CN110904079B - β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用 - Google Patents

β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110904079B
CN110904079B CN202010012144.4A CN202010012144A CN110904079B CN 110904079 B CN110904079 B CN 110904079B CN 202010012144 A CN202010012144 A CN 202010012144A CN 110904079 B CN110904079 B CN 110904079B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vitamin
gene
mutant
fructofuranosidase
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010012144.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110904079A (zh
Inventor
张大伟
董会娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN202010012144.4A priority Critical patent/CN110904079B/zh
Publication of CN110904079A publication Critical patent/CN110904079A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110904079B publication Critical patent/CN110904079B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2431—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/42—Cobalamins, i.e. vitamin B12, LLD factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/41—Rhizobium

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种β‑呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达的β‑呋喃果糖苷酶基因和突变基因的基因工程菌，其生产维生素B12的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。

Description

β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因，及其在制备维生素B12中的应用。
背景技术
维生素 B12 (VB12)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B12可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B12参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。
由于维生素B12分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B12的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。
目前，国内外针对维生素B12生产菌生物合成维生素B12的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb 基因来增加细胞生产维生素B12的能力（程立芳等, 不同来源的尿卟啉原 III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素 B12 的影响. 工业微生物，2017，第47 卷第 3期）。
本发明人前期筛选出了一株高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），可发酵生产维生素B12。
β-呋喃果糖苷酶的作用机理是将蔗糖的葡萄糖基与果糖基的β-(1, 4)糖苷键断裂，生成果糖与葡萄糖。果糖与葡萄糖随后进入糖酵解途径。目前，尚未有β-呋喃果糖苷酶cscA用于维生素B12合成的报道。
发明内容
本发明人对前期筛选出的高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），通过对其进行诱变，获得一株产维生素B12能力提高的诱变菌株。本发明作了进一步研究以发现对产维生素B12能力有影响的基因。经过研究发现一种发现β-呋喃果糖苷酶基因和其突变基因，其导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B12的能力。
本发明首先提供一种β-呋喃果糖苷酶的突变体，其多肽氨基酸序列相对于如SEQID No.4所示氨基酸序列，第436位氨基酸替换为T，和/或第330位氨基酸替换为L。
更具体地，其多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：5或6所示。
进一步地，本发明提供上述的β-呋喃果糖苷酶的突变体的编码基因。
更具体地，所述核苷酸酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。
本发明尤其提供β-呋喃果糖苷酶编码基因在制备维生素B12中的应用。
在具体实施方式中，其是通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。进一步地，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。
优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。
在某些实施方式中，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因编码具有SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽。优选地，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。
经研究证实，本发明中，过量表达β-呋喃果糖苷酶基因和突变基因的基因工程菌生物安全（在菌内过表达未对菌体的生长造成影响），尤其可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B12的能力。经实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，可以提高产维生素B12的能力达16.7%，而突变基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达能进一步提高产维生素B12的能力即提高20%，尤其是具有两突变位点时提高达 25.6%。
附图说明
图1：质粒载体pBBR-P21-cscA的图谱。
图2：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的VB12产量。
图3：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的生物量。
图4：维生素B12的标准曲线图。
具体实施方式
本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
培养基配方：
LB 培养基（g/L）：氯化钠 10 ，胰蛋白胨10 ，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。
种子培养基（g/L）：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH4)2SO4 1，(NH4)2HPO4 2，MnSO4·H2O 0.8，CoCl2·6H2O 0.02，MgO 0.3，DMBI 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，CaCO3 1.5,pH通过NaOH控制在7.0～7.4。
发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH4)2SO4 2，MgSO4 1.5, K2HPO40.75，CoCl2·6H2O 0.14, DMBI 0.075，ZnSO4·7H2O 0.08，CaCO3 1，pH通过NaOH控制在7.0～7.4。
检测方法
(1) 样品预处理
取1 mL发酵液，加入8%的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40 min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜(⌀= 0.22µm)过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl 2%的NaCN (w / v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。
（2）标准品的制备
配置梯度维生素B12标准品(20 mg/L，50 mg/L，100mg/L，150 mg/L)。
（3）HPLC检测条件
C18-250A柱（Agilent，4.6 mmid 9×250 mm，5µm）。流动相为70%有机相（乙腈）和30%无机相（乙酸钠水溶液），吸收波长为361 nm，柱温为35℃，流速0.8 mL/min，进样量20 µL。
（4）维生素B12标准曲线的绘制
将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB12浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B12质量浓度C（mg/L）记为横坐标，绘制维生素B12标准曲线。见图4，得回归方程y=19.846x-80.857，R2=0. 999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素B12标准曲线计算样品产量。
实施例1：常压室温等离子体（ARTP）诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得
（1）致死率的测定
为了获得一个比较广的突变体库，对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体（ARTP）诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638的致死率进行测定。将种子用LB培养基培养至对数中期的CGMCCNO.9638细胞(OD600=1) 用0.85% NaCl溶液冲洗两遍，然后用0.85% NaCl溶液稀释成108个细胞/mL的悬液。取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0 s、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后将带有细胞的铁片置于1 mL无菌水中漩涡震荡洗下细胞，将细胞悬液10倍梯度稀释至10-3，取稀释后的细胞悬液100 μL涂LB培养基平板，30℃培养72 h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变Ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中N=5、10、15、20、25。
从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。
Figure 415371DEST_PATH_IMAGE001
（2）突变体库的构建及筛选
取浓度为108个/mL的细胞悬液10 uL涂布于铁片上进行ARTP诱变，诱变时间为10s，共对3个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这3个铁片上的细胞在含有1mL LB培养基的1.5 mL离心管中涡旋振荡重悬。将细胞悬液10倍梯度稀释至10-3，取稀释后的细胞悬液100 μL涂LB培养基平板，30℃培养72h，长出270个单菌落。
（3）突变株96深孔板发酵初筛
分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL的种子培养基的96深孔板中（每个孔板上包含6株对照菌株CGMCC NO.9638），30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B12产量。
（4）突变株96深孔板发酵复筛
将步骤（3）中产量排前30的株菌的单菌落（包含一个对照菌株CGMCC NO.9638）接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中（每株菌3个平行），30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B12产量。
重复步骤（3）和（4）三次，最后获得一株高产维生素B12的菌种SM*，96孔板中产量从50 mg/L提高到80 mg/L，是底盘菌株产量的1.6倍。
实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析
将菌种SM*和出发菌株CGMCC NO.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现β-呋喃果糖苷酶编码基因cscA发生了点突变，其第989位核苷酸由C变为T，第1306位核苷酸由G变为A。为了验证突变位点对维生素B12产量的影响，将突变前和突变后的cscA基因在出发菌种CGMCC NO.9638中进行了过量表达。
实施例3：质粒载体的构建
1、pBBR-P21-cscA的构建：
分别利用表2的引物对P21-XbaI-F和P21-R，以Ensifer adhaerens Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21片段。P21启动子序列如SEQ ID No.7所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。
分别利用表2的引物对cscA-F和cscA-XhoI-R，以Ensifer adhaerens Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XhoI酶切位点，得到cscA片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的cscA片段。cscA基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
然后，利用引物对P21-XbaI-F和cscA-XhoI-R，以纯化的P21片段和cscA片段为模板，通过融合PCR，得到P21-cscA片段（含XbaI和XhoI酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-cscA片段。
将上述纯化的P21-cscA片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将P21-cscA片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-cscA。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-cscA备用，质粒图谱如图1所示。
、pBBR-P21-cscA（G1306A）
以质粒pBBR-P21-cscA为模板，用引物对 G1306A-F/ G1306A-R进行反向PCR扩增，得到大小约7.8kb的片段DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2 μl 10*T4连接酶缓冲液（NEB公司）、1 μl T4多核苷酸激酶（NEB公司），补充蒸馏水至20 μl，37℃反应30 min，加入1 μl T4连接酶（NEB公司），室温反应2 h得到连接产物。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-cscA（G1306A）。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-cscA（G1306A）备用。其中，突变的cscA基因序列如SEQ ID No.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
、pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）
以质粒pBBR-P21-cscA（G1306A）为模板，用引物对C989T-F/ C989T-R进行反向PCR扩增，得到大小约7.8kb的片段DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2 μl 10*T4连接酶缓冲液（NEB公司）、1 μl T4多核苷酸激酶（NEB公司），补充蒸馏水至20 μl，37℃反应30 min，加入1 μl T4连接酶（NEB公司），室温反应2 h得到连接产物。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）备用。其中，突变的cscA基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
Figure 129249DEST_PATH_IMAGE002
实施例4：含质粒载体菌株的构建
将实施例3中的4个质粒pBBR1MCS2、pBBR-P21-cscA、pBBR-P21-cscA（G1306A）和pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中：
（1）接种新活化的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638、大肠杆菌（含有相应的质粒）以及辅助载体MT616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到OD值为1.0左右；
（2）无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638的菌液、MT616和大肠杆菌的菌液各500 μL转移至1.5mL无菌EP管中并在4 ℃，12,000 rpm条件下离心1 min。
（3）在无菌条件下弃掉上清液，并用1mL 0.85%的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。
（4）再次在4℃，12,000 rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。
（5）分别采用500μL新鲜的LB液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和MT616的沉淀进行悬浮。
（6）分别取各2μL的三种菌液，滴在不添加抗性的LB固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。
（7）待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。
（8）挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。
（9）从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:SM/pBBR (对照菌)、SM/pBBR-P21-cscA（简写为SM1）、SM/ pBBR-P21-cscA（G1306A）（简写为SM2）、SM/ pBBR-P21-cscA（G1306A，C989T）（简写为SM3）。
实施例5：不同菌株评价
1、苜蓿中华根瘤菌的培养条件：
将对照菌、SM1、SM2和SM3菌株在无菌条件下用接种针在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置48 h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5 mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基的试管中，30℃，200 rpm培养36h。将种子培养基按照10%比例接种至含有100mg/L卡那霉素的30mL发酵培养基中（250ml摇瓶）。30℃震荡（220r/min）培养144 h后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。
、不同苜蓿中华根瘤菌菌株产VB12能力的比较
SM1、SM2和SM3三个菌株与对照菌相比生产维生素B12的能力均得到提高。
Figure 594472DEST_PATH_IMAGE003
其中SM1提高16.7%,，SM2提高20%，SM3提高 25.6%（参见表3和图2）。结果说明本发明中过量表达β-呋喃果糖苷酶编码基因cscA的苜蓿中华根瘤菌菌株生产维生素B12的能力得到显著提高。四个菌株生物量变化不大，说明cscA基因的过表达未对菌体的生长造成影响（见表3和图3）。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用
<160>15
<170> PatentIn Version 3.1
<210>1
<211> 1707
<212>DNA
<213>Sinorhizobium meliloti
<400> 1
atgacttcgc agacaaaacc cgcgagcccc gtgcttgaaa tcgtcgaggc cgaactcccg 60
gccgggaccg tgctgcatct ctggctgaag gcgcgcaaaa ttggcgacga ggcaatactg 120
tccgtcacct tagaccgcag tgagattgcc ggtccgtcca cgcgccgcgc cggggagttc 180
gaattcttcg cggtgacgct cgggacgact ggccgcacgg tgcttgccta tgatgcggaa 240
acaactgcgc tctccgtcgc ctatgcgttc cacccgcaga cggtgctgga ggaggggatc 300
cgcgtcctcc atcacgacgt ccgcacggcg ccgcctgagg ttcccggcag ctaccatttc 360
cgaccgccct tcggctggat gaacgacccg aacggcttcg gccggttcaa aggtctcggc 420
catctcttct accagcacta tccgcatggc ttgcgttgga acaccatgca ctggggccat 480
gcggtctcga aagatttgat ccgctggacg cacctgccga tgttcctgtt tccggcggac 540
cacctgtcgg aaaaggacga tggccgtggc ggcgcctttt ccggctcggc cgtccccgtc 600
tccgggccgg acggggacga catccgggtc ttctacaccg aacacgttcg cgaccgggag 660
ccggaggagc agatccagct ctcggccgtc agccgagacg gcatcgttgc cggcccgtcc 720
gaggtgatcc tgcctatccg tccggagggt ctgaacctca cgactgattt ccgcgatccc 780
tatgtgttca agggcccgga cggccgctgg aagatgctgc ttggcagtcg cgaccgatcg 840
ggcggtgtcg tcctgcttta cgagacggcg gatctgcagg gtgccacggg ctggaccttc 900
ctcgacatca tccatcgcga ggacggtttc ggcatgaccg cagcggagtg cccttgcatg 960
ctgccggtcg gcggcatggc ggatgatccg gagacccgct gggcgctgat ctttggcctg 1020
ctcacaagcc gtgacccggc caccggccgg cgcaacctca catccgtcac cgtcggccgc 1080
ttcgacggcc ggtcgttcac ggccgaattc gaacaggaac tggatttcgg ctccgacgcc 1140
tacgccttcc aggccttcgt cgacggcgac gaaccggtcg gcatcgcctg gcttgccaac 1200
tggacagact tttccaagaa ggacgatttc ccgacggcga tgaccttgcc gcgtcgcgtg 1260
cttctcgatg ggggtgccgt gttgacgccg ccggtcgcgg cagtcgaaaa cctgcgccac 1320
aggctgctcg atgaagcagc ccttgctgcg ggcgaaacgg ttccactcga aagcggtgcg 1380
gtcgagatcg tgcttgcact gcccgaggcc ggcgcggctt tcgagctcgt cctcgatcac 1440
ccggatgtcg cgcttggcgt caggctcgat gacgagggcc ttgcaatcct cttcgatgcc 1500
ggtaccggca agccgccacc gcgatatctg gcgtcaggcg ccagaccttc gcagctgcgc 1560
atcttcctcg atgcgggctc gatcgaggtc tttgccgaca acggccgctg gacaggcacc 1620
aagcgcattc ccggatttgc cgccgcgcga tcggcaaggc tgacgggcgc cgtcacgggc 1680
gcgaaaatct ggcaactcaa gctttga 1707
<210>2
<211> 1707
<212>DNA
<213>Sinorhizobium meliloti
<400> 2
atgacttcgc agacaaaacc cgcgagcccc gtgcttgaaa tcgtcgaggc cgaactcccg 60
gccgggaccg tgctgcatct ctggctgaag gcgcgcaaaa ttggcgacga ggcaatactg 120
tccgtcacct tagaccgcag tgagattgcc ggtccgtcca cgcgccgcgc cggggagttc 180
gaattcttcg cggtgacgct cgggacgact ggccgcacgg tgcttgccta tgatgcggaa 240
acaactgcgc tctccgtcgc ctatgcgttc cacccgcaga cggtgctgga ggaggggatc 300
cgcgtcctcc atcacgacgt ccgcacggcg ccgcctgagg ttcccggcag ctaccatttc 360
cgaccgccct tcggctggat gaacgacccg aacggcttcg gccggttcaa aggtctcggc 420
catctcttct accagcacta tccgcatggc ttgcgttgga acaccatgca ctggggccat 480
gcggtctcga aagatttgat ccgctggacg cacctgccga tgttcctgtt tccggcggac 540
cacctgtcgg aaaaggacga tggccgtggc ggcgcctttt ccggctcggc cgtccccgtc 600
tccgggccgg acggggacga catccgggtc ttctacaccg aacacgttcg cgaccgggag 660
ccggaggagc agatccagct ctcggccgtc agccgagacg gcatcgttgc cggcccgtcc 720
gaggtgatcc tgcctatccg tccggagggt ctgaacctca cgactgattt ccgcgatccc 780
tatgtgttca agggcccgga cggccgctgg aagatgctgc ttggcagtcg cgaccgatcg 840
ggcggtgtcg tcctgcttta cgagacggcg gatctgcagg gtgccacggg ctggaccttc 900
ctcgacatca tccatcgcga ggacggtttc ggcatgaccg cagcggagtg cccttgcatg 960
ctgccggtcg gcggcatggc ggatgatccg gagacccgct gggcgctgat ctttggcctg 1020
ctcacaagcc gtgacccggc caccggccgg cgcaacctca catccgtcac cgtcggccgc 1080
ttcgacggcc ggtcgttcac ggccgaattc gaacaggaac tggatttcgg ctccgacgcc 1140
tacgccttcc aggccttcgt cgacggcgac gaaccggtcg gcatcgcctg gcttgccaac 1200
tggacagact tttccaagaa ggacgatttc ccgacggcga tgaccttgcc gcgtcgcgtg 1260
cttctcgatg ggggtgccgt gttgacgccg ccggtcgcgg cagtcaaaaa cctgcgccac 1320
aggctgctcg atgaagcagc ccttgctgcg ggcgaaacgg ttccactcga aagcggtgcg 1380
gtcgagatcg tgcttgcact gcccgaggcc ggcgcggctt tcgagctcgt cctcgatcac 1440
ccggatgtcg cgcttggcgt caggctcgat gacgagggcc ttgcaatcct cttcgatgcc 1500
ggtaccggca agccgccacc gcgatatctg gcgtcaggcg ccagaccttc gcagctgcgc 1560
atcttcctcg atgcgggctc gatcgaggtc tttgccgaca acggccgctg gacaggcacc 1620
aagcgcattc ccggatttgc cgccgcgcga tcggcaaggc tgacgggcgc cgtcacgggc 1680
gcgaaaatct ggcaactcaa gctttga 1707
<210>3
<211> 1707
<212>DNA
<213>Sinorhizobium meliloti
<400> 3
atgacttcgc agacaaaacc cgcgagcccc gtgcttgaaa tcgtcgaggc cgaactcccg 60
gccgggaccg tgctgcatct ctggctgaag gcgcgcaaaa ttggcgacga ggcaatactg 120
tccgtcacct tagaccgcag tgagattgcc ggtccgtcca cgcgccgcgc cggggagttc 180
gaattcttcg cggtgacgct cgggacgact ggccgcacgg tgcttgccta tgatgcggaa 240
acaactgcgc tctccgtcgc ctatgcgttc cacccgcaga cggtgctgga ggaggggatc 300
cgcgtcctcc atcacgacgt ccgcacggcg ccgcctgagg ttcccggcag ctaccatttc 360
cgaccgccct tcggctggat gaacgacccg aacggcttcg gccggttcaa aggtctcggc 420
catctcttct accagcacta tccgcatggc ttgcgttgga acaccatgca ctggggccat 480
gcggtctcga aagatttgat ccgctggacg cacctgccga tgttcctgtt tccggcggac 540
cacctgtcgg aaaaggacga tggccgtggc ggcgcctttt ccggctcggc cgtccccgtc 600
tccgggccgg acggggacga catccgggtc ttctacaccg aacacgttcg cgaccgggag 660
ccggaggagc agatccagct ctcggccgtc agccgagacg gcatcgttgc cggcccgtcc 720
gaggtgatcc tgcctatccg tccggagggt ctgaacctca cgactgattt ccgcgatccc 780
tatgtgttca agggcccgga cggccgctgg aagatgctgc ttggcagtcg cgaccgatcg 840
ggcggtgtcg tcctgcttta cgagacggcg gatctgcagg gtgccacggg ctggaccttc 900
ctcgacatca tccatcgcga ggacggtttc ggcatgaccg cagcggagtg cccttgcatg 960
ctgccggtcg gcggcatggc ggatgatctg gagacccgct gggcgctgat ctttggcctg 1020
ctcacaagcc gtgacccggc caccggccgg cgcaacctca catccgtcac cgtcggccgc 1080
ttcgacggcc ggtcgttcac ggccgaattc gaacaggaac tggatttcgg ctccgacgcc 1140
tacgccttcc aggccttcgt cgacggcgac gaaccggtcg gcatcgcctg gcttgccaac 1200
tggacagact tttccaagaa ggacgatttc ccgacggcga tgaccttgcc gcgtcgcgtg 1260
cttctcgatg ggggtgccgt gttgacgccg ccggtcgcgg cagtcaaaaa cctgcgccac 1320
aggctgctcg atgaagcagc ccttgctgcg ggcgaaacgg ttccactcga aagcggtgcg 1380
gtcgagatcg tgcttgcact gcccgaggcc ggcgcggctt tcgagctcgt cctcgatcac 1440
ccggatgtcg cgcttggcgt caggctcgat gacgagggcc ttgcaatcct cttcgatgcc 1500
ggtaccggca agccgccacc gcgatatctg gcgtcaggcg ccagaccttc gcagctgcgc 1560
atcttcctcg atgcgggctc gatcgaggtc tttgccgaca acggccgctg gacaggcacc 1620
aagcgcattc ccggatttgc cgccgcgcga tcggcaaggc tgacgggcgc cgtcacgggc 1680
gcgaaaatct ggcaactcaa gctttga 1707
<210>4
<211>568
<212>PRT
<213>Sinorhizobium meliloti
<400> 4
MTSQTKPASP VLEIVEAELP AGTVLHLWLK ARKIGDEAIL SVTLDRSEIA GPSTRRAGEF 60
EFFAVTLGTT GRTVLAYDAE TTALSVAYAF HPQTVLEEGI RVLHHDVRTA PPEVPGSYHF 120
RPPFGWMNDP NGFGRFKGLG HLFYQHYPHG LRWNTMHWGH AVSKDLIRWT HLPMFLFPAD 180
HLSEKDDGRG GAFSGSAVPV SGPDGDDIRV FYTEHVRDRE PEEQIQLSAV SRDGIVAGPS 240
EVILPIRPEG LNLTTDFRDP YVFKGPDGRW KMLLGSRDRS GGVVLLYETA DLQGATGWTF 300
LDIIHREDGF GMTAAECPCM LPVGGMADDP ETRWALIFGL LTSRDPATGR RNLTSVTVGR 360
FDGRSFTAEF EQELDFGSDA YAFQAFVDGD EPVGIAWLAN WTDFSKKDDF PTAMTLPRRV 420
LLDGGAVLTP PVAAVENLRH RLLDEAALAA GETVPLESGA VEIVLALPEA GAAFELVLDH 480
PDVALGVRLD DEGLAILFDA GTGKPPPRYL ASGARPSQLR IFLDAGSIEV FADNGRWTGT 540
KRIPGFAAAR SARLTGAVTG AKIWQLKL 568
<210>5
<211>568
<212>PRT
<213>Sinorhizobium meliloti
<400>5
MTSQTKPASP VLEIVEAELP AGTVLHLWLK ARKIGDEAIL SVTLDRSEIA GPSTRRAGEF 60
EFFAVTLGTT GRTVLAYDAE TTALSVAYAF HPQTVLEEGI RVLHHDVRTA PPEVPGSYHF 120
RPPFGWMNDP NGFGRFKGLG HLFYQHYPHG LRWNTMHWGH AVSKDLIRWT HLPMFLFPAD 180
HLSEKDDGRG GAFSGSAVPV SGPDGDDIRV FYTEHVRDRE PEEQIQLSAV SRDGIVAGPS 240
EVILPIRPEG LNLTTDFRDP YVFKGPDGRW KMLLGSRDRS GGVVLLYETA DLQGATGWTF 300
LDIIHREDGF GMTAAECPCM LPVGGMADDP ETRWALIFGL LTSRDPATGR RNLTSVTVGR 360
FDGRSFTAEF EQELDFGSDA YAFQAFVDGD EPVGIAWLAN WTDFSKKDDF PTAMTLPRRV 420
LLDGGAVLTP PVAAVKNLRH RLLDEAALAA GETVPLESGA VEIVLALPEA GAAFELVLDH 480
PDVALGVRLD DEGLAILFDA GTGKPPPRYL ASGARPSQLR IFLDAGSIEV FADNGRWTGT 540
KRIPGFAAAR SARLTGAVTG AKIWQLKL 568
<210>6
<211>568
<212>PRT
<213>Sinorhizobium meliloti
<400> 6
MTSQTKPASP VLEIVEAELP AGTVLHLWLK ARKIGDEAIL SVTLDRSEIA GPSTRRAGEF 60
EFFAVTLGTT GRTVLAYDAE TTALSVAYAF HPQTVLEEGI RVLHHDVRTA PPEVPGSYHF 120
RPPFGWMNDP NGFGRFKGLG HLFYQHYPHG LRWNTMHWGH AVSKDLIRWT HLPMFLFPAD 180
HLSEKDDGRG GAFSGSAVPV SGPDGDDIRV FYTEHVRDRE PEEQIQLSAV SRDGIVAGPS 240
EVILPIRPEG LNLTTDFRDP YVFKGPDGRW KMLLGSRDRS GGVVLLYETA DLQGATGWTF 300
LDIIHREDGF GMTAAECPCM LPVGGMADDL ETRWALIFGL LTSRDPATGR RNLTSVTVGR 360
FDGRSFTAEF EQELDFGSDA YAFQAFVDGD EPVGIAWLAN WTDFSKKDDF PTAMTLPRRV 420
LLDGGAVLTP PVAAVKNLRH RLLDEAALAA GETVPLESGA VEIVLALPEA GAAFELVLDH 480
PDVALGVRLD DEGLAILFDA GTGKPPPRYL ASGARPSQLR IFLDAGSIEV FADNGRWTGT 540
KRIPGFAAAR SARLTGAVTG AKIWQLKL 568
<210>7
<211> 1000
<212>DNA
<213>Ensifer adhaerens Casida A
<400> 7
caaacagacc gggatatgcg ggtattcttc cgccgcgccg aggatgaggt ggcgcaggaa 60
cgcgtcaccg gcataggagc gggcgccacg gcttgcctga aggatgaccg ggctgtcggt 120
cgcatcggcg gcgcgcatga cggcctgaat gtattccaga ttgttcacat tgaacgccgg 180
cagcgcgtaa tcgttctccg ccgcatggtc gagcagttgc cgcaatgtga tcaatgccat 240
tcgctatctc cctttggata ctcggtgcaa cctatgcggc gcaccacaaa aacaatccgg 300
ccgttgaacc gcacgaaatg catcgatggc aaagtcgatg gccggctttt tcgtgcggcg 360
tgacggcgcg cgcgaattgg tcgcgcccac cgaagtcagg cgcacaatag ttcatcgaag 420
tggtttgaca accgggcaaa aggcaggttg ccagaggtcg aaactcgctt caatcgattt 480
tactgtggac tggatgcaac accttcagtg tgaagtgttt tcactttctg gtggtgcctg 540
agaggagggg gagtcgaggg cagtggatgc aaccattggg cgctgatttt gtctgttaca 600
ccatcgtggt ggatgccctg tcggaaacag tctgtcgaca ggaggtgaac gtcccgcaag 660
aagattgcgg caacgcccct ctttctttgc gcagattacg taaactgccg ctaaaattca 720
caaactttgc atcgcggatg attcgaggct caatccggcc gacaaaaagc gcggacctaa 780
aacgttgcag tagatttcgc aaaaatgccc tgttcacgtc atatgcccgt cgcaaaggcg 840
acgaaaagaa tcgcaaacaa aatacaacct atgggatagg ccgattcccc tcctatagat 900
aaagatgcag acagccgcag aatccgcctt gcgttcgcga acgatttgcg cttctctcct 960
gcgatcacaa acccaaaaca aggggaagga gagaaacaaa 1000
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 8
ctagtctaga caaacagacc gggatatgcg gg 32
<210>9
<211> 42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gggttttgtc tgcgaagtca ttttgtttct ctccttcccc tt 42
<210>10
<211> 42
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 10
aaggggaagg agagaaacaa aatgacttcg cagacaaaac cc 42
<210>11
<211> 30
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 11
ccgctcgagt caaagcttga gttgccagat 30
<210>12
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 12
cggcggcatg gcggatgatc tggagacccg ctgggcgctg a 41
<210>13
<211> 41
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 13
tcagcgccca gcgggtctcc agatcatccg ccatgccgcc g 41
<210>14
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 14
cgccgccggt cgcggcagtc aaaaacctgc gccacaggct g 41
<210>15
<211> 41
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 15
cagcctgtgg cgcaggtttt tgactgccgc gaccggcggc g 41

Claims (8)

1.一种β-呋喃果糖苷酶的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列如SEQ ID No.5或SEQ ID NO：6所示。
2.如权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶的突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在，所述编码基因的核苷酸酸序列如SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3所示。
4.β-呋喃果糖苷酶编码基因在制备维生素B12中的应用，其特征在于，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因编码如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述苜蓿中华根瘤菌的保藏号为CGMCCNO.9638。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。
8.如权利要求5至7任一项所述的应用，其特征在于，所述编码基因位于质粒或染色体中。
CN202010012144.4A 2020-01-07 2020-01-07 β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用 Active CN110904079B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010012144.4A CN110904079B (zh) 2020-01-07 2020-01-07 β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010012144.4A CN110904079B (zh) 2020-01-07 2020-01-07 β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110904079A CN110904079A (zh) 2020-03-24
CN110904079B true CN110904079B (zh) 2020-05-19

Family

ID=69813990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010012144.4A Active CN110904079B (zh) 2020-01-07 2020-01-07 β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110904079B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502308B (zh) * 2021-04-15 2023-02-03 黑龙江新和成生物科技有限公司 一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素b12的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9802249D0 (en) * 1998-02-03 1998-04-01 Ciba Geigy Ag Organic compounds
CN1236697C (zh) * 2001-04-13 2006-01-18 自然美化妆品股份有限公司 果寡糖甜味料的制造方法
FR2912036B1 (fr) * 2007-02-01 2009-10-02 Nutritis Sirops de sucres de fruits a haute teneur en fructose,et procede de preparation.

Also Published As

Publication number Publication date
CN110904079A (zh) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110804598B (zh) 前咕啉-2c(20)-甲基转移酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用
CN110904126B (zh) 转录调控因子和其突变体及其在制备维生素b12中的应用
CN111057133B (zh) 响应调节因子和其突变体及其在制备维生素b12中的应用
CN110950938B (zh) 一种双组分调控系统及其在制备维生素b12中的应用
CN112680484B (zh) 一种利用双菌共培养体系生产3,4-二羟基丁酸的方法
CN110904079B (zh) β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用
CN111041020B (zh) 异柠檬酸裂合酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用
CN113817762A (zh) 一种产戊二胺的重组大肠杆菌及其应用
CN110819605B (zh) 甲硫氨酸合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用
CN110903358B (zh) 核糖体因子和其突变体及其在制备维生素b12中的应用
CN113717892B (zh) 一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株及其应用
CN110819615B (zh) 尿卟啉原ⅲ合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用
CN108531518A (zh) 一种提高大肠杆菌积累丙酮酸的方法
CN113462628B (zh) 一株产血红素的基因工程菌及其构建方法和应用
CN112375725B (zh) 一种生产维生素b6的代谢工程菌株及其构建方法与应用
CN114958693A (zh) 一株枯草芽孢杆菌、一种重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN115011614A (zh) Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用
CN114672525A (zh) N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
CN112680387A (zh) 一种发酵产放线菌素d的锈赤蜡黄链霉菌株及其应用
CN113462624B (zh) 基于人工设计的基因工程菌群落及其构建方法和应用
CN116064357B (zh) 一株有效提高Fcl29产量的改良菌株及改良方法
CN111154706B (zh) L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN117965325A (zh) 一种产黄青霉菌株及其应用
CN117844727A (zh) 一种基于细菌群体感应调控策略构建核黄素高产菌株的遗传改良方法
CN116790651A (zh) admX基因作为正调控因子在提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant