CN118064472A - 一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法及其应用。构建合成苯酚的代谢途径得到重组质粒pACYCDuet‑tpl；选取大肠杆菌BL21(DE)3依次敲除iclR基因，实现乙醛酸循环的加强，以增加流向目标产物的乙酰CoA代谢流；继续敲除合成酪氨酸的调控基因tyrR基因，从而解除苯酚直接前体，即酪氨酸对莽草酸途径酶的反馈抑制；再引入编码DAHP合成酶的aroG基因的反馈抗性突变体基因aroG*（Asp146Asn），以解除DAHP合成酶的反馈抑制，从而增加前体供应；最后导入重组质粒pACYCDuet‑tpl得到以乙酸为碳源发酵生产苯酚的重组大肠杆菌。本发明大肠杆菌在以乙酸为碳源的培养基中发酵生产苯酚，产量可以达到204.6 mg/L。
Description
技术领域
本发明属于菌株代谢改造领域，具体涉及一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法及其应用。
背景技术
苯酚又名石碳酸，用途十分广泛，可以生产酰胺、酚醛树脂、酚酞等众多的化工产品及中间体，还可以作为生产消毒剂、涂料、防腐剂以及药物的重要原料，因此在具有优秀的工业价值和市场前景。目前苯酚的主要生产方法为化学合成法，主要包括异丙苯法、甲苯氧化法、苯直接氧化法、磺化法、氯苯水解法、拉西法、环己烷法等，以上化学合成法都涉及到高温高压，条件要求较高，并且环境污染较大。
乙酸作为典型的双碳分子，具有许多葡萄糖等常规碳源不具备的优势，包括成本低廉、来源广泛、原子经济效益好、同化途径效率较高等。目前，已有众多生物基化学品以乙酸作底物生物合成的报道。同时，大肠杆菌本身可以利用乙酸作为碳源，因此可以参考葡萄糖合成苯酚的代谢途径，拓展利用乙酸合成苯酚。
近几年，由于对代谢工程与基因工程改造具有较高的适应性，大肠杆菌已被改造为苯酚生物合成的强大主力菌株。Kim等人（2014年）在大肠杆菌中开发了一条通过芳香族氨基酸——酪氨酸从葡萄糖合成苯酚的途径（TPL途径）。在原位萃取的作用下，工程菌株在双相补料分批生物反应器中生产了3.79 g/L苯酚，产率为0.02 g/g。该路径下苯酚是由内源性产生的酪氨酸经异源性酪氨酸酚裂解酶催化合成的。与此同时，Minji等人（2019年）通过代谢工程改造大肠杆菌，增强乙酸同化途径与乙醛酸循环，过表达相关基因，最终实现以10 g/L乙酸为底物，合成0.70g/L的酪氨酸。但是，目前还未有利用乙酸作碳源进行苯酚合成的相关报道。
作为苯酚的前体，酪氨酸是芳香族氨基酸生物合成代谢途径的产物之一，而大肠杆菌天然不具备合成苯酚的能力，但可以合成酪氨酸，并且大肠杆菌本身可以利用乙酸作为碳源，因此要想实现以乙酸为底物合成苯酚，需要引入外源基因tpl构建苯酚合成途径，同时增强乙酸的同化途径和解除酪氨酸的反馈抑制以提高前体酪氨酸的积累，促进苯酚的生成。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法。
本发明的第二个目的在于提供利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源，合成苯酚上的应用。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种利用乙酸合成苯酚的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，具体步骤如下：构建合成苯酚的代谢途径得到重组质粒pACYCDuet-tpl；选取大肠杆菌BL21(DE)3依次敲除iclR基因，实现乙醛酸循环的加强，以增加流向目标产物的乙酰CoA代谢流；继续敲除合成酪氨酸的调控基因tyrR基因，从而解除苯酚直接前体，即酪氨酸对莽草酸途径酶的反馈抑制；再引入编码DAHP合成酶的aroG基因的反馈抗性突变体基因aroG*（Asp146Asn），以解除DAHP合成酶的反馈抑制，从而增加前体供应；最后导入重组质粒pACYCDuet-tpl得到以乙酸为碳源发酵生产苯酚的重组大肠杆菌。
作为改进的是，构建合成苯酚的代谢途径为：以弗氏柠檬酸杆菌为来源，复制酪氨酸酚裂解酶基因tpl，再与载体pACYCDuet连接，即得到重组质粒pACYCDuet-tpl，所述酪氨酸酚裂解酶基因tpl序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步改进的是，拷贝酪氨酸酚裂解酶基因tpl所用的引物中上游引物带有Nde I酶切位点，下游引物带有Kpn I 酶切位点。
作为改进的是，选取大肠杆菌BL21(DE)3，敲除iclR基因，以增强基因aceA、aceB、aceK的表达，从而实现增强乙醛酸循环并加强底物乙酸的利用。
作为改进的是，在敲除iclR基因的大肠杆菌上继续敲除tyrR基因，以解除苯酚直接前体酪氨酸的对莽草酸途径酶的反馈抑制，从而加强酪氨酸的合成，进一步提高苯酚的积累。
作为改进的是，在敲除iclR基因和tyrR基因的大肠杆菌上，用aroG基因的反馈抗性突变体aroG*（Asp146Asn）替换aroG基因，从而解除DHAP合成酶的反馈抑制，增加前体供应。
上述构建方法构建得到的重组大肠杆菌在以乙酸为碳源合成苯酚上的应用。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源发酵生产苯酚中的应用。以乙酸为主要碳源，在改良的M9发酵培养基中发酵生产苯酚。利用构建的苯酚生产菌株，实现利用乙酸合成苯酚。
有益效果
与现有技术相比，本发明一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法及其应用，通过构建苯酚合成途径，并利用基因工程改造大肠杆菌，加强乙酸同化途径和乙醛酸循环从而调节乙酰CoA代谢流；解除苯酚前体酪氨酸对莽草酸途径酶的反馈抑制；解除莽草酸途径中第一个限速步骤即DAHP合成反应的反馈抑制，增加前体积累从而促进苯酚的合成。最终得到的重组大肠杆菌能够利用乙酸作为碳源合成苯酚。
附图说明
图1为本发明重组大肠杆菌利用乙酸合成苯酚的代谢图；
图2为本发明中HPLC检测苯酚的生成，（a）为苯酚标准品，（b）为实施例苯酚；
图3为大肠杆菌不同处理下后的，发酵产苯酚的对比图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，使用的大肠杆菌Trans1-T1与BL21(DE)3、质粒pACYCDuet、质粒Cas9等材料都是商业化产品，可直接购买。
实施例中所述的乙酸，苯酚的浓度均指的是对应物在体系中的终浓度。
乙酸测定方法：Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱，流动相100% 8mM 硫酸，流速0.6mL·min-1；紫外检测器，检测波长为210 nm。
苯酚测定方法：Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱，流动相为15%乙腈和85% 5mM硫酸；流速0.8 mL·min-1；紫外检测器，检测波长为275 nm。
实施例1 苯酚生产途径的重组质粒的构建
以来源于弗氏柠檬酸杆菌的酪氨酸酚裂解酶基因为模板进行扩增，获得tpl基因片段，再以pACYCDuet质粒为载体，构建重组质粒pACYCDuet-tpl。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE)3，得到重组菌株BL21(DE)3-tpl。
酪氨酸酚裂解酶基因tpl序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGAATTATCCGGCAGAACCCTTCCGTATTAAAAGCGTTGAAACTGTATCTATGATCCCGCGTGATGAACGCCTTAAGAAAATGCAGGAAGCGGGATACAATACTTTCCTGTTAAATTCGAAAGATATTTATATTGACCTGCTGACAGACAGTGGCACTAACGCAATGAGCGACAAGCAGTGGGCCGGAATGATGATGGGTGATGAAGCCTACGCGGGCAGCGAAAACTTCTATCATCTGGAAAGAACCGTGCAGGAACTGTTTGGCTTTAAACATATTGTTCCTACTCACCAGGGGCGCGGCGCAGAAAACCTGTTATCGCAGTTGGCAATTAAACCGGGGCAATATGTTGCCGGGAATATGTATTTCACTACCACCCGTTATCACCAGGAAAAAAATGGTGCGGTGTTTGTCGATATCGTTCGTGACGAAGCGCACGATGCCGGTCTGAATATTGCTTTTAAAGGTGATATCGATCTTAAAAAATTACAAAAACTGATTGATGAAAAAGGCGCCGAGAATATTGCCTATATTTGCCTGGCAGTCACGGTTAACCTCGCAGGCGGGCAGCCGGTCTCCATGGCTAACATGCGCGCGGTGCGTGAACTGACTGCAGCACATGGCATTAAAGTGTTCTACGACGCTACCCGCTGCGTAGAAAACGCCTACTTTATCAAAGAGCAAGAGCAGGGCTTTGAGAACAAGAGCATCGCCGAGATCGTGCATGAGATGTTCAGCTACGCCGACGGTTGCACCATGAGTGGTAAAAAAGACTGTCTGGTGAACATCGGCGGCTTCCTGTGCATGAACGATGACGAAATGTTCTCTTCTGCCAAAGAGTTAGTCGTTGTCTACGAAGGCATGCCATCTTACGGCGGCCTGGCCGGACGCGACATGGAAGCCATGGCGATTGGTCTGCGCGAAGCTATGCAGTATGAGTACATCGAGCACCGCGTGAAGCAGGTTCGCTATCTGGGCGACAAGCTGAAAGCCGCTGGTGTACCGATTGTTGAACCGGTGGGCGGTCACGCGGTATTCCTTGATGCGCGTCGCTTCTGCGAGCATCTGACGCAGGACGAGTTCCCGGCGCAAAGCCTGGCTGCCAGTATCTATGTGGAAACCGGCGTACGTAGTATGGAGCGCGGAATTATCTCTGCGGGCCGTAATAACGTGACTGGTGAACACCACAGGCCGAAACTGGAAACCGTGCGTCTGACTATTCCACGCCGCGTTTATACTTACGCGCATATGGATGTGGTGGCTGACGGTATTATTAAACTTTACCAGCACAAAGAAGATATTCGCGGGCTGAAGTTTATTTACGAGCCGAAGCAGCTCCGTTTCTTTACTGCACGCTTTGACTATATCTAA
上游引物带有酶切位点Nde I，序列如SEQ ID NO.2所示：
ATAAGAAGGAGATATACATATGATGAATTATCCGGCAGAACCCT；
下游引物带有酶切位点Kpn I，序列如SEQ ID NO.3所示：
TTTCTTTACCAGACTCGAGGGTACCTTAGATATAGTCAAAGCGTGCAG；
反应条件为：95 ℃ 3 min ，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将表达载体pACYCDuet用Takara 公司的Xba I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 5 μL，Xba I 2 μL，载体质粒33 μL。酶切体系于37 ℃条件下反应1小时。酶切回收后的载体片段与目的序列片段有同源臂，使用诺唯赞公司的一步克隆试剂盒进行同源重组，反应体系为：Takara公司的5×CE IIBuffer 2 μL，Exnase II 1 μL，表达载体片段2 μL，插入的序列片段5 μL。反应体系37 ℃反应45 min。将连接产物转化到大肠杆菌 Trans1-T1中，得到重组质粒pACYCDuet-tpl，PCR筛选阳性菌株进行DNA测序验证，验证重组质粒的构建正确。
实施例2 上调乙醛酸循环以增强乙酸同化途径
强化乙醛酸循环能够加强乙酰CoA向草酰乙酸的积累，而草酰乙酸是芳香族化合物合成途径的前体。因此，上调乙醛酸循环可以增加流向下游苯酚合成途径的碳通量。
通过CRISPR/Cas9技术，敲除iclR基因，以增强aceA基因、aceB基因、aceK基因的表达，从而实现增强乙醛酸循环并加强底物乙酸的利用，达到提高苯酚产量的目的。
通过CRISPR/Cas9技术敲除iclR的具体操作如下：
（1）获得宿主菌的电转感受态：
将cas9质粒导入到大肠杆菌BL21(DE)3中，涂布在含终浓度为50mg/L的卡那霉素平板上。挑单菌落，抽质粒验证目的质粒是否成功转入。对成功转入目的质粒的菌落进一步制备电转感受态。将其接种于5 mL含50 μg mL-1卡那霉素抗性的LB液体培养基，30 ℃，250rpm 培养 8 h 后，按 1%接种量接种于50 mL 含50 μg mL-1卡那霉素抗性的LB液体培养基，30 ℃，250 rpm培养至OD600约为0.2后，加入终浓度为30 mM的L-阿拉伯糖（灭菌），继续培养至OD600至0.2~0.6后，将培养液转移至50 ml离心管中，冰上预冷20 min，4℃下4000 rpm离心10 min，收集细胞；弃上清液，用40 ml预冷的无菌水重悬细胞；重复一次；弃上清液，用20ml预冷的10%(V/V)甘油重悬细胞；4℃下4000 rpm离心10 min；弃上清液，用初始菌液体积的3‰预冷10%(V/V)甘油重悬，以每管50 μl分装于预冷的1.5 ml离心管中，-80℃保存。
（2）突变SgRNA质粒和Donor DNA的构建：
选取宿主菌株BL21(DE)3基因组待敲除基因iclR两端基因作为上下同源臂即上下donor片段（约600 bp，中间剩余的部分即为敲除的基因），设计引物pcr拷贝上下donor片段之后再使用overlap pcr 连接起来得到Donor DNA（iclR）。找出待敲除基因iclR的N20序列（如SEQ ID NO.4所示）：CTAACCACAATGCAACAGCA，并构建出含有N20序列能对SgRNA质粒环状定量pcr的上下引物。pcr结束后，使用DpnI酶对产物进行消化2 h，然后转入大肠杆菌Trans1-T1感受态中培养，提质粒并送测，若质粒突变，则构建成功得到质粒sgRNA（iclR）。
sgRNA质粒序列如SEQ ID NO.5所示：
TCGAGTTCATGTGCAGCTCCATCAGCAAAAGGGGATGATAAGTTTATCACCACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCGTGCTATGATCGACTGATGTCATCAGCGGTGGAGTGCAATGTCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAAGATGCCGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGCTCATGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCGCGAACGCGTAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCTGGATCCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTCATCGCCGCAGCGGTTTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTAGATCTATTACCCTGTTATCCCTAC
（3）基因敲除：
取一管含有cas9质粒的大肠杆菌BL21(DE)3电转感受态细胞，置于冰上融化；取10~15 μl质粒加到感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上1 min，其中Donor DNA（iclR）：SgRNA（iclR）=5：1，SgRNA=100ng/μl。将上述样品放到预冷的2 mm电转杯中，置于冰上5 min；将电转仪电压设定为2500 V，电击5-6 ms，迅速加入1 ml LB培养基，在30 ℃、250 rpm条件下培养2 h后，涂布至含50 μg mL-1卡那霉素抗性和 40 μg mL-1 链霉素抗性的固体LB培养基并于30 ℃过夜培养。
最后，从平板上挑取单菌落，进行菌落pcr验证，若敲除成功，则应出现iclR的Donor DNA大小的条带。
表1 iclR基因敲除引物
在敲除iclR的大肠杆菌BL21(DE)3中导入苯酚生产途径的重组质粒pACYCDuet-tpl，并将得到的重组菌株命名为△iclR-tpl。
实施例3 解除酪氨酸对莽草酸途径酶的反馈抑制以增强苯酚合成
大肠杆菌天然具有生成芳香族氨基酸的代谢通路，其中酪氨酸可以作为苯酚的直接前体。因此，通过异源表达酪氨酸酚裂解酶，构建了合成苯酚的途径。增加酪氨酸的积累可以促进苯酚的合成，其中tyrR基因控制酪氨酸对莽草酸途径酶的反馈调节，因此可以通过敲除tyrR基因以解除苯酚前体酪氨酸的反馈抑制，从而促进酪氨酸的积累，提高苯酚的产量。
tyrR的N20序列（如SEQ ID NO.6所示）：AAATAGGGGAAATGTCACCA，具体操作同实施例2。得到敲除tyrR基因的大肠杆菌BL21(DE)3。
按照上述方法，在实施例2敲除iclR的大肠杆菌BL21(DE)3的基础上进行tyrR基因敲除的操作，得到敲除tyrR和iclR的大肠杆菌BL21(DE)3。
表2 tyrR基因敲除引物
在敲除tyrR的大肠杆菌BL21(DE)3中导入苯酚生产途径的重组质粒pACYCDuet-tpl，得到重组菌株△tyrR-tpl。
在敲除tyrR和iclR的大肠杆菌BL21(DE)3中导入苯酚生产途径的重组质粒pACYCDuet-tpl得到重组菌株△△-tpl。
实施例4 解除DAHP合成酶的反馈抑制以增强苯酚合成
DAHP（3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸）是芳香族氨基酸合成途径重要的中间体，由aroG基因编码的DAHP合成酶催化PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）与E4P（赤藓糖-4-磷酸）合成DAHP，该反应是莽草酸代谢途径的重要限速步骤，因此解除DAHP合成酶的反馈抑制可以有效促进DAHP的生成，从而加强下游的代谢通量。对于aroG基因，点突变Asp146Asn即可完全解除下游产物苯丙氨酸对DHAP合成酶的反馈抑制，从而实现增强苯酚的合成。
基因整合同样使用CRISPR/Cas9技术来实现，其中只有Donor DNA的构建和基因敲除中的操作不同。aroG*（Asp146Asn）的Donor DNA具体构建操作为：将aroG反馈抗性突变体aroG*（Asp146Asn）整合到大肠杆菌BL21(DE)3基因组上替代原基因aroG，整合位点为aroG，其N20序列（如SEQ ID NO.7所示）为：CTGCTTGATATTAACGACAG。选取宿主菌株BL21(DE)3基因组待替换基因aroG两端基因作为上下同源臂即上下donor片段（约600 bp，中间剩余的部分即为敲除的基因），设计引物pcr拷贝上下donor片段和aroG*（Asp146Asn）基因片段之后，再使用overlap pcr 将aroG*（Asp146Asn）基因片段插入上下donor片段之间连接起来得到Donor DNA（aroG*），其他操作步骤同实施例2中的基因敲除步骤。
其中，aroG的反馈抗性突变体aroG*（Asp146Asn）基因来源于委托通用生物(安徽)股份有限公司合成的质粒pCDFDuet-trc-aroG*，其序列如SEQ ID NO.8所示：
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAAGACTATTTCAAAAGGAGCATCACGAATGAATTATCAGAACGACGATTTACGCATCAAAGAAATCAAAGAGTTACTTCCTCCTGTCGCATTGCTGGAAAAATTCCCCGCTACTGAAAATGCCGCGAATACGGTTGCCCATGCCCGAAAAGCGATCCATAAGATCCTGAAAGGTAATGATGATCGCCTGTTGGTTGTGATTGGCCCATGCTCAATTCATGATCCTGTCGCGGCAAAAGAGTATGCCACTCGCTTGCTGGCGCTGCGTGAAGAGCTGAAAGATGAGCTGGAAATCGTAATGCGCGTCTATTTTGAAAAGCCGCGTACCACGGTGGGCTGGAAAGGGCTGATTAACGATCCGCATATGGATAATAGCTTCCAGATCAACGACGGTCTGCGTATAGCCCGTAAATTGCTGCTTGATATTAACGACAGCGGTCTGCCAGCGGCAGGTGAGTTTCTCAATATGATCACCCCACAATATCTCGCTGACCTGATGAGCTGGGGCGCAATTGGCGCACGTACCACCGAATCGCAGGTGCACCGCGAACTGGCATCAGGGCTTTCTTGTCCGGTCGGCTTCAAAAATGGCACCGACGGTACGATTAAAGTGGCTATCGATGCCATTAATGCCGCCGGTGCGCCGCACTGCTTCCTGTCCGTAACGAAATGGGGGCATTCGGCGATTGTGAATACCAGCGGTAACGGCGATTGCCATATCATTCTGCGCGGCGGTAAAGAGCCTAACTACAGCGCGAAGCACGTTGCTGAAGTGAAAGAAGGGCTGAACAAAGCAGGCCTGCCAGCACAGGTGATGATCGATTTCAGCCATGCTAACTCGTCCAAACAATTCAAAAAGCAGATGGATGTTTGTGCTGACGTTTGCCAGCAGATTGCCGGTGGCGAAAAGGCCATTATTGGCGTGATGGTGGAAAGCCATCTGGTGGAAGGCAATCAGAGCCTCGAGAGCGGGGAGCCGCTGGCCTACGGTAAGAGCATCACCGATGCCTGCATCGGCTGGGAAGATACCGATGCTCTGTTACGTCAACTGGCGAATGCAGTAAAAGCGCGTCGCGGGTAAATGAATTATCAGAACGACGATTTACGCATCAAAGACAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTGAAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAACCGAAGACGCTAAGGAGGTACGAGAATGGTTGCTGAATTGACCGCATTACGCGATCAAATTGATGAAGTCGATAAAGCGCTGCTGAATTTATTAGCGAAGCGTCTGGAACTGGTTGCTGAAGTGGGCGAGGTGAAAAGCCGCTTTGGACTGCCTATTTATGTTCCGGAGCGCGAGGCATCTATATTGGCCTCGCGGCGCGCAGAGGCGGAAGCTCTGGGTGTACCGCCAGATCTGATTGAGGATGTTTTGCGTCGGGTGATGCGTGAATCTTACTCCAGTGAAAACGACAAAGGATTTAAAACACTTTGTCCGTCACTGCGTCCGGTGGTTATCGTCGGCGGTGGCGGTCAGATGGGACGCCTGTTCGAGAAGATGCTGACACTATCGGGTTATCAGGTGCGGATTCTGGAGCAACATGACTGGGATCGAGCGGCTGATATTGTTGCCGATGCCGGAATGGTGATTGTTAGTGTGCCAATCCACGTTACTGAGCAAGTTATCGGCAAATTACCGCCTTTACCGAAAGATTGTATTCTGGTTGATCTGGCATCAGTGAAAAATGGACCATTACAGGCCATGCTGGCGGCGCACGATGGCCCGGTACTGGGGTTACACCCGATGTTCGGCCCGGACAGCGGTAGCCTGGCAAAGCAAGTTGTGGTCTGGTGTGATGGACGTAAGCCGGAAGCATACCAATGGTTTCTGGAGCAAATTCAGGTCTGGGGCGCTCGGCTGCATCGTATTAGCGCTGTCGAGCACGATCAGAATATGGCGTTTATTCAGGCTCTGCGCCACTTTGCTACTTTTGCTTATGGGCTGCATCTGGCAGAAGAAAATGTTCAGCTTGAGCAACTTCTGGCGCTCTCTTCGCCGATTTACCGCCTTGAGCTGGCGATGGTCGGGCGACTGTTTGCTCAGGATCCGCAGCTTTATGCCGACATTATTATGTCGTCAGAGCGTAATCTGGCGTTAATCAAACGTTACTATAAGCGTTTCGGCGAGGCGATTGAGTTGCTGGAGCAGGGCGATAAGCAGGCGTTTATTGACAGTTTCCGCAAGGTGGAGCACTGGTTCGGCGATTACGTACAGCGTTTTCAGAGTGAAAGCCGCGTGTTATTGCGTCAGGCGAATGACAACCGCCAGTAAATGGTTGCTGAATTGACCGCATTACGCGATCAAATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCTGAAACCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCATCGTGGCCGGATCTTGCGGCCCCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGCTAGCTCACTCGGTCGCTACGCTCCGGGCGTGAGACTGCGGCGGGCGCTGCGGACACATACAAAGTTACCCACAGATTCCGTGGATAAGCAGGGGACTAACATGTGAGGCAAAACAGCAGGGCCGCGCCGGTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCTCCTGCCAGAGTTCACATAAACAGACGCTTTTCCGGTGCATCTGTGGGAGCCGTGAGGCTCAACCATGAATCTGACAGTACGGGCGAAACCCGACAGGACTTAAAGATCCCCACCGTTTCCGGCGGGTCGCTCCCTCTTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGTTTACCGGATACCTGTTCCGCCTTTCTCCCTTACGGGAAGTGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACACACTGGTATCTCGGCTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTAAGCAAGAACTCCCCGTTCAGCCCGACTGCTGCGCCTTATCCGGTAACTGTTCACTTGAGTCCAACCCGGAAAAGCACGGTAAAACGCCACTGGCAGCAGCCATTGGTAACTGGGAGTTCGCAGAGGATTTGTTTAGCTAAACACGCGGTTGCTCTTGAAGTGTGCGCCAAAGTCCGGCTACACTGGAAGGACAGATTTGGTTGCTGTGCTCTGCGAAAGCCAGTTACCACGGTTAAGCAGTTCCCCAACTGACTTAACCTTCGATCAAACCACCTCCCCAGGTGGTTTTTTCGTTTACAGGGCAAAAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACTGAACCGCTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAAT
表3 aroG*（Asp146Asn）基因整合引物
按照上述方法，在实施例3敲除iclR和tyrR的大肠杆菌BL21(DE)3的基础上进行aroG*（Asp146Asn）基因整合的操作，得到敲除iclR和tyrR且整合aroG*（Asp146Asn）的大肠杆菌BL21(DE)3。
在敲除tyrR和iclR且整合aroG*（Asp146Asn）的大肠杆菌BL21(DE)3中导入苯酚生产途径的重组质粒pACYCDuet-tpl得到重组菌株△△-aroG*-tpl。
实施例5 苯酚生成菌株摇瓶发酵
以BL21(DE)3或其敲除整合菌株为出发菌，通过钙转转入构建苯酚生产途径的质粒，分别得到BL21(DE)3-tpl、△iclR-tpl、△tyrR-tpl、△△-tpl、△△-aroG*-tpl菌株。上述菌株构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)。
摇瓶发酵操作：将保存在甘油菌中的BL21(DE)3-tpl、△iclR-tpl、△tyrR-tpl、△△-tpl、△△-aroG*-tpl菌株，分别接入装有5 ml LB培养基的摇管中，温度37℃，200 rpm，培养10-12 h。再以1%的接种量转接到装有100 ml M9改良培养基的500 mL摇瓶中，温度37℃，200 rmp下进行培养。待菌液光密度值OD600生长至0.6，添加0.5 mM终浓度的IPTG诱导，诱导温度为30℃。期间用磷酸调控pH在7，并在48 h时取样离心后保留上清，供高效液相检测分析。
表4 M9改良培养基配方
最终重组菌株苯酚产量及得率如下：
表5 摇瓶发酵苯酚产量及得率
本发明通过构建苯酚合成途径，并利用基因工程改造大肠杆菌，加强乙酸同化途径和乙醛酸循环，从而调节乙酰CoA代谢流，解除反馈抑制增加前体积累，进而促进苯酚的合成。本发明构建得到的重组大肠杆菌利用乙酸作为碳源合成苯酚,且苯酚产量可达到204.6 mg/L。
Claims (7)
1.一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：构建合成苯酚的代谢途径得到重组质粒pACYCDuet-tpl；选取大肠杆菌BL21(DE)3依次敲除iclR基因，实现乙醛酸循环的加强，以增加流向目标产物的乙酰CoA代谢流；继续敲除合成酪氨酸的调控基因tyrR基因，从而解除苯酚直接前体，即酪氨酸对莽草酸途径酶的反馈抑制；再引入编码DAHP合成酶的aroG基因的反馈抗性突变体基因aroG*（Asp146Asn），以解除DAHP合成酶的反馈抑制，从而增加前体供应；最后导入重组质粒pACYCDuet-tpl得到以乙酸为碳源发酵生产苯酚的重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆的菌构建方法，其特征在于，构建合成苯酚的代谢途径为：以弗氏柠檬酸杆菌为来源，复制酪氨酸酚裂解酶基因tpl，再与载体pACYCDuet连接，即得到重组质粒pACYCDuet-tpl，所述酪氨酸酚裂解酶基因tpl序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，拷贝酪氨酸酚裂解酶基因tpl所用的引物中上游引物带有Nde I 酶切位点，下游引物带有Kpn I 酶切位点。
4.根据权利要求1所述的一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，选取大肠杆菌BL21(DE)3，敲除iclR基因，以增强基因aceA、aceB、aceK的表达，从而实现增强乙醛酸循环并加强底物乙酸的利用。
5.根据权利要求4所述的一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在敲除iclR基因的大肠杆菌上继续敲除tyrR基因，以解除苯酚直接前体酪氨酸的对莽草酸途径酶的反馈抑制，从而加强酪氨酸的合成，进一步提高苯酚的积累。
6.根据权利要求5所述的一种利用乙酸合成苯酚的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在敲除iclR基因和tyrR基因的大肠杆菌上，用aroG基因的反馈抗性突变体aroG*（Asp146Asn）替换aroG基因，从而解除DHAP合成酶的反馈抑制，增加前体供应。
7.基于权利要求1所述的重组大肠杆菌在以乙酸为碳源合成苯酚上的应用。
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