CN110551672B - 高产反式-4-羟基-l-脯氨酸的大肠杆菌菌株及其构建方法 - Google Patents

高产反式-4-羟基-l-脯氨酸的大肠杆菌菌株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的大肠杆菌菌株的构建及应用。技术方案为：一种高产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的大肠杆菌，在所述大肠杆菌中引入L‑脯氨酸‑反式‑4‑羟化酶基因；所述大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因、aceA基因被敲除；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；对proB基因引入I69E突变。使用本发明构建的工程菌及发酵方法，可以葡萄糖为原料，在不外加L‑脯氨酸等底物的情况下，从头开始高效合成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸，最高产量可达4.82g/L。

Description

高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株的构建及应用。
背景技术
反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline，简称HYP)是L-脯氨酸的4-羟基化产物，是胶原蛋白的主要组成氨基酸，被广泛应用于医药、化工、饲料、食品营养和美容等行业。HYP的主要制备方法为酸水解法：以胶原蛋白为原料，通过酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程获得。但存在原料消耗量大、三废排放量大、能耗高、终产物纯度低、生产成本高等缺点。另外，虽然也可通过化学合成的方法制备HYP，但又存在合成路线较长、成本太高、难以产业化等缺陷。与之相对的，微生物发酵法因具有原料成本低、反应条件温和、易大规模生产等优势，逐渐成为广受关注的化合物合成新方法；为HYP的合成提供了新思路。
Yulan Yi等将来源于不同物种的L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因(P4H)构建到大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌表达载体上，直接转化大肠杆菌BL21(DE3)或者谷氨酸棒杆菌，在MEC培养基中进行摇瓶发酵。结果发现，来源于指孢囊菌RH1的P4H活性最好，其在大肠杆菌中生成的HYP的量最高--在不添加脯氨酸的情况下，OD600nm为6.5左右时，HYP的产量可以达到470mg/L；当添加浓度为4mM的脯氨酸时，同等水平摇瓶发酵，HYP的产量可以达到6.72g/L。脯氨酸的含量是大肠杆菌中限制HYP生物合成的重要因素。
国内的盛花开等将不同来源的proB、proA、proC、P4H基因，通过重叠延伸PCR串联基因并连接pET-28a载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，培养基不添加L-脯氨酸时，摇瓶水平发酵24小时，E.coli BL21/pET-28a-Bamg中HYP的产量达到0.29g/L，添加4mM的L-脯氨酸时，产量可以达到0.74g/L。
现有技术虽然已实现了不外加L-脯氨酸的情况下生产HYP，但其产量最高也只有0.29g/L，无法真正实现工业生产。综上，提供一种可大幅提高HYP产量的微生物发酵法，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株构建及应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，在所述大肠杆菌中引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因；所述大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因、aceA基因被敲除；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；对proB基因引入I69E突变。
优选的，所述大肠杆菌的aceK基因被敲除。
优选的，所述大肠杆菌的gdhA基因的启动子和5＇UTR序列被编辑。
优选的，所述大肠杆菌的icd基因的启动子和5＇UTR序列被编辑。
相应的，一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)敲除大肠杆菌BL21(DE3)的putA基因，引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因，获得工程菌21-S1；
(2)敲除所述工程菌21-S1中的poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因和adhE基因，获得工程菌21-S2；
(3)敲除所述工程菌21-S2中的aceA基因，获得工程菌21-S3；
(4)对所述工程菌21-S3的proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，对proA基因的5＇UTR序列进行编辑，对所述proB基因引入I69E突变，获得工程菌21-S4；
(5)敲除所述工程菌21-S4中的aceK基因，获得工程菌21-S5；
所述21-S5即为所需的大肠杆菌。
优选的，所述步骤(5)后还包括如下步骤：
(6)对所述工程菌21-S5中gdhA基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，获得工程菌21-S6；
(7)对所述工程菌21-S6的icd基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，获得工程菌21-S7；
所述21-S6或21-S7即为所需的大肠杆菌。
优选的，所述步骤(7)后还包括如下步骤：
(8)对所述工程菌21-S7的acnB基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，并将gltA基因第164位精氨酸对应密码子cgc替换为亮氨酸密码子ctg，获得工程菌21-S8；或；
(9)将所述工程菌21-S7的argA基因的5＇UTR替换为强度为1％的5＇UTR，获得工程菌21-S9；或；
(10)将所述工程菌21-S8的argA基因的5＇UTR替换为强度为1％的5＇UTR，获得工程菌21-S10；
所述21-S8或21-S9或21-S10即为所需的大肠杆菌。
优选的，所述对proB、proC、proA基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑的方法为：
将proB和proC基因的原始启动子替换为BBA-j23100；将proA和proB、proC的5＇UTR替换为v5-UTR。
优选的，所述对工程菌21-S5中gdhA基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑的方法为：将gdhA基因的启动子替换为BBa-J23100，将gdhA基因的5＇UTR替换为：ACCCGGGGTGAAAGGAGGTATTTTA；或；
所述对工程菌21-S6的icd基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑的方法为：将icd基因的启动子替换为BBa-J23100；将icd基因的5＇UTR替换为：AGAAACAAAGTGAGGAGGAGGTAAA。
相应的，所述大肠杆菌在产反式-4-羟基-L-脯氨酸上的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明将大肠杆菌L-脯氨酸的生物合成途径地分为三部分，并针对每部分的特定基因进行基因敲除或改造，最终构建了一种高产HYP的大肠杆菌。具体构建方法为：
利用CRISPR/Cas9基因敲除系统和λ-red基因重组系统，将大肠杆菌糖酵解途径中的基因pflB(丙酮酸甲酸裂解酶)、ldhA(乳酸脱氢酶)、poxB(丙酮酸氧化酶)、pdhR(DNA结合转录双调节因子)、adhE(乙醇脱氢酶)、pta(磷酸转乙酰基酶)进行敲除，使乙酰辅酶A的产量提高。
将大肠杆菌三羧酸循环(TCA)中的基因aceA(异柠檬酸裂解酶)、aceK(异柠檬酸脱氢酶激酶)进行敲除，将大肠杆菌三羧酸循环(TCA)的基因gltA(柠檬酸合酶)、acnB(乌头酸水合酶)、icd(NADP+特异性异柠檬酸脱氢酶)进行改造，使α-酮戊二酸的产量提高。
将大肠杆菌利用α-酮戊二酸转化为L-脯氨酸过程中的基因gdhA(NADP-特异性谷氨酸脱氢酶)、proB(γ-谷氨酸激酶)、proC(吡咯啉-5-羧酸还原酶)、proA(γ-谷氨酰磷酸还原酶)、argA(氨基酸N-乙酰转移酶和活性乙酰谷氨酸激酶)进行改造；将putA(脯氨酸脱氢酶)基因敲除，最终使菌株积累更多的L-脯氨酸。向上述工程菌中引入构建在载体pTric-HisB上的源于指孢囊菌RH1D的脯氨酸羟化酶(P4H)，即获得可高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌。
2、本发明同时提供了一种利用构建的工程菌的发酵高效生产HYP的方法，具体采用了LB和mMCG培养基结合的两步发酵法。使用该方法制备HYP，可以葡萄糖为原料，在不外加L-脯氨酸等底物的情况下，从头开始高效合成HYP，获得最高为4.82g/L的HYP产量，效果与外加底物时相当。
附图说明
图1为本发明的菌株构建路线图；
图2为氯胺T法测定反式-4-羟基-L-脯氨酸浓度的标准曲线。
具体实施方式
如图1所示的，本发明将大肠杆菌L-脯氨酸的生物合成途径地分为三部分：(1)第一部分为糖酵解部分，从丙酮酸到乙酰辅酶A；(2)第二部分为TCA循环部分，从乙酰辅酶A到α-酮戊二酸；(3)第三部分为α-酮戊二酸到L-脯氨酸的产生过程。本发明对L-脯氨酸生物合成途径中的所述各部分分别进行相关基因的编辑，获得相关菌株，并引入构建在载体pTric-HisB上的、源于指孢囊菌RH1D的脯氨酸羟化酶(P4H)，即获得可高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌。
具体基因编辑方法包括：
(1)敲除E.coli BL21(DE3)中putA基因，以降低细胞内L-脯氨酸的分支代谢。
(2)再对糖酵解部分进行改造，敲除参与醋酸合成的poxB基因和pta基因；敲除参与甲酸合成的pflB基因、参与乳酸合成的IdhA基因、参与乙醇合成的adhE基因及负调控丙酮酸脱氢酶多酶复合物的转录因子pdhR。使糖酵解途径的代谢流向乙酰辅酶A，积累更多的乙酰辅酶A。
(3)对于TCA循环部分，主要有gltA基因、acnB基因和icd基因参与乙酰辅酶A到α-酮戊二酸的过程。对参与柠檬酸生成的gltA基因、参与异柠檬酸生成的acnB基因和参与α-酮戊二酸生成的icd基因分别进行启动子和5’UTR基因改造。将影响icd基因活性的异柠檬酸脱氢酶激酶aceK敲除，提高icd基因的活性；将参与异柠檬酸分支代谢的aceA基因敲除，使乙酰辅酶A到α-酮戊二酸的过程能够积累更多的α-酮戊二酸。
(4)对于α-酮戊二酸到L-脯氨酸的过程，主要有gdhA、proC、proB、proA参与，将参与谷氨酸形成的gdhA、参与γ-谷氨酸磷酸形成的proB、参与L-脯氨酸形成的proC基因分别进行启动子和5＇UTR的改造，对参与谷氨酸γ-半醛形成的proA基因进行5＇UTR的改造，从而增加L-脯氨酸的产量。向上述工程菌中引入构建在载体pTric-HisB上的、源于指孢囊菌RH1D的脯氨酸羟化酶(P4H)即获得可高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌。
通过上述方法，最终实现在不外源添加L-脯氨酸情况下，高产率合成反式-4-羟基-L-脯氨酸，有效降低发酵成本。
下面结合具体的实施例，对本发明进行进一步阐释。其中，实施例中涉及的各培养基、溶液及测定方法如下所示：
(1)LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl。
(2)mMCG培养基：葡萄糖10g/L，甘油10mL/L，尿素10g/L，玉米浆15g/L，KH2PO41.5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L,FeSO4·7H2O 1mM，MnSO4·4H2O 10mg/L,ZnSO4·7H2O 10mg/L,VB1 100μg/L。
(3)氨苄抗性平板：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，15g/L琼脂，100mg/L的氨苄青霉素。
(4)卡那霉素抗性平板：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，15g/L琼脂，50mg/L的卡那霉素。
(5)壮观霉素抗性平板：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，15g/L琼脂，50mg/L的壮观霉素霉素。
(5)双抗性平板：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，1g/LNaCl，15g/L琼脂，50mg/L的卡那霉素和50mg/L的壮观霉素。
(6)柠檬酸缓冲液：将5g柠檬酸，2.63g NaOH和14.61g乙酸钠溶于水中至100mL，然后与20mL水以及30mL正丙醇混合。
(7)氯胺T溶液：将1.41g氯胺T溶于10mL水中，依次加入10mL正丙醇和80mL柠檬酸缓冲液。
(8)显色剂溶液：将10g对二甲氨基苯甲醛用35mL高氯酸溶解，再加入65mL异丙醇。
(9)反式-4-羟基-L-脯氨酸的测定方法(氯胺T法)：在500ul稀释至所需浓度的(稀释250倍)上清液中加入200ul所述氯胺T溶液，摇匀后25℃孵育20min。然后加入500ul显色剂溶液；摇匀后60℃孵育20min.反应结束后冷却至室温，560nm波长处测定吸光值。
实施例一：反式-4-羟基-L-脯氨酸标准曲线的绘制
将浓度为1g/L的反式-4-羟基-L-脯氨酸标准品进行梯度稀释，分别稀释成15mg/L、7.5mg/L、3.75mg/L、1.875mg/L、0.9375mg/L、0.46875mg/L、0.02343mg/L的浓度，以H2O作为空白对照，按照氯胺T法测定出不同浓度的反式-4-羟基-L-脯氨酸相对应的560nm的吸光度值。绘制标准曲线，计算标准曲线公式以及R2值，结果如图2所示。再以标准曲线拟合出来的公式计算反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
实施例二：质粒pTrcHisB-P4H的构建
采用OPTIMWIZ软件对来源于指孢囊菌属(Dactylosporangium.sp.RH1)的L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因(P4H)进行密码子优化，使其能在大肠杆菌中更好地表达，并进行全基因合成。具体优化路线如下：
使用金唯智公司的在线软件OPTIMWIZ进行L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因(P4H)的密码子优化，将密码子适应指数(CAI)由0.77调整到0.94(由公司完成)；使得最优密码子使用频率(FOP)使用频次在90～100的比例达到80％以上，使用频次在80～100的比例达到90％以上；将GC含量由0.74调整为0.59，去除影响核糖体结合的二级结构(由公司完成)。最终，使P4H基因转录的mRNA的稳定性增加，蛋白的翻译水平得到提高。以密码子优化后全基因合成的DNA作为模板，用5’端带有SacI酶切位点，3’端带有BamHI酶切位点的一对引物(P4H-pTrc-F和P4H-pTrc-R)进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收后和pTrcHisB载体分别以SacI和BglII进行酶切，回收后连接转化，最终构建成pTrcHisB-P4H质粒，测序确定P4H序列正确性，并提质粒待用。
P4H带酶切位点引物序列为：
P4H-pTrc-F：GCGAGCTCGATGCTGACCCCGACCGA；
P4H-pTrc-R：GCGAGCTCGATGCTGACCCCGACCGA。
实施例三：菌株21-S1的构建
以10％甘油制备大肠杆菌BL21(DE3)电转感受态细胞，具体方法为：大肠杆菌BL21(DE3)保菌菌液接种5ul至3ml培养基中活化过夜。然后接种50ul菌液至50ml LB培养基中，37℃，230rpm培养。培养至OD600nm＝0.5～0.7时，将菌液取出，置于冰上冰浴20min.将菌液转移至50ml灭菌离心管中，4℃，5000rpm，5min离心，弃上清液。用灭菌的50ml冰水重新悬浮细胞,吸吹清洗细胞。然后4℃，5000rpm，5min离心，弃上清液。再用25ml已灭菌的10％甘油重新悬浮细胞，4℃，5000rpm，5min离心弃上清液。再用20ml灭菌的10％甘油重新悬浮细胞，然后4℃，5000rpm，5min离心，弃上清液。最后用2ml灭菌的10％甘油重新悬浮细胞，分装150ul细胞液于EP管中，-80℃保存。即获得大肠杆菌BL21(DE3)的电转感受态细胞。在所述大肠杆菌BL21(DE3)电转感受态细胞中转入pKD46质粒，以卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。将挑选的阳性克隆活化，在菌长到OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，30℃诱导1小时，使λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达，收菌，制成感受态细胞。设计带有putA基因(Gene ID：945600)编码区上下游50bp同源臂的引物，所述引物为：
putA-H1P1:GACCACGTTAAAGATGCCGGAGGAGGTTGTAACATCCTCCGGCTACCTGTAGCGATTGTGTAGGCTGGAG；
putA-H2P2:ACGATAACGTTAAGTTGCACCTTTCTGAACAACAGGAGTAATGGCATGGGAATTAGCCATGGTCC。
用于扩增pKD4上priming site 1和2间的序列，回收扩增的DNA片段，并转化BL21(DE3)包含pKD46的感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上以30℃条件培养过夜，以鉴定引物通过菌落PCR筛选putA基因敲除的BL21菌株的阳性克隆。所述鉴定引物为：
putA-KO-idf-F GCGGATTATTATTGAGGGGATTCGA；
putA-KO-idf-R CGCATGTCACATTTAACATGGTTGC。
敲除成功的菌PCR片段长度为1.6Kb；敲除不成功的菌PCR片段长度为4.1Kb。将PCR产物测序，确定为正确敲除。将pCP20载体用化学转化的方法转入putA已成功被卡那霉素抗性基因替换的单克隆中，30℃培养过夜，再提高温度至42℃过夜。将菌液涂布在无抗性LB平板上，待有单克隆长出后，挑取同一个单克隆分别划线于卡那霉素和氨苄抗性平板上。对在卡那霉素和氨苄抗性平板上未生长的单克隆用所述鉴定引物PCR进行鉴定。以可在无抗性LB平板上生长但无法在卡那霉素和氨苄抗性平板上生长的单克隆为阳性克隆，挑取阳性克隆，获得BL21(ΔputA)工程菌，将BL21(ΔputA)工程菌制备电转感受态，电转入pTrcHisB-P4H质粒，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆，即获得工程菌21-S1。
上述pKD46、pKD4和pCP20的敲除系统均来源于文献Scientific Reports.2014.4:6640.DOI:10.1038/srep06640，为作者惠赠。氨苄青霉素购自生工生物科技有限公司，使用终浓度为100mg/L。卡那霉素购自生工生物科技有限公司，使用终浓度为50mg/L。
实施例四：菌株21-S2的构建
采用CRISPR/Cas9单质粒敲除系统将21-S1菌株中poxB基因敲除，然后采用pCas、pTarget-F双质粒敲除系统将ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因和adhE基因敲除。
敲除poxB基因具体过程如下：以10％的甘油制备菌株21-S1的感受态，然后将包含有poxB N20序列和donor DNA序列的pRed-Cas9-poxB300质粒电转到21-S1感受态细胞中，再在100ul 21-S1感受态细胞中加入1mL LB培养基，30℃，180rpm活化1h。取活化菌液涂布在含有10g/L葡萄糖的卡那霉素平板上，30℃培养。挑选卡那霉素平板上的单克隆，在卡那霉素培养基(液体)中活化2h，2h后加入终浓度为2g/L的阿拉伯糖，诱导λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)和Cas9蛋白表达。6h后，取活化菌液涂布含有阿拉伯糖的卡那霉素平板，30℃活化过夜。以鉴定引物通过菌落PCR筛选poxB基因敲除的21-S1菌株的阳性克隆：所述鉴定引物为：
poxB KO-idf-F：GCCTCCTTTCTCTCCCATCCCT；
poxB KO-idf-R：CGGGTAACGGTATCACTGCGT。
敲除成功的菌PCR出来的片段长度为1008bp；敲除不成功的菌PCR出来的片段长度为1521bp；测序以确定敲除成功的菌。将鉴定为敲除成功菌株的单克隆在LB培养基中42℃培养过夜，将菌液涂布在无抗性LB平板上，挑无抗性平板上长出的单克隆，划线于卡那霉素平板上，若是在无抗性平板上生长，但在卡那霉素平板上不生长的单克隆，则为阳性克隆，对其用鉴定引物PCR进行鉴定。即获得敲除了poxB基因并消除pRed-Cas9-poxB300质粒的菌株，编号21-S2a。
上述CRISPR/Cas9单质粒敲除系统来源于文献Microbial Cell Factories 201615:205DOI 10.1186/s12934-016-0605-5，为作者惠赠。
在21-S2a菌株的基础上，利用pCas、pTarget-F双质粒敲除系统敲除ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因和adhE基因。具体过程如下：以10％的甘油制备21-S2a菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与敲除目的基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donor DNA片段，30℃活化11h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的双抗性平板上，30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因敲除的阳性克隆。
所述pTargetF质粒的获得方法为：以原始pTargetF质粒为模板，用设计的带有N20序列的正向引物，及与质粒序列互补的反向引物扩增获得。带有N20序列的质粒pTargetF扩增的正向引物为：
5＇-TCCTAGGTATAATACTAGT-N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3＇。
带有N20序列的质粒pTargetF扩增的反向引物(后续所有待敲除基因片段均使用此反向引物)：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇。
上述待敲除基因ldhA、pflB、pta、pdhR、adhE的pTargetF质粒扩增正向引物分别如下：
pT-N20-ldhA-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTGCCGTTGCTGAACACGCCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
pT-N20-pflB-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTGCCGTTGATTGCGTACAGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
pT-N20-pta-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTCAGCTGATCAAAACTGCACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
pT-N20-pdhR-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTACGTTGAATCGCCTCACGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
pT-N20-adhE-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTATCAACCTGATCCTCGCGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
所述donor DNA的获得方法为：以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用设计的引物进行片段的扩增，并使用OE-PCR方法将扩增得到的片段进行连接，即获得所述donor DNA序列。所述用于扩增donor DNA序列引物分别如下：
ldhA up-F:GCTTTTTTTGAGGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGA；
ldhA up-R:GAAATACTGGTCACTACTTTCAGCCCCAGTTCTTTTG；
ldhA down-F:GGCTGAAAGTAGTCTGACCAGTATTTCTCAGACTACGC；
ldhA down-R:ACGCGTCGACGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTT；
pflB up-F:CATCGGTGACTACCGTCGCGTTGCG；
pflB up-R:GAATCGGTTTAACGGTGGAGGTACGACCGAAGGACA；
pflB down-F:CGTACCTCCACCGTTAAACCGATTCGTGACGAAGAC；
pflB down-R:GAGGCTACTGCACCTTTCTGGTCAC；
pta up-F:GGCAGCCATGAACGGCGTAGAAATC；
pta up-R:AGATTACTGCTGCGATAACGGAACGCAGGCGGAGAC；
pta down-F:GCGTTCCGTTATCGCAGCAGTAATCTCGTCATCATCCG；
pta down-R:CTTCCTGACTGTCAAACATCCCCACC；
pta down-F:GCGTTCCGTTATCGCAGCAGTAATCTCGTCATCATCCG；
pta down-R:CTTCCTGACTGTCAAACATCCCCACC；
pdhR up-F:GGTAAGTGAATCGGTTCAATTCGGATT；
pdhR up-R:GATGGCGATGCGATCAATCACATCGGAGAGTTTTGGT；
pdhR down-F:CCGATGTGATTGATCGCATCGCCATCTGGCCTTTATC；
pdhR down-R:GATCGGATCCACGTCATTTGGGAAAC；
adhE up-F:GCCAGTTTCACTCAAGAGCAAGTAGAC；
adhE up-R:GTTTTCTTGTTGAGCGATTTGAAGATAGCAGTTGAAGT；
adhE down-F:ATCTTCAAATCGCTCAACAAGAAAACCGTTGCTAAGC；
adhE down-R:CGATAATCACGTCTGGTTTGAAGGAGT。
将菌落PCR验证的阳性克隆进行测序，测序正确后的克隆再在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷；0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的单克隆，即为消除了pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，将菌液涂布在LB培养基上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上。在卡那霉素平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株。该菌株即为工程菌株21-S2。
本专利所述双质粒敲除系统均为pCas、pTarget-F双质粒敲除系统，此敲除系统来源于文献Applied and Environmental Microbiology DOI:10.1128/AEM.04023-14，由作者惠赠。
实施例五：菌株21-S3的构建
在21-S2菌株的基础上，利用所述双质粒敲除系统敲除aceA基因。具体过程如下：以10％甘油制备21-S2菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒，30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与aceA基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donor DNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的双抗性平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因敲除的阳性克隆。
上述待敲除基因aceA的pTargetF质粒扩增引物如下：
pT-N20-aceA-F:
TCCTAGGTATAATACTAGTAGTTCACTTCGAAGATCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
pT-N20-aceA-R:5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇。
敲除aceA基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
aceA up-F:CCACTTCCGATGAGTTAATTGATTTCC；
aceA up-R:GGATAGCTTGTGCAGTCAGTGCGCCGAGGCTGTTGATG。
aceA down-F:CGGCGCACTGACTGCACAAGCTATCCACGCGAAATATC；
aceA down-R:TGCTGGTGAGATACGAAGGTATAGC。
菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的为成功敲除pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上。在抗性平板上不生长的单克隆，即为消除了pCas质粒的菌株；即所需的工程菌株21-S3。
实施例六：21-S4的构建
在所述工程菌株21-S3的基础上，对proB、proC的启动子和5＇UTR序列进行编辑。将基因组上proB和proC的原始启动子用强启动子BBA-j23100(来自Anderson启动子库)替换。同时将proA和proB、proC的5＇UTR用v5-UTR替换；并对proB进行改造，引入突变I69E。构建pBbA5C-CABG质粒，再以pBbA5C-CABG质粒为模板获得proB、proC、proA基因的donor DNA。
(1)所述pBbA5C-CABG质粒的构建方法为：
设计引物对枯草芽孢杆菌的NAD特异性的谷氨酸脱氢酶基因(rocG，Gene ID:937066)进行PCR扩增，得到1275bp的片段，所述引物为：
rocG-F：
GAAGATCTTTAACTTTAATGAGGAGAGATACATATGTCAGCAAAGCAAGTCTC；
rocG-R：CCCTCGAGTTTGGATCCTTAGACCCATCCGCGGAAACGCGAT。
分别设计相应的引物用于大肠杆菌催化谷氨酸转化成脯氨酸的三个酶基因(proB，Gene ID:946425；proA，Gene ID:946680；proC，Gene ID:945034)的PCR扩增，三个酶基因的引物分别为：
proB-F:GAAGATCTTTAACTTTAATGAGGAGAGATACATATGAGTGACAGCCAG；
proB-R:CCCTCGAGTTTGGATCCTTAACGGGTAATCATGTCATC；
proA-F:GAAGATCTTTAACTTTAATGAGGAGAGATACATATGCTGGAACAAATGGG；
proA-R:CCCTCGAGTTTGGATCCTTACGCACGAATGGTGTAATC；
proC-F:GAAGATCTTTAACTTTAATGAGGAGAGATACATATGGAAAAGAAAATCGGT；
proC-R:CCCTCGAGTTTGGATCCTCAGGATTTGCTGAGTTTTTC。
对proB基因进行扩增，得到一个1104bp的片段；对proA基因进行扩增后，得到一个1254bp的片段；对proC基因进行扩增后，得到一个810bp的片段。扩增后的rocG、proB、proA和proC的每个基因序列的5＇和3＇端通过引物引入酶切位点，其中proB额外设计引物以重叠延伸PCR的形式引入单位点突变(I69E)，所述引物为：
proB-I69E-F:GAACTGCCAGCGACCGAAGCCTCGAAACAA；
proB-I69E-R:CAGTTGTTTCGAGGCTTCGGTCGCTGGCAG；
分别以枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的基因组为模板进行相应的PCR反应。分别以内切酶酶切PCR反应后的rocG、proB(I69E)、proA和proC的基因片段以及pBbA5C-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)质粒，将pBbA5C-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)质粒酶切后留取pBbA5C载体片段待用；先将proC连入酶切后的pBbA5C载体，获得阳性克隆，测序确定正确后，再分别以相同的方法，将proA、proB(I69E)、rocG基因依次分别连到酶切后的pBbA5C载体上，最终构建成pBbA5C-CABG质粒，测序确定序列正确后，提取质粒待用。
上述枯草芽孢杆菌、大肠杆菌购买自武汉淼灵生物科技有限公司。载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)来源于Scientific Reports.2014.4:6640.DOI:10.1038/srep06640，为作者惠赠。
(2)所述待编辑基因proB、proC、proA的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-proC-F:
TCCTAGGTATAATACTAGTTGAATTTCACGGCAGGAGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
pT-N20-proB-F:
TCCTAGGTATAATACTAGTATGCTTTGCTCGCAGATGGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
pT-N20-proA-F:
TCCTAGGTATAATACTAGTTTTATACGAGGCTTGCTTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
所述待编辑基因proB，proC,proA的pTargetF质粒扩增反向引物均为：5’-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3’。
BBa-J23100启动子序列如下：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC。
V5-UTR序列为：TTAACTTTAATGAGGAGAGATACAT。
所述待编辑基因proB、proC、proA的donor DNA扩增引物如下：
proC up-F:CCAAATCGCCCGCTTCACACTGCCG；
proC up-R:
ACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAAGTTTTGATAATCGCTGGCAGAAGCA。
proC down-F:
CTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCTTAACTTTAATGAGGAGAGATACAT；
proC down-R:AACGACCAGAGAGTCTTTATTCAGGCT。
proB up-F:GCTTTAACTTTGCCATAGACATCCAGT；
proB up-R:ACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAAGCGAGCAAAGCATGGCGTTTTGT。
proB down-F:CTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCTTAACTTTAATGAGGAGAGAT；
proB down-R:GCAGCAACAGTTTATCGGCACCCGCAAGAATCG。
proA up-F:TCCATGCCCAGGCGACTCCGCTTGAA；
proA up-R:GAGGCTTGCTTCGCCGCAATGCCCATTTGT。
proA down-F:CAAATGGGCATTGCGGCGAAGCAAGCCTC；
proA down-R:CAATAACCCCCAGCGGTACGCGACGA。
对于基因proA的编辑，以所述质粒pBbA5C-CABG为模板，用引物proA up-F和proAup-R进行PCR扩增，获得含有约300bp同源臂、完整的v5-UTR序列以及部分ORF序列的片段A1。以质粒pBbA5C-CABG为模板，用引物proA down-F和proA down-R进行PCR扩增，获得300bp左右的同源臂和与片段A有部分重叠序列的片段B1。以片段A1和片段B1混合作为模板，以引物proA up-F和proA down-R进行PCR扩增，获得proA基因的donnor DNA。
对于基因proB的编辑，以质粒pBbA5C-CABG为模板，用引物proB up-F和proB up-R进行PCR扩增，获得含有同源臂以及完整的v5-UTR序列以及部分ORF序列的片段A2。以质粒pBbA5C-CABG为模板，用引物proB down-F和proB down-R进行PCR扩增，获得下游同源臂和与片段A2有部分重叠序列的片段B2。以片段A2和片段B2混合作为模板，以引物proB up-F和proB down-R进行PCR扩增，获得proB基因的donnor DNA。
对于基因proC的编辑，以质粒pBbA5C-CABG为模板，用引物proC up-F和proC up-R进行PCR扩增，获得含有同源臂以及完整的v5-UTR序列以及部分ORF序列的片段A3。以质粒pBbA5C-CABG为模板，用引物proC down-F和proC down-R进行PCR扩增，获得下游同源臂和与片段A3有部分重叠序列的片段B3。以片段A3和片段B3混合作为模板，以引物proC up-F和proC down-R进行PCR扩增，获得proC基因的donnor DNA。
(3)分别获得proB、proC、proA的pTargetF质粒和donor DNA后，再对各基因分别进行基因编辑。
以10％甘油制菌株21-S3的电转感受态细胞，转入pCas质粒，30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入proB基因的pTargetF质粒和donorDNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因被编辑了的阳性克隆。菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中，30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的，即为消除了pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中，42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上。则在抗性平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株。从而获得工程菌株21-S4a。
之后再在工程菌株21-S4a的基础上转入proA的pTarget质粒和donor DNA，以与编辑proB基因相同的步骤进行proA基因的编辑和鉴定，获得21-S4b。再以相同的方法在菌株21-S4b的基础上进行proC基因的编辑。最终获得到工程菌株21-S4。
实施例七：菌株S1-S5的构建
在21-S4菌株的基础上，利用所述双质粒敲除系统敲除aceK基因。具体步骤如下：以10％的甘油制备21-S4菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒，30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与aceK基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donor DNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因敲除的阳性克隆。
上述待敲除基因aceK的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-aceK-F:
TCCTAGGTATAATACTAGTCTCTTTCACCAGTTGATAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
上述待敲除基因aceK的pTargetF质粒扩增反向引物如下：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇；
敲除aceK基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
aceK up-F:AGCCGTGACATCCATTACATTATTCGC；
aceK up-R:AGCAGCGGCAAGCAATTTCCCGTAGCCACTCGACCA；
aceK down-F:GGCTACGGGAAATTGCTTGCCGCTGCTAACATTTTCCCT；
aceK down-R:CATCTTCCACATGCCCTTCACGTATG。
菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中，30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的，即为消除了pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上。在卡那霉素平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株。最终得到了工程菌21-S5。
实施例八：菌株21-S6的构建
在工程菌21-S5的基础上，对gdhA基因进行改造：将gdhA基因的启动子替换为BBa-J23100强启动子，并将gdhA的5＇UTR用UTR designer进行优化后替换原有的序列。
编辑所述gdhA基因使用的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-gdhA-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTGCTTACCGTCACATTCTTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
编辑所述gdhA基因使用的pTargetF质粒扩增反向引物如下：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇。
BBa-J23100启动子序列为：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC。
gdhA优化的5＇UTR序列为：ACCCGGGGTGAAAGGAGGTATTTTA。
编辑gdhA基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
gdhA up-F:CTAAGGGTTTTGTCATCACGCTGGC；
gdhA up-R:ACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAAGAAAAAAATGACCCAGGAAAGCA。
gdhA down-F1:CTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCACCCGGGGTGAAAGGAGGTA；
gdhA down-F2:GGTGAAAGGAGGTATTTTAATGGATCAGACATATTCTCT；
gdhA down-R:GGTTAACTGACGGATGGAAGCGCAT。
引物gdhA down-F1含有部分BBa-J23100启动子序列和部分优化的5＇UTR序列，引物gdhA down-F2含有部分优化的5＇UTR序列和gdhA基因的部分ORF序列，gdhA down-R为gdhA基因的ORF区序列。
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物gdhA down-F2和gdhA down-R进行PCR扩增，获得含有部分优化的5＇UTR序列以及部分gdhA基因ORF序列的片段A4。引物gdhAdown-F1和gdhA down-F2有部分重叠序列，以片段A4为模板，加入引物gdhA down-F1和gdhAdown-R进行PCR扩增，获得含有部分BBa-J23100启动子序列和完整优化的5＇UTR序列以及作为gdhA同源臂序列的284bp的ORF区序列的片段B4。以大肠杆菌MG1655基因组为模板使用引物gdhA up-F和gdhA up-R进行PCR即可获得含有347bp的gdhA的同源臂序列和部分BBa-J23100启动子序列的片段C4。片段B4和片段C4含有部分重叠序列，因此以片段B4和片段C4为模板，加入引物gdhA up-F和gdhA down-R进行PCR即可获得两端带有gdhA基因同源臂，中间含有改造的BBa-J23100启动子序列和完整优化的5＇UTR序列的供体donor DNA序列。
然后以10％的甘油制备21-S5菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与pdhA基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donorDNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因被编辑的阳性克隆。菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导，以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的为消除了pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上；在抗性平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株。最终得到了工程菌21-S6。
实施例九：菌株21-S7的构建
在工程菌21-S6的基础上，对icd基因进行编辑：将icd基因的启动子替换为BBa-J23100强启动子，并将icd基因的5＇UTR用UTR designer进行优化后替换原有的序列。
上述icd基因的编辑使用的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-icd-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTAGCAAACCAGTAGCGCTCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
上述icd基因编辑使用的pTargetF质粒扩增反向引物如下：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇；
BBa-J23100启动子序列如下：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC。
Icd基因优化的5＇UTR序列为：AGAAACAAAGTGAGGAGGAGGTAAA。
编辑icd基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
icd up-F:TCCGGTGCGTTTACCCGGCTGGGTT；
icd up-R:ACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAAATGCGCGTTATTAGGCTATAATGC。
icd down-F1:CTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCAGAAACAAAGTGAGGAGGAGG；
icd down-F2:AAGTGAGGAGGAGGTAAAATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTC；
icd down-R:TCAGAGAGCGAATACCGCCACCAAC。
其中，所述icd down-F1含有部分BBa-J23100启动子序列和部分优化的5＇UTR序列，所述icd down-F2含有部分优化的5＇UTR序列和icd基因的部分ORF序列，icd down-R为icd基因的ORF区序列。
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物icd down-F2和icd down-R进行PCR扩增，可以获得含有部分优化的5＇UTR序列以及部分icd基因ORF序列的片段A5。引物icddown-F1和icd down-F2有部分重叠序列，以片段A5为模板，加入引物icd down-F1和icddown-R进行PCR扩增，可获得含有部分BBa-J23100启动子序列和完整优化的5＇UTR序列以及作为icd基因同源臂序列的ORF区序列。以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用icd up-F和icd up-R进行PCR扩增，获得icd基因的同源臂序列和部分BBa-J23100启动子序列的片段B5。片段A5和片段B5含有部分重叠序列，因此以片段A5和片段B5为模板，加入引物icd up-F和icd down-R进行PCR扩增，获得两端带有icd基因同源臂，中间含有改造的BBa-J23100启动子序列和完整优化的5＇UTR序列的供体donor DNA序列。
以10％的甘油制备21-S6菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与icd基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donorDNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因被编辑的阳性克隆。菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导，以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的即为消除了pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上。在卡那霉素平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株；即为工程菌21-S7。
实施例十：菌株21-S8的构建
在工程菌21-S7的基础上，用所述双质粒敲除系统编辑acnB基因：以10％的甘油制备21-S7菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与acnB基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donorDNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因敲除的阳性克隆。
(1)所述待编辑基因acnB的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-acnB-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTCCTACAAACTGCTGTCTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
所述待编辑基因acnB的pTargetF质粒扩增反向引物如下：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇。
BBa-J23100启动子序列如下：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC；
acnB优化的5＇UTR序列为：AGAGTCAAAGTGAGGAGGATGAAAT。
编辑acnB基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
acnB up-F：GGTTCCACAGGCGCTTCCACTGTGC；
acnB up-R：
ACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAAAGCAACATAAAAAAGTGGCTGAATC。
acnB down-F1：CTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCAGAGTCAAAGTGAGGAGGATG
acnB down-F2：AAGTGAGGAGGATGAAATATGCTAGAAGAATACCGTAAGCA；
acnB down-R：CGTCGATCAGCGGATGAATGTTGTAAC。
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物acnB down-F2和acnB down-R进行PCR扩增，获得含有部分优化的5＇UTR序列以及部分acnB基因ORF序列的片段A6。以片段A6为模板，加入引物acnB down-F1和acnB down-R进行PCR扩增，含有部分BBa-J23100启动子序列和完整优化的5＇UTR序列以及作为acnB同源臂序列的ORF区序列的片段B6。以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物acnB up-F和acnB up-R进行PCR扩增，获得含有gdhA的同源臂序列和部分BBa-J23100启动子序列的片段C6。片段B6和片段C6含有部分重叠序列，因此以片段B6和片段C6混合为模板，加入引物acnB up-F和acnB down-R进行PCR扩增，获得两端带有acnB基因同源臂，中间含有改造的BBa-J23100启动子序列和完整优化的5＇UTR序列的供体donor DNA序列。
(2)菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的即为消除了pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上；在卡那霉素平板上不生长的单克隆即为消除了pCas质粒的菌株；即得到工程菌21-S8a。在所述工程菌21-S8a的基础上，对gltA进行基因编辑。
所述待编辑基因gltA的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-gltA-F：
TCCTAGGTATAATACTAGTTTTCGACAGCAGGCGGAACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
所述待编辑基因gltA的pTargetF质粒扩增反向引物如下：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇。
BBa-J23100启动子序列如下：TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC。
gltA优化的5＇UTR序列如下：AGAACAGAGCTGAGGAGGACACATT。
编辑所述gltA基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
gltA up-F:TGGGTGGCTCGGGATTGCAGGGTGTTC；
gltA up-R:ACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAATGGTCAATACTTCCACACTGTTA。
gltA down-F1:CTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCAGAACAGAGCTGAGGAGGACA
gltA down-F2:AGCTGAGGAGGACACATTATGGCTGATACAAAAGCAAAACT；
gltA down-R:CGTGCGCAGGTCCCCACAGTGAAGCAATAC。
gltA R164L-up-F:TGATGGTGATGAAGGTATTTTGCTGCA；
gltA R164L-up-R:GCAGGAACGCCGCAATTTCACGGTGACGATTG。
gltA R164L-down-F:GCGGCGTTCCTGCTGCTGTCGAAAATGCCGACCAT；
gltA R164L-down-R:CGTGCGCAGGTCCCCACAGTGAAGCAATAC。
在工程菌株21-S8a的基础上使用双质粒敲除系统对gltA基因进行164位氨基酸的突变。将164位的精氨酸对应的密码子cgc通过设计合适的引物替换成编码亮氨酸的密码子ctg。Donor DNA的获得步骤如下:以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，使用引物gltAR164L-up-F和gltA R164L-up-R进行PCR扩增，获得含有164位精氨酸密码子替换为亮氨酸密码子ctg的片段A7，然后用引物gltA R164L-down-F和gltA R164L-down-R进行PCR扩增，获得和片段A7具有互补序列且和突变位点下游序列互补的片段B7。以片段A7和片段B7混合作为模板，以引物gltA R164L-up-F和gltA R164L-down-R进行PCR扩增，获得用于gltA基因氨基酸164位点突变的donor DNA。再转入donor DNA和pTarget-F以及pCas质粒对工程菌株进行gltA突变编辑后，在此菌株的基础上，对gltA基因进行启动子和5＇UTR的编辑。
(3)以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，用引物gltA up-F、gltA up-R进行PCR得到含有约300bp同源臂序列和前部分BBA-j23100启动子序列的片段A8。然后以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，用引物gltA down-F2、gltA down-R进行PCR得到含有约800bp同源臂序列和部分优化的5＇UTR序列的片段B8。以片段B8为模板，使用引物gltA down-F1和gltAdown-R进行PCR得到含有约800bp同源臂序列和完整优化的5＇UTR序列以及BBA-j23100启动子后部分序列的片段C8。片段C8和片段A8有启动子序列的重叠。因此以片段A8和片段C8为模板，以引物gltA up-F和gltA down-R进行PCR扩增，得到了含有上游约300bp同源臂，下游约800bp同源臂，以及优化了的启动子和5＇UTR序列的donor DNA。
基因编辑具体步骤如下：制备菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与gltA基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donorDNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因敲除的阳性克隆。菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的为消除pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上；在抗性平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株；即得到工程菌21-S8。
实施例十一：菌株21-S9的构建
argA基因是参与精氨酸生物合成途径的第一个酶，而精氨酸生物合成途径会和L-脯氨酸的生物合成途径竞争谷氨酸。因此在工程菌21-S7的基础上，将argA基因的5＇UTR进行编辑，用UTR-designer设计的强度为1％的5＇UTR去替换原有的5＇UTR。双质粒敲除系统编辑argA基因具体过程如下：以10％甘油制备21-S8菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与argA基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donor DNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因敲除的阳性克隆。
所述待编辑基因argA的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-argA-F:
TCCTAGGTATAATACTAGTTGATATAGGGAACCGAATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
所述待编辑基因的pTargetF质粒扩增反向引物如下：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇。
BBa-J23100启动子序列如下：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC。
argA改造的5＇UTR序列如下：CAAACAGATGTGCC。
编辑argA基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
argA up-F:GCCAGACTGACCTGACTTACGCTCA；
argA up-R:ACCACGGCACATCTGTTTGCATGATTATTCGAAATTAG。
argA down-F:CAAACAGATGTGCCGTGGTAAAGGAA；
argA down-R:GCAGCGGCGTGTTATTGAGACTCAT。
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物argA up-F和argA up-R进行PCR扩增，获得含有启动子上游300bp左右同源臂序列以及改造的5’UTR序列的片段A9。以大肠杆菌MG1655基因组为模板使用引物argA down-F和argA down-R进行PCR扩增，获得含有改造的5＇UTR序列和起始密码子下游约300bp同源臂序列的片段B9。片段A9和片段B9含有部分重叠序列，因此以片段A9和片段B9为模板，加入引物argA up-F和argA down-R进行PCR扩增，获得两端带有argA基因同源臂，中间含有改造的的5＇UTR序列的供体donor DNA序列。
用菌落PCR方式鉴定相应基因被编辑的阳性克隆。菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中，30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。将活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的为消除pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上；在抗性平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株；即得到工程菌21-S9。
实施例十二：菌株21-S10的构建
在工程菌21-S8的基础上，将argA的5＇UTR进行编辑，用UTR-designer设计的强度为1％的5＇UTR去替换原有的5＇UTR。双质粒敲除系统编辑argA基因具体过程如下：以10％甘油制21-S8菌株的电转感受态细胞，转入pCas质粒30℃活化，当OD600nm＝0.2～0.3时，加入L-阿拉伯糖(30mM)，33℃诱导1小时至OD600nm＝0.55～0.6，使Cas9蛋白和λ-red重组蛋白(exo，bet，gram)表达。收菌，将含有Cas9蛋白的菌体制备成10％的甘油感受态。电转入带有与argA基因互补的N20序列的pTargetF质粒和donorDNA片段，30℃活化1h，然后涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB平板上，平板30℃过夜培养。用菌落PCR方式鉴定相应基因敲除的阳性克隆。
所述待编辑基因argA的pTargetF质粒扩增正向引物如下：
pT-N20-argA-F:
TCCTAGGTATAATACTAGTTGATATAGGGAACCGAATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
上述待编辑基因的pTargetF质粒扩增反向引物如下：
5＇-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3＇；
BBa-J23100启动子序列如下：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC。
argA改造的5’UTR序列如下：CAAACAGATGTGCC
编辑argA基因所用到的扩增donor DNA序列引物如下：
argA up-F:GCCAGACTGACCTGACTTACGCTCA；
argA up-R:ACCACGGCACATCTGTTTGCATGATTATTCGAAATTAG。
argA down-F:CAAACAGATGTGCCGTGGTAAAGGAA；
argA down-R:GCAGCGGCGTGTTATTGAGACTCAT。
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物argA up-F和argA up-R进行PCR扩增，获得含有启动子上游300bp左右同源臂序列以及改造的5＇UTR序列的片段A10。以大肠杆菌MG1655基因组为模板使用引物argA down-F和argA down-R进行PCR即可获得含有改造的5＇UTR序列和起始密码子下游约300bp同源臂序列的片段B10。片段A10和片段B10含有部分重叠序列，以片段A10和片段B10为模板，加入引物argA up-F和argA down-R进行PCR即可获得两端带有argA基因同源臂，中间含有改造的的5＇UTR序列的供体donor DNA序列。
用菌落PCR方式鉴定相应基因被编辑的阳性克隆。菌落PCR验证的阳性克隆测序正确后，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中30℃，230rpm活化过夜，并加入IPTG(0.5mM)诱导以除去pTarget-N20质粒。活化菌液涂布于卡那霉素平板上，挑同一单克隆至壮观霉素平板上；在卡那霉素平板上生长，在壮观霉素平板上不生长的为消除pTarget-F质粒的菌株。将此菌株在LB培养基中42℃活化过夜，涂布于LB平板上，挑同一单克隆至卡那霉素平板上；在抗性平板上不生长的单克隆为消除了pCas质粒的菌株；即得到工程菌21-S10。
实施例十三：工程菌株21-S1P～21-S10P的构建
将实施例3～12中构建的菌株21-S1～21-S10分别制备为感受态细胞，将实施例2中获得的pTrcHisB-P4H质粒分别转到上述宿主菌的感受态细胞中，筛选阳性克隆，即获得工程菌株21-S1P～21-S10P。
实施例十四：利用工程菌株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法及效果展示
(1)采用两步发酵法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸：将5uL工程菌株21-S1P～S10P菌液接种至3mL管中，37℃、220rpm活化过夜。再将100uL活化菌液接种至50mL LB培养基中，37℃，220rpm活化至OD600nm＝0.5，再用终浓度为500uM的IPTG进行诱导，30℃、170rpm发酵6h。6h后，30℃，230rpm继续发酵10h。10h后，4000rpm离心10min。再将菌体转移至50mL mMCG培养基中，再加入终浓度为500uM的IPTG和终浓度为100μg/L的VB1，30℃，240rpm继续发酵36～80h。
(2)采用图2中的工作曲线，利用氯胺T法分别测定21-S1P～21-S10P生产反式-4-羟基-L-脯氨酸(HYP)的产量。上述工程菌21-S1P～21-S10P生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为0.18～4.82g/L。具体如表1所示；其中，因21-S2P只是改造中的过渡菌种，故表1中未体现具体数据。
表1各工程菌株发酵72h后最高HYP产量展示表
Figure GDA0004049396650000281
Figure GDA0004049396650000291
/>

Claims (8)

1.一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：在所述大肠杆菌中引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因，所述L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因来源于指孢囊菌属（Dactylosporangium. sp.）RH1；敲除大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因和aceA基因；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；编辑方法为：将proB和proC基因的原始启动子替换为BBA-j23100；将proA和proB、proC的5＇UTR替换为v5-UTR；对proB基因引入I69E突变；
所述BBA-j23100启动子序列为：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC；
所述v5-UTR序列为：TTAACTTTAATGAGGAGAGATACAT；
所述proB的Gene ID为:946425。
2.根据权利要求1所述的一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌的aceK基因被敲除。
3.根据权利要求2所述的一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌的gdhA基因的启动子和5＇UTR序列被编辑，编辑方法为：将gdhA基因的启动子替换为BBa-J23100，将gdhA基因的5＇UTR替换为：ACCCGGGGTGAAAGGAGGTATTTTA。
4.根据权利要求3所述的一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌的icd基因的启动子和5＇UTR序列被编辑，编辑方法为：将icd基因的启动子替换为BBa-J23100；将icd基因的5＇UTR替换为：AGAAACAAAGTGAGGAGGAGGTAAA。
5.一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）敲除大肠杆菌BL21（DE3）的putA基因，引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因，所述L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因来源于指孢囊菌属RH1，获得工程菌21-S1；
（2）敲除所述工程菌21-S1中的poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因和adhE基因，获得工程菌21-S2；
（3）敲除所述工程菌21-S2中的aceA基因，获得工程菌21-S3；
（4）对所述工程菌21-S3的proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，对proA基因的5＇UTR序列进行编辑，对所述proB基因引入I69E突变，获得工程菌21-S4，编辑方法为：将proB和proC基因的原始启动子替换为BBA-j23100；将proA和proB、proC的5＇UTR替换为v5-UTR；
所述BBA-j23100启动子序列为：
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC；
所述v5-UTR序列为：TTAACTTTAATGAGGAGAGATACAT；
所述proB的Gene ID为:946425；
（5）敲除所述工程菌21-S4中的aceK基因，获得工程菌21-S5；
所述21-S5即为所需的大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤（5）后还包括如下步骤：
（6）对所述工程菌21-S5中gdhA基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，获得工程菌21-S6；编辑方法为：将gdhA基因的启动子替换为BBa-J23100，将gdhA基因的5＇UTR替换为：ACCCGGGGTGAAAGGAGGTATTTTA；
（7）对所述工程菌21-S6的icd基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，获得工程菌21-S7；编辑方法为：将icd基因的启动子替换为BBa-J23100；将icd基因的5＇UTR替换为：AGAAACAAAGTGAGGAGGAGGTAAA；
所述21-S6或21-S7即为所需的大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤（7）后还包括如下步骤：
（8）对所述工程菌21-S7的acnB基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，并将gltA基因第164位精氨酸对应密码子cgc替换为亮氨酸密码子ctg，获得工程菌21-S8；所述gltA基因扩增自大肠杆菌MG1655；
编辑acnB基因的启动子和5＇UTR序列的方法为：将acnB基因的启动子替换为BBa-J23100；将acnB基因的5＇UTR序列替换为：AGAGTCAAAGTGAGGAGGATGAAAT；
所述21-S8即为所需的大肠杆菌。
8.权利要求1～7任意一项所述大肠杆菌在产反式-4-羟基-L-脯氨酸上的应用。
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