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーター で子嚢を解剖し、 YPAG培地でそれぞれの胞子を生育させ、それぞれの一倍体細 胞を得た。得られた一倍体細胞の栄養要求性を調べた。目的とする Δ pdcl Δ pdc 5二重欠失株は、ゥラシルおよびトリブトファン非要求性を示すはずである。栄養供給 性を調べた結果、ゥラシルおよびトリブトファン非要求性を示した。得られたゥラシル、 およびトリプトファン非要求性株のゲノム DNAを増幅铸型とし、配列番号 58及び配 列番号 59で表されるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号 56及び配列番号 57で表さ れるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより、 PDC1遺伝子、および P DC5遺伝子が欠失されて ヽることを確認した。この Δ pdcl Δ pdc5二重欠失株を S W012株とした。 SW012株はグルコースを唯一炭素源として生育しないことを確認し た。
更にプラスミド pRS403を増幅铸型として、配列番号 54及び配列番号 55で表され るオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより 1. 3kbの HIS3遺伝子DNA 断片を増幅した。増幅した DNA断片を精製し、該 DNA断片を用いて NBRC10506 株をヒスチジン非要求性に形質転換した。得られた形質転換細胞はゲノム DNA上の PDC5遺伝子が HIS3遺伝子に置換されて!、る Δ pdc5欠失株となって!/、るはずであ る。それを確認するために、ゲノム DNAを増幅铸型として、配列番号 56及び配列番 号 57で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより得られた増幅 産物を電気泳動した。ゲノム DNA上の PDC5遺伝子が HIS3遺伝子に置換されて いた場合、 1. 3kbの増幅産物が得られる。一方、置換されていない場合、 1. 9kb産 物が得られる。 1. 3kb産物が得られたことから、該形質転換体を pdc5が欠失された SW013株とした。 A pdcl A pdc5二重欠失株は下記のように作製した。上記得ら れた SW013株及び実施例 2で得られた SW029株を接合させ 2倍体細胞を得た。該 2倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解 剖し、 YPAG培地でそれぞれの子嚢を生育させ、それぞれの一倍体細胞を得た。得 られた一倍体細胞の栄養要求性を調べた。目的とする Δ pdcl Δ pdc5二重欠失株 は、ヒスチジンおよびトリブトファン非要求性を示すはずである。栄養供給性を調べた 結果、得られたヒスチジンおよびトリブトファン非要求性株のゲノム DNAを増幅铸型と し、配列番号 58及び配列番号 59で表されるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号 56 及び配列番号 57で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより、 P DC1および PDC5遺伝子が欠失されていることを確認した。この A pdcl A pdc5二 重欠失株を SW014株とした。 SW014株はグルコースを唯一炭素源として生育しな いことを確認した。
[0207] (実施例 18 :pdc5温度感受性変異遺伝子の取得）
BY4741株のゲノム DNAを铸型として、配列番号 60及び配列番号 61で表される オリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより、 PDC5遺伝子を含む 2. 7kb の増幅 DNA断片を得た。該断片を Notlで消化し、予め Notlで消化しておいたブラ スミド pRS 316の Notl間隙に挿入した。得られたプラスミド pRS316 - PDC5によつ て、 SW013株をゥラシル非要求性に形質転換した。該形質転換体がグルコースを 唯一炭素源として生育能力が回復し、且つ 37°Cでの生育能力を有していることを確 認した。該形質転換体から、プラスミド PRS316— PDC5を常法によって回収し、 pR S316に挿入した 2. 7kbの塩基配列を常法によって決定し、 pRS316— PDC5は P DC5遺伝子が含まれて 、ることを確認した。
[0208] 次に、プラスミド pRS316— PDC5を増幅铸型とし、配列番号 62及び配列番号 63 で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとし、 BD Diversify PCR Random Muta genesis Kit (クロンテック社製)を用いた PCRにより PDC5をコードする 1. 7kbの増幅 DNA断片を得た。該 kitを用いた PCRにより、 DNA増幅時に変異導入頻度が高く なり、上記得られた 1. 7kb断片は通常の PCRで得られる断片と比較して、変異を含 む断片を含む頻度が高い。得られた 1. 7kb断片と、プラスミド pRS316— PDC5を制 限酵素 Van91I、 Bpul 1021により消化し線状化したプラスミド断片によって、 SW01 4株をゥラシル非要求性に形質転換し、 SC— Ura培地を用い 25°Cで保温することで 生育する形質転換体を選択した。ギャップ修復法を応用した方法により、上記 1. 7k b断片と線状ィ匕プラスミドが相同組み換えを起こし、再び環状化したプラスミドを獲得 した細胞のみが生育する。得られた形質転換体群を新鮮な SC— Ura培地にレプリカ し 34°Cで保温した。レプリカした形質転換体群の中で 34°Cで生育しな!ヽ形質転換体 を 2株選択し、 pdc5温度感受性変異 pdc5ts— 9、および pdc5ts— 11とした。この形 質転換体から常法によりプラスミドを回収し、上記 1. 7kb増幅 DNA断片に対応する 塩基配列を決定した。その結果、 pdc5ts— 9は、配列番号 52で表される構造遺伝子 DNAの 1697番目の塩基が C力も Tへの一塩基置換変異、また pdc5ts— 11は、配 列番号 53で表される構造遺伝子 DNAの 701番目の塩基力 から Tへの一塩基置 換変異であった。それぞれの該プラスミドを pdc5温度感受性変異アレルをもつ pRS 316— pdc5ts9、および pRS316— pdc5tsl lとした。
[0209] (実施例 19 :pdc5ts変異株の作製）
プラスミド PRS316— pdc5ts9および pRS316— pdc5tsl lを Notlで消ィ匕し、 pdc 5ts9および pdc5tsl l変異遺伝子を含む 2. 7kb断片を得た。該断片を用いて SW0 12株をゥラシル要求性に形質転換し、 5— FOA培地で 25°Cに保温し生育する形質 転換体を選択した。得られた形質転換体群を新鮮な SC培地にレプリカし 34°Cで保 温した。レプリカした形質転換体群の中で 34°Cで生育しない形質転換体を選択し、 p dc 5ts9温度感受性変異株 S WO 15株、 pdc 5ts 11温度感受性変異株 SWO 16株とし た。
[0210] (実施例 20 :pdc5ts変異株の諸性質）
PDC野生型株、 Δ pdc 1欠失株および Δ pdc 1 pdc5温度感受性株の PDC活性 を測定した。
[0211] (a)菌体からのタンパク質抽出
寒天培地上から NBRC10505株、 SW029株、 SW015株、および SW016株をそ れぞれ少量とり、 3mLの YPD液体培地に植菌し一晩培養した (前培養)。前培養液 を新し 、YPD液体培地 20mLに 1%植菌し、 lOOmL容坂口フラスコを用いて 30°C の温度で 24時間振とう培養した (本培養)。本培養液 10mLを遠心分離により集菌、 10mLのリン酸バッファーで洗浄後、 lmLのリン酸バッファーに懸濁した。上記菌体 懸濁液をエツペンドルフチューブに移し、さらに等量のガラスビーズ（SIGMA社製、 直径 0. 6mm)をカ卩え、 Micro Tube Mixer (TOMY社製）を用い 4°Cで菌体を破 砕した。このようにして菌体を破砕した後、遠心分離して得られる上清を PDC酵素液 とした。
[0212] (b) PDC活性測定
上記（a)で得られた PDC酵素液の濃度を、ゥシ IgG (l. 38mgZmL、 BIO -RAD 社製）をスタンダードとして作製した検量線をもとに BCA Protein Assay Kit (PI ERCE社製）により測定し、それぞれの PDC酵素液が 2mgZmLになるように滅菌水 で希釈した。次に、表 13に示した割合で PDC酵素液および NADHを除いた混合液 をセミミクロキュベットに分注し、測定を始める直前に PDC酵素液及び NADHをカロえ 混合した。
[0213] [表 13]
Sample 10(^l (2mg/mL)
Bu£fer(20mM bis-Tris,50mM KCl,pH6) 425μΙ
50 mM MgCI2 200μΙ (final 5mM)
2 mM Thiaminepyrophosphate 200μΙ (final 0.2mM)
10 mM NADH 30μΙ (final 0.3mM) 22 U/μΙ ADH 20μΙ
200m Pyruvate Na 25μΙ (final 5m ) 各 PDC酵素液の 340nmにおける吸光度の減少を分光光度計 (Ultrospec3300 Pro アマシャム社製）で測定し、得られた Δ の値を式（1)にあてはめ、ピルビン酸
340
ナトリウム 5mMについて、各 PDCの比活性を算出した。その結果を表 14に示す。
[表 14]
Figure imgf000050_0001
[0216] この結果、変異型 PDC5遺伝子を有する pdc5ts9温度感受性変異株 SW015株、 pdc5tsl l温度感受性変異株 SW016株の PDC比活性は、 NBRC10505株の lZ 3以下、且つ SW029株より低いことが明らかになり、 PDC5遺伝子の温度感受性変 異酵母を取得することで、 PDC比活性が低下した酵母を得ることができた。
[0217] (実施例 21 :pdc5温度感受性変異株による乳酸発酵試験 (その 1) )
上記で取得した pdc5温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。実施例 1で得 られたヒト由来の L—ldh遺伝子発現プラスミド pTRS48を用いて SW015株、および SW016株をゥラシル非要求性に形質転換することで、 pdc5温度感受性変異株にヒ ト由来の L ldh遺伝子を導入した。乳酸発酵試験には表 1に示す乳酸発酵培地を 用いた。
[0218] 生産物である乳酸の濃度の評価は、実施例 5に記載した HPLC法により行った。
[0219] また、 L 乳酸の光学純度測定は以下の条件で HPLC法により測定した。
[0220] カラム： TSK— gel Enantio L1 (東ソ一社製）
移動相： ImM硫酸銅水溶液
流速： 1. Oml/ mm
検出方法： UV254nm
温度：30°C。
[0221] また、 L 乳酸の光学純度は次式で計算される。
[0222] 光学純度（％) = 100 X (L— D) Z (L + D) ここで、 Lは L 乳酸の濃度、 Dは D 乳酸の濃度を表す。
[0223] グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬)を用いた。
[0224] 乳酸発酵試験条件を以下に示す。
[0225] 醱酵装置： Bioneer— N (丸菱バイオェンジ社製）
培地： 1L 乳酸発酵培地
培養温度： 30°C
通: ^直： 100 ml, min
撹拌速度： 200 1/min
pH : 5. 0
中和剤： IN NaOH溶液。
[0226] まず、 pTRS48を形質転換した SW015、および SW016株を試験管で 5mlの乳酸 発酵培地で一晩振とう培養した (前々培養)。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地 10 Omlに植菌し 500ml容坂口フラスコで 24時間振とう培養した (前培養)。前培養液を 発酵装置に植菌し、乳酸発酵試験を行った。その結果を表 15に示した。
[0227] (実施例 22 :pdc5温度感受性変異株による乳酸発酵試験 (その 2) )
上記で取得した pdc5温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。実施例 1で得 られた力エル由来の L ldh遺伝子発現プラスミド pTRS102を SW015株、および S W016株に形質転換することで、力エル由来の L ldh遺伝子を導入した。乳酸発酵 試験には表 1に示す乳酸発酵培地を高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)した。
[0228] 生産物である乳酸の濃度の評価には、実施例 5に記載した HPLC法により行った。
[0229] また、 L 乳酸の光学純度測定は実施例 21に記載した HPLC法により行った。
[0230] まず、 pTRS102を形質転換した SW015、および SW016株を試験管で 5mlの乳 酸発酵培地で一晩振とう培養した (前々培養)。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地 100mlに植菌し 500ml容坂口フラスコで 24時間振とう培養した (前培養)。前培養液 を発酵装置に植菌し、乳酸発酵試験を行った。その結果を表 15に示した。
[0231] (比較例 7： PDC5野生型株を用いた乳酸発酵 (その 1) )
また、対照比較例として PDC5野生型株を用いた発酵試験を行った。実施例 3で得 られた SW029ZPTRS48を用い、 pdc5温度感受性変異株と同条件で発酵試験を 行った。その試験結果を表 15に示した。
[0232] (比較例 8： PDC5野生型株を用いた乳酸発酵 (その 2) )
更に、対照比較例として実施例 3で得られた SW029ZPTRS102を用い、 pdc5温 度感受性変異株と同条件で発酵試験を行った。その試験結果を表 15に示した。
[0233] [表 15]
Figure imgf000052_0001
[0234] 以上の結果から、ヒト又は力エル由来の L— ldh遺伝子を導入した pdc5ts9温度感 受性変異株 S WO 15株、 pdc 5ts 11温度感受性変異株 SWO 16株を用 ヽて乳酸発酵 を行うと、 PDC5遺伝子欠失の SW029株を用いた場合より、乳酸の対糖収率が向上 することを示した。このことから、本発明の変異型 PDC5遺伝子を有する比活性が低 下した酵母を用いることで乳酸の効率的な生産が可能になることが明らかになった。 産業上の利用可能性
[0235]
本発明の酵母、およびその酵母を用いた乳酸の製造方法で得られる乳酸は、酒、 味噌、醤油、漬物、乳製品などの醸造製品、クェン酸、酒石酸に代替する酸味料とし て清涼飲料、医薬品などに用いられるなど、幅広い用途がある。更に、榭脂の分野に おいては、ポリ乳酸の原料としても好適に用いられており、極めて有用な物質である 本発明の酵母、およびその酵母を用いた乳酸の製造法を用いて乳酸を製造すれ ば、これら幅広い用途のある乳酸を効率的に製造することができることから、より安価 に乳酸を提供することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[I] ヒトまたは力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母。
[2] L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子力 ヒト（Homo sapiens)由来の L-乳酸脱 水素酵素をコードする遺伝子である請求項 1に記載の酵母。
[3] L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子力 ゼノプス ·レービス (Xenopus laevis)由 来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である請求項 1に記載の酵母。
[4] ヒト由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、配列番号 1に示す核酸配列を 有する遺伝子である請求項 1または 2に記載の酵母。
[5] 力エル由来の L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、配列番号 2に示す核酸配 列を有する遺伝子である請求項 1または 3に記載の酵母。
[6] L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、 L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子 の発現を可能とするプロモーターの下流に導入された請求項 1〜3のいずれかに記 載の酵母。
[7] L-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素 1遺 伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入された請求項 1〜3のいずれか に記載の酵母。
[8] 野生型 PDR13遺伝子の DNA配列の一部が欠失、挿入又は置換によって変異され 、野生型 PDR13遺伝子がコードするタンパク質の一部が翻訳される DNA配列から なる変異型 PDR13遺伝子を有する、請求項 1〜3のいずれかに記載の酵母。
[9] 野生型 PDR13遺伝子の塩基配列が、配列番号 64に示す塩基配列からなる遺伝子 である請求項 8に記載の酵母。
[10] 変異型 PDR13遺伝子力 配列番号 22に示す塩基配列力もなる遺伝子である請求 項 8に記載の酵母。
[II] 野生型 PDR13遺伝子、または、変異型 PDR13遺伝子がコードするタンパク質の一 部力 配列番号 23に示すアミノ酸一次配列力 なる請求項 8または 9に記載の酵母。
[12] 野生型アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列の一部が置換、欠失、挿入及び Z又 は付加されたアミノ酸配列からなる変異型アルコール脱水素酵素を有する酵母であ つて、該変異型アルコール脱水素酵素が、培養温度を変えることにより細胞内のアル コール脱水素酵素活性が消失又は低下する温度感受性を示す請求項 1〜3のいず れかに記載の酵母。
[13] 変異型アルコール脱水素酵素が、培養温度が摂氏 34度以上で温度感受性を示す 請求項 12に記載の酵母。
[14] 変異型アルコール脱水素酵素が、培養温度が摂氏 30度以上で温度感受性を示す 請求項 12に記載の酵母。
[15] 変異型アルコール脱水素酵素が、配列番号 39に示される野生型アルコール脱水素 酵素 1のアミノ酸配列において、 1個から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び Z 又は付加されたアミノ酸配列力もなる変異型アルコール脱水素酵素である請求項 12 に記載の酵母。
[16] 変異型アルコール脱水素酵素が、配列番号 40、配列番号 41又は配列番号 42のい ずれかに示されるアミノ酸配列力 なる変異型アルコール脱水素酵素である請求項 1 2に記載の酵母。
[17] ピルビン酸脱炭酸酵素 1をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵 素 5をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び Z又は付加され た塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5遺伝子を有する請求項 1〜3い ずれかに記載の酵母。
[18] 酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性が野生型酵母細胞内の比活性の 3分 の 1以下に低下した請求項 17に記載の酵母。
[19] 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5が温度感受性である請求項 17に記載の酵母。
[20] 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5が、摂氏 34度以上で温度感受性を示す請求項 17 に記載の酵母。
[21] 野生型ピルビン酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝子の塩基配列が、配列番号 51に 示す塩基配列からなる遺伝子である請求項 17に記載の酵母。
[22] 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素 5をコードする遺伝子が、配列番号 52又は 53のいず れかに示す塩基配列からなる遺伝子である請求項 17に記載の酵母。
[23] 酵母がサッカロミセス属（Genus Saccharomyces)に属する、請求項 1〜3のいず れかに記載の酵母。
[24] 酵母がサッカロミセス'セレビセ（Saccharomyces cerevesiae)である、請求項 1〜
24の!、ずれか 1項に記載の酵母。
[25] 請求項 1〜24のいずれかの項に記載の酵母を培養することを含む、 L-乳酸の製造 方法。
[26] 請求項 1〜24のいずれかの項に記載の酵母を 25〜37°Cで培養することを含む、 L- 乳酸の製造方法。
[27] 請求項 1〜24のいずれかの項に記載の酵母を 30〜34°Cで培養することを含む、 L- 乳酸の製造方法。
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