JP2011512154A - 還元電位および還元酵素活性が同時に増大した遺伝学的に形質転換されたバイオマス発酵用微生物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、バイオマス由来の発酵可能な糖からより効率的に、工業的に有用な生産物を生産するよう微生物の特性を高めるバイオテクノロジーに用いられる、生産性微生物の遺伝子工学に関する。ピリジンヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）を必要とする複数のデヒドロゲナーゼによる基質の酸化および還元を機能的に結びつけた操作された微生物は、電子の移動を伴う還元電位酵素活性を同時に向上させる。特に、本発明は、エタノールの生産を増大させる、２つの異なるデヒドロゲナーゼの発現のための切除可能な遺伝子発現カセットの構築に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
本発明は、バイオマス由来の糖からより効率的に、工業的に有用な生産物を生産するよう微生物の特性を高めるバイオテクノロジーに用いられる、微生物の遺伝子工学に関する。特に、本発明は、エタノールなどの代謝物の生産を高める、２つの異なるデヒドロゲナーゼの発現のための切除可能な遺伝子発現カセット及びプロモータ配列の構築に関する。
微生物が効率的な速度で商業的に重要な生産物をより高い収率で生産する能力は、関与する代謝経路において関連する代謝反応を触媒する鍵酵素の増幅、付加、又は欠失を伴う代謝工学的アプローチにより得ることができる。オキシドレダクターゼと一般に呼ばれる酵素によって触媒される、いくつもの代謝経路におけるレドックス反応は、多くの工業的に有用な化合物の生産に関与している。細胞内レドックスバランスを維持することが、細胞増殖および代謝の基本的な要件であり、また微生物が商業的に重要な代謝物を生産する際の効率性に基本的に必要であることを考慮すれば、最適なレドックスバランスの維持に関与する遺伝子を操作することは、微生物の代謝工学においてさらなるツールを提供することになる。種々の補因子の中でも、ピリジンヌクレオチド類、すなわち、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）は、普遍的な可溶の電子伝達体として働き、また、いくつかのデヒドロゲナーゼ酵素類の補因子として機能する。異化経路に関与するＮＡＤ−および同化経路に関与するＮＡＤＰ−は、基質分子の酸化（脱水素化）に伴う可逆的還元を受け、いくつかのデヒドロゲナーゼの補因子として機能する。特に、酸化された形態（ＮＡＤ+）および還元された形態（ＮＡＤＨ＋Ｈ+）でＮＡＤ−は、３００を超えるレドックス反応において補因子として機能し、異化作用において電子受容体として働くのみならず、好気呼吸および嫌気呼吸において起こるエネルギー保存レドックス反応において、細胞に還元力を与える（Fosterら, 1990）。細胞濃度よりも代謝回転の方が大きいため、これらヌクレオチドの酸化速度および還元速度のバランスをとることが、異化および同化を継続するための前提条件となる。
当業者には、嫌気条件下でのグルコースの異化に関与する発エルゴン経路が、以下に示すように、ＮＡＤＨ＋Ｈ+の生成と密接して、エネルギーを、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で生成することが知られている。
グルコース＋２ＮＡＤ+＋２ＡＤＰ＋２Ｐｉ＝２ピルビン酸＋２ＮＡＤＨ＋Ｈ+＋２ＡＴＰ＋２Ｈ2Ｏ
グルコース＋２ＮＡＤ+＋２ＡＤＰ＋２Ｐｉ＝２ピルビン酸＋２ＮＡＤＨ＋Ｈ+＋２ＡＴＰ＋２Ｈ2Ｏ
最終的にＡＴＰの生成に至る解糖系の２つのエネルギー保存反応のうち、グリセルアルデヒド３−リン酸の１，３−ビスホスホグリセリン酸への酸化は、ＮＡＤ+の還元と同時に起こるため、重要である。異化における重要な中間体でありすべての自由エネルギー源の共通の生産物であるピルビン酸が、引き続いて、（脱炭酸により）アセトアルデヒドへ変換されるか、またさらにエタノールへ変換されるか、または嫌気条件下で（還元により）乳酸へ変換されるか、または好気条件下で（酸化的脱炭酸により）アセチルＣｏＡへ変換されるかは、主に、細胞の酸化状態、およびＮＡＤＨ＋Ｈ+の酸化によりＮＡＤ+が再生する反応によって決定される。ＮＡＤ+の再生がないと、細胞は、グリセルアルデヒド３−リン酸の酸化に必要な電子受容体を使い果たし、解糖系のエネルギー供給反応が停止する。
補因子としての上記の役割に加え、ピリジンヌクレオチド補因子はまた、遺伝子発現を制御する。このため、ＮＡＤ合成を制限することによりadhEの発現は減少したが、ＮＡＤＨ濃度を増加させると、adhE遺伝子が誘導される（Leonardo, 1996）。
細胞学から生じる上記の知識の延長で、ＮＡＤ+およびＮＡＤＨ＋Ｈ+の収率および相対的代謝回転を変化させることによって細胞のレドックス電位を操作する試みがなされ、微生物による代謝物の商業的生産を調節するに向けて大きな改善があった。現在利用可能な補因子操作の戦略のほとんどは、（ａ）ＮＡＤの酸化および還元に関与するデヒドロゲナーゼ、または（ｂ）これらピリジンヌクレオチドの相対含量の向上を対象としている。
代謝経路の増幅又は遮断又は付加に向けた代謝工学的アプローチは、重要な結果をもたらした。重要なことに、余剰のＮＡＤＨの酸化におけるグリセロールの生理的役割およびＡＴＰ生成におけるエタノールの生理的役割についての我々の知識は、代謝工学においてこの上なく利用されている。
その他の中で、特定の目的とする代謝物の生産に向けたＮＡＤ+／ＮＡＤＨ比を調節することによる補因子操作の重要な例は、以下が挙げられる。
ｉ）ＮＡＤＨ＋Ｈ+のアベイラビリティを高めることにより、大腸菌（Escherichia coli）において（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）adhE遺伝子を過剰発現させることができ、発酵条件下でのエタノール生産を高めることができる（Leonardoら, 1996）。
ii）Ｌ−ラクトアルデヒドの酸化−還元間のシフトを、高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ比でピルビン酸デヒドロゲナーゼ錯体を抑制することによって制御できた（Graefら, 1999;Baldoma & Aguilar, 1988）。
iii）ＮＡＤＨ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）の過剰発現により、炭素フラックスがグリセロール生産に向かい、エタノール生産を犠牲にしてコハク酸および酢酸が生産される（Remizeら, 1999）。
iv）グリセロールおよびエタノールの収率の制御は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＤＰを過剰発現する、または破壊することによっても可能であった（Nevoigt, 1998）。
ｖ）ＧＰＤ１の破壊により、グリセロール生産が減少しエタノール生成が増加する一方で、遺伝子の過剰発現により、アセトアルデヒド生成が顕著に増大し、ピルビン酸、酢酸、アセトイン、２，３ブタンジオール、およびコハク酸の著しい蓄積があった。これらの変化は、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨの競合的再生によってなすことができた（Michnikら, 1998）。
vi）Nissenら(2000)は、サッカロミセス・セレビシエにおけるアンモニウムおよび２−オキソグルタル酸からのグルタミン酸の通常のＮＡＤＰＨ消費合成を、ＮＡＤＨおよびＡＴＰの消費によって特徴付けられる新しい経路に置き換えた。得られた酵母株は、嫌気発酵条件下での親野生型株と比べて、高いエタノール収量および低いグリセロール収量であった。
vii）ホモ乳酸発酵から混合有機酸発酵への代謝シフトが、ミュータンス菌（Streptococcus mutans）からラクトバクターラクティス（Lactobacter lactis）へ、ＮＡＤＨ酸化酵素をコードするnox2遺伝子をクローニングすることにおいてなされた。好気条件下、形質転換細胞における観測されたシフトは、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ+比を低くするＮＡＤＨ酸化のレベルによって制御された（Lopez De Felipeら, 1998）。
ｉ）ＮＡＤＨ＋Ｈ+のアベイラビリティを高めることにより、大腸菌（Escherichia coli）において（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）adhE遺伝子を過剰発現させることができ、発酵条件下でのエタノール生産を高めることができる（Leonardoら, 1996）。
ii）Ｌ−ラクトアルデヒドの酸化−還元間のシフトを、高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ比でピルビン酸デヒドロゲナーゼ錯体を抑制することによって制御できた（Graefら, 1999;Baldoma & Aguilar, 1988）。
iii）ＮＡＤＨ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）の過剰発現により、炭素フラックスがグリセロール生産に向かい、エタノール生産を犠牲にしてコハク酸および酢酸が生産される（Remizeら, 1999）。
iv）グリセロールおよびエタノールの収率の制御は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＤＰを過剰発現する、または破壊することによっても可能であった（Nevoigt, 1998）。
ｖ）ＧＰＤ１の破壊により、グリセロール生産が減少しエタノール生成が増加する一方で、遺伝子の過剰発現により、アセトアルデヒド生成が顕著に増大し、ピルビン酸、酢酸、アセトイン、２，３ブタンジオール、およびコハク酸の著しい蓄積があった。これらの変化は、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨの競合的再生によってなすことができた（Michnikら, 1998）。
vi）Nissenら(2000)は、サッカロミセス・セレビシエにおけるアンモニウムおよび２−オキソグルタル酸からのグルタミン酸の通常のＮＡＤＰＨ消費合成を、ＮＡＤＨおよびＡＴＰの消費によって特徴付けられる新しい経路に置き換えた。得られた酵母株は、嫌気発酵条件下での親野生型株と比べて、高いエタノール収量および低いグリセロール収量であった。
vii）ホモ乳酸発酵から混合有機酸発酵への代謝シフトが、ミュータンス菌（Streptococcus mutans）からラクトバクターラクティス（Lactobacter lactis）へ、ＮＡＤＨ酸化酵素をコードするnox2遺伝子をクローニングすることにおいてなされた。好気条件下、形質転換細胞における観測されたシフトは、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ+比を低くするＮＡＤＨ酸化のレベルによって制御された（Lopez De Felipeら, 1998）。
補因子依存の工業生産の極めて高い重要性を考慮して、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨなどの使用した補因子を再生するための検討もまた、なされた。その検討としては以下が挙げられる。
ｉ）酸化剤としてのアルデヒドと組み合わせ、クロストリジウムクルイベリ（Clostridium kluyveri）の細胞溶解物を用いたＮＡＤＨのインビボ再生（米国特許第４７６６０７１号）
ii）ＮＡＤＨの電気化学的再生をとりなす電極の使用（米国特許第５３９３６１５号）
iii）ポリマー骨格と共有結合したメディエータを含む被覆ポリマーの採用（米国特許第５２６４０９２号）
ｉ）酸化剤としてのアルデヒドと組み合わせ、クロストリジウムクルイベリ（Clostridium kluyveri）の細胞溶解物を用いたＮＡＤＨのインビボ再生（米国特許第４７６６０７１号）
ii）ＮＡＤＨの電気化学的再生をとりなす電極の使用（米国特許第５３９３６１５号）
iii）ポリマー骨格と共有結合したメディエータを含む被覆ポリマーの採用（米国特許第５２６４０９２号）
上記に加え、ＮＡＤＨの細胞内生産を増加させるための特定の戦略についてもまた、大腸菌において研究がなされた。これらは、（ａ）異なる酸化状態を有する炭水化物を供給すること、（ｂ）（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどの）ＮＡＤＨを用いてＮＡＤＨをめぐって競う経路を除くこと、（ｃ）ＮＡＤ+依存ギ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させてＮＡＤＨを再生すること、（ｄ）外から加えられたニコチン酸をニコチン酸モノヌクレオチドに変換するニコチン酸ホスホリボシルトランスファーゼを過剰発現させることを含む。これらのアプローチのうち、外部手段と遺伝子的手段を組み合わせることによって、すなわち、異なる酸化状態を有する異なる炭素源を、ニコチン酸ホスホリボシルトランスファーゼを過剰発現する大腸菌株に供給することによって、ＮＡＤＨアベイラビリティを変化させると、分子内ＮＡＤＨ含有量がある程度高くなった。大腸菌におけるカンジダボイジニイ（Candida boidinii）ＮＡＤ+依存ギ酸デヒドロゲナーゼの異種発現によって、グルコースまたはソルビトールから生じるＮＡＤＨの最大収量が、各基質１モルに対し、理論最大値２モルから、４および４．６モルに高められた。異種ギ酸デヒドロゲナーゼにより形質転換され炭素源としてソルビトールを用いた大腸菌（E. coli）株は、ＮＡＤＨアベイラビリティが高くなったことを反映してエタノール生産の増大を示した（Sanchezら, 2005）。
発明者らと先行技術の知識を有する科学者は、上記の検討の共通のモチーフは、解糖系またはそれに関連する経路に関与する複数のデヒドロゲナーゼのうちの１つをターゲットとすることにより、細胞のレドックスバランスに影響するＮＡＤ／ＮＡＤＨ比を変化させることにあることを十分に理解している。そこで、代謝フラックスを、エタノール、酢酸、ピルビン酸、アセトイン、ブタンジオール、またはコハク酸などの微生物代謝産物の生成に導くために、アルコールデヒドロゲナーゼまたはピルビン酸デヒドロゲナーゼまたはグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼまたはギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の操作を再分類した。しかし、これらのデヒドロゲナーゼのすべてが、補因子として還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）を利用する、基質の還元に関与している。ＮＡＤＨの生産に関与するデヒドロゲナーゼを操作するまたは過剰発現するためになされた検討は限られたものであった。
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、グリセルアルデヒド３−リン酸の１，３−ビスホスホグリセリン酸への酸化−解糖系の報酬期の最初のステップ−に関与する次の反応を触媒する。
グリセルアルデヒド３−リン酸＋無機リン酸 ＝ １，３−ビスホスホグリセリン酸
＋ＮＡＤ+ ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
グリセルアルデヒド３−リン酸＋無機リン酸 ＝ １，３−ビスホスホグリセリン酸
＋ＮＡＤ+ ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
当該反応における水素の受容体は、還元型補因子ＮＡＤＨを生じる、グリセルアルデヒド３−リン酸のアルデヒド基からＮＡＤのニコチンアミド環へのヒドリドイオン（：Ｈ-）の酵素的転移に関与するＮＡＤ+であり、基質の他の水素原子は、溶液中Ｈ+として現れる。大量の反応の標準自由エネルギー（ΔＧ0’＝−４９．３ＫＪ／ｍｏｌ）が、引き続き起こる、１，３−ビスホスホグリセリン酸が３−ホスホグリセリン酸に変換される反応において、ＡＴＰの生成に利用される。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、解糖系においてＮＡＤＨの唯一のソースであり、発酵可能な糖の利用において主要な異化経路であり、解糖系および微生物による糖新生に関与している。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、サッカロマイセス（Saccharomyces）などの発酵性産生細胞の細胞質および細胞壁内に分散する四量体である。サッカロマイセスにおいては、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２およびＴＤＨ３と名付けられた３つの非結合遺伝子（〜１ｋｂｐ）が、関連しているが同一ではない触媒的に活性なホモ４量体を、異なる特定の活性が代謝および構造のリモデリングに関与しつつ、コードする（Robertsら, 2006）。ＴＤＨ３タンパク質が、全活性の５０〜６０％を占める一方、ＴＤＨ１およびＴＤＨ２でコードされた蛋白質はそれぞれ、全活性の１０〜１５％および２５〜３０％を占める。
ＴＤＨ酵素をコードする遺伝子のうち、ＴＤＨ１およびＴＤＨ２は、染色体Ｘ上に位置し、ＴＤＨ３は、染色体ＶII上に位置する。ＴＤＨ２またはＴＤＨ３機能遺伝子の存在が細胞生存に必須であっても、これらの構造遺伝子のうち、細胞生存に個々に必須なものはない。しかし、ＴＤＨ１が、解糖系のウルトラディアン振動に関与するＧＴＳ１と相互作用して、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ２）遺伝子を欠いた酵母培養液の嫌気性増殖を高めることが報告されている（Valadiら, 2004）。ＴＤＨ遺伝子の生理的および遺伝子的役割について入手可能なこのような多数の情報にもかかわらず、ＴＤＨ遺伝子が補因子工学に関し生来有している能力については、産生微生物による商業的代謝物生産に対しては開拓されていなかった。従って、最大理論収量に近い高さでの生産物生成のために、糖異化に必要な酵素をコードする、安定なゲノムインサートや遺伝子カセットの創出が未だに要求されている。
新しい考え方に踏み入り、発明者らは、微生物の代謝生産に関する補因子の要件を立案するために、ＮＡＤＨの生産と利用に関する事象を組み合わせる検討を行った。これらの実験により、新規なＤＮＡ構築物および、ＮＡＤＨの生産と利用に関与する２つのデヒドロゲナーゼの過剰発現においてサイクリックにより大きな還元電位が継続して生産され利用される生理学的状況を作り出す方法を表現する本発明に至った。このようなアプローチは、工業的な微生物による糖からの、特定の工業的に重要な生産物の生産性を高める。当該革新的アイデアの新規性はまた、発明者らが２つの異なるデヒドロゲナーゼ酵素、１つはＮＡＤＨの生産に関与し、もう１つがＮＡＤＨの利用に関与する、を操作したという事実に関連している。このアプローチは、ＮＡＤＨを生産するか利用するかのどちらかのデヒドロゲナーゼ１つのみを対象とし、微生物代謝生産の増大に用いている上述のアプローチとは明らかに異なる。より重要なことに、このようなアプローチは、サイクリックにＮＡＤＨを生産および利用するようになり、微生物代謝生産を増大させる。なぜなら、２つの酵素は、１つの代謝経路すなわち解糖系の要素であり、２つのデヒドロゲナーゼは、生成物生成に寄与する不可欠の要素であるため、当該アプローチは、基質を生成物生成に導くことを増進させる。
本発明の目的は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモータにより駆動されるトリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）遺伝子とそれに続くＡＤＨ１プロモータにより駆動されるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）遺伝子を含む新規のＤＮＡ構築物または遺伝子発現カセットを作り出す方法を表すことにある。この遺伝子発現カセットは、モノマーとしてまたは１以上のマルチマーの複製として、還元電位の生成と付随する利用を増進し、工業的に重要な生産物の発酵生産を増大させる能力を有する。解糖系に関与する複数のデヒドロゲナーゼが結合したピリジンヌクレオチドにより酸化および還元を機能的に結びつけると、２つのデヒドロゲナーゼ間の還元電位のサイクリックな移動が促進される。本発明の別の側面は、前記２つのデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも１つをコードするかもしくは前記２つのデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも１つの発現を引き起こす、少なくとも１つの組み換えＤＮＡ分子を有する、組み換えられた細菌または酵母などの微生物を形質転換し選択する方法を表す。より多量の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ＋Ｈ+）を提供することにより還元電位のアベイラビリティが増加することは、生産物生成の速度向上に寄与し、得られる組み換え微生物は、バイオマスなどの再生可能な炭素源から、効率良く発酵生産物を生産する能力を有する。本発明の目的のために、微生物は好ましくは、酵母、糸状菌、および細菌である。好ましくは、酵母は、サッカロミセス（Saccharomyces）属であり、特に、サッカロミセス種株である。従って、新規な本発明は、遺伝子操作された工業的な微生物、遺伝子発現カセット、およびバイオマス炭水化物を変性微生物によって工業的に有用な生産物に発酵するためのプロセスを表す。本発明の一番の利点は、生体内変換に利用可能なＮＡＤＨの量を増やすことによって、変性された生物においてＮＡＤＨがサイクリックに生産されかつ利用され、高収率で発酵生産物が得られることにある。
本開示の１以上の実施態様の詳細を、添付図面と以下の記載にて記述する。他の特徴、目的および利点は、以下の記載および図面から、ならびにクレームから明らかになるであろう。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する添付図面は、本開示の１以上の実施態様を説明するものであり、詳細な説明とともに当該開示の原理と実施を説明するのに役立つものである。
本開示は、生体内変換に利用可能なＮＡＤＨの量を増やすことによって、変性された生物においてＮＡＤＨがサイクリックに生産されかつ利用され、高収率で発酵生産物が得られるよう操作された組み換え微生物について言及する。
本明細書において使用される「遺伝子」との用語は、タンパク質やリボ核酸（ＲＮＡ）などの機能的な生物学的生産物の合成に必要な情報を有するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のセグメントのことをいう。
「遺伝子操作」との用語は、遺伝子の分離、結合、導入を含む遺伝子の操作作法を含む種々の方法、および操作された遺伝子を含む選択した有機体を分離する方法を指すものとして用いられている。
ここで規定するように、「ＤＮＡ構築物」との用語は、１以上のソースから得られるデオキシリボヌクレオチドを含むデオキシリボヌクレオチド配列のことをいう。
「遺伝子発現」との用語は、関与する遺伝子に含まる遺伝子情報の効率的な転写および翻訳のことをいう。
ここで使用するように、「切除可能な遺伝子カセット」とは、還元電位および還元酵素活性が同時に増大したベクター中の遺伝子に含まれる構築物のことをいう。
ここで使用するように、「協調発現」との用語は、関与する遺伝子によってコードされた生産物の出現の細胞的な位置と時間に関し、遺伝子が同時発現することを意味する。
「プロモータ」との用語は、遺伝子を構成しているデオキシリボヌクレオチド配列の上流（５’〜３’方向）にあるデオキシリボヌクレオチド配列のことをいう。「モノマー」との用語は、（上に規定した）遺伝子発現カセットの１ユニットのことをいい、「マルチマー」は、１より多い遺伝子発現カセットのユニットを含む。
「レドックス電位」との用語は、標準的な生物学的条件下でｐＨ７．０で測定される化合物の酸化／還元電位のことをいう。当該用語はまた、電子キャリアの酸化力および還元力の尺度としても用いられ、特に、ＮＡＤおよびＮＡＤＨの標準レドックス電位（Ｅ0’＝−０．３２ボルト）、および酵素活性のための補因子としてのＮＡＤおよびＮＡＤＨに依存する酵素反応に関連している。従って、還元電位の「生成」および「利用」との用語は、還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）の生成および消失が関与する生体反応のことをいう。
ここで使用するように、「サイクリックな移動」とは、特定のデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される酸化反応および還元反応が機能的に結びつくことを伴う反応を意味する。
「組み換え」細胞または細胞集団との用語は、外因性核酸配列がプラスミドなどの送達ビヒクルを用いて導入された、細胞または細胞集団のことをいう。
ここで使用するように、「還元電位のサイクリックな移動」との用語は、還元電位の連続的な生成および利用を容易にする、操作され、組み換えられた系のことをいう。
ここでいう「微生物」の用語は、細菌または酵母の１以上の形態／種のことをいう。
「微好気性条件」との用語は、微生物が増殖可能な低酸素条件の環境のことをいう。
解糖系（ギリシャ語；glykys＝甘い；lysis＝分割）は、グルコースの嫌気分解が関与し酵素によって触媒される一連の反応を介してピルビン酸２分子を与える、偏在し、中心となる異化経路である。解糖経路は、細胞に、高エネルギー化合物、すなわちアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態でバイオエネルギーを与えるのみならず、アミノ酸、脂肪酸、コレステロールなどの生体分子の生合成に必要なＣ３前駆体を与えるため、両性代謝である。上記に加え、この嫌気代謝経路はまた、還元型ピリジンヌクレオチド−ＮＡＤＨの生成源となる。グリセルアルデヒド３−リン酸の１，３−ビスホスホグリセリン酸への変換に関与する反応を触媒するグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、糖分解でグルコースをピルビン酸に変換する際にＮＡＤＨに寄与する唯一の酵素であるため、解糖系の鍵酵素である。この生体触媒的な役割の他に、高度に保存されたタンパク質が、微小管結束促進、プロテインキナーゼの調節、ニューロン転写の活性化などの他のいくつかの重要な細胞機能に寄与する（Sastry & Rao, 2000）。グルコース分解の嫌気発酵経路において、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、酸化型ＮＡＤから還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）への還元に伴って同時に起こるアルデヒドから酸への変換に関与する酸化電位に関与する唯一の酵素である。解糖系で引き続き起こる反応においては、ピルビン酸（炭素数３の化合物）が生成する。ピルビン酸のエタノールまたは乳酸などの種々の代謝物への変換は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼによって以前に生成したＮＡＤＨの酸化を伴い、ついには、ＮＡＤ+が再生し、解糖経路が連続して作動することができるようになる（図１）。
微生物の生産性を向上させるのに寄与する還元電位を操作し、リサイクルする例として、発明者らは、サッカロミセス・セレビシエの天然遺伝子構築物を、エタノール生産の発酵能を高めるために操作した。これに関し、発明者らは、候補となる遺伝子（ＴＤＨ３およびＡＤＨ１）を操作し、一般的なＡＤＨ１プロモータの制御下に置き、制限フラグメントとして得ることが可能な、切除可能な遺伝子カセットを生成させた。このカセットは、あらゆるベクター、プラスミド、または有機体に、単一のユニット、または遺伝子量を高めることを容易にするタンデムリピートを生成する複数のユニットとして挿入することができる。高められた遺伝子量は、遺伝子が関与するデヒドロゲナーゼの合成を増進し、ＴＤＨ３に触媒される還元型補因子（ＮＡＤＨ）のアベイラビリティを高め、より高い量でＡＤＨ１酵素発現により引き起こされて酸化型ＮＡＤ+が再生する。このような急速なレドックス電位の代謝回転は、サイクリックにＮＡＤの酸化および還元が増進されることに表されるように、バイオマス由来の炭水化物を発酵させる酵母や細菌などの工業的微生物によって、エタノールなどの微生物代謝物の割合／収率を高める。
本発明の一実施態様は、共に独立してＡＤＨ１プロモータによって駆動される、サッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼとそれに続くアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子カセットを構築する方法を表す。これに関し、ＡＤＨ１プロモータは、Ostranderが過去に（1998）報告するように、ｐＤＯ１０５、すなわちＡＤＨ１プロモータを含む酵母シャトルベクターを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断することによって得た。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＴＤＨ３遺伝子と、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ１遺伝子は、実験用Ｓ．セレビシエ株（ＡＴＣＣ コロケーションＮｏ．ＢＹ４７４２）のトータルゲノムＤＮＡより増幅した。プロモータと遺伝子を、クローニングベクター（ＡＴＣＣから得られるｐＢＳＫＳ）に連続して導入し、遺伝子カセットを含む組み換えｐＢＳＫＳプラスミドの構築物を得た。遺伝子カセットを、切断時に、組み換えｐＢＳＫＳプラスミドから、ＢａｍＨＩおよびＢｇ１ＩＩを用いて切除し、酵母シャトルベクターに導入した（ＹＥｐ３５１）。得られた組み換えＹＥｐ３５１プラスミドを、ｐＮＦ０３４と称した。
本発明の別の実施態様では、Ｓ．セレビシエ株（ＡＴＣＣからのＷ３０３）を、ｐＮＦ０３４によって形質転換した。形質転換細胞を得るために、GietzおよびWoodsの方法（2004）をわずかに変更しつつ適用した。その手順は、２％イースト抽出物、４％ペプトン、および１０ｍｇ％のアデニンヘミスルフェートを含む４％デキストロースから作製された培地中で１ｍｌあたり〜１．２×１０7の濃度まで酵母細胞を培養することを含んでいた。０．１Ｍ酢酸リチウム、１００μｇの一本鎖ＤＮＡ、および３３．３％ポリエチレングリコールを含むトランスフォーメーションミックス中で、細胞に４２℃で１８０分間熱ショックを与えた。細胞を滅菌水で洗浄し、形質転換細胞を選択するために、ロイシン欠損合成培地上で、プレート培養した（Ｒｏｓｅ １９８７ａ）。形質転換細胞は、ロイシン栄養要求性変異および野生型遺伝子相補によって選別した。形質転換細胞は、組み換えｐＮＦ０３４を分離し、ＢａｍＨ１で切断することによって確認した。確認した形質転換細胞を、ｔＮＦ００６と称した。
本発明のさらに別の実施態様では、酵母形質転換細胞（ｔＮＦ００６）のエタノール生産能について発酵条件下で確認し、その親Ｗ３０３細胞と比較した。親酵母株は、パブリックドメイン（http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/media.html）で入手可能なGietz labプロトコルで特定されている、０．６７％酵母窒素塩基、１０％グルコースを含み、アミノ酸、ウラシル、アデニンヘミスルフェートが補充された完全合成培地中で培養した。ｔＮＦ００６を培養する間、形質転換細胞の栄養要求性を確認するために、ロイシンは、培地から除いた。等しい数（５×１０6個）の細胞を、２８±２℃で４８時間、上記で規定する培地５００ｍｌを含む密封ボトル中で培養した。一定時間経過後にアリコート（５０ｍｌ）を抜き取り、増殖、グルコース消費量、およびアルコール生産量を評価した。
実施例１ 組み換えプラスミドｐＮＦ０３４の構築方法
還元電位および還元酵素活性が同時に増大した遺伝子的に形質転換された微生物を得るために、組み換えプラスミドｐＮＦ０３４を構築した。このプラスミドは、共に独立してＡＤＨ１プロモータによって駆動される、サッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼとそれに続くアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子カセットを含む。添付の遺伝子配列は、共に独立してＡＤＨ１プロモータによって駆動されるサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼとそれに続くアルコールデヒドロゲナーゼをコードする切除可能な遺伝子カセットのヌクレオチドシークエンスから推定されるアミノ酸シークエンスのアラインメントを表す。ヌクレオチドシークエンス１−１５１６はＡＤＨ１プロモータを示し；ヌクレオチドシークエンス１５１７−１５５９は、ＴＤＨ３遺伝子の上流にあるＫｏｚａｋシークエンスを示し；ヌクレオチドシークエンス１５６０−２５５８は、ＴＤＨ３遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示し；ヌクレオチドシークエンス２５５９−２８１５は、ＴＤＨ３遺伝子の転写のターミネーター領域を示し；ヌクレオチドシークエンス２８１６−３１９３は、ＡＤＨ１プロモータを示し；ヌクレオチドシークエンス３１９４−４２４０は、ＡＤＨ１遺伝子のオープンリーディングフレームを示し；ヌクレオチドシークエンス４２４１−４４５１は、ＡＤＨ１遺伝子の転写のターミネーター領域を示す。転写を容易にするＳ．セレビシエのコンセンサスプロモータシークエンスは、ヌクレオチドシークエンス１３４３−１３５０および３０６６―３０７２にある。
還元電位および還元酵素活性が同時に増大した遺伝子的に形質転換された微生物を得るために、組み換えプラスミドｐＮＦ０３４を構築した。このプラスミドは、共に独立してＡＤＨ１プロモータによって駆動される、サッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼとそれに続くアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子カセットを含む。添付の遺伝子配列は、共に独立してＡＤＨ１プロモータによって駆動されるサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼとそれに続くアルコールデヒドロゲナーゼをコードする切除可能な遺伝子カセットのヌクレオチドシークエンスから推定されるアミノ酸シークエンスのアラインメントを表す。ヌクレオチドシークエンス１−１５１６はＡＤＨ１プロモータを示し；ヌクレオチドシークエンス１５１７−１５５９は、ＴＤＨ３遺伝子の上流にあるＫｏｚａｋシークエンスを示し；ヌクレオチドシークエンス１５６０−２５５８は、ＴＤＨ３遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示し；ヌクレオチドシークエンス２５５９−２８１５は、ＴＤＨ３遺伝子の転写のターミネーター領域を示し；ヌクレオチドシークエンス２８１６−３１９３は、ＡＤＨ１プロモータを示し；ヌクレオチドシークエンス３１９４−４２４０は、ＡＤＨ１遺伝子のオープンリーディングフレームを示し；ヌクレオチドシークエンス４２４１−４４５１は、ＡＤＨ１遺伝子の転写のターミネーター領域を示す。転写を容易にするＳ．セレビシエのコンセンサスプロモータシークエンスは、ヌクレオチドシークエンス１３４３−１３５０および３０６６―３０７２にある。
パート１ ＡＤＨ１プロモータのＰＢＳＫＳクローニングベクターへのクローニング
ｐＮＦ０３４の構築の最初のステップとして、ＡＤＨ１プロモータ（シークエンス番号１−１５１６）に相当するシークエンスを、ｐＤＯ１０５プラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断することにより得た。得られたフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、細菌性のクローニングベクターｐＢＳＫＳのｌａｃプロモータの制御下、マルチクローニングサイト内に位置するＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩサイトにライゲーションし、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α株に形質転換した。得られた形質転換細胞は、インデューサーとしてイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）と、発色基質として５−ブロモ−４ クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を用いて青白選択により選別した。１５１６ｂｐフラグメントを得るための、ＡＤＨ１プロモータを含む組み換えｐＢＳＫＳのＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによる制限酵素切断、ならびに関連するヌクレオチドシークエンスの照合によりＡＤＨ１プロモータを確認した。
ｐＮＦ０３４の構築の最初のステップとして、ＡＤＨ１プロモータ（シークエンス番号１−１５１６）に相当するシークエンスを、ｐＤＯ１０５プラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断することにより得た。得られたフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、細菌性のクローニングベクターｐＢＳＫＳのｌａｃプロモータの制御下、マルチクローニングサイト内に位置するＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩサイトにライゲーションし、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α株に形質転換した。得られた形質転換細胞は、インデューサーとしてイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）と、発色基質として５−ブロモ−４ クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を用いて青白選択により選別した。１５１６ｂｐフラグメントを得るための、ＡＤＨ１プロモータを含む組み換えｐＢＳＫＳのＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによる制限酵素切断、ならびに関連するヌクレオチドシークエンスの照合によりＡＤＨ１プロモータを確認した。
パート２ ＴＤＨ３遺伝子のＡＤＨ１プロモータを含む組み換えｐＢＳＫＳベクターへのクローニング
サッカロミセス・セレビシエ（ＳＧＤ Ｎｏ．ＹＧＲ１９２Ｃ）のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに相当するＯＲＦを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、酵母染色体ＤＮＡから増幅した。ＴＤＨ３遺伝子の末端を相補するプライマー（順方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１＝５’−ＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧＴＴＴＣＧ−３’；逆方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２＝５’−ＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＧＡＧＣＧＣＣ−３’）を、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４２から分離した染色体ＤＮＡからこの遺伝子を増幅するために用いた。順方向プライマーには、５’終端にＰｓｔＩの制限サイトが含まれ、逆方向プライマーには、５’終端にＥｃｏ ＲＩおよびＢｇ１ＩＩによる切断のためのサイトが含まれていた。ＰＣＲの条件は、９５℃５分の熱による開始、９５℃１分、６０℃１分、７２℃１．５分の３０サイクル、７２℃５分の終了期間とした。ＴＤＨ３遺伝子を代表するＰＣＲ生成物を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏ ＲＩにより切断し、０．５％アガロースゲルで精製した。ＴＤＨ３遺伝子を、上記の実施例１パート１で得られた組み換えｐＢＳＫＳベクターのＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩサイトにおいてＡＤＨ１プロモータ下流でライゲーションした。
サッカロミセス・セレビシエ（ＳＧＤ Ｎｏ．ＹＧＲ１９２Ｃ）のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに相当するＯＲＦを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、酵母染色体ＤＮＡから増幅した。ＴＤＨ３遺伝子の末端を相補するプライマー（順方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１＝５’−ＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧＴＴＴＣＧ−３’；逆方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２＝５’−ＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＧＡＧＣＧＣＣ−３’）を、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４２から分離した染色体ＤＮＡからこの遺伝子を増幅するために用いた。順方向プライマーには、５’終端にＰｓｔＩの制限サイトが含まれ、逆方向プライマーには、５’終端にＥｃｏ ＲＩおよびＢｇ１ＩＩによる切断のためのサイトが含まれていた。ＰＣＲの条件は、９５℃５分の熱による開始、９５℃１分、６０℃１分、７２℃１．５分の３０サイクル、７２℃５分の終了期間とした。ＴＤＨ３遺伝子を代表するＰＣＲ生成物を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏ ＲＩにより切断し、０．５％アガロースゲルで精製した。ＴＤＨ３遺伝子を、上記の実施例１パート１で得られた組み換えｐＢＳＫＳベクターのＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩサイトにおいてＡＤＨ１プロモータ下流でライゲーションした。
パート３ ＡＤＨ１遺伝子の、ＡＤＨ１プロモータおよびＴＤＨ３遺伝子を含む組み換えｐＢＳＬＳベクターへのクローニング
アルコールデヒドロゲナーゼのＯＲＦをコードするＡＤＨ１遺伝子を、そのプロモータおよびターミネーターシークエンス（ＳＧＤＮｏ．ＹＯＬ０８６Ｃ）とともに、ＰＣＲによりＳ．セレビシエの染色体ＤＮＡから増幅した。ＡＤＨ１遺伝子の末端を相補するプライマー（順方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３＝５’−ＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＣＴＣＡＣＣ−３’；逆方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４＝５’−ＧＧＣＡＴＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＴＧ ＣＣＧＧ−３’）を、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４２から分離した染色体ＤＮＡからこの遺伝子を増幅するために用いた。順方向プライマーには、５’終端にＢａｍＨＩの制限サイトが含まれ、逆方向プライマーには、５’終端にＢｇ１ＩＩによる切断のためのサイトが含まれていた。ＰＣＲの条件は、９５℃５分の熱による開始、９５℃１分、６２．９／６６．８℃１分、７２℃１．５分の３０サイクル、７２℃５分の終了期間とした。このＰＣＲ生成物を、上記の実施例１パート２で得られた組み換えプラスミドのＢｇ１ＩＩサイトにおいてライゲーションした。
アルコールデヒドロゲナーゼのＯＲＦをコードするＡＤＨ１遺伝子を、そのプロモータおよびターミネーターシークエンス（ＳＧＤＮｏ．ＹＯＬ０８６Ｃ）とともに、ＰＣＲによりＳ．セレビシエの染色体ＤＮＡから増幅した。ＡＤＨ１遺伝子の末端を相補するプライマー（順方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３＝５’−ＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＣＴＣＡＣＣ−３’；逆方向プライマー ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４＝５’−ＧＧＣＡＴＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＴＧ ＣＣＧＧ−３’）を、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４２から分離した染色体ＤＮＡからこの遺伝子を増幅するために用いた。順方向プライマーには、５’終端にＢａｍＨＩの制限サイトが含まれ、逆方向プライマーには、５’終端にＢｇ１ＩＩによる切断のためのサイトが含まれていた。ＰＣＲの条件は、９５℃５分の熱による開始、９５℃１分、６２．９／６６．８℃１分、７２℃１．５分の３０サイクル、７２℃５分の終了期間とした。このＰＣＲ生成物を、上記の実施例１パート２で得られた組み換えプラスミドのＢｇ１ＩＩサイトにおいてライゲーションした。
得られた組み換えｐＢＳＫＳベクターに存在するＡＤＨ１プロモータによって共に独立して駆動されるサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼとそれに続くアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、上記のようにして得られた遺伝子カセット（図２に記載）を、実施例１パート３で得られた組み換えプラスミドをＢａｍＨ１およびＢｇ１ＩＩで切断することによって得た。
パート４ 遺伝子カセットを含むｐＮＦ０３４の構築
ＬＥＵ２マーカー遺伝子を含む酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ３５１を、ＢａｍＨＩで切断することにより、リニアライズした。（実施例１パート３に記載の工程を経て得られた）組み換えｐＢＳＫＳベクターを、ＢａｍＨ１およびＢｇ１ＩＩで切断することによって得られた遺伝子カセットを、リニアライズしたＹＥｐ３５１のＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。得られた遺伝子カセットを含む組み換え発現プラスミドを、ｐＮＦ３０４と称した。
ＬＥＵ２マーカー遺伝子を含む酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ３５１を、ＢａｍＨＩで切断することにより、リニアライズした。（実施例１パート３に記載の工程を経て得られた）組み換えｐＢＳＫＳベクターを、ＢａｍＨ１およびＢｇ１ＩＩで切断することによって得られた遺伝子カセットを、リニアライズしたＹＥｐ３５１のＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。得られた遺伝子カセットを含む組み換え発現プラスミドを、ｐＮＦ３０４と称した。
実施例２ 酵母のｐＮＦ０３４による形質転換
サッカロミセス・セレビシエ株Ｗ３０３（MATa/MATalpha {leu2-3, 112 trp1-1 can 1-100 ura 3-1 ade 2-1 his 3-11, 15）[phi+]をＡＴＣＣ（Ｎｏ．２０００６０）より得て、遺伝子カセットが与えられたｐＮＦ３０４により形質転換した。形質転換は、GietzおよびWoods（2004）に記載をわずかに変更して行った。その手順は、２％イースト抽出物、４％ペプトン、および１０ｍｇ％のアデニンヘミスルフェートを含む４％デキストロースから作製された培地中で１ｍｌあたり〜１．２×１０7の濃度まで酵母細胞を培養することを含んでいた。０．１Ｍ酢酸リチウム、１００μｇの鮭精子ＤＮＡ、および３３．３％ポリエチレングリコールを含むトランスフォーメーションミックス中で、細胞に、４２℃で１８０分間熱ショックを与えた。２８±２℃での４８時間インキュベーションの終わりにロイシン栄養要求性変異および野生型遺伝子相補によって形質転換細胞を選択するために、洗浄した細胞を、ロイシン欠損合成培地上でプレート培養した（Rose 1987a）。同時に、親酵母株をまた、ＹＥｐ３５１単体で形質転換し、コントロールとした。組み換えプラスミドをRoseの方法（1987b）によって酵母形質転換細胞から分離した。形質転換細胞から分離した組み換えプラスミドのＢａｍＨＩによる制限切断によって、遺伝子カセットを含むベクターに相当する〜１０ｋｂフラグメントを分離した。遺伝子カセットをコードするｐＮＦ０３４をホストする、確認された酵母形質転換細胞を、ｔＮＦ００６と称した。
サッカロミセス・セレビシエ株Ｗ３０３（MATa/MATalpha {leu2-3, 112 trp1-1 can 1-100 ura 3-1 ade 2-1 his 3-11, 15）[phi+]をＡＴＣＣ（Ｎｏ．２０００６０）より得て、遺伝子カセットが与えられたｐＮＦ３０４により形質転換した。形質転換は、GietzおよびWoods（2004）に記載をわずかに変更して行った。その手順は、２％イースト抽出物、４％ペプトン、および１０ｍｇ％のアデニンヘミスルフェートを含む４％デキストロースから作製された培地中で１ｍｌあたり〜１．２×１０7の濃度まで酵母細胞を培養することを含んでいた。０．１Ｍ酢酸リチウム、１００μｇの鮭精子ＤＮＡ、および３３．３％ポリエチレングリコールを含むトランスフォーメーションミックス中で、細胞に、４２℃で１８０分間熱ショックを与えた。２８±２℃での４８時間インキュベーションの終わりにロイシン栄養要求性変異および野生型遺伝子相補によって形質転換細胞を選択するために、洗浄した細胞を、ロイシン欠損合成培地上でプレート培養した（Rose 1987a）。同時に、親酵母株をまた、ＹＥｐ３５１単体で形質転換し、コントロールとした。組み換えプラスミドをRoseの方法（1987b）によって酵母形質転換細胞から分離した。形質転換細胞から分離した組み換えプラスミドのＢａｍＨＩによる制限切断によって、遺伝子カセットを含むベクターに相当する〜１０ｋｂフラグメントを分離した。遺伝子カセットをコードするｐＮＦ０３４をホストする、確認された酵母形質転換細胞を、ｔＮＦ００６と称した。
実施例３ サッカロミセス・セレビシエのバッチ培養
Ｓ．セレビシエＷ３０３の前培養を、０．６７％酵母窒素塩基、２％グルコースを含み、アミノ酸、ウラシル、アデニンヘミスルフェートが補充された合成培地１００ｍｌ中で、単一コロニーで行い、一方で、遺伝子カセットが与えられたＳ．セレビシエｔＮＦ００６を、ロイシンを除いた上記と同じ培地で単一コロニーで培養した（http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/media.html）。前培養は、５００ｍｌ三角フラスコ中２８±２℃２００ｒｐｍで１４〜１６時間株を増殖させることによって行った。親株と形質転換株の両方について等しい量の細胞（５×１０6個）を、３通りのバッチ培養実験に用いた。Ｓ．セレビシエＷ３０３細胞は、０．６７％酵母窒素塩基、１０％グルコースを含み、アミノ酸、ウラシル、アデニンヘミスルフェートが補充された発酵培地５００ｍｌを含む６５０ｍｌストッパー付きガラス容器中で、２８±２℃で４８時間静置培養として増殖させた。培地からロイシンを除いた以外は同様の培地と条件を、Ｓ．セレビシエｔＮＦ００６の発酵に用いた。
Ｓ．セレビシエＷ３０３の前培養を、０．６７％酵母窒素塩基、２％グルコースを含み、アミノ酸、ウラシル、アデニンヘミスルフェートが補充された合成培地１００ｍｌ中で、単一コロニーで行い、一方で、遺伝子カセットが与えられたＳ．セレビシエｔＮＦ００６を、ロイシンを除いた上記と同じ培地で単一コロニーで培養した（http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/media.html）。前培養は、５００ｍｌ三角フラスコ中２８±２℃２００ｒｐｍで１４〜１６時間株を増殖させることによって行った。親株と形質転換株の両方について等しい量の細胞（５×１０6個）を、３通りのバッチ培養実験に用いた。Ｓ．セレビシエＷ３０３細胞は、０．６７％酵母窒素塩基、１０％グルコースを含み、アミノ酸、ウラシル、アデニンヘミスルフェートが補充された発酵培地５００ｍｌを含む６５０ｍｌストッパー付きガラス容器中で、２８±２℃で４８時間静置培養として増殖させた。培地からロイシンを除いた以外は同様の培地と条件を、Ｓ．セレビシエｔＮＦ００６の発酵に用いた。
実施例４：分析方法
パート１ サッカロミセス・セレビシエ株の増殖
実施例３に挙げたサッカロミセス・セレビシエ株の細胞密度を、Ｓｈｉｍａｚｕ ＵＶ−１６０１分光光度計（島津製作所，京都，日本）において６００ｎｍで４８時間の増殖時間にわたってモニターした。３つの異なる実験から得られる平均値を、図３に示す。見識のある科学者であれば、データから、親Ｗ３０３株の増殖は、遺伝子カセットが与えられたｔＮＦ００６形質転換細胞の増殖よりもはるかに少ないということが理解できるであろう。より具体的には、４８時間内の親株による増殖には、形質転換細胞により、指数対数的増殖段階の初期に約８時間内に到達することができた。さらに、４８時間の増殖の終了までに、形質転換細胞を、親株の場合に得られる０．５ユニットのＡ600に対し、約３．９ユニットのＡ600まで培養できた。親株に比べて８倍の形質転換細胞による増殖の増加は、株内でのレドックス電位の急速なリサイクル効果が現れたものであった。
パート１ サッカロミセス・セレビシエ株の増殖
実施例３に挙げたサッカロミセス・セレビシエ株の細胞密度を、Ｓｈｉｍａｚｕ ＵＶ−１６０１分光光度計（島津製作所，京都，日本）において６００ｎｍで４８時間の増殖時間にわたってモニターした。３つの異なる実験から得られる平均値を、図３に示す。見識のある科学者であれば、データから、親Ｗ３０３株の増殖は、遺伝子カセットが与えられたｔＮＦ００６形質転換細胞の増殖よりもはるかに少ないということが理解できるであろう。より具体的には、４８時間内の親株による増殖には、形質転換細胞により、指数対数的増殖段階の初期に約８時間内に到達することができた。さらに、４８時間の増殖の終了までに、形質転換細胞を、親株の場合に得られる０．５ユニットのＡ600に対し、約３．９ユニットのＡ600まで培養できた。親株に比べて８倍の形質転換細胞による増殖の増加は、株内でのレドックス電位の急速なリサイクル効果が現れたものであった。
パート２ グルコース消費量の分析
親株（Ｗ３０３）および形質転換（ｔＮＦ００６）Ｓ．セレビシエ株のグルコース消費量を、特定時間における発酵培地中の残存グルコース含有量を決定して得られた値を発酵の開始時に利用可能なグルコースの初期濃度（１０％）から引き算することによって分析した。発酵培地のアリコート（５０ｍｌ）について、１００００ｒｐｍ１５分間の遠心分離により、特定時間における酵母細胞を清澄し、これを、還元糖によって黄色がかった橙色の化合物に変換される３，５−ジニトロサリチル酸を用いたグルコース量の決定に用いた（Miller, 1972）。３つの異なる実験から得られる平均値を、図４に示す。データより、親Ｗ３０３株および形質転換ｔＮＦ００６株の両方とも、約９時間でグルコース消費（ｇ／Ｌ）が始まることがわかる。４８時間終了までの形質転換株によるその後のグルコース消費は、急速であり、培地中で利用可能なグルコースの全量の〜８４％の消費量になった。これは、４８時間の発酵終了時の親株と比べ、形質転換細胞によってグルコースが７６％多く消費されたことになり、形質転換株内のレドックス電位の急速なリサイクル効果が現れたものであった。
親株（Ｗ３０３）および形質転換（ｔＮＦ００６）Ｓ．セレビシエ株のグルコース消費量を、特定時間における発酵培地中の残存グルコース含有量を決定して得られた値を発酵の開始時に利用可能なグルコースの初期濃度（１０％）から引き算することによって分析した。発酵培地のアリコート（５０ｍｌ）について、１００００ｒｐｍ１５分間の遠心分離により、特定時間における酵母細胞を清澄し、これを、還元糖によって黄色がかった橙色の化合物に変換される３，５−ジニトロサリチル酸を用いたグルコース量の決定に用いた（Miller, 1972）。３つの異なる実験から得られる平均値を、図４に示す。データより、親Ｗ３０３株および形質転換ｔＮＦ００６株の両方とも、約９時間でグルコース消費（ｇ／Ｌ）が始まることがわかる。４８時間終了までの形質転換株によるその後のグルコース消費は、急速であり、培地中で利用可能なグルコースの全量の〜８４％の消費量になった。これは、４８時間の発酵終了時の親株と比べ、形質転換細胞によってグルコースが７６％多く消費されたことになり、形質転換株内のレドックス電位の急速なリサイクル効果が現れたものであった。
パート３ アルコール生産の分析
特定時間において抜き取って、実施例４パート３に記載のように清澄した発酵培地の清澄アリコートについて、Templeton（1994）の手順にわずかな修正を加え、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＳｈｉｍａｚｕ ＧＣ−１４Ｂガスクロマトグラフ（島津製作所，京都，日本）、およびＰｏｒａｐａｋ Ｑカラムを用いて、エタノール含有量を評価した。１０μｌのサンプル中のエタノール含有量を評価するために用いたパラメータは、１４０℃のオーブン温度、２２０℃の注入ポート温度、２２５ＫＰａに維持された窒素キャリアガスを用いた２４０℃のＦＩＤ温度、５０ＫＰａの水素および２５ＫＰａの空気である。図５に示されたデータから、Ｓ．セレビシエの親Ｗ３０３株によるエタノール生産は、３６時間後に開始されたことが明らかである。これに対して、ｔＮＦ００６形質転換細胞によるエタノール生産は、６時間という初期に開始され、４８時間の発酵時間の終了時には、最大〜４０ｇ／Ｌに達した。親Ｗ３０３株は、この期間の終了時に〜４ｇ／Ｌのエタノールのみ生産できた。４８時間終了時における形質転換細胞によるトータルエタノール生産量の１０倍の増加は、遺伝子カセットに含まれる形質転換細胞によるエタノールの過剰生産に寄与するレドックス電位のリサイクルの増加が現れたものであった。
特定時間において抜き取って、実施例４パート３に記載のように清澄した発酵培地の清澄アリコートについて、Templeton（1994）の手順にわずかな修正を加え、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＳｈｉｍａｚｕ ＧＣ−１４Ｂガスクロマトグラフ（島津製作所，京都，日本）、およびＰｏｒａｐａｋ Ｑカラムを用いて、エタノール含有量を評価した。１０μｌのサンプル中のエタノール含有量を評価するために用いたパラメータは、１４０℃のオーブン温度、２２０℃の注入ポート温度、２２５ＫＰａに維持された窒素キャリアガスを用いた２４０℃のＦＩＤ温度、５０ＫＰａの水素および２５ＫＰａの空気である。図５に示されたデータから、Ｓ．セレビシエの親Ｗ３０３株によるエタノール生産は、３６時間後に開始されたことが明らかである。これに対して、ｔＮＦ００６形質転換細胞によるエタノール生産は、６時間という初期に開始され、４８時間の発酵時間の終了時には、最大〜４０ｇ／Ｌに達した。親Ｗ３０３株は、この期間の終了時に〜４ｇ／Ｌのエタノールのみ生産できた。４８時間終了時における形質転換細胞によるトータルエタノール生産量の１０倍の増加は、遺伝子カセットに含まれる形質転換細胞によるエタノールの過剰生産に寄与するレドックス電位のリサイクルの増加が現れたものであった。
パート４ 基質消費量と生産物生成との化学量論的関係の評価
図６は、親Ｗ３０３とその形質転換細胞間での、基質（グルコース）から生産物（エタノール）への化学量論的転化率の詳細な比較を示し、次のことを明らかにしている。（ｉ）発酵初期の６時間において形質転換細胞によりグルコースからエタノールが生産されたことは、明白である。（ii）４８時間で親Ｗ３０３株によりグルコースがエタノールに変換される割合は、形質転換細胞により９時間の発酵で達成された。（iii）グルコースのエタノールへの変換の理論最大値（グルコース１モルに対しエタノール２モル）を考慮すると、このような関係は、３６時間経過時までに形質転換ｔＮＦ００６によって達成することができた。これは、還元電位の急速なリサイクルが、エタノール生産速度にプラスに影響したことを示している。
図６は、親Ｗ３０３とその形質転換細胞間での、基質（グルコース）から生産物（エタノール）への化学量論的転化率の詳細な比較を示し、次のことを明らかにしている。（ｉ）発酵初期の６時間において形質転換細胞によりグルコースからエタノールが生産されたことは、明白である。（ii）４８時間で親Ｗ３０３株によりグルコースがエタノールに変換される割合は、形質転換細胞により９時間の発酵で達成された。（iii）グルコースのエタノールへの変換の理論最大値（グルコース１モルに対しエタノール２モル）を考慮すると、このような関係は、３６時間経過時までに形質転換ｔＮＦ００６によって達成することができた。これは、還元電位の急速なリサイクルが、エタノール生産速度にプラスに影響したことを示している。
実施例５ 酵素アッセイ
パート１ グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイ
形質転換株の遺伝子カセットに存在するＴＤＨ３の過剰発現を確認するために、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をアッセイした。無細胞抽出液を、van Hoek（2000）のようにして２ｍＭのＭｇＣｌ2と１ｍＭのジチオスレイトールを含むｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で、Ｓ．セレビシエの親Ｗ３０３株および形質転換ｔＮＦ００６株より作製し、Worthington（1993）の記載のように酵素アッセイした。図７は、これについて得られた結果を示し、酵素活性が、３時間の増殖時間で２．３倍の増加〜４８時間の発酵終了時に約６．３倍の増加が観測され、顕著に増加したことを示している。形質転換細胞の場合、酵素の比活性の値が、６時間で約８．５から３６時間で約２０まで増加した。
パート１ グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイ
形質転換株の遺伝子カセットに存在するＴＤＨ３の過剰発現を確認するために、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をアッセイした。無細胞抽出液を、van Hoek（2000）のようにして２ｍＭのＭｇＣｌ2と１ｍＭのジチオスレイトールを含むｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で、Ｓ．セレビシエの親Ｗ３０３株および形質転換ｔＮＦ００６株より作製し、Worthington（1993）の記載のように酵素アッセイした。図７は、これについて得られた結果を示し、酵素活性が、３時間の増殖時間で２．３倍の増加〜４８時間の発酵終了時に約６．３倍の増加が観測され、顕著に増加したことを示している。形質転換細胞の場合、酵素の比活性の値が、６時間で約８．５から３６時間で約２０まで増加した。
パート２ アルコールデヒドロゲナーゼ活性のアッセイ
形質転換株の遺伝子カセットに存在するＡＤＨ１の過剰発現を確認するために、アルコールデヒドロゲナーゼ活性をアッセイした。無細胞抽出液を、van Hoek（2000）のようにして２ｍＭのＭｇＣｌ2と１ｍＭのジチオスレイトールを含むｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で、Ｓ．セレビシエの親Ｗ３０３株および形質転換ｔＮＦ００６株より作製し、Valle（1995）により記載された方法によって、アルコールデヒドロゲナーゼの活性をアッセイした。図８は、これについて得られた結果を示し、４８時間の発酵終了時において、ＡＤＨ酵素活性が、親Ｗ３０３と異なり形質転換細胞において約３．５倍と顕著に増加したことを示している。形質転換細胞の酵素活性は経時的に増加し、３時間後約１７（ｍｍｏｌ酸化されたＮＡＤＨ／分／ｍｇタンパク質）から４８時間後約１６９という比活性となり、４８時間の発酵で約１０倍の活性の増加を示した。
形質転換株の遺伝子カセットに存在するＡＤＨ１の過剰発現を確認するために、アルコールデヒドロゲナーゼ活性をアッセイした。無細胞抽出液を、van Hoek（2000）のようにして２ｍＭのＭｇＣｌ2と１ｍＭのジチオスレイトールを含むｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で、Ｓ．セレビシエの親Ｗ３０３株および形質転換ｔＮＦ００６株より作製し、Valle（1995）により記載された方法によって、アルコールデヒドロゲナーゼの活性をアッセイした。図８は、これについて得られた結果を示し、４８時間の発酵終了時において、ＡＤＨ酵素活性が、親Ｗ３０３と異なり形質転換細胞において約３．５倍と顕著に増加したことを示している。形質転換細胞の酵素活性は経時的に増加し、３時間後約１７（ｍｍｏｌ酸化されたＮＡＤＨ／分／ｍｇタンパク質）から４８時間後約１６９という比活性となり、４８時間の発酵で約１０倍の活性の増加を示した。
微生物の寄託
以下の微生物を、ブダペスト条約の規則に則り、２００８年１２月１１日に、インド共和国、チャンディーガル−１６０ ０３６、セクター３９−ＡのInstitute of Microbial Technologyの、ＭＴＣＣ Microbial Type Culture Collection and Gene Bankに寄託した。
微生物 株記号表示 受入番号
サッカロミセス・セレビシエ ｔＮＦ００６ ＭＴＣＣ５４５１
の２倍体株
以下の微生物を、ブダペスト条約の規則に則り、２００８年１２月１１日に、インド共和国、チャンディーガル−１６０ ０３６、セクター３９−ＡのInstitute of Microbial Technologyの、ＭＴＣＣ Microbial Type Culture Collection and Gene Bankに寄託した。
微生物 株記号表示 受入番号
サッカロミセス・セレビシエ ｔＮＦ００６ ＭＴＣＣ５４５１
の２倍体株
この開示は、特定の組成や生物学的システムに限られるものではなく、当然に変更可能であることが理解されるべきである。ここで用いられる用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであって、限定する意図はないこともまた理解されるべきである。本明細書および添付のクレームで用いられているように、単数表示の“a”“an”および“the”は、内容に明確な断りのない限り、複数の指示対象を含むものである。従って、例えば、“生合成中間体”との言及は、複数の当該中間体を含み、“核酸”との言及は、複数の当該核酸を含むものであり、“遺伝子操作されたホスト細胞”との言及は、１以上の遺伝子操作されたホスト細胞および当業者が理解する均等物の言及を含む、などである。
特に断りのない限り、ここで使用するすべての技術用語および科学用語は、当該開示が属する分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。ここで記載されたものと同様のまたは均等のいかなる方法および材料が、当該開示の試験の実施に用いることができるが、ここでは、適した材料および方法の特定の例について記載した。ここで挙げた刊行物は、引用する刊行物が関連する方法および材料を開示および記載するものとして、参照としてここに組み込まれる。
上記の実施例は、当該開示の装置、システム、および方法の実施態様をいかにして作製して使用するかの完全な開示と説明を当業者に与えるためのものであって、本発明者らが開示であるとみなしているものの範囲を限定することが意図されているものではない。当業者に自明な開示を実行するための上記の様式の変更は、以下の請求の範囲内にあることが意図されている。明細書で挙げた全ての特許公報および刊行物は、当該開示が属する分野の当業者の技術レベルの指標となるものである。当該開示において引用された全ての文献は、各文献が個々に完全な形で参照として組み込まれるようにして、参照として組み込まれる。
背景技術、詳細な説明および実施例で引用した各文献（特許公報、特許出願、学術論文、要約、研究マニュアル、単行本、他の開示等を含む）の開示の全体が、ここに参照として組み込まれる。さらに、ここに提出した配列表のハードコピーおよびコンピュータで読み取り可能なその対応物も共に、完全な形で参照として組み込まれる。
本開示の特定の実施態様がここで明確に開示されているが、上記の明細書および実施例は、説明のためのものであって、これに制限されるものではない。当該開示の精神と範囲を外れることなく、種々の変更を行ってもよいことが理解されるであろう。当該開示の多くの変更は、本明細書と以下の実施態様を検討することにより当業者に明確になるであろう。当該開示の全範囲は、均等物の全範囲と共に実施態様と、上記の変更と共に明細書とを参照して決定されるべきである。従って、他の実施態様も以下の請求の範囲内にある。
参考文献
特許文献
米国特許第７０９１０１４号明細書Ｂ１ ８／２００６ Aristidouら
米国特許出願第０２５７９８３号明細書Ａ１ １１／２００６ Broら
米国特許出願第０００９０３４号明細書Ａ１ １／２００８ Sanら
米国特許出願第４７６６０７１号明細書 ８／１９８８ Simonら
米国特許出願第５２６４０９２号明細書 １０／１９９３ Skotheimら
米国特許出願第５３９３６１５号明細書 ２／１９９５ Coreyら
特許文献
米国特許第７０９１０１４号明細書Ｂ１ ８／２００６ Aristidouら
米国特許出願第０２５７９８３号明細書Ａ１ １１／２００６ Broら
米国特許出願第０００９０３４号明細書Ａ１ １／２００８ Sanら
米国特許出願第４７６６０７１号明細書 ８／１９８８ Simonら
米国特許出願第５２６４０９２号明細書 １０／１９９３ Skotheimら
米国特許出願第５３９３６１５号明細書 ２／１９９５ Coreyら
他の刊行物
Baldoma L and Aguilar J. Metabolism of L-fucose and L-rhamnose in Escherichia coli: aerobic-anaerobic regulation of L-lactaldehyde dissimilation. J. Biotechnol. 1988, 170: 416-421.
Foster J. W. et al., Regulation of NAD metabolism in Salmonella typhimurium: Molecular sequence analysis of the bifunctional nadR regulator and the nadA-pnuC operon. J. Bacteriol. 1990. 172: 4187-4196.
Gietz R.D. and Woods R.A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Meth. Enzymol. 2004, 350: 87-96.
Graef M.R. et al., The steady-state internal redox state (NADH/NAD) reflects the external redox state and is correlated with catabolic adaptation in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1999. 181: 2351-2357.
Leonardo M. R. et al. Role of NAD in regulating the adh E gene of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1996, 178: 6013-6018.
Lopez De Felipe, F et al. Cofactor engineering: A novel approach to metabolic engineering in Lactococcus lactis by controlled expression of NADH oxidase. J. Bacteriol., 1998, 180: 3804-3808.
Maestre O et al. Effects of ADH2 overexpression in Saccharomyces bayanus during alcohol fermentation. Appl. Environ. Microbiol., 2008, 74: 702-707.
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Valadi H. et al. NADH reductive stress in Saccharomyces cerevisiae induces the expression of minor isoform of Triosephosphate Dehydrogenase 1. Curr. Genet. 2005. 45: 90-95
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Claims (13)
- アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモータによって駆動されるトリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）遺伝子とそれに続くＡＤＨ１遺伝子を含み、当該２つの遺伝子がＡＤＨ１プロモータにより駆動される、工業的発酵生産物の生産性を高めるためのＮＡＤＨ補因子系のサイクリックな再生のための遺伝子カセット構築物。
- 請求項１に記載の遺伝子カセット構築物の構築方法であって、遺伝子がタンデムに配置される方法。
- 請求項１に記載の遺伝子カセット構築物の構築方法であって、ＴＤＨ３とＡＤＨ１の両方を含む遺伝子カセットを、マルチマー化することが可能な方法。
- 請求項１に記載の遺伝子カセット構築物の構築方法であって、遺伝子が誘導可能なプロモータにより駆動される方法。
- 前記カセット中の候補となる遺伝子を、誘導可能なまたは誘導不能なタイプの他の任意のプロモータシークエンスにより駆動可能な請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子が、ホスト酵母株にエピソーム組込物または染色体組込物として導入されている請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子カセットが、エタノール、乳酸、および他の発酵生産物の生産のためのホスト酵母株に導入されている請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の、一倍体株、二倍体株、または倍数体株に導入されている請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ、ピチア属（Pichia sp.）、ハンゼンスラ属（Hansensula sp.）、クルベロマイセス属（Kluveromyces sp.）を含むいずれかの酵母属を形質転換するために用いられる請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子カセットがグルコースを炭素源として利用するための任意のホスト酵母株を形質転換するのに用いられる請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子カセットが任意の単糖類を炭素源として利用するための任意のホスト酵母株を形質転換するのに用いられる請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子を、ホスト細胞中の還元当量を最適化するために原核ホスト中での発現のための原核プロモータによって駆動可能な請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
- 遺伝子が、５０以上２００以下の塩基対の転写不能なシークエンスにより分離される請求項１に記載の遺伝子カセット構築物。
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| CN113897382B (zh) * | 2021-09-01 | 2023-10-20 | 浙江工业大学 | 辅酶自足型大肠杆菌及其构建方法与应用 |
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