CN115011614A

CN115011614A - Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用

Info

Publication number: CN115011614A
Application number: CN202210256759.0A
Authority: CN
Inventors: 汪宏凯; 陈云; 马忠华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-03-16
Also published as: CN115011614B

Abstract

本发明公开了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用，所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述应用的途径为破坏Pa22基因的功能，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。本发明基于上述应用获得了一株可高产草欧菌素A的成团泛菌工程菌ZJU23‑Pa22，此成团泛菌工程菌ZJU23‑Pa22是通过敲除成团泛菌ZJU23中的Pa22基因获得的，将此成团泛菌工程菌ZJU23‑Pa22接种至KB液体培养基中发酵72h，即可使发酵液中草欧菌素A的产量高达116.6mg/L，是野生型成团泛菌ZJU23的1.33倍。

Description

Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用。

背景技术

草欧菌素A(Herbicolin A)是由成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23产生的一种次生代谢产物。草欧菌素A对稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢等植物病原真菌以及白色念珠菌、烟曲霉等人体条件致病菌均具有抑制效果。草欧菌素A具有独特的抑菌机制，其可通过结合禾谷镰刀菌细胞膜上的麦角甾醇，破坏膜上脂筏的结构，从而发挥抑菌活性，可作为良好的生物源农药用于生物防治。草欧菌素A的结构式如式 (1)所示，其具有许多优点，但是其生产成本巨大，所以提高其产量成为降低其生产成本的核心问题。

目前，生产草欧菌素A的方法主要为微生物发酵法，目前尚未有报道通过化学合成法获得草欧菌素A。微生物发酵法主要是通过微生物发酵获得草欧菌素A，具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等优势。

然而，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。因此，急需找到一株可高产草欧菌素A的微生物以克服上述缺陷。

目前提高细菌次生代谢产物产量的方法主要有优化发酵条件，基因突变筛选高产菌株，代谢工程等。负责草欧菌素A生物合成的相关基因在成团泛菌ZJU23的基因组上成簇分布。迄今为止，涉及草欧菌素A生物合成途径中相关转录调控因子及其调控机制的研究仍旧很少。

发明内容

本发明提供了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的新用途，并据此获得破坏Pa22基因功能后的成团泛菌基因工程菌，将其发酵来生产草欧菌素A，显著提高了成团泛菌草欧菌素A的产量。

具体技术方案如下：

本发明提供了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用，所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述应用的途径为破坏 Pa22基因的功能，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。

在本发明的研究中，挖掘到与草欧菌素A基因簇转录负调控相关的基因Pa22，敲除这个调控蛋白基因，可以显著提高草欧菌素A的产量。

Pa22基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该基因共编码341个氨基酸，是一个LacI家族转录调控因子，在细菌的运动、毒力、次生代谢等方面发挥作用，能够调控许多基因表达；破坏Pa22基因功能的方式可以是多种的，例如：基因敲除，基因沉默等。

进一步地，所述应用的途径为通过敲除成团泛菌的Pa22基因，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。

更进一步地，所述成团泛菌为成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23，菌株保藏编号为CGMCC No.16174，保藏日期为2018年7月30日。

本发明还提供了一种成团泛菌基因工程菌，所述成团泛菌基因工程菌为Pa22基因被敲除的成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23；所述Pa22基因的核苷酸序列如 SEQ IDNo.1所示。

进一步地，所述基因工程菌内还包含质粒pKD46。

敲除原理是：将含有目的基因上下游50bp同源臂的抗性片段转入宿主细胞ZJU23中，在质粒pKD46表达的重组酶的帮助下，通过同源重组的方式，对目的基因进行敲除。

本发明还提供了成团泛菌基因工程菌在提高草欧菌素A产量中的应用，所述成团泛菌基因工程菌如上文所述。

本发明还提供了一种生产草欧菌素A的方法，包括：将成团泛菌基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有草欧菌素A的发酵液；将含有草欧菌素A的发酵液进行分离，获得草欧菌素A；

所述成团泛菌基因工程菌如上文所述。

进一步地，所述发酵的温度为25～30℃、转速为150～200rpm。更进一步地，所述发酵的温度为25℃、转速为180rpm。

进一步地，所述发酵培养基为KB液体培养基；所述KB液体培养基的成分包含蛋白胨8～12g/L、甘油13～16g/L、磷酸氢二钾1.2～1.6g/L、硫酸镁0.4～0.8g/L。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的新用途，并基于该发现获得了一株可高产草欧菌素A的成团泛菌工程菌 ZJU23-Pa22，此成团泛菌工程菌ZJU23-Pa22是通过敲除成团泛菌ZJU23中的Pa22基因获得的，将此成团泛菌工程菌ZJU23-Pa22接种至KB液体培养基中发酵72h，即可使发酵液中草欧菌素A的产量高达116.6mg/L，是野生型成团泛菌ZJU23的1.33倍。

附图说明

图1为Pa22基因的敲除原理示意图；

其中，Pa22-F、Pa22-R为含有Pa22基因上下游50bp同源臂的引物，用于扩增卡那抗性基因序列；Pa22-ID-F、Pa22-ID-R为验证Pa22基因是否敲除的引物，引物分别设计在50bp同源臂上游以及卡那抗性基因片段上，若Pa22基因被敲除，能扩增出大小为1008bp的条带；Pa22-N-F、Pa22-N-R为Pa22基因内部序列，若Pa22基因未被敲除，则能够扩增出大小为622bp的条带，因此，Pa22基因敲除突变体无法扩增出条带，ZJU23野生型菌株能够扩增出对应大小的条带；Km为卡那抗性基因序列。

图2为Pa22基因敲除株的菌落PCR鉴定图；

其中，ID即代表用引物Pa22-ID-F、Pa22-ID-R进行PCR验证，IN即代表用引物Pa22-N-F、Pa22-N-R进行PCR验证。Pa22-1为Pa22基因敲除株1的条带，Pa22-2为 Pa22基因敲除株2的条带，Pa22-3为Pa22基因敲除株3的条带，三个菌株为不同的转化子；ZJU23为成团泛菌ZJU23的PCR扩增条带；Negative control为阴性对照，即 PCR时未加入DNA模板，Marker为购自Takara的250bp DNA Ladder，用于指示跑胶条带大小。

图3为成团泛菌基因工程菌ZJU23-Pa22与成团泛菌ZJU23中草欧菌素A的发酵产量示意图；

其中，23WT为成团泛菌ZJU23，ZJU23-Pa22即为成团泛菌基因工程菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L。

KB液体培养基：蛋白胨10g/L、甘油15g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁0.6g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

草欧菌素A含量的测定：获得发酵液后，通过使用高效液相色谱法(HPLC)对发酵液中的草欧菌素A产量进行测定。发酵液经离心，过滤器，去除菌体及其他一些杂质，用于HPLC测定。使用ZorBax RX C-18 250x4.6mm柱子进行试验，柱温为40℃，进样量为10μL，紫外吸收峰为210nm。流动相为：A液(含有0.1％甲酸的甲醇)，B液(0.1％磷酸的去离子水)。进样程序为：0-30min，30％A-90％A；30-40min， 90％A-100％A，溶液A和溶液B总比例为100％，流速为1mL/min。以草欧菌素A标样为对照，出峰时间约为25.6分钟。

实施例1成团泛菌工程菌ZJU23-Pa22的构建

具体步骤如下：

步骤一：含有Pa22基因上下游50bp同源臂的卡那抗性基因片段的扩增。

以质粒plvc-Km为模板，用Pa22-F、Pa22-R引物进行PCR反应扩增抗性片段，跑胶回收对应片段，卡那抗性基因序列如SEQ ID NO.3所示；表1列出了基因敲除过程中使用到的引物序列。

表1 Pa22基因敲除过程中使用的引物序列

其中，引物Pa22-F、Pa22-R用于扩增抗性基因片段，引物Pa22-ID-F、Pa22-ID-R、Pa22-N-F、Pa22-N-R用于验证基因是否敲除。Pa22-ID-F、Pa22-ID-R为验证Pa22基因是否敲除的引物，引物分别设计在50bp同源臂上游以及卡那抗性基因片段上，若 Pa22基因被敲除，能扩增出大小为1008bp的条带。Pa22-N-F、Pa22-N-R为Pa22 基因内部序列，若Pa22基因未被敲除，则能够扩增出大小为622bp的条带，因此，Pa22基因敲除突变体无法扩增出条带，ZJU23野生型菌株能够扩增出对应大小的条带

步骤二：敲除Pa22基因的成团泛菌基因工程菌ZJU23/pKD46的构建。

本实施例选用的同源辅助质粒pKD46不仅编码λ-red重组系统Exo、Bet和Gam 三种蛋白因子，并受到L-阿拉伯糖的诱导表达，而且其本身含有氨苄青霉素抗性基因筛选标记。

首先，制备成团泛菌ZJU23的热激感受态细胞。从固体培养基平板上挑取新活化的ZJU23单菌落接种于3-5mL的LB培养液中，30℃过夜培养，直至对数生长后期，将该菌液按照1:100比例接种于100mL LB中，30℃振荡培养3～5小时，直至OD₆₀₀为0.5左右；将培养物转至50mL离心管中，冰上放置30分钟，然后于4℃，4000rpm 离心10分钟；弃上清，用预冷的0.1M的CaCl₂溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置 30分钟后，4℃，4000rpm离心5分钟；弃上清，加入4mL预冷的含15％甘油的0.1 M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟后即为感受态细胞悬浮液。随后，取10μL质粒pKD46加入100μL感受态细胞悬液中，静置30分钟后，于42℃热激 45s，立即加入800μL新鲜LB液体培养基，30℃、180rpm摇床培养1h。菌液5000 rpm离心3min收集菌体。用100μL LB液体培养基重悬，然后涂布于终浓度为100mg/L 的氨苄青霉素的LB固体培养基中，30℃培养箱过夜。挑取转化的单菌落，接种于3mL LB培养基中(含有100mg/L Amp),30℃振荡培养12-16h或过夜，保存于-80℃；

步骤三：卡那抗性基因片段电击转入ZJU23/pKD46，并筛选验证突变体。

从LB平板上挑取ZJU23/pKD46单菌落于3mL LB培养液中，30℃，180rpm过夜培养，获得种子液；随后将种子液以1:100转接至100mL LB液体培养基中(培养基中加入终浓度为10mM的阿拉伯糖)，30℃，180rpm培养约5小时(OD₆₀₀约为 1.0)；将培养物转至50mL离心管中，冰上放置30分钟，然后于4℃，4000rpm离心，用预冷的去离子水洗3次即得到感受态细胞悬浮液；随后将含有50bp目的基因同源臂的卡那抗性基因片段电击转入感受态，使用Bio-Rad的2mm电击杯进行电击，电击参数为：电压2.5kV，电击时间4.0-5.5ms；电转化结束后，将800μL液体LB培养基快速加入到电转化杯中。将菌液从电击杯中移入2mL离心管中，于30℃，180rpm 恢复培养约1小时，使卡那抗性片段与宿主菌种的靶标基因发生区域同源重组；随后使用卡那抗性进行筛选，挑取单菌落进行PCR验证，得到草欧菌素A高产菌株 ZJU23-Pa22。

实施例2草欧菌素A的生产

具体步骤如下：

将野生型菌株ZJU23与基因敲除突变株ZJU23-Pa22在LB固体培养基上活化，然后将活化后菌株接种在LB液体培养基中于30℃、180rpm的转速下培养12小时；按照1:1000的接种量转接至发酵培养基中于25℃、180rpm的转速下培养72小时后收取发酵液。获得发酵液后，通过使用高效液相色谱法(HPLC)对测定草欧菌素A产量。

草欧菌素A产量测定结果如图3所示。相比于野生型菌株ZJU23，突变体菌株ZJU23-Pa22有明显提升。室内摇瓶发酵产量达到116.6mg/L，为野生型菌株的1.33倍。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内作出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 浙江大学

<120> Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> 成团泛菌(pantoea agglomerans)

<400> 1

atgaaaatca ggccgcctcg cgccaccatc agcgatgttg ctcacgtggc acgaaccggt 60

aaaaccagcg tttcacgcta tctcaatggt gaactgcatc tgctctctgc cggtctgaaa 120

gcgcggatcg aacaggctat tgctgatctc agctatcgcc cgagtcagat ggcgcgcggc 180

ctgaagcgcg gacgtacccg cctgatcggg ctgattatcg ccgatatcac caatccctat 240

tctgttgatg tcatgagcgg tattgaagcc gcctgccgcg agcagggttt cacgctgctg 300

atgtgtaaca ccaataacga agtggatctg gagcagcact atctgcaatt gctgagcagc 360

tatcaggttg agggcattgt ggttaacgcc gtcgggatgc gtgaagaggt gctgaaccat 420

ctgcaacaat ccctgctgcc gatggtgctg attgaccgta aaatccccga ttttccctgc 480

gatgtggtgg gcctgaacaa cgccgaggca gccgaaacgg caacgcggca tctggtcgac 540

aatggctacg atgcgctgct ttttcttagc gagccgctgg gcagcgtcaa cacgcgccgt 600

gagcgcctgc aggccttccg ccagctactg gcggagcatc cgcaggttga gcatgagaat 660

accgaggtgg cgctgcacca gcccgctgcg ctggatcagg cgctactggc ctttcatcag 720

cgtcacaccg gcaaacgttg cgcggtgatg gtcgccaacg gggcgctgac attgcaggta 780

gcacgatcgc tacagcgact caatctgcac tggggccgcg atatcggcct gctcggtttt 840

gacgaactgg agtgggcggc gctggccggt gtgggtatca ccacgctgaa acaacccacc 900

tggcagattg gctacagtgc gctggaacgc ctgattgcgc gcatcgaggg cagcggatta 960

ccggttgccg agcaggtctt ctctggcgaa cttatcgttc gcggctccag ccagcctctt 1020

aactga 1026

<210> 2

<211> 341

<212> PRT

<213> 成团泛菌(pantoea agglomerans)

<400> 2

Met Lys Ile Arg Pro Pro Arg Ala Thr Ile Ser Asp Val Ala His Val

1 5 10 15

Ala Arg Thr Gly Lys Thr Ser Val Ser Arg Tyr Leu Asn Gly Glu Leu

20 25 30

His Leu Leu Ser Ala Gly Leu Lys Ala Arg Ile Glu Gln Ala Ile Ala

35 40 45

Asp Leu Ser Tyr Arg Pro Ser Gln Met Ala Arg Gly Leu Lys Arg Gly

50 55 60

Arg Thr Arg Leu Ile Gly Leu Ile Ile Ala Asp Ile Thr Asn Pro Tyr

65 70 75 80

Ser Val Asp Val Met Ser Gly Ile Glu Ala Ala Cys Arg Glu Gln Gly

85 90 95

Phe Thr Leu Leu Met Cys Asn Thr Asn Asn Glu Val Asp Leu Glu Gln

100 105 110

His Tyr Leu Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Gln Val Glu Gly Ile Val Val

115 120 125

Asn Ala Val Gly Met Arg Glu Glu Val Leu Asn His Leu Gln Gln Ser

130 135 140

Leu Leu Pro Met Val Leu Ile Asp Arg Lys Ile Pro Asp Phe Pro Cys

145 150 155 160

Asp Val Val Gly Leu Asn Asn Ala Glu Ala Ala Glu Thr Ala Thr Arg

165 170 175

His Leu Val Asp Asn Gly Tyr Asp Ala Leu Leu Phe Leu Ser Glu Pro

180 185 190

Leu Gly Ser Val Asn Thr Arg Arg Glu Arg Leu Gln Ala Phe Arg Gln

195 200 205

Leu Leu Ala Glu His Pro Gln Val Glu His Glu Asn Thr Glu Val Ala

210 215 220

Leu His Gln Pro Ala Ala Leu Asp Gln Ala Leu Leu Ala Phe His Gln

225 230 235 240

Arg His Thr Gly Lys Arg Cys Ala Val Met Val Ala Asn Gly Ala Leu

245 250 255

Thr Leu Gln Val Ala Arg Ser Leu Gln Arg Leu Asn Leu His Trp Gly

260 265 270

Arg Asp Ile Gly Leu Leu Gly Phe Asp Glu Leu Glu Trp Ala Ala Leu

275 280 285

Ala Gly Val Gly Ile Thr Thr Leu Lys Gln Pro Thr Trp Gln Ile Gly

290 295 300

Tyr Ser Ala Leu Glu Arg Leu Ile Ala Arg Ile Glu Gly Ser Gly Leu

305 310 315 320

Pro Val Ala Glu Gln Val Phe Ser Gly Glu Leu Ile Val Arg Gly Ser

325 330 335

Ser Gln Pro Leu Asn

340

<210> 3

<211> 914

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa 60

aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa 120

cgtcttgctc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 180

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 240

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 300

agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 360

tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc 420

aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 480

tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 540

gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 600

acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 660

tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 720

aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 780

atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 840

ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 900

atgagttttt ctaa 914

<210> 4

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatcgtgc tcacgaagcg agcacgtaaa cggaaggtta aatctgaaat tgtctcaaaa 60

tctctgatgt tac 73

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctttgcttg tgctagtctc tgcctggttt cttattacgc aggatatctc ttagaaaaac 60

tcatcgagca tc 72

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aactggcgtg cttcttcaac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaccaaacc gttattcatt c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggctggagcc gcgaacgata ag 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcgggatgc gtgaagaggt gc 22

Claims

1.Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用，其特征在于，所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述应用的途径为破坏Pa22基因的功能，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的途径为通过敲除成团泛菌的Pa22基因，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成团泛菌为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)ZJU23，菌株保藏编号为CGMCC No.16174，保藏日期为2018年7月30日。

4.一种成团泛菌基因工程菌，其特征在于，所述成团泛菌基因工程菌为Pa22基因被敲除的成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23；所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.如权利要求4所述的成团泛菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌内还包含质粒pKD46。

6.成团泛菌基因工程菌在提高草欧菌素A产量中的应用，其特征在于，所述成团泛菌基因工程菌如权利要求4所述。

7.一种生产草欧菌素A的方法，其特征在于，包括：将成团泛菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有草欧菌素A的发酵液；将含有草欧菌素A的发酵液进行分离，获得草欧菌素A；所述成团泛菌基因工程菌如权利要求4～5任一项所述。

8.如权利要求5所述的生产草欧菌素A的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25～30℃、转速为150～200rpm。

9.如权利要求5所述的生产草欧菌素A的方法，其特征在于，所述发酵培养基为KB液体培养基；所述KB液体培养基的成分包含蛋白胨8～12g/L、甘油13～16g/L、磷酸氢二钾1.2～1.6g/L、硫酸镁0.4～0.8g/L。